專利名稱：：針對lct中毒的藥物的制作方法針對LCT中毒的藥物本發(fā)明涉及用于預(yù)防或減輕大梭菌細胞毒素(LCTs)，特別是艱難梭菌毒素A和B(TcdA和TcdB)、索氏梭菌致命毒素(TcsL)及諾維氏梭菌a毒素(Tcna)中毒的藥物。艱難梭菌(Clostridiumdifficile)是嚴格厭氧生長、產(chǎn)生孢子的革蘭氏陽性菌，于70年代末才被鑒定為與抗生素相關(guān)的腹瀉和假膜性結(jié)腸炎的病原體。從90年代起艱難梭菌被認為是發(fā)展中國家最重要的醫(yī)院病菌。作為愈加廣泛地使用廣謙抗生素的后果，尤其是對于住院治療的患者，艱難梭菌感染的發(fā)病率進一步持續(xù)上升。與艱難梭菌相關(guān)的疾病是由艱難梭菌所產(chǎn)生的外毒素毒素A(TcdA)和B(TcdB)引起的。存在顯示不同毒性和毒素產(chǎn)生的不同菌抹。大約所有菌林的四分之一不產(chǎn)生毒素。產(chǎn)生毒素的菌株幾乎總是產(chǎn)生這兩種毒素。TcdA是腸毒素，其通過對腸細胞的細胞毒性損害提高小腸粘膜上皮的滲透性并由此引起腹瀉。TcdB是細胞毒素，其干擾電解質(zhì)輸送并引起小腸脫水及功能紊亂。TcdA和TcdB屬于所謂的大梭菌細胞毒素(LCTs)，分別由具有3個功能結(jié)構(gòu)域的肽鏈組成，即負責(zé)毒素與宿主細胞膜綴合的C端結(jié)構(gòu)域，負責(zé)穿越細胞膜的轉(zhuǎn)運的疏水的中間結(jié)構(gòu)域，和具有糖基轉(zhuǎn)移酶功能和介導(dǎo)分子毒性活性的N端結(jié)構(gòu)域。盡管毒素被攝入宿主細胞的過程還未完全弄清，但被認作事實的是，毒素在與宿主細胞受體綴合后通過胞吞作用進入宿主細胞，N端催化結(jié)構(gòu)域被切離且被轉(zhuǎn)運至宿主細胞胞漿內(nèi)以發(fā)揮其毒性。在胞漿內(nèi)催化結(jié)構(gòu)域?qū)ho-亞族(Rho,Rac和Cdc42)的GTP酶特異地糖基化(所述Rho-亞族本身參與大量信號傳導(dǎo)級聯(lián))，并以這種方式阻斷相關(guān)的信號傳導(dǎo)過程，從而最終導(dǎo)致細胞骨架的解聚和細胞死亡。迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)的出發(fā)點在于，TcdA和TcdB和其它"大梭5菌細胞毒素"LCT的毒素肽鏈上的N-端催化結(jié)構(gòu)域的切離，被一種細胞蛋白酶催化(Rupnik等人，2005和Pfeiffer等人，2003)。但是卻不能提供相應(yīng)的證據(jù)。然而在本發(fā)明以之為根據(jù)的研究過程中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，TcdA和TcdB的裂解是自催化的過程，該過程由磷酸肌醇(IP)啟動，因此艱難梭菌毒素除了它的糖基轉(zhuǎn)移酶的催化功能之外，還具有用于自我裂解和自催化性裂解的蛋白酶功能。該蛋白酶功能被鑒定為天門冬氨酸蛋白酶。鑒定為蛋白酶催化中心的蛋白區(qū)域是，涉及根據(jù)序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)的TcdB的氨基酸位置從AS1653至AS1678的氨基酸序列。表征天門冬氨酸蛋白酶的DXG基序(Rao等人)處于氨基酸位置1665。鑒定為磷酸肌醇結(jié)合位點的蛋白區(qū)域是，涉及根據(jù)序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)的TcdB蛋白的氨基酸位置從AS1517至AS2142的氨基酸序列。該氨基酸序列展現(xiàn)肌苷-5-單磷酸-脫氫酶(IMPDH)基序，該基序由兩個區(qū)域構(gòu)成，即AS1517-AS1593和AS1918-AS2142，它們通過325個氨基酸長的無序列同源性的蛋白質(zhì)片段分隔開。為了治療艱難梭菌感染的患者，首先要盡可能停用所述引發(fā)性抗生素。進一步的治療僅僅針對癥狀進行。在較長持續(xù)的或者嚴重的病程情形下，以及如果出于其它原因不可能停用所述引發(fā)性抗生素，則施用甲硝唑或者萬古霉素用于治療。常用的抗生素治療的缺點是多方面的。在此尤其重要的是，因為用抗生素治療另一種感染狀況而引起的疾病，無法用抗生素治療有效治愈。其背景是以下事實，艱難梭菌在健康人的腸腔內(nèi)只相對很少地出現(xiàn)，并且相對于正常的腸菌叢不能夠發(fā)展。如果正常的腸菌叢經(jīng)抗生素治療而破壞，艱難梭菌能得以發(fā)展并有效地安頓于小腸。針對抗艱難梭菌的抗生素治療再度導(dǎo)致腸菌叢的破壞并由此在因果上還阻止健康腸菌叢的產(chǎn)生。這也解釋了抗生素治療結(jié)束后所觀察到的緩解(Remissionen)的高數(shù)目。常用的抗生素治療的額外缺點是，近期多重抗藥性的艱難梭菌屬種越來越多地出現(xiàn)。從而威脅到，使目前用于艱難梭菌誘發(fā)的疾病的唯一療法失效，并且因艱難梭菌疾病而死亡的數(shù)目上升。另外，用于治療艱難梭菌感染所必須的抗生素是非常昂貴的，且通常只有在有理由的情況下作為保留抗生素使用。因而存在對藥物的迫切需求，該藥物適用于特定地防治(預(yù)防、清除、緩解)艱難梭菌感染，而不存在梭菌或其它細菌發(fā)展耐藥性的風(fēng)險，并且不會損害相關(guān)患者的自然菌叢-特別是腸菌群。本發(fā)明的任務(wù)是提供這樣的藥物。所述任務(wù)的解決方案在于提供文端所提及的類型的藥物，其特征在于，包含至少一種效應(yīng)劑作為活性物質(zhì)，所述效應(yīng)劑為LCTs(大梭菌細胞毒素)自催化性蛋白酶活性抑制劑或激活劑，所述LCTs特別是艱難梭菌毒素A(TcdA)和/或艱難梭菌毒素B(TcdB)，和/或索氏梭菌致死毒素(TcsL)和/或諾氏梭菌oc毒素(Tenoc)。