專利名稱：卵巢顆粒細(xì)胞抗衰老制品、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及卵巢顆粒細(xì)胞抗衰老制品、其制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
卵巢的主要功能是排卵和分泌女性激素，在女性一生中掌控著幾件重要的生理事件青 春發(fā)育、生兒育女、良好身材和美麗容顏的維持，其中卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)揮了極其重要的作用。 隨著年齡增長，女性的卵巢功能在45-50歲左右時開始衰退，有些女性因為環(huán)境、心理或病 理的因素發(fā)生卵巢早衰，隨后出現(xiàn)一系列更年期癥狀，例如月經(jīng)紊亂或絕經(jīng)，情緒變化，肌 肉松弛、彈性降低、沒有光澤，繼而衰老加速，身體免疫功能發(fā)生改變，心血管疾病、骨質(zhì) 疏松、生殖系統(tǒng)腫瘤和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率上升等，這一系列問題嚴(yán)重影響了女性的生 活質(zhì)量。因此，抗衰老或延緩衰老就成了眾多女性追求的目標(biāo)。針對卵巢功能衰退傳統(tǒng)的治療方法就是激素替代治療(HRT)，雖然雌激素單獨或雌孕 激素聯(lián)合應(yīng)用可以改善女性更年期癥狀，預(yù)防骨質(zhì)疏松等疾病的發(fā)生，改善生活質(zhì)量，但是 HRT的弊端也是不容忽視的。HRT巳經(jīng)證實的副作用有撤退性出血，增加卒中、血栓形成 和栓塞的風(fēng)險，引起水鈉儲留導(dǎo)致體重增加，對于HRT引起子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的觀點還 存在爭議。權(quán)衡利弊，美國FDA和歐洲EMEA都對HRT做出了嚴(yán)格的限定。顆粒細(xì)胞移植治療雖然從理論上可行，但是組織相容性問題、移植部位、細(xì)胞活性及功 能、可操作性等問題限制了其臨床應(yīng)用，國內(nèi)外僅有個例報道，效果還不明確。在護(hù)膚品中添加雌激素或其類似物解決更年期女性出現(xiàn)的皮膚問題，早已有產(chǎn)品問世， 深得女性喜愛。但是這些添加劑均采用人工合成的雌、孕激素或從植物提取的雌激素類似物， 有效成分比較單一，與生理狀態(tài)差距較大，不能很好模擬生理狀態(tài)，效果并不理想，有些甚 至有較大的副作用。因此在皮膚抗衰老方面的作用也是十分有限的。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題，提供一種卵巢顆粒細(xì)胞抗衰老制品、其制備 方法及其用途，針對卵巢功能減退是女性衰老的根本原因，利用卵巢功能的主要行使者顆粒 細(xì)胞能夠在體外大量增殖、分泌多種生物活性物質(zhì)，采用近乎女性生理的生物利用度極高的 顆粒細(xì)胞培養(yǎng)上清及其細(xì)胞提取物，通過口服、皮膚吸收及陰道栓劑多途徑達(dá)到抗衰老之目 的。本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明卵巢顆粒細(xì)胞抗衰老制品，其特點是含有體外培養(yǎng)擴增的雌性哺乳類動物卵巢顆 粒細(xì)胞的培養(yǎng)上清和/或細(xì)胞提取物，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的藥用賦形劑和抗氧化 劑。卵巢顆粒細(xì)胞抗衰老制品，其特點是所述制品為口服制劑、表皮涂抹的膏劑、液體制劑 或陰道栓劑。本發(fā)明卵巢顆粒細(xì)胞抗衰老制品的制備方法，其特點是將體外培養(yǎng)擴增的雌性哺乳類動 物卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)上清和/或細(xì)胞提取物收集、濃縮，添加賦形劑、抗氧化劑。 本發(fā)明卵巢顆粒細(xì)胞抗衰老制品的制備方法，其特點是按如下歩驟操作a、 獲取卵巢顆粒細(xì)胞無菌條件下取出哺乳動物的卵巢顆粒細(xì)胞，400IU/ml透明質(zhì)酸酶消化顆粒細(xì)胞3 5分 鐘，吸管反復(fù)吹打消化后顆粒細(xì)胞10 15次，使其分散成單個細(xì)胞并經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾， 離心洗滌濾過的顆粒細(xì)胞兩次；b、 獲取卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞提取物采用含體積比為10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，步驟a所獲取的顆粒細(xì)胞用所 述培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2xl0"ml接種培養(yǎng)瓶，37°C、體積比為5%的(:02條件下培 