專利名稱：：一種在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞特異表達(dá)標(biāo)記基因和治療基因的慢病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組慢病毒基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。結(jié)合端粒酶基因啟動(dòng)子的腫瘤特異啟動(dòng)功能，用慢病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)在體外研究腫瘤的發(fā)生和發(fā)治療性藥物；在體內(nèi)實(shí)施腫瘤的示蹤和在體治療。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是目前人類紇康面臨的最大威脅，傳統(tǒng)的惡性腫瘤的治療手段包括手術(shù)，化療.放療等。但對(duì)很多中晚期腫瘤患者，這些傳統(tǒng)治療方法就顯得力不從心，與此同時(shí)生物治療就成為一種必需的手段?；蛑委熓巧镏委煹姆绞街唬瑢⒒蛲ㄟ^載體轉(zhuǎn)入病人體內(nèi)，從而達(dá)到治療和預(yù)防疾病的目的。基因治療的一大關(guān)鍵問題是腫瘤靶向性問題。腫瘤的基因治療是建立在診斷明確，定位明確，精確把握治療范圍和治療程度的基礎(chǔ)上的。腫瘤靶向性活體生物螢光成像技術(shù)在腫瘤的基因診斷和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理過程中有非常寬闊的應(yīng)用前景?；铙w生物螢光成像技術(shù)具有以下幾個(gè)常規(guī)檢測(cè)手段所不具備的優(yōu)點(diǎn)(l)無創(chuàng)份性；(2)可多次重復(fù)在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)；(3)快速掃描成像(時(shí)間少于5min);(4)可以使生物活體整體成像?；铙w生物螢光成像技術(shù)與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物相結(jié)合可以實(shí)時(shí)示蹤許多重要細(xì)胞和分子，特別是腫瘤細(xì)胞、免疫相關(guān)細(xì)胞和介質(zhì)，從而洞悉其在疾病發(fā)生發(fā)展過程中所扮演的角色，為揭示多種疾病病理過程提供了線索。在動(dòng)物模型的病理過程研究中，活體生物螢光成像技術(shù)的無創(chuàng)檢觀'撒告基因表達(dá)這一能力與傳統(tǒng)的將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后再進(jìn)行組織染色、酶活性分析的方法相比有巨大優(yōu)勢(shì)。活體生物螢光成像技術(shù)在實(shí)驗(yàn)中可在同一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)獲得全部時(shí)間點(diǎn)的整體數(shù)據(jù)，可以用極少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而迅速獲得更全面的數(shù)據(jù)，這樣就大大地節(jié)省了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、時(shí)間以及實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。由于能夠?qū)ν粍?dòng)物進(jìn)行連續(xù)檢觀'J這樣就最大程度減少了不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間的W差異以及傳統(tǒng)檢測(cè)方法誤差所造成的對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。更重要的是活體生物螢光成像技術(shù)的敏感性極高，有研究證實(shí)活體生物螢光成像技術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的敏感性甚至超過了流式細(xì)胞儀體外檢測(cè)的敏感性。與其他用于檢測(cè)細(xì)胞游走增殖的標(biāo)記技術(shù)如螢光染料、放射性探針等相比活體生物螢光成像技術(shù)對(duì)標(biāo)靶細(xì)胞無毒副作用，并且也不會(huì)因標(biāo)靶細(xì)胞增殖分裂，信號(hào)稀釋而喪失標(biāo)記作用?；铙w生物螢光成像技術(shù)在腫瘤方面可以應(yīng)用于快速的測(cè)量各種癌癥模型中腫瘤的生長(zhǎng)，并可對(duì)癌癥治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)評(píng)估；可以無創(chuàng)傷地定量檢測(cè)小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。已有研究人員使用螢光素酶和GFP作為報(bào)告子活體成像腫瘤細(xì)胞，并探討了使用這些報(bào)告基因在細(xì)胞分子水平研究腫瘤的前景。而且研究證實(shí)使用活體生物螢光成像技術(shù)獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與MRI成像的結(jié)果能夠達(dá)到91%的一致性，這進(jìn)一步證明活體生物螢光成像技術(shù)在活體分析腫瘤的時(shí)間空間分布方面是一個(gè)極其優(yōu)秀的工具。MRI測(cè)出的腫瘤體積與活體生物螢光成像測(cè)得的腫瘤組織所產(chǎn)生的光子數(shù)呈線性相關(guān)。由于MRI測(cè)得的體積還包括腫瘤周邊的水腫、浸潤(rùn)的細(xì)胞、死亡細(xì)胞的殘骸，而活體生物螢光成像測(cè)得的卻只有具有代謝活力的腫瘤細(xì)胞因此更具研究?jī)r(jià)值?；铙w生物螢光成像技術(shù)最基本的要求是要將外源的顯像基因靶向性導(dǎo)入活體細(xì)胞表達(dá)。