下文中，作為LCTs自催化性蛋白酶活性的效應(yīng)劑，描述的既是LCTs自催化性蛋白酶的激活劑，又是LCTs自催化性蛋白酶的抑制劑。如果所述活性物質(zhì)或效應(yīng)劑是抑制劑，則其抗毒性作用基于抑制完整毒素(特別是TcdB或TcdA或TcsL或Tcnot)的蛋白酶活性，并由此阻止細胞毒素的具有糖基轉(zhuǎn)移酶功能的有效片段(在TcdB和TcdA的情形下是63kDa片段)的切除。適合的抑制劑是抑制毒素的蛋白酶活性的化學(xué)物質(zhì)。在上下文的闡述中，術(shù)語"化學(xué)物質(zhì)，，既表示無機化合物也表示有機化合物、離子和肽或蛋白。優(yōu)選的抑制劑是那些不可逆地抑制蛋白酶活性的化學(xué)物質(zhì)。對此的實例是物質(zhì)EPNP(1，2-環(huán)氧基-3-(對-硝基苯氧基)-丙烷)。該物質(zhì)在蛋白酶催化中心與天冬氨酸殘基不可逆反應(yīng)并抑制所述蛋白水解作用。其它蛋白酶抑制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或可以由他們用已知的方法輕易鑒定的(計算機模擬、高通量篩選)。例如可以合成肽以實施高通量篩選，該肽的氨基酸序列對應(yīng)于LCTs的蛋白酶裂解位點的序列。通過這些肽鏈，例如運用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法與染料AMC(7-氨基，4-甲基-香豆素)的偶合可以產(chǎn)生探針。為實施"高通量篩選"將已標記的探針與毒素和候選物質(zhì)放置一起。如果探針被裂解，則產(chǎn)生熒光光譜的變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員用通常的方法輕易捕獲該變化。試劑(Ansatze),其中觀察到焚光光鐠沒有變化的即包含潛在的蛋白酶抑制劑。還示例性地描述了另一種方法用于鑒定影響LCTs自催化性蛋白酶活性的活性的物質(zhì)。對此可以使用例如與染料連接的全毒素或者合適的毒素片段，所述染料的熒光在未裂解的毒素或者毒素片段中是淬滅的。通過毒素或毒素片段的自催化性裂解取消了淬滅性效應(yīng)。該熒光光鐠的變化，如所述，易于捕獲。特別合適的抑制劑，即具有抑制作用的效應(yīng)劑是化學(xué)物質(zhì)，特別是蛋白質(zhì)且其中尤其是抗體，通過與所述蛋白酶活性中心相互反應(yīng)抑制LCTs的自催化性蛋白酶活性。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"相互反應(yīng)"意指在LCT與化學(xué)物質(zhì)(特別是蛋白質(zhì))之間的任何類型的相互作用，并特別是包括共價鍵如雙硫鍵和非共價鍵如范德華力、疏水或靜電的相互作用以及氫橋鍵。在此優(yōu)選蛋白質(zhì)且其中尤其是抗體，其與分別根據(jù)TcdB-氨基酸序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)從AS1500至AS1800，優(yōu)選AS1653至AS1678的TcdB-蛋白質(zhì)區(qū)域，和尤其與1665位置處的DXG基序，或者與TcdA、TcsL或Tcnot的與此等同的或同源的蛋白區(qū)域相互作用。這些等同的/同源的蛋白區(qū)域，在TcdA的情況下，涉及根據(jù)TcdA-氨基酸序列號P16154(SwissProt/TrEMBL)位于AS1662位置處具有DXG基序的從AS1651至AS1675的氨基酸序列截段，在TcsL的情況下，涉及根據(jù)TcsL-氨基酸序列號Q46342(SwissProt/TrEMBL)位于AS1666位置處具有DXG基序的從AS1654至AS1679的氨基酸序列截段，在Tcna的情況下，涉及根據(jù)Tcna-氨基酸序列號(546149(SwissProt/TrEMBL)從AS1641至AS1665的氨基酸序列截段。其它適宜的抑制劑(具有抑制作用的效應(yīng)劑)是化學(xué)物質(zhì)，特別是蛋白質(zhì)且其中尤其是抗體，其通過抑制磷酸肌醇與毒素的相互作用來抑制LCTs的自催化性蛋白酶活性。通過阻止IP鍵，阻止毒素的溶蛋白性裂解。在此優(yōu)選蛋白質(zhì)且其中尤其是抗體，其與分別根據(jù)TcdB-氨基酸序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)從AS1400至AS2300，優(yōu)選AS1517至AS2142，和尤其AS1517至AS1593或AS1918至AS2142的TcdB蛋白區(qū)域，或者與TcdA、TcsL或Tenct的與此等同的或同源的蛋白區(qū)域相互作用。同樣好的是也可以產(chǎn)生抗體和其它蛋白，其不直接與磷酸肌醇結(jié)合(特別是前述蛋白區(qū)域)相互作用，而是靶向相鄰區(qū)域并空間阻礙IP鍵并由此阻止毒素的溶蛋白性裂解。此外可以產(chǎn)生不直接與LCTs的蛋白酶作用的DXG基序相互作用，而是通過與相鄰蛋白質(zhì)片段結(jié)合阻止溶蛋白性裂解的抗體和其它蛋白。適宜的抑制劑(具有抑制作用的效應(yīng)劑)此外呈現(xiàn)出磷酸肌醇(IP)且特別是六磷酸肌醇(IP6)的類似結(jié)構(gòu)，該類似結(jié)構(gòu)可以具有LCT(特別是TcdA和/或TcdB、和/或TcsL和/或Tena)的反應(yīng)結(jié)合位點而非磷酸肌醇且特別是六磷酸肌醇的反應(yīng)結(jié)合位點，但是不具有IP或IP6的引發(fā)劑功能(Initiator-Funktion)。該類似結(jié)構(gòu)由此是激動劑IP(特別是IP6)的拮抗劑，并展現(xiàn)出與LCT(特別是TcdA和/或TcdB、和/或TcsL和/或Tcncc)的蛋白酶活性的竟爭抑制作用。