養(yǎng)6小時后用所述培養(yǎng)基換液一次，去除死細(xì)胞及組織碎片，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞90%融合再用 所述培養(yǎng)基換液一次；48小時后收集顆粒細(xì)胞培養(yǎng)上清；重量體積比為0.25%的胰蛋白酶消 化貼壁顆粒細(xì)胞，離心洗漆消化脫落的顆粒細(xì)胞兩次，加入細(xì)胞裂解液裂解顆粒細(xì)胞，離心 收集上清；或利用傳2_6代或凍存復(fù)蘇的顆粒細(xì)胞按照前述方法獲取上清；c、 純化對步驟b所獲得的上清利用柱層析和生物半透膜進(jìn)行純化、濃縮，以雌二醇的濃度為標(biāo) 準(zhǔn)，調(diào)整其含量為200pg/ml，同時加入終濃度為200IU/ml的維生素E。 本發(fā)明卵巢顆粒細(xì)胞在制備抗衰老制品中進(jìn)行應(yīng)用。本發(fā)明卵巢顆粒細(xì)胞在制備抗衰老制品中進(jìn)行應(yīng)用，其特點是將體外培養(yǎng)擴增的雌性哺 乳類動物卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)上清和/或細(xì)胞提取物在制備抗衰老制品中應(yīng)用。卵巢功能的主要行使者一顆粒細(xì)胞，除了分泌雌激素、孕激素等類固醇激素以外，還分 泌多種生長因子如胰島素樣生長因子I (IGF-I)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子 (TGF)等，以及一些尚未發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)。本發(fā)明通過體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞同樣可以 分泌這些物質(zhì)，收集、濃縮的培養(yǎng)上清和細(xì)胞提取物完全近乎人的生理狀態(tài)，通過口服、皮 膚吸收以及陰道栓劑應(yīng)用于人體生物利用度非常高。該制劑添加到護(hù)膚品中經(jīng)皮膚吸收，通 過細(xì)胞表面受體加快新陳代謝，促進(jìn)細(xì)胞更新，加速自由基的清除，從而延緩皮膚衰老。陰 道栓劑營養(yǎng)泌尿生殖道粘膜上皮，可以改善局部因激素水平下降導(dǎo)致的更年期改變。另外， 局部應(yīng)用或聯(lián)合口服，相當(dāng)于再續(xù)卵巢功能，對更年期的全身癥狀也有不同程度的改善作用。 由于卵巢顆粒細(xì)胞還可以分泌一類親水性的非類固醇物質(zhì)，即抑制素(INH)、激活素 (ACT)和卵泡抑素(FS),簡稱為INH - ACT - FS系統(tǒng)，其中INH可以抑制纖維蛋白溶酶原 激活因子(PA)的活性，延緩卵泡的閉鎖，已被很多學(xué)者定為判定卵巢功能的敏感指標(biāo)之 一。本發(fā)明利用顆粒細(xì)胞培養(yǎng)上清及其提取物不但可以部分替代卵巢功能，而且還可以延長 卵巢的"服役"時間，為女性留住青春和美麗提供了新途徑。 與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在1、 卵巢顆粒細(xì)胞是卵巢功能的主要行使者，體外培養(yǎng)能夠分泌雌激素、孕激素、卵泡 刺激素和黃體生成素等激素物質(zhì)，IGF、 EGF、 TGF、 INH、 ACT、 FS等多種生物活性物質(zhì)， 接近在體卵巢的內(nèi)分泌功能。2、 各種生物成分接近生理狀態(tài)，生物利用度高。3、 來源方便，多途徑應(yīng)用，沒有任何毒副作用。4、 不但可在體外替代卵巢部分功能，而且可以激發(fā)卵巢潛能，延緩卵巢功能衰退。因 此，在緩解女性更年期癥狀、抗衰老、美容、保健等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。


圖l為各組小鼠使用本發(fā)明顆粒細(xì)胞制劑灌胃2個月后肝臟內(nèi)自然殺傷細(xì)胞(NK)的 數(shù)量變化。其中圖1A為成年鼠、圖1B為去勢鼠、圖IC為老年鼠。 以下通過具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一歩描述。
具體實施方式
1、 獲取卵巢顆粒細(xì)胞取4-6周齡雌性昆明種小鼠腹腔注射孕馬血清(PMSG) 7.5U/ 只，常規(guī)飼養(yǎng)48小時后頸椎脫臼處死，無菌條件下取出雙側(cè)卵巢，置于盛有4'C預(yù)冷的平 衡鹽溶液(BSS，含400IU/ml透明質(zhì)酸酶，100U/ml青、鏈霉素)的培養(yǎng)皿中，在體視顯微 鏡下用28G注射針頭刺破卵泡，顆粒細(xì)胞釋放入BSS中；吸管反復(fù)吹打數(shù)次，使其分散成 單個細(xì)胞并經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，離心洗滌細(xì)胞兩次。2、 顆粒細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞提取物的獲取含體積比為10。