因此需要一種高效、安全的基因?qū)胂到y(tǒng)，也即是轉(zhuǎn)基因載體系統(tǒng)。近年來，研究人員提出了癌癥的靶向基因-病毒治療策略(targetinggene-virotherapyofcancer),即將高效安全的病毒轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)和特定的腫瘤選擇元件結(jié)合起來，使外源的顯像基因或治療基因能夠通過病毒載體選擇性的轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞中去，并在其中表達(dá)。癌癥的靶向基因-病毒治療策略,可克服傳統(tǒng)腫瘤基因治療中轉(zhuǎn)染效率低、靶向性差、目的基因表達(dá)量低、殺傷力不夠等缺點(diǎn)，因此，癌癥的靶向基因_病毒治療應(yīng)該會(huì)比過去的基因治療方法效果好很多。靶向基因-病毒治療策略之關(guān)鍵步驟是解決兩個(gè)問題(1)如何選擇高效安全的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，即病毒。(2)如何選擇和實(shí)施基因轉(zhuǎn)移的腫瘤靶向性元件。病毒載體有兩類:一類可以整合到染色體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒；另一類不能整合到染色體,如腺病毒、單純皰疹病毒及EB病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期細(xì)胞，容納外源基因的DNA片段長(zhǎng)度不超過8kb;腺病毒載體感染細(xì)胞時(shí)，病毒DNA游離在細(xì)胞核內(nèi)，并不整合到染色體上，在體內(nèi)不能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的長(zhǎng)期表達(dá)，且反復(fù)應(yīng)用容易引起免疫反應(yīng)。而以人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)來源的慢病毒載體越來越受到人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)慢病毒載體最大的特點(diǎn)是可以感染非分裂期細(xì)胞，人們已成功地應(yīng)用慢病毒載體感染了神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、造血干細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等。此外,慢病毒載#^納外源性目的基因的片段大，可以在體內(nèi)較長(zhǎng)期的表達(dá)，免疫反應(yīng)小，安全性較好。這些優(yōu)點(diǎn)使慢病毒成為基因治療中最理想的載體?；蜣D(zhuǎn)移的腫瘤靶向性一直是腫瘤基因治療的瓶頸問題。多種腫瘤靶點(diǎn)已經(jīng)被逐漸明確的闡述，本發(fā)明使用端粒酶催化亞基啟動(dòng)子作為腫瘤靶點(diǎn)。端粒存在于真核細(xì)胞染色體末端。隨著細(xì)胞的逐次分裂，端粒逐漸變短，約每分裂一次減少50-200個(gè)核苷酸，細(xì)胞分裂至一定次數(shù)，端?？s短至一定程度，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生惡變時(shí)，通過某種機(jī)制端粒酶被激活，使得分裂過程中的細(xì)胞端粒延長(zhǎng)，從而維持染色體的穩(wěn)定，使細(xì)胞逃逸死亡獲得永生，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不斷增殖。因此端粒酶激活在腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。端粒酶在90%腫瘤細(xì)胞中均為陽性，而極大多數(shù)正常細(xì)胞端粒酶均為陰性，因此端粒酶可作為腫瘤細(xì)胞一種特征性標(biāo)記。目前研究證實(shí)，人的端粒酶由三個(gè)部分組成l.RNA組分(hTR),2.端粒酶結(jié)合蛋白(hTP)，3.端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)。由于在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞株中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶高表達(dá)，而在正常細(xì)胞中呈不表達(dá)或低表達(dá)，表明端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子在極大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中具有啟動(dòng)活性。某些文獻(xiàn)也將端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶稱為端粒酶催化亞基。隨著腫瘤的基因治療的發(fā)展，示蹤基因和治療基因的研究已經(jīng)非常深入。多種腫瘤示蹤基因和治療基因早已用于腫瘤的臨床診斷、生物治療和腫瘤藥物開發(fā)?；铙w生物螢光成像技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)嶄新的分子、基因表達(dá)的分析檢測(cè)系統(tǒng).多種生物熒光基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)可以直接或間接的發(fā)出熒光，在體外用特殊的熒光檢測(cè)設(shè)備能夠精確探測(cè)到這種熒光。這些設(shè)備包括CCD照相機(jī)(chargecoupleddevicecamera,CCDcamera)、雙光子激發(fā)顯微鏡(two-photonexcitationmicroscopy)等。研究比較深入的生物熒光蛋白或基因是螢光素酶基因和綠色熒光蛋白基因。螢光素酶基因的表達(dá)產(chǎn)物熒光素酶在ATP存在的前提下可以催化其底物熒光素反應(yīng)并發(fā)出熒光。