適宜的結(jié)構(gòu)類似物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或可應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的測試方式(例如對此是先前已經(jīng)描述過的)輕易鑒定。適宜的抑制劑此外是磷酸肌醇的抑制物質(zhì)(同義詞磷酸肌醇抑制物質(zhì)或磷酸肌醇抑制劑)，即這樣的抑制物質(zhì)，其如此結(jié)合或改性磷酸肌醇且特別是六磷酸肌醇，從而抑制它們引發(fā)LCT(特別是TcdA和/或TcdB和/或TcsL和/或Tcnot)的蛋白酶活性的能力。這樣的物質(zhì)的實例為二價離子如Ca2+，其與IP6形成不溶的配合物。類似的物質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或可應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的測試方式(例如對此是先前已經(jīng)描述過的)輕易鑒定。9其它適宜的抑制劑(具有抑制作用的效應(yīng)劑)是抑制在患者(哺乳動物，特別是人類)的腸腔中或患者(哺乳動物，特別是人類)的體細胞內(nèi)的礴酸肌醇的形成，或者破壞已存在的磷酸肌醇的化學(xué)物質(zhì)，從而阻止LCT在穿透入細胞質(zhì)的情形下的溶蛋白性裂解。優(yōu)選這樣的物質(zhì)的實例是鋰、VPA(丙戊酸)或CBZ(卡馬西平)。適宜的激活劑，即具有激活作用的效應(yīng)劑，是激活毒素蛋白酶活性的化學(xué)物質(zhì)。激活劑的抗毒作用基于，毒素與宿主細胞如此結(jié)合，以致被裂解的片段能夠到達細胞內(nèi)(胞漿)之前，引發(fā)完整毒素(特別是TcdB或TcdA或TcsL或Tenot)的蛋白酶活性。所述激活劑因而在宿主細胞外起到裂解具有糖基轉(zhuǎn)移酶功能的細胞毒的有效片段(在TcdB和TcdA中為63kDa-片段)的作用。所述細胞毒的有效片段不能再進入到達細胞內(nèi)并在那里發(fā)揮其細胞毒作用。特別適宜的激活劑(具有激活作用的效應(yīng)劑)是被分離的(以區(qū)別于胞漿內(nèi)的)磷酸肌醇(IP)，優(yōu)選六磷酸肌醇(IP6)。具有這種活性物質(zhì)的藥物具有下列優(yōu)點，存在于患者腸內(nèi)的LCT(特別是TcdB和/或TcdA和/或TcsL和/或Tcnot)，即在其能與腸細胞或其它體細胞結(jié)合并發(fā)揮毒性之前，通過藥物導(dǎo)入的IP已經(jīng)在腸中促使裂解。同樣良好地適宜作為激活劑(具有激活功能的效應(yīng)劑)的物質(zhì)，其類似IP6地促進LCT(特別是TcdA和/或TcdB和/或TcsL和/或Tena)的自催化性蛋白酶活性。這樣的物質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式輕易鑒定。對此還適宜的是前述的"高通量試驗"的改進的變化方案。其中使毒素與潛在的激活物質(zhì)一起提供并依據(jù)時間過程研究熒光光譜中的變化。在短時間內(nèi)呈現(xiàn)強烈變化的檢測物(Ansatze)包含適宜的激活劑(具有激活功能的效應(yīng)劑)。根據(jù)本發(fā)明，LCT的蛋白酶功能的催化中心也可以用作靶向施用的抗原(接種物質(zhì))以產(chǎn)生對抗毒素的免疫。本發(fā)明的主題因此還有用于避免或減輕LCT(-大梭菌細胞毒素)中毒的藥物，其特征在于，適宜作為疫苗用于施用，并且具有TcdB和/或TcdA和/或TcsL和/或Tcnot的催化中心的完整氨基酸序列或其作為抗原性活性物質(zhì)的片段。所述抗原性活性物質(zhì)優(yōu)選選自下組的蛋白質(zhì)片段-TcdB氨基酸序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)的位于1665位置處的DXG基序-TcdB氨基酸序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)的氨基酸位置AS1653至AS1678-TcdB氨基酸序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)的氨基酸位置AS1500至AS1800-TcdA氨基酸序列號P16154(SwissProt/TrEMBL)的位于1662位置處的DXG基序-TcdA氨基酸序列號P16154(SwissProt/TrEMBL)的氨基酸位置AS1651至AS1675-TcsL氨基酸序列號Q46342(SwissProt/TrEMBL)的位于1666位置處的DXG基序-TcsL氨基酸序列號Q46342(SwissProt/TrEMBL)的氨基酸位置AS1654至AS1679-Tcna氨基酸序列號Q46149(SwissProt/TrEMBL)的氨基酸位置AS1641至AS1665。以下依據(jù)實施例和附圖進一步闡述本發(fā)明。顯示圖1:TcdB1M63(270kDa)全毒素被裂解為在SDS-PAGE中的易位/配位體結(jié)構(gòu)域(207kDa)和N端催化結(jié)構(gòu)域(63kDa)，其實施采用a:Cy3標記的TcdB簡3和豬脾細胞提取物的混合物(實施例U);b:Cy3標記的TcdB腦3和不含蛋白質(zhì)的豬脾細胞提取物的混合物(實施例IB);c:Cy3標記的TcdB腦3和磷酸肌醇的混合物；d:無標記的TcdB，3和磷酸肌醇的混合物；e:無標記(借助親和色譜法純化)的TcdB腦3和磷酸肌醇的混合物;a-e分別在室溫下溫育1小時圖2:TcdB,和/或IP6的混合物的SDS-PAGE，該毒素用或沒有用EPNP預(yù)處理；泳道1:用EPNP預(yù)處理后且無IP6的TcdB腦3，在63kDa區(qū)域沒有可檢驗的條帶；泳道2:用EPNP預(yù)處理后且與IP6溫育后的TcdB腦3，僅微弱地顯示出典型的63kDa條帶；泳道3:沒有用EPNP預(yù)處理且與IP6溫育后的TcdB，"在63kDa的分子量區(qū)域可識別明顯清晰的條帶；泳道4:沒有用EPNP預(yù)處理且無IP6的TcdB，"在63kDa區(qū)域沒有可檢驗的條帶。