/。的胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸顆粒細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2xlO"ml接種培養(yǎng)瓶，37°C、體積比為5。/。C02條件 下培養(yǎng)6小時后第一次換液，去除死細(xì)胞及組織碎片，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞90%融合再換液一次。 48小時后收集顆粒細(xì)胞培養(yǎng)上清；重量體積比為0.25%胰蛋白酶消化、收獲顆粒細(xì)胞，離心 洗滌兩次，加入細(xì)胞裂解液裂解顆粒細(xì)胞，12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘收集上清；或利用傳2 一6代或凍存復(fù)蘇的顆粒細(xì)胞按照前述方法獲取上清。3、 調(diào)制顆粒細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞提取物通過層析柱、生物半透膜，除去高豐度的胎
牛血清成份、各種離子及鹽類和多余的水分，將顆粒細(xì)胞分泌的有效成分進(jìn)行純化、濃縮。a、 口服液以雌二醇含量計，調(diào)整其濃度至200pg/ml,同時加入VitE至終濃度為 200IU/ml;b、 膏劑按重量組分計算，收集的濃縮純化液0.1-3、 VitE0.5-l、凡士林5、硬脂酸15、 丙三醇5、蒸餾水70，采用膠體磨勻質(zhì)制成膏狀，使雌二醇和VitE終濃度分別為5嗎/mg和 5IU/mg:c、 液體制劑按重量組分計算，收集的濃縮純化液0.1-3、 VitE0.5-l、丙三醇10、 1， 3-丁二醇5、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯1、蒸餾水78，采用膠體磨勻質(zhì)制成液態(tài)皮膚 涂抹用品，其中雌二醇和VitE終濃度分別為5pg/mg和5IU/mg;d、 陰道栓劑按重量組分計算，將丙三醇70、明膠20、蒸餾水7加熱配制基質(zhì)，待基 質(zhì)冷至55 6(TC加入濃縮純化液0.1-3和VitE0.5-l —起恒溫攪拌混合30分鐘，將混合物注 入栓劑成型模具中制成陰道栓劑，每粒栓劑含雌二醇和VitE分別為200叫和200 IU。e、 用法及用量所有劑型每天用量折算成雌二醇的量為200pg/天，即口服液每天口服 lml，膏劑和液體制劑的皮膚涂抹用品每天臉部和手部皮膚涂抹40mg，陰道栓劑每晚塞1 粒于陰道后穹窿部。4、 動物試驗a、 小鼠去勢6-8周雌性昆明種小鼠30只，手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，繼續(xù)詞養(yǎng)一個月，陰 道脫落細(xì)胞檢測小鼠動情周期消失，外周血雌、孕激素水平較去勢前明顯降低，即小鼠去勢 成功。選取20周齡雌性昆明種小鼠30只，作為老齡組。b、 口服組成年鼠(對照)、去勢鼠和老齡鼠各10只，每天用調(diào)制的口服液灌胃一次， 每次lml (以雌二醇含量計200嗎/天)，連續(xù)2個月；c、 皮膚涂抹組成年鼠(對照)、去勢鼠和老齡鼠各20只，先用20%硫化鈉脫去小鼠 背部皮膚的毛，面積為lX2cra、用調(diào)制的膏劑或液體劑型涂抹皮膚，每天兩次，以雌二醇 劑量計達(dá)到200陶/天，連續(xù)使用2個月。d、 陰道栓劑組6個月一1歲昆明種大耳白兔6只，3只按照前述方法去勢作為去勢組， 3只作為正常對照組；6 — 7歲齡昆明種大耳白兔3只，作為老齡組。兔子每晚陰道塞入一粒 栓劑，空腹過夜，連續(xù)使用2個月。5、 效果觀察去勢鼠/兔和老年鼠/兔外周血雌、孕激素水平有所上升，陰道恢復(fù)分泌功 能，免疫功能也較使用前有所增強。部分結(jié)果參見表l和圖l。表l各組小鼠使用顆粒細(xì)胞制劑灌胃2個月后體內(nèi)雌、孕激素水平變化 組別 -E2 P E2 P成年鼠70. 59±8. 952. 62±0. 97 69. 74±9. 16 2. 69±0. 91去勢鼠10. 34±2. 820.58±0. 1342. 67±6. 23* 0.69±0, 14老年鼠35.26±3. 15 1.07±0,3257.86±9.22* 1.53±0.36**與使用前比較/ <0. 05表l中，去勢鼠和老年鼠體內(nèi)的雌、孕激素水平與成年鼠相比均處于較低的水平；使用 口服型顆粒細(xì)胞制劑灌胃2個月以后，去勢鼠和老年鼠體內(nèi)的雌、孕激素水平較使用前明顯 上升(去勢鼠孕激素水平使用前后變化不明顯)，盡管仍然低于成年鼠，兩種鼠的一些癥狀 得到改善。圖1中，自然殺傷細(xì)胞(NK)是一種天然免疫細(xì)胞，無需抗原預(yù)先刺激就可以直接殺 傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染的靶細(xì)胞，在機體免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過程中發(fā)揮重要作用。 卵巢功能衰退或喪失的老鼠(老年鼠和去勢鼠)肝臟內(nèi)NK細(xì)胞數(shù)量較正常成年鼠明顯降低； 使用口服型顆粒細(xì)胞制劑灌胃2個月以后，老年鼠和去勢鼠肝內(nèi)NK數(shù)量均有明顯上升，正 常成年鼠肝內(nèi)NK數(shù)量變化不明顯。