綠色熒光蛋白(GFP)是Chalfic等從研究維多利亞水母(Aeq魔eaVictoria)發(fā)光現(xiàn)象中分離純化出綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein,GFP)基因，由于其分子量小,蛋白性質(zhì)極為穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，不影響目的基因的表達(dá)及目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,對(duì)細(xì)胞無毒性作用，易于耐受高溫等處理，無光漂白作用，用甲醛固定和石蠟包埋不影響其熒光特性，能夠在異源細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，無須輔助因子或共反應(yīng)因子加入即可在紫外光或藍(lán)光激發(fā)下發(fā)射熒光?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，這兩種熒光報(bào)告基因^T泛用于生物顯像和體內(nèi)示蹤的研究中
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種重組慢病毒，它包含有腫瘤特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的目的外源基因，該目的外源基因是經(jīng)證實(shí)可以對(duì)腫瘤實(shí)施活體顯像和同步治療的基因片段。本發(fā)明所涉及的慢病毒是基于人類免疫缺陷病毒HIV-1改建的，其內(nèi)含有重構(gòu)后的端粒酶基因啟動(dòng)子，并且該病毒的載體質(zhì)粒內(nèi)含有一個(gè)以上外源基因。所述慢病毒可以由三質(zhì)粒系統(tǒng)胞膜質(zhì)粒PMD2G、包裝質(zhì)粒psPAX2和載體質(zhì)粒pLenti-hTERT-eGFP組成；或由四質(zhì)粒系統(tǒng)包胞膜質(zhì)粒pLP/VSVG、裝質(zhì)粒pLPl，pLP2、和載體質(zhì)粒pLenti-hTERT-eGFP組成。上述重構(gòu)后的端粒酶基因啟動(dòng)子是端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因肩動(dòng)子、端粒酶RNA組分啟動(dòng)子其中之一。將上述端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子截取其核心成分，并加入三個(gè)E-box加以改良，得到所述重構(gòu)后的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子SEQIDN0:1。上述病毒的載體質(zhì)粒內(nèi)含的外源基因是一個(gè)標(biāo)記示蹤基因加上一個(gè)腫瘤治療基因、或者僅一上標(biāo)記示蹤基因。上述病毒所攜帶的標(biāo)記示蹤基因取自紅色熒光蛋白R(shí)FP基因、綠色熒光蛋白GFP或eGFP基因、熒光素酶基因及各種核素標(biāo)記基因中的一種；病毒所攜帶的腫瘤治療基因選自前藥轉(zhuǎn)換酶基因、抑癌基因、細(xì)胞凋亡基因和細(xì)胞因子基因其中的一種。上述標(biāo)記示蹤基因和腫瘤治療基因相對(duì)位置可以是以下幾種之一.啟動(dòng)子-示蹤基因-IRES2-治療基因、啟動(dòng)子-治療基因-IRES2-示蹤基因、啟動(dòng)子-示蹤基因-治療基因、啟動(dòng)子-治療基因-示蹤基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了以下腫瘤特異性啟動(dòng)子之一人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子、人端粒酶RNA組分基因啟動(dòng)子。在該啟動(dòng)子之后接入以下至少一種腫瘤示蹤基因綠色熒光蛋白(eGFP)基因，熒光素酶(luciferase)基因。然后用基于HIV-1的慢病毒第三代包裝系統(tǒng)將該表達(dá)質(zhì)粒包裝成慢病毒。第三代包裝系統(tǒng)包括四種質(zhì)粒包胞膜質(zhì)粒PLP/VSV-G、裝質(zhì)粒pLPl，pLP2、和自主構(gòu)建的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒組成。在體外試驗(yàn)中，本發(fā)明成功用該病毒選擇性感染了端粒酶陽性腫瘤和端粒酶陽性的正常細(xì)胞，并經(jīng)特殊檢測(cè)手段證實(shí)所使用的改良hTERT啟動(dòng)子在體外以上細(xì)胞中具有較強(qiáng)啟動(dòng)能力，可啟動(dòng)示蹤基因較強(qiáng)表達(dá)。相比之下，使用同種病毒感染端粒酶陰性腫瘤細(xì)胞和端粒酶陰性正常細(xì)胞，檢須燥果發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子在其中弱表達(dá)甚至不表達(dá)。在活體試驗(yàn)中，本發(fā)明成功用該病毒以尾靜脈注射的方式，分別感染端粒酶陽性腫瘤大鼠模型和端粒酶陰性腫瘤大鼠模型，使用以下兩種方式之一CCD照相機(jī)(charge-coupleddevicecamera、CCD)、雙光子激發(fā)顯微鏡(two-photonexcitationmicroscopy)。對(duì)活體大鼠腫瘤中eGFP的表達(dá)進(jìn)行顯像。檢測(cè)結(jié)果證實(shí)在端粒酶陽性腫瘤大鼠模型活體顯像中，GFP有較強(qiáng)表達(dá)，腫瘤能夠清晰成像；而在端粒酶陰性腫瘤大鼠模型中，GFP不能被成像系統(tǒng)所檢測(cè)到。在進(jìn)一步的活體研究中，，本發(fā)明在人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動(dòng)子啟動(dòng)的eGFP之后接入胞嘧啶脫氨酶(CD)'基因，并用該病毒感染端粒酶陽性腫瘤大鼠模型和端粒酶陰性腫瘤大鼠模型，使用相同的成像設(shè)備多時(shí)相檢測(cè)腫瘤的eGFP表達(dá)和腫瘤的殺傷效應(yīng)。