圖3:天然TcdB蛋白(a)和經(jīng)EPNP修飾的TcdB蛋白(b)的胰蛋白酶消化后的ESI-LCMSMS-分析。MS-SurveyScan(大圖)和裂解譜(插入部分)。的。如在Ausubel等人(2003)中所描述。實施例1:TcdB自催化性蛋白酶活性的證明參考菌林VPI10463的艱難梭菌毒素B(WOkDa)，下文中簡稱為TcdB簡"將首先用Cy3進行熒光標記。為此將200-400PgTcdB腦3(tgcB麗ICS，Mainz,德國)用染料Cy3依據(jù)制造商(Amersham，Bioscience)的說明進行標記，其通過將毒素與在二甲基甲酰胺中溶解的染料一起在4。C下溫育1小時的方式。未結(jié)合的染料隨即借助尺寸排阻色譜法(SizeExclusionChromatographie-SEC)去除，其中10mM的Tris-HClpH8.5溶液用作為洗脫緩沖液。染料與經(jīng)Cy3標記的TcdB腦3之間的摩爾比為0.8-1.6。將經(jīng)標記的TcdB腦3等分并于-80。C下儲存以備進一步使用。(A)用于實施現(xiàn)有技術(shù)中已知的"體外裂解分析(In-vitro-cleavageassay)，，(對此特另'J參見Rupnik等人(2005);該公開文獻的內(nèi)容明確在此引用)將融化至室溫的等份的經(jīng)Cy3標記的TcdB自3在室溫下與豬脾細胞提取物溫育1小時。這種豬脾細胞提取物將如下制備將新鮮獲得的豬脾收納于磷酸緩沖液(PBS)中并破碎成單細胞混懸液。通過加入低鹽緩沖液(LowSaltBuffer)-即150mMNH4C1、1mMKHC03，0.1mMEDTA,pH7.6-，將存在的紅細胞胞溶并由此去除。隨即將脾細胞用lOmM的Tris-HClpH8.5洗滌兩次，并立即于-80匸深凍。就所希望的細胞提取物而言，視需要將一等份這種深凍的脾細胞在一等份10mM的Tris-HClpH8.5中融化并混懸，并且將該混懸液隨即經(jīng)受超聲波處理。將所獲得的溶胞產(chǎn)物在200000xg和4t:下離心1小時，并將上清液用于待進行的試驗。為了分離和驗證在溫育過程中產(chǎn)生的TcdB片段，在溫育階段結(jié)束時將經(jīng)Cy3標記的TcdB觸3和豬脾細胞提取物的混合物進行SDS-PAGE。該SDS-PAGE的結(jié)果顯示于圖la中獲得了預(yù)期的這兩條艱難梭菌毒素B(在此為TcdB1M63)的已知的且特征性的63kDa片段和2O7kDa片段。未混合有脾細胞提取物的TcdB腦3等份用作為陰性對照(參見附圖1"-，，)。(B)在平行實驗中，將(A)中所描述的脾細胞提取物在與經(jīng)Cy3標記的TcdB,3溫育之前純化脫除蛋白質(zhì)。出于此目的，將一等份根據(jù)(A)制備的豬脾細胞提取物在緊隨超聲波處理后進行6次苯酚-氯仿提取，其如以下步驟進行將豬脾細胞提取物與苯酚-氯仿-異戊醇(25/24/1)以體積比例1:1混合。將該混合物在1，700xg和4匸下離心10分鐘。將含水的最上層傾倒入新的離心管并且將離心和傾倒再重復(fù)5次。為了將苯酚的最后殘留也去除掉，隨即進行氯仿提取法。13以體積比例1:30(30),1:IOO(100)或1:300(300)用10mM的Tris-HClpH8.5稀釋，并如在(A)中所描述的與融化至室溫的經(jīng)Cy3標記的TcdB腦3等份混合，并在室溫下溫育1小時。為了分離和驗證在溫育過程中產(chǎn)生的TcdB片段，在溫育階段結(jié)束時將該混合物進行SDS-PAGE。該SDS-PAGE的結(jié)果將借助GelDocEQSystemImageReader(BIO-RAD慕尼黑，德國)使之可見并顯示于圖lb中在所有測試物中荻得這兩條TcdB，3的特征性的63kDa片段和207kDa片段。這說明，脾細胞提取物的含水且無蛋白質(zhì)的級份始終具有將TcdBm63裂解為它的這兩條特征性部分片段的特性。在另一組平行實驗中，將(A)中所描述的脾細胞提取物在其如(A)中所述與經(jīng)Cy3標記的TcdB簡3溫育和進行SDS-PAGE之前，加熱(96'C，30分鐘)處理。該SDS-PAGE的結(jié)果同樣顯示于圖lb中再次獲得這兩條TcdBm"的特征性的63kDa片段和207kDa片段。結(jié)果表明，經(jīng)過熱誘導(dǎo)的脾細胞提取物仍具有將TcdB腦3裂解為它的兩條特征性部分片段的特性。(C)在另一實驗系列中將經(jīng)Cy3標記的TcdB腦3和未標記的TcdB腦3單獨(即，沒有與脾細胞提取物混合)與不同的磷酸肌醇在室溫下溫育1小時并將各自的混合物隨即進行SDS-PAGE。該研究的結(jié)果在表1和圖lc-e中顯示。它提供了令人驚奇的核心證據(jù)，即TcdB簡3的溶蛋白性裂解可單獨由化學(xué)物質(zhì)如IP引發(fā)，且在這種溶蛋白性裂解的情形下由此涉及毒素蛋白的自催化過程。由表1所示，一系列的磷酸肌醇可以引發(fā)TcdB腦3的自催化性裂解。六磷酸肌醇(IP6)在所測試的肌醇中導(dǎo)致最強的裂解活性，這說明IPs具有最高的引發(fā)活性(參見圖lc-e)。結(jié)構(gòu)類似物或其它具有引發(fā)劑活性的磷酸肌醇相關(guān)物質(zhì)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或可以用已知方法(如，計算機4莫擬)輕易獲得的。例如也可以使用上文所描述的"高通量分析"。在與TcdB,3的溫育實驗中，對不同濃度IP6的測試顯示(參見圖14lc和Id)，IP濃度為10幽(圖1C)足夠用于裂解經(jīng)熒光標記的毒素B，而用于裂解未標記的(且在SDS-PAGE中通過鋅染色(ZincStainandDestainKit,Biorad，Hercules,USA)才使之可見)毒素B，更低的IP濃度直至1MM(圖Id)就夠了。