權(quán)利要求
1、卵巢顆粒細(xì)胞抗衰老制品，其特征是含有體外培養(yǎng)擴增的雌性哺乳類動物卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)上清和/或細(xì)胞提取物，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的藥用賦形劑和抗氧化劑。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的卵巢顆粒細(xì)胞抗衰老制品，其特征是所述制品為口服制劑、 表皮涂抹的膏劑、液體制劑或陰道栓劑。
3、 卵巢顆粒細(xì)胞抗衰老制品的制備方法，其特征是將體外培養(yǎng)擴增的雌性哺乳類動物 卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)上清和/或細(xì)胞提取物收集、濃縮，添加賦形劑和抗氧化劑。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的卵巢顆粒細(xì)胞抗衰老制品的制備方法，其特征是按如下步驟 操作a、 獲取卵巢顆粒細(xì)胞無菌條件下取出哺乳動物的卵巢顆粒細(xì)胞，400IU/ml透明質(zhì)酸酶消化顆粒細(xì)胞3 5分 鐘，吸管反復(fù)吹打消化后顆粒細(xì)胞10 15次，使其分散成單個細(xì)胞并經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾， 離心洗滌濾過的顆粒細(xì)胞兩次；b、 獲取卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞提取物采用含體積比為10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，步驟a所獲取的顆粒細(xì)胞用所 述培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2xl()S/ml接種培養(yǎng)瓶，37°C、體積比為5%的C02條件下培 養(yǎng)6小時后用所述培養(yǎng)基換液一次，去除死細(xì)胞及組織碎片，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞90%融合再用 所述培養(yǎng)基換液一次；48小時后收集顆粒細(xì)胞培養(yǎng)上清；重量體積比為0.25%的胰蛋白酶消 化貼壁顆粒細(xì)胞，離心洗滌消化脫落的顆粒細(xì)胞兩次，加入細(xì)胞裂解液裂解顆粒細(xì)胞，離心 收集上清；或利用傳2 — 6代或凍存復(fù)蘇的顆粒細(xì)胞按照前述方法獲取上清；c、 純化對步驟b所獲得的上清利用柱層析和生物半透膜進(jìn)行純化、濃縮，以雌二醇的濃度為標(biāo) 準(zhǔn)，調(diào)整其含量為200tig/ml，同時加入終濃度為200IU/ml的維生素E。
5、 卵巢顆粒細(xì)胞在制備抗衰老制品中的應(yīng)用。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的卵巢顆粒細(xì)胞在制備抗衰老制品中的應(yīng)用，其特征是將體外 培養(yǎng)擴增的雌性哺乳類動物卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)上清和/或細(xì)胞提取物在制備抗衰老制品中 應(yīng)用。
全文摘要
卵巢顆粒細(xì)胞抗衰老制品、其制備方法及其用途，本發(fā)明將卵巢顆粒細(xì)胞在制備抗衰老制品中進(jìn)行應(yīng)用，本發(fā)明卵巢顆粒細(xì)胞抗衰老制品的特征是含有體外培養(yǎng)擴增的雌性哺乳類動物卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)上清和/或細(xì)胞提取物，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的藥用賦形劑和抗氧化劑。本發(fā)明利用卵巢顆粒細(xì)胞能夠在體外大量增殖、分泌多種生物活性物質(zhì)，采用近乎女性生理的生物利用度極高的顆粒細(xì)胞培養(yǎng)上清及其細(xì)胞提取物，通過口服、皮膚吸收及陰道栓劑多途徑達(dá)到抗衰老之目的。
文檔編號A61K35/54GK101152215SQ20071013253
公開日2008年4月2日 申請日期2007年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月19日
發(fā)明者馮定慶, 斌 凌, 穎 周, 程 彭, 朱園園, 沈國棟 申請人:安徽省立醫(yī)院