結(jié)果證實(shí)在端粒酶陽性腫瘤大鼠模型活體顯像中，eGFP有較強(qiáng)表達(dá)，且隨時(shí)間推移腫瘤范圍逐漸縮小，證明了CD基因?qū)δ[瘤的靶向性殺傷作用；而在端粒酶陰性胂瘤大鼠模型中，eGFP不能被成象系統(tǒng)所檢測(cè)到，不同時(shí)相處死腫瘤大鼠發(fā)現(xiàn)腫瘤不縮小。HIV-1病毒DNA的主要結(jié)構(gòu)基因及其排列形式與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒相同，均為5'LTR-gag-pro-pol-env-3'LTR。其中g(shù)ag基因編碼病毒的核心蛋白，pol基因編碼病毒復(fù)制所需的酶類,env基因編碼病毒的包膜糖蛋白，pro基因則編碼切割蛋白前體所需的蛋白酶。與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒不同的是,HIV-1基因組尚有較多調(diào)節(jié)基因,其中屬于HIV-1基因復(fù)制所必需的tat基因和rev基因,分別編碼兩個(gè)反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白，前者在HIV-1基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄延伸過程中發(fā)揮重要作用，后者則可促使HIV-1基因的表達(dá)由早期向晚期轉(zhuǎn)化。非HIV-1復(fù)制所必需的調(diào)節(jié)基因有nef、vif、vpr和vpu。這些基因的編碼產(chǎn)物都有各自的功能。HIV-1載體系統(tǒng)由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)泉能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白；載體成分則與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。為降低兩種成分同源重組恢復(fù)成野生型病毒的可能,需盡量減少二者的同源性，如將包裝成分上5'LTR換成巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子、yLTR換成SV40polyA等。包裝成分通常被分開構(gòu)建到兩個(gè)質(zhì)粒上，一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Gag和Pol蛋白，另一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Env蛋白，其目的也是附氐恢復(fù)成野生型病毒的可能。本實(shí)驗(yàn)所使用的慢病毒載體是在多次改建優(yōu)化載體性能后的第三代四質(zhì)粒慢病毒表達(dá)系統(tǒng)。所有基因的表達(dá)均依賴外源性的強(qiáng)組成性啟動(dòng)子。包裝系統(tǒng)被分為互不重疊的一個(gè)gag/pol質(zhì)粒和一個(gè)rev質(zhì)粒。為了降低包裝質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒重組的可能性，將gag/pol的編碼優(yōu)先性從HIV的AU富含區(qū)改變到人類基因更易找到的序列(人類化)。由此分裂了HIV基因組中的不穩(wěn)定序列(INS)。這種改造使得gag/po1序列的表達(dá)不依賴Rev/RRE系統(tǒng)。載體安全性在兩方面得到改善(1)包裝質(zhì)粒的RRE/Rev依賴性的消除,氐了載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒之間的同源性。(2)gag/pol序列的人類化進(jìn)一步降低了包裝質(zhì)粒和載體質(zhì)粒的gag序列的同源性。本發(fā)明改建的慢病毒載體改建于invitrogen公司的pLenti6/V5T0P0質(zhì)粒。將其CMV啟動(dòng)子更換為我們?cè)O(shè)計(jì)的腫瘤特異性hTERT啟動(dòng)子.再在其后加入我們的目的基因。該基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)包括四個(gè)質(zhì)粒表達(dá)gag/pol的pLPl質(zhì)粒，表達(dá)rev的pLP2質(zhì)粒，表達(dá)胞膜蛋白的pLP/VSV-G質(zhì)粒，以及我們構(gòu)建的載體質(zhì)粒。在本發(fā)明實(shí)施例之一，成功構(gòu)建了包含腫瘤特異性改良型hTERT啟動(dòng)子，以及在其調(diào)控下特異表達(dá)腫瘤示蹤基因(綠色熒光蛋白或熒光素酶)和治療基因(胞嘧啶脫氨酶)的載體質(zhì)粒。并用慢病毒第三代載體系統(tǒng)包裝，檢測(cè)滴度后感染端粒酶陽性和端粒酶陰性腫瘤小鼠模型。并用CCD照相機(jī)檢測(cè)了在活體腫瘤內(nèi)表達(dá)的綠色熒光蛋白。同時(shí)給予前藥5-氟胞嘧啶，觀察綠色熒光示蹤的腫瘤殺傷范圍和程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病毒能夠?qū)Χ肆Ｃ戈栃阅[瘤進(jìn)行清晰有效的在體顯影，并同時(shí)對(duì)腫瘤具有較強(qiáng)殺傷效應(yīng)。圖1:pLenti6/V5T0P0克隆表達(dá)載體質(zhì)粒(invitrogen公司)。圖2:pUC57質(zhì)粒測(cè)序圖譜。圖3:pLenti-hTERT-eGFP質(zhì)粒測(cè)序圖譜。圖4:pLenti-hTERT-eGFP和對(duì)照組pLenti-CMV-eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞H印GII后綠色熒光蛋白的表達(dá)。左為pLenti-hTERT-eGFP,右為pLenti-CMV-eGFP。圖5:pLenti-hTERT-eGFP和pLenti-CMV-eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞SW80后綠色熒光蛋白的表達(dá)。