類似實驗也用LCTs中的TcdA腦3、索氏梭菌的TcsL、和Tcnot進行。其表明，磷酸肌醇對LCT家族的所有被研究的毒素的自催化性裂解起激活性作用。(D)為了排除，在實驗中使用的來自艱難梭菌的培養(yǎng)基上清液的純化的TcdB，3被蛋白酶污染，用特別純化的TcdBw"進行對照實驗。TcdB簡3的這種純化借助親和色謙法在單克隆抗體2CV(DSMACC2321)的使用下如下進行將7mg的TcdB特異性單克隆抗體2CV(經(jīng)G蛋白純化的無血清雜交瘤培養(yǎng)基上清液)偶合到HiTrapNHSSepharose柱上(商購可得自GEHealthcare,Freiburg,FRG)。根據(jù)制造商的說明進行偶合和洗脫。用約4mg的TcdB脳3注入所述完備的柱并用50mM的Tris/HCl，pH7.0;125mMNaCl三次洗滌將未結(jié)合的蛋白質(zhì)去除。所述洗脫在一個步驟中用0.1M的三乙醇胺-HClpHll進行。將毒素洗脫為具有濃度為450-185Pg/mg的3個4ml的級份。經(jīng)洗脫的毒素立即用1M的Tris/HCl,pH7.5以1/10的體積比中和，其經(jīng)此得以確保，即在洗脫開始之前，所述中和溶液就已經(jīng)是被預(yù)置于級份的承接小管中的。隨即通過SDS-PAGE和隨后的鋅染色證明所述污染性蛋白不存在(參見圖le"-，，)。對照試驗由如此純化的未標記的TcdB,3與IP6的溫育和隨后的SDS-PAGE和借助鋅染色毒素和毒素片段的驗證組成。該試驗的結(jié)果顯示于圖le中并顯示全毒素完全裂解為這兩種已知的片段63kDa和207kDa。實施例2:通過與蛋白酶抑制劑的溫育而滅活TcdB腦3將TcdB,3如實施例1(D)中所述借助親和色譜法在單克隆抗體2CV的使用下純化，并隨后或者(i)與蛋白酶抑制劑EPNP(10mM的1，2-環(huán)氧基-3-(對-硝基苯氧基)-丙烷)或者(ii)-作為對照-與緩沖液(50mMHEPES，1MNaCl，1mMEDTA，pH8.0)在室溫下預(yù)處理6G分鐘。隨即類似實施例1(A)進行體外裂解分析。測試物各涉及IOW的體積，且包含各50-100ng未標記的TcdB1(M63，100MMIP6和10mMTris-HClPH8.5。將這些測試物在緊接著溫育(室溫下l小時)之后進行SDS-PAGE(10%)，隨即借助鋅染色使毒素和毒素片段可見。圖2顯示這些實驗的結(jié)果TcdB，3單獨與IP6進行溫育后(泳道3)在63kDa的分子量區(qū)域顯示明顯清晰的條帶。如果將毒素事先用EPNP預(yù)處理后(泳道2),典型的63kDa條帶僅微弱地顯示。該發(fā)現(xiàn)說明，通過添加EPNP幾乎完全抑制了TcdB廳3的蛋白水解活性(蛋白酶活性)。此外，用EPNP預(yù)處理的毒素將根據(jù)Moos等人(2000)的CHO試驗測試其殘余活性(細胞毒作用)。CHO試驗將如下進行將CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)播種于96孔的微量滴定板中(5000細胞/孔)并在標準條件下(5%C02，37°C，用2mM的L-谷氨酰胺補充DMEMF12，5%FCS)溫育16小時。隨即向細胞中加入在生長培養(yǎng)基中逐級稀釋后的毒素。測試10°至10—8之間的稀釋級。將細胞在標準條件下溫育3小時。隨即通過拍攝孔的多個代表性截面并且計數(shù)展開的(ausgestreckt)、以及變圓的細胞的方式，用顯微鏡測定變圓(abgerundet)的細胞的份額(參見Moos等人，MethEnzymol.2000，325:114-125。在此明確引用該出版物的內(nèi)容)。該CHO試驗的結(jié)果表明，所述經(jīng)EPNP預(yù)處理的TcdB腦3相比未經(jīng)處理的TcdB簡3具有明顯較弱的細胞毒活性(見表2)。因為EPNP的抑制作用已知基于，EPNP與催化性天冬氨酸殘基發(fā)生共價的相互作用并經(jīng)此導(dǎo)致蛋白酶的不可逆的滅活(Salto等人1994)，上述實驗的結(jié)果表明，TcdB,3的活性抑制基于毒素分子的蛋白酶活性的抑制。在此所描述實驗用EPNP證明，TcdB腦3和其它LCT的毒性作用通過用適宜的蛋白酶抑制劑的預(yù)處理而明顯降低。EPNP表現(xiàn)為LCT類的共價抑制劑的模式物質(zhì)(Mode11stubstanz)。知的或由他們用已知方法，例如用已經(jīng)描述的"高通量分析"獲得。10463實施例3:通過用IP6細胞外激活蛋白酶活性，從而使TcdB的細胞毒作用滅活將TcdB腦3如實施例1(C)所述與100MMIP6溫育。緊接著溫育之后，通過將測試物經(jīng)Microcon-小管(Mi11ipore，孔尺寸為100kD)提純的方式，將通過蛋白酶活性切下的小的、毒素蛋白的63kDa片段分離。這種TcdB腦3的63kDa片段隨即在實施例2中所描述的根據(jù)Moos等人(2000)的CHO試驗以研究細胞的變圓。其中向細胞中加入未稀釋和不同稀釋級的蛋白質(zhì)。該實驗表明，具有TcdBw"的糖基轉(zhuǎn)移酶功能的63kDa片段，在所給定的條件下，不能單獨引起細胞毒作用。在稀釋和未稀釋的情況下都不能觀察到細胞變圓(因Rho亞族的特異性GTPase的糖基化而引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程阻斷，并從而引起細胞骨架解聚)。該發(fā)現(xiàn)，即所述借助自催化產(chǎn)生的毒素片段是細胞外失活的，證明了Pfeifer等人(2003)和Rupnik等人U005)的結(jié)果，其顯示，已切離的TcdB10463的催化性結(jié)構(gòu)域不能進入真核細胞并因而在細胞培養(yǎng)基中失活。(而在該工作中明顯排除LCT的自催化活性[Pfeiffer等人，2003]，或推斷通過細胞蛋白酶激活LCTs[Rupnik等人，2005]，所述與本發(fā)明相關(guān)地獲得的試驗結(jié)果第一次表明，N-末端的毒素片段自催化切離。)TcdB,3和其它LCTs的毒性作用可以因此通過在毒素進入細胞前誘導(dǎo)毒素的溶蛋白性裂解而抑制。實施例4:TcdB蛋白酶活性中心的證明將經(jīng)EPNP滅活(參見實施例2)和未經(jīng)處理的TcdB10463借助SDS-凝膠分離并用鋅染色顯示。隨即切割相應(yīng)于蛋白質(zhì)的條帶并破碎成小塊。將其脫色并干燥，隨即在2mMDTT中還原并用20mM乙酰胺碘烷基化。在洗滌和重新干燥凝膠片段后，將其用胰蛋白酶在37。C下過夜消化。所獲得的肽鍵隨即通過HPLC分離(NanoAcquity高效液相色語法，Waters,Milford，USA)。為此將樣品加載到在2%的流動相B緩沖液(于乙腈中的0.1%的蟻酸)中的反相柱上(NanoEase，BEHC18(75x10cm),Waters,Milford，USA)。流動相A緩沖液包含于水中的0.1%的蟻酸。隨即將所述片段通過梯度為3-40%的流動相B緩沖液(90分鐘，300nl/min)從該柱中洗脫。將經(jīng)洗脫的片段隨即進行質(zhì)傳研究。為此使用Waters公司的Q-TofPremier質(zhì)語儀。該儀器用[Glu-1]-纖維蛋白原肽溶液(500fmol/pl于300nl/min)通過NanoLockSpay-Quelle(Waters)的參考噴霧劑(Referenz—Sprayer)校準。<吏用MassLnyx4.1軟件(Waters)用于結(jié)果的分析。結(jié)果的分析表明，未處理的TcdB與經(jīng)EPNP處理的毒素僅在一個典型片段有區(qū)別(附圖3)。該片段包括根據(jù)TcdB氨基酸序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)的TcdB蛋白的氨基酸AS1653至AS1678，其具有于位置1665處的天冬氨酸蛋白酶特征性DXG基序。TcdB催化中心的氨基酸序列AS1653至AS1678與毒素TcdA，TcsL和Tcnoc的對應(yīng)的催化中心和蛋白區(qū)域的對比顯示，該區(qū)域是高度保守的(參見表3)。本領(lǐng)域技術(shù)人員因此可以用已知方法產(chǎn)生抗體或其它蛋白，其特異性地與毒素的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的活性中心相互作用，并由此例如阻止LCTs的自催化性裂解。同樣好的是也可產(chǎn)生不直接阻斷活性中心而是靶向相鄰區(qū)域并由此空間阻礙毒素的自催化溶蛋白裂解的抗體或蛋白。實施例5:由于經(jīng)滅活的TcdB的免疫作用通過抗體抑制TcdB作用為了誘導(dǎo)出對抗TcdB細胞毒效應(yīng)的保護，制備以下TcdB制劑并18在家兔中用于免疫制劑A:用甲醛滅活的TcdB制劑B:用EPNP滅活的TcdB(參見實施例2)制劑C:TcdB片段AS1601至AS1716(DSG基序)制劑D:TcdB片段AS1508至AS1601(肌苷結(jié)合性基序的一部分)制劑E:TcdB片段AS1508至AS2157(DSG基序和全部肌苷結(jié)合性基序)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法在質(zhì)粒pET-19(Novagen)中表達TcdB片段并通過綴附的His-Tag進行純化。隨即將His-Tag借助腸激酶消化而切除。蛋白純度將在SDS凝膠中檢驗(數(shù)據(jù)未展示)。為進行免疫，首先用抗原將家兔進行基礎(chǔ)免疫并隨后進行多次強化免疫。最終由家兔血液中獲得多克隆的抗血清。為檢驗多克隆抗血清的中和作用，首先將TcdB用多克隆抗血清預(yù)處理(稀釋級1:100)并在室溫下溫育1小時。隨即依據(jù)CHO試驗如在實施例2中所述檢測抗血清的中和作用。血清的中和作用的標準是，使細胞免受TcdB的細胞毒作用的保護有多長時間。用制劑A免疫的家兔只顯示微量的抗體滴度(參見表4)，而且該家兔的血清不起中和作用。該發(fā)現(xiàn)符合本領(lǐng)域技術(shù)人員已知于用甲醛處理的LCT的免疫實驗的結(jié)果。用制劑B免疫的動物，雖然形成明顯的滴度(可稀釋至1:1500)，然而該抗血清在CHO試驗中也不顯示中和作用(表4)。用制劑C至E免疫的家兔，同樣顯示抗體滴度，而且它們的多克隆血清在CHO試驗中顯示出明顯的中和作用(表4)。通過用制劑E免疫產(chǎn)生的多克隆血清，在此顯示出最強的中和性特性。通過用制劑C和D分開免疫而產(chǎn)生的血清，顯示出相對較低的中和作用。用含有部分肌醇結(jié)合性區(qū)域的D片段的成功免疫證明，LCT的該截段涉及對于激活毒素重要的區(qū)域。IP6在該毒素截段的結(jié)合導(dǎo)致自催化性蛋白酶活性的激活，并由此導(dǎo)致LCT的激活。涉及DSG基序的區(qū)域的中和作用證明，乾向蛋白酶活性中心的抗體能夠抑制蛋白水解活性。用這樣的抗體還能夠在體內(nèi)形成對LCT的毒性效應(yīng)的保護。在用制劑E進行免疫的情形下只是將所述成功的制劑C和D的這兩種片段一起使用。用這兩種TcdB片段的成功免疫基于，在動物體內(nèi)誘導(dǎo)了抗體，其既靶向蛋白酶活性中心，又是結(jié)合磷酸肌醇結(jié)合性區(qū)域的這樣的抗體?？寡宓淖饔糜纱嘶?，第一次能夠誘導(dǎo)針對性地阻止毒素激活的特異性抗體。毒素的自催化性裂解對于LCT在其宿主細胞中的自然攝入是重要的，因為只有這樣所述N末端，作為真正的毒性活性的介導(dǎo)性片段才能釋放入宿主細胞。在天冬氨酸蛋白酶和磷酸肌醇結(jié)合位點的DSG基序的環(huán)境下，特異性抗體的結(jié)合阻止了毒素的自催化性裂解。由此在患者中可通過使用對LCT的自催化性裂解必要的毒素片段，達到針對LCT的有效免疫。文獻A咖bel,F.M.etal,:"CurrentProtocolsinMolecularBiology"(2003),JohnWileyandSons,Inc.Rupniketal.