左為pLenti-hTERT-eGFP，右為pLenti-CMV-eGFP。圖6:pLenti-hTERT-eGFP和pLenti-CMV-eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞SGC-7901后綠色熒光蛋白的表達(dá)。左為pLenti-hTERT-eGFP，右為pLenti-CMV-eGFP。圖7:pLenti-hTERT-eGFP和pLenti-CMV-eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293FT后綠色熒光蛋白的表達(dá)。左為pLenti-hTERT-eGFP，右為pLenti-CMV-eGFP。圖8:pLenti-hTERT-eGFP和pLenti-CMV-eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常人肝細(xì)胞L02后綠色熒光蛋白的表達(dá)。左為pLenti-hTERT-eGFP,右為pLenti-C匿-eGFP。圖9:pLenti-hTERT-eGFP和pLenti-CMV-eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞U20S后綠色熒光蛋白的表達(dá)。左為pLenti-hTERT-eGFP，右為pLenti-CMV-eGFP。圖10:pLenti-hTERT-eGFP和pLenti-CMV-eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常人成纖維細(xì)胞HF后綠色熒光蛋白的表達(dá)。左為pLenti-hTERT-eGFP，右為pLenti-CMV-eGFP。圖11:pGL-3basic質(zhì)粒圖譜。圖12:Luciferase全長(zhǎng)基因PCR產(chǎn)物電泳圖。圖13:用BamHI和xhoI酶切鑒定pLenti-hTERT-luciferase質(zhì)粒電泳圖。圖14:用檢測(cè)引物對(duì)重組pLenti-hTERT-luciferase質(zhì)粒做菌落PCR,電泳結(jié)果圖。圖15:重組質(zhì)粒pLenti-hTERT-luciferase測(cè)序圖。圖16:用質(zhì)粒pLenti-hTERT-luciferase和pLenti-CMV-luciferase轉(zhuǎn)染七種細(xì)胞。圖中每種顏色直方圖代表一種細(xì)胞，每組直方圖從左至右不同顏色分別為人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人肝癌細(xì)胞H印GII、正常人肝細(xì)胞L02、人胚腎細(xì)胞293FT、人骨肉瘤細(xì)胞U20S、人成纖維細(xì)胞HF。其中人骨肉瘤細(xì)胞U20S、人成纖維細(xì)胞HF為端粒酶陰性，其余全部為陽性。橫軸標(biāo)注的符號(hào)為轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒，從左至右分別是pLenti-hTERT-luciferase質(zhì)粒；pLenti-CMV-luciferase質(zhì)粒；Negative為陰性對(duì)照，內(nèi)不含啟動(dòng)子；positive為陽性對(duì)照，內(nèi)含SV40啟動(dòng)子；wildtype為含野生型hTERT啟動(dòng)子的對(duì)照質(zhì)粒。圖17:共轉(zhuǎn)染10小時(shí)候293FT細(xì)胞照片。可見細(xì)胞內(nèi)毒性空斑。圖18:重組病毒感染大鼠H印GII肝癌模型。圖19:重組病毒感染大鼠SGC-7901胃癌模型。圖20:重組病毒感染大鼠SW480結(jié)腸癌模型。圖21:重組病毒感染大鼠U20S骨肉瘤模型。具體實(shí)施例方式實(shí)施過程分為體外部分和體內(nèi)部分。體外部分以pLenti6/V5TOPO質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建了改良型hTERT啟動(dòng)子啟動(dòng)eGFP或luciferase基因表達(dá)的質(zhì)粒，并分別用該質(zhì)粒在體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染多種端粒酶陽性和端粒酶陰性腫瘤細(xì)胞，釆用不同手段檢測(cè)了eGFP或luciferase基因的表達(dá)特點(diǎn)和表達(dá)強(qiáng)度。以確定我們?cè)O(shè)計(jì)的該啟動(dòng)子是否具有端粒酶陽性腫瘤特異性。體內(nèi)部分,外構(gòu)建的質(zhì)粒在綠色熒光蛋白之后接入胞嘧啶脫氨酶基因，并使用第三代慢病毒載體系統(tǒng)將該質(zhì)粒包裝成慢病毒，感染端粒酶陽性和端粒酶陰性腫瘤大鼠模型。并用CCD照相機(jī)檢測(cè)了在活體腫瘤內(nèi)表達(dá)的綠色熒光蛋白。同時(shí)給予前藥5-氟胞嘧嚏，觀察綠色熒光示蹤的腫瘤殺傷范圍和程度。1體外部分1.1hTERT啟動(dòng)子調(diào)控綠色熒光蛋白表達(dá)的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建。從invitrogen公司購(gòu)得pLenti6/V5TOPO克隆表達(dá)載體盒。其中包括pLenti6/V5TOPO質(zhì)粒(質(zhì)粒圖譜見圖1)及質(zhì)粒專用擴(kuò)增菌株Stb13,包裝細(xì)胞系293FT。pLenti6/V5T0P0質(zhì)粒是一種高效的慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒。該質(zhì)粒的CMV啟動(dòng)子是一個(gè)強(qiáng)勢(shì)啟動(dòng)子，其后有一個(gè)TOPO定向克隆位點(diǎn)，是一種一端為鈍端另一端為粘性末端的克隆位點(diǎn)。此位點(diǎn)一旦連接即不能再次斷開，屬于一次性位點(diǎn)。我們從pEGFP-Cl質(zhì)粒上PCR擴(kuò)增eGFP全長(zhǎng)序列，并用T0P0定向克隆的方式裝載至裝載至pLenti6/V5TOPO質(zhì)粒的TOPO位點(diǎn)。