(2005)"CharacterizationofthecleavagesiteandftinctionofresultingcleavagefragmentsafterlimitedproteolysisofCVoWcA'"/wd砂d/etoxinB(TcdB)byhostcells."M歸i'o/151，199-208.Moosal.(2000)"PurificationandevaluationoflargeClostridia!cytotoxinsthatinhibitsmallGTPasesofRhoandRassubfamilies"MethEnzymol.325:114-125.Pfeiferetal,(2003)"CelluiarUptakeofClostridiumdifficiletoxinsB"丄Biol.Chem.278:44535-41.Raoetal.(1998)"Molecularandbiotechnologicalaspectsofmicrobialproteases"Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:597-635.Saltoetal.(1994)"InvitrocharacterizationofnonpeptideirreversibleinhibitorsofHIVproteases",J.Biol.Chem.269:10691-8.Tang(1971)"Specificandirreversibleinactivationofpepsinbysubstrate-HkeEpoxides",J.Biol.Chem.246:4510-17.21表1:在加入給定的磷酸肌醇下的TcdB,3的自催化性裂解。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表2:與TcdB腦3孵化后的CHO-細胞的細胞變圓(以％)-經(jīng)EPNP或者未經(jīng)EPNP-預(yù)處理稀釋3小時后變圓的細胞(以％)TcdB-10463TcdB-10463+EPNPIO一3100%100%10"100%100%10-5100%50%10—6100%10%l(T10%<5%l(T8>5%<5%表3:TcdB的蛋白酶功能的催化中心的氨基酸序列AS1653至AS1678與毒素TcdA、TcsL和Tcnoc相對應(yīng)的催化中心和蛋白質(zhì)區(qū)域的比較毒素同族序列范圍TcdB-104631653-Q麗IVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQ-1678TcdA-104631649-RNVVVEPIYNPDTGEDISTSL-DFSY-1675TcsL1654-QNLIVEPSYHLDDSGNISSTVINFSQ-1679丁cna1638-CNVIVSGSNKLNSEGDLADT-IDVLD-1663表4:與用多克隆抗血清預(yù)處理的TcdB溫育后CHO-細胞的細胞變圓的開始時間(以h計)_制劑抗體滴度在…之后開始細胞變圓A1:1001.5hB1:15003hC1:75012-15hD1:5009-12hE1:1000>24h2權(quán)利要求1.用于預(yù)防或減輕LCT(＝大梭菌細胞毒素)中毒的藥物，其特征在于，作為活性物質(zhì)，含有至少一種效應(yīng)劑，即LCT(大梭菌細胞毒素)的蛋白酶活性的抑制劑或激活劑。2.根據(jù)權(quán)利要求l的藥物，其特征在于，所述活性物質(zhì)是效應(yīng)劑，即艱難梭菌毒素A(TcdA)和/或艱難梭菌毒素B(TcdB)和/或索氏梭菌致死毒素(TcsL)和/或諾氏梭菌a毒素(Tcnoc)的蛋白酶活性的抑制劑或激活劑。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述抑制劑是1，2-環(huán)氧-3-(對-硝基苯氧基)-丙烷(EPNP)。4.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物，其特征在于，所述激活劑是磷酸肌醇，特別是肌醇六磷酸(IP6)。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述效應(yīng)劑是磷酸肌醇的竟爭抑制性結(jié)構(gòu)類似物，特別是與肌醇六磷酸(IP6)竟爭。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述激活劑是類似IP6地促進LCT的(自催化性)蛋白酶活性，特別是促進TcdA和/或TcdB和/或TcsL和/或Tcncc的(自催化性)蛋白酶活性的物質(zhì)。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述效應(yīng)劑是適用于降低哺乳動物，特別是人類的腸腔內(nèi)的磷酸肌醇濃度的化學(xué)物質(zhì)。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述效應(yīng)劑是適用于降低哺乳動物細胞內(nèi)，特別是人類細胞內(nèi)的磷酸肌醇濃度的化學(xué)物質(zhì)o9.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述抑制劑是與蛋白酶活性中心相互作用的化學(xué)物質(zhì)，特別是蛋白，尤其特別是抗體，該活性中心根據(jù)TcdB氨基酸序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)在AS1500至AS1800的TcdB蛋白區(qū)域中。10.