具體實(shí)施方式為運(yùn)用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)eGFP的擴(kuò)增引物，并在上游引物起始子ATG前加入TOPO識(shí)別位點(diǎn)CACC。將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將eGFP全長(zhǎng)序列PCR產(chǎn)物用T0P0定向克隆的方式連接到pLenti6/V5TOPO質(zhì)粒的定向克隆位點(diǎn)。根據(jù)試劑盒(invitrogen公司)的說明，T0P0連接反應(yīng)的混合比例如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注鹽溶液用pLenti6/V5T0P0定向克隆載體試劑盒中原裝鹽溶液。PCR產(chǎn)物與T0P0質(zhì)粒的摩爾數(shù)比為0.5:l或2:1。將該系統(tǒng)混合均句，室溫靜置5分鐘后放置冰上。按試劑盒說明將該混合物轉(zhuǎn)化至擴(kuò)增菌株Stb13。氨節(jié)西林抗生素篩選陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)并小劑量抽提質(zhì)粒。電泳檢測(cè)有陽性質(zhì)粒條帶。將該質(zhì)粒命名為pLenti-CMV-eGFP。根據(jù)NCBI記錄的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子序列，軟件分析后切取其中的一段核心序列，并在其中加入三個(gè)E-box:CACGTG.其目的為降低該啟動(dòng)子在端粒酶陰性細(xì)胞中的活性，同時(shí)不影響其在端粒酶陽性細(xì)胞中的活性。在這段核心序列首尾分別加入BspDI酶切位點(diǎn)ATCGAT和BamHI酶切位點(diǎn)GGATCC，該改良端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子全長(zhǎng)312bp，見序列(SEQIDNO:01)。將該序列送生物公司合成。該序列被合成于質(zhì)粒pUC57中。BspDI與BamHI酶切位點(diǎn)用于之后將該序列替代pLenti-CMV-eGFP質(zhì)粒中的CMV啟動(dòng)子。將合成好的質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果如圖3。酶切并回收pl)C57質(zhì)粒和上的hTERT啟動(dòng)子片斷，同時(shí)酶切pLenti-CMV-eGFP并回收除去CMV啟動(dòng)子的線性載體片斷。并將hTERT啟動(dòng)子片斷與pLenti-eGFP線性載體片斷連接。瓊脂糖凝膠電泳后回收連接產(chǎn)物片段。并將該產(chǎn)物測(cè)序檢測(cè)。結(jié)果見圖4。將該質(zhì)粒命名為pLenti-hTERT-eGFP。1.2用pLenti-hTERT-eGFP分別轉(zhuǎn)染端粒酶陽性和端粒酶陰性腫瘤細(xì)胞，并用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。同時(shí)轉(zhuǎn)染一組pLenti-CMV-eGFP質(zhì)粒以對(duì)照hTERT啟動(dòng)子的端粒酶特異性。用脂質(zhì)體(DOTAP,ROCHE)法將pLenU-hTERT-eGFP和對(duì)照組pLenti-CMV-eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染端粒酶陽性的人肝癌細(xì)胞H印GII、人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人胚腎細(xì)胞293FT、正常人肝細(xì)胞L02，和端粒酶陰性的人骨肉瘤細(xì)胞U20S、人成纖維細(xì)胞HF。轉(zhuǎn)染使用35mm直徑六孔細(xì)胞培養(yǎng)板。轉(zhuǎn)染條件為每孔接種細(xì)胞105個(gè)。培養(yǎng)至融合率70%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。無血清培養(yǎng)基lml/孔；質(zhì)粒2.^g/孔，用HBS稀釋至終體積25ul;D0TAP15ul/孔，用HBS稀釋至終體積50ul。質(zhì)粒和DOTAP混合后在室溫靜置15分鐘再加入孔板。IO小時(shí)后換完全培養(yǎng)基。48小時(shí)后在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光。結(jié)果如圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖IO、圖ll。1.3hTERT啟動(dòng)子調(diào)控?zé)晒馑孛富?luciferase)表達(dá)的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建。在以上工作基礎(chǔ)之上，本發(fā)明將pLenti-hTERT-eGFP質(zhì)粒中的eGFP基因更換為熒光素酶基因。其目的為更換不同的報(bào)告子，在體外分別轉(zhuǎn)染端粒酶陽性和陰性的腫瘤細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)強(qiáng)度，從而進(jìn)一步量化測(cè)定該啟動(dòng)子在端粒酶陽性腫瘤中的特異性及調(diào)控活性。多種生物包括細(xì)菌、藻類、腔腸動(dòng)物、珊瑚、螢火蟲等體內(nèi)存在螢光素酶基因，其中以北美螢火蟲(NorthAmericafirefly)的螢光素酶基因應(yīng)用的最為廣泛。此種基因可編碼產(chǎn)生550個(gè)氨基酸的螢光素酶蛋白。生物螢光實(shí)質(zhì)是一種化學(xué)螢光，北美螢火蟲螢光素酶在氧化其特有底物螢光素的過程中可以釋放波長(zhǎng)廣泛的可見光光子，其平均波長(zhǎng)為560咖(460-630nm),這其中包括重要的波長(zhǎng)超過600nm的紅光成分。