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述抑制劑是與根據(jù)TcdB氨基酸序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)的AS1653至AS1678的TcdB蛋白區(qū)域相互作用的化學(xué)物質(zhì)，特別是蛋白，尤其特別是抗體。11.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述抑制劑是與根據(jù)TcdB氨基酸序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)的位于TcdB蛋白的氨基酸位置AS1665處的DXG基序相互作用的化學(xué)物質(zhì)，特別是蛋白，尤其特別是抗體。12.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述抑制劑是與根據(jù)TcdA氨基酸序列號P16154(SwissProt/TrEMBL)的AS1651至AS1675的TcdA蛋白區(qū)域相互作用的化學(xué)物質(zhì)，特別是蛋白，尤其特別是抗體。13.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述抑制劑是與根據(jù)TcdA氨基酸序列號P16154(SwissProt/TrEMBL)的位于TcdA蛋白的氨基酸位置AS1662處的DXG基序相互作用的化學(xué)物質(zhì)，特別是蛋白，尤其特別是抗體。14.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述抑制劑是與根據(jù)TcsL氨基酸序列號Q46342(SwissProt/TrEMBL)的AS1654至AS1679的TcsL蛋白區(qū)域相互作用的化學(xué)物質(zhì)，特別是蛋白，尤其特別是抗體。15.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述抑制劑是與根據(jù)TcsL氨基酸序列號Q46342(SwissProt/TrEMBL)的位于TcsL蛋白的氨基酸位置AS1666處的DXG基序相互作用的化學(xué)物質(zhì)，特別是蛋白，尤其特別是抗體。16.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述抑制劑是與根據(jù)Tcnot氨基酸序列號Q46149(SwissProt/TrEMBL)的AS1641至AS1665的Tcnoc蛋白區(qū)域相互作用的化學(xué)物質(zhì)，特別是蛋白，尤其特別是抗體。17.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述抑制劑是與根據(jù)TcdB氨基酸序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)的AS1400至AS2300的TcdB蛋白區(qū)域，或者與與此等同或同源的TcdA或TcsL或Tcnot的蛋白區(qū)域相互作用的化學(xué)物質(zhì)，特別是蛋白，尤其特別是抗體。18.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述抑制劑是與根據(jù)TcdB氨基酸序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)的AS1517至AS2142的TcdB蛋白區(qū)域，或者與與此等同或同源的TcdA或TcsL或Tena的蛋白區(qū)域相互作用的化學(xué)物質(zhì)，特別是蛋白，尤其特別是抗體。19.根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其特征在于，所述抑制劑是與才艮據(jù)TcdB氨基酸序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)的AS1517至AS1593或者AS1918至AS2142的TcdB蛋白區(qū)域，或者是與此等同或同源的TcdA或TcsL或Tenet的蛋白區(qū)域相互作用的化學(xué)物質(zhì)，特別是蛋白，尤其特別是抗體。20.用于預(yù)防或減輕大梭菌細胞毒素(LCT)中毒的藥物，其特征在于，該藥物(1)是適用于作為疫苗施用的，且(2)作為抗原性活性物質(zhì)-(a)含有TcdB氨基酸序列號P18177(SwissProt/TrEMBL)的那些TcdB蛋白片段，至少包括位置1665上的DXG基序，優(yōu)選氨基酸位置AS1653至AS1678的氨基酸序列，特別優(yōu)選氨基酸位置AS1500至AS1800的氨基酸序列，-和/或(b)含有TcdA氨基酸序列號P16154(SwissProt/TrEMBL)的那些TcdA蛋白片段，至少包括1662位置處的DXG基序，優(yōu)選氨基酸位置AS1651至AS1675的氨基酸序列，-和/或(c)含有TcsL氨基酸序列號Q46342(SwissProt/TrEMBL)的那些TcsL蛋白片段，至少包括1666位置處的DXG基序，優(yōu)選氨基酸位置AS1654至AS1679的氨基酸序列，-和/或(d)含有Tcnoc氨基酸序列號Q46149(SwissProt/TrEMBL)的那些Tcnoc蛋白片段，至少包括氨基酸位置AS1641至AS1665的氨基酸序列。全文摘要用于預(yù)防或減輕大梭菌細胞毒素(LCT)中毒的藥物，特別是艱難梭菌毒素A和B(TcdA和TcdB)，其特征在于，作為活性物質(zhì)，至少含有一種效應(yīng)劑，即LCT(大梭菌細胞毒素)自催化性蛋白酶活性的抑制劑或激活劑。文檔編號A61K31/661GK101516359SQ200780035763公開日2009年8月26日申請日期2007年5月26日優(yōu)先權(quán)日2006年8月2日發(fā)明者C·馮埃歇爾斯特雷伯,H·希爾德,J·雷尼克,M·魯普尼克,S·藤澤申請人:美因茨約翰內(nèi)斯古藤貝格大學(xué)