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)血紅蛋白是吸收可見光的主要成分，能吸收中藍(lán)綠光波段的大部分可見光；水和脂質(zhì)主要吸收紅外線，但其均對(duì)波長(zhǎng)為590-800nm的紅光至近紅外線吸收能力較差，因此波長(zhǎng)超過600nm的紅光雖然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動(dòng)物組織被敏感的CCDcamera檢測(cè)到。本發(fā)明使用的北美螢火蟲螢光素酶基因來自pGL3熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(promega公司)。具體實(shí)施例方式Luciferase全長(zhǎng)基因來源于pGL3熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，質(zhì)粒圖譜如圖12。針對(duì)該質(zhì)粒中的熒光素酶全長(zhǎng)1656bp以及其后的一段SV40polyA,釆用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)pGL3質(zhì)粒上77-2004共1927bp目的基因的引物。上游5'CGGGATCCACCATGGAAGACGCy,下游5'CCGCTCGAGTTTACCACATTTGTAGAGG3'。在其中上游加入了BamHI酶切位點(diǎn)GGATCC，下游加入xhoI酶切位點(diǎn)CTCGAG,以便向pLenti-hTERT-eGFP和pLenti-CMV-eGFP質(zhì)粒上裝載該片段以替換eGFP片段。將PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖13。用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和xhoI將pLenti-hTERT-eGFP和pLenti-CMV-eGFP質(zhì)粒中的eGFP片段切去并將以上熒光素酶基因的PCR產(chǎn)物連接至相同位置。將產(chǎn)物質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc，氨節(jié)西林抗生素篩選陽性克隆，擴(kuò)增后小劑量抽提質(zhì)粒。并用BamHI和xhoI酶切鑒定產(chǎn)物質(zhì)粒。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切片段。結(jié)果如圖14:同時(shí)用檢測(cè)引物上游5'CTCATAGAACTGCCTGCGTG3'，下游5'GAGACTTCAGGCGGTCAACG3'做菌落PCR，電泳結(jié)果如圖15。將該兩種重組質(zhì)粒分別命名為pLenti-hTERT-luciferase和pLenti-CMV-luciferase質(zhì)粒，并將pLenti-hTERT-luciferase質(zhì)粒送測(cè)序，結(jié)果如圖16。1.4將質(zhì)粒pLenti-hTERT-luciferase和pLenti-CMV-luciferase分別體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染端粒酶陽性和端粒酶陰性腫瘤細(xì)胞，并用熒光素酶蛋白定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)情況。并對(duì)照兩組啟動(dòng)子的表達(dá)活性，觀察hTERT啟動(dòng)子在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞中的特異性。訂購(gòu)雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒。用脂質(zhì)體(DOTAP，Roche)法將該兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染端粒酶陽性的人肝癌細(xì)胞H印GII、人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人胚腎細(xì)胞293FT、人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、正常人肝細(xì)胞L02，和端粒酶陰性的人骨肉瘤細(xì)胞U20S、人成纖維細(xì)胞HF。轉(zhuǎn)染使用35mm直徑六孔細(xì)胞培養(yǎng)板。轉(zhuǎn)染條件每孔接種細(xì)胞105個(gè)。培養(yǎng)至融合率70%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。無血清培養(yǎng)基lml/孔。質(zhì)粒2.5ug/孔，同時(shí)每孔0.125ug內(nèi)參質(zhì)粒PRL(promega公司)，用HBS稀釋至終體積25ul;D0TAP15u1/孔，用HBS稀釋至終體積50ul。質(zhì)粒和D0TAP混合后在室溫靜置15分鐘再加入孔板。IO小時(shí)后換完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后裂解液裂解細(xì)胞，反復(fù)凍融并高速離心提取蛋白。在熒光酶標(biāo)儀上檢測(cè)熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度。先加入LARII檢測(cè)載體質(zhì)粒的熒光素酶基因表達(dá)產(chǎn)物，再加St叩&Glo檢測(cè)內(nèi)參質(zhì)粒的熒光素酶基因表達(dá)產(chǎn)物，將兩者的熒光素酶基因表達(dá)強(qiáng)度之值相比，即為消除了轉(zhuǎn)染誤差的標(biāo)準(zhǔn)熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度值。結(jié)果如圖17。分析后發(fā)現(xiàn)hTERT啟動(dòng)子在端粒酶陽性細(xì)胞有與CMV啟動(dòng)子相當(dāng)?shù)膯?dòng)功能。而該啟動(dòng)子在端粒酶陰性細(xì)胞的啟動(dòng)能力極弱或近似無活性。陰性對(duì)照組為無啟動(dòng)子的熒光素酶基因質(zhì)粒；陽性對(duì)照組為SV40啟動(dòng)熒光素酶基因表達(dá)的質(zhì)粒。野生型hTERT為未改建以前的hTERT啟動(dòng)子。2體內(nèi)部分2.1將體外構(gòu)建的pLenti-hTERT-eGFP質(zhì)粒在綠色熒光蛋白之后接入胞嘧嚏脫氨酶基因。構(gòu)建集顯像和治療基因于一體的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。具體實(shí)施例方式從丹麥哥本哈根大學(xué)生物工程中心購(gòu)得pCD2質(zhì)粒，我們用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI消化pLenti-hTERT-eGFP質(zhì)粒和pCD2質(zhì)粒，凝膠電泳后回收1.6kb的CD基因片段和pLenti-hTERT-eGFP線性載體。然后T4DNA連接酶連接。測(cè)序結(jié)果(SEQIDN0:2)。將其命名為pLenti-hTERT-eGFP-CD質(zhì)粒。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，將內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES引入質(zhì)粒用于連接eGFP和CD基因融合表達(dá)。在質(zhì)粒構(gòu)建中，發(fā)現(xiàn)eGFP和CD基因的位置可以顛倒互換，并不影響其表達(dá)。2.2將pLenti-hTERT-eGFP-CD質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒pLPl、pLP2、pLP/VSV-G—同轉(zhuǎn)入293FT細(xì)胞包裝為復(fù)制缺陷型慢病毒。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，我們使用慢病毒三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，同樣成功包裝了含有目的外源基因的慢病毒。這種三質(zhì)粒組合是胞膜質(zhì)粒pMD2G、包裝質(zhì)粒psPAX2和pLenti-hTERT-eGFP-CD質(zhì)粒。具體實(shí)施例方式使用磷酸錦共轉(zhuǎn)染法。293FT細(xì)胞接種于10cm直徑平板細(xì)胞培養(yǎng)皿。細(xì)胞匯合率75%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。將pLenti-hTERT-eGFP-CD質(zhì)粒、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G按照invitrogen公司提供的包裝比混合于HBS溶液中；將90ulDOTAP(德國(guó)Roche)與一定量HBS溶液混合；將以上兩種混合液體混合后室溫靜置15分鐘。除去細(xì)胞培養(yǎng)皿里的培養(yǎng)液，換成無血清培養(yǎng)基10ml。將以上混合液體加入培養(yǎng)皿。轉(zhuǎn)染10小時(shí)候換成完全培養(yǎng)基。此時(shí)觀察到細(xì)胞的毒性空斑效應(yīng)。如圖17所示。52小時(shí)候收集病毒上清。將病毒感染Hela細(xì)胞并檢測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)率，以測(cè)定病毒滴度。2.3將以上病毒經(jīng)皮注射入大鼠端粒酶陽性腫瘤模型，并成功用CCD照相機(jī)觀察到活體腫瘤細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)。如圖18-21圖所示。權(quán)利要求1、一種重組慢病毒，其特征在于其內(nèi)含有重構(gòu)后的端粒酶基因啟動(dòng)子，并且該病毒的載體質(zhì)粒內(nèi)含有一個(gè)以上外源基因。2、t^fe利要求i戶腿的塾且醜毒，欺寺征劍;Mf魏毒由三質(zhì)米媒統(tǒng)鵬莫質(zhì)粒pMD2G、^M粒psPAX2禾口載體質(zhì)粒pLenti-hTERT-eGFP纟M;或由四質(zhì)米孫統(tǒng)^M繊立pLP/VSVG、驗(yàn)粒pLPl，pLP2、和載體質(zhì)粒pLenti-hIERT-eGFP纟賊。3、^^權(quán)利要求2戶腿的重組'醜毒，欺寺征在于戶;M動(dòng)勾后的織立,因啟動(dòng)子是^^^^^因啟動(dòng)子、i辭，RNA組分基因啟動(dòng)子其中之一。4、t離權(quán)利要求3戶滿的彭尉魏毒，辦征是將立辭立酶逆車緑酉瞎因啟動(dòng)子截取期亥心成分，并加AH個(gè)E"box加以改良，得到戶;MS構(gòu)后的端粒S每m^itt因啟動(dòng)子SEQIDNO:l。5、t離權(quán)利要求i戶腿的彭且f魏毒，欺寺征在于戶;M病毒的載體質(zhì)粒內(nèi)含的外源基因是一個(gè)標(biāo)B^,鎮(zhèn)因加上一個(gè)腫瘤治療基因、^t僅一個(gè)標(biāo)B^,鎮(zhèn)因。6、職權(quán)利要求書5臓的離〖魏毒，嫩總腿病毒所攜帶辦射己示鍵因取自紅色熒光蛋白R(shí)FP基因、鄉(xiāng)tfe熒光蛋白GEP或eGFP基因、熒光素因及各種核素硫己基因中的一沐病毒所麟的腫瘤治療基因選自前藥轉(zhuǎn)換酉錢因、-嶋基因、細(xì)胞凋亡基因和細(xì)胞因子基因其中的一種。7、t^fe利要求6戶腿的彭且醜毒，欺寺征靜;M標(biāo)玩s雜因糊中瘤治療基因相別體可以是以下幾種之一啟動(dòng)子一示^鎮(zhèn)因一IRES2-治療基因、啟動(dòng)子一治療基因—IRES2-示^鎮(zhèn)因、啟動(dòng)子—示^鎮(zhèn)因-治療基因、啟動(dòng)子—治療基因-示S,鎮(zhèn)因。8、權(quán)利要求1臓的離醜毒在制備腫瘤生物驟劑中的鵬。9、權(quán)利要求1戶腿的重紐魏#^制備活懶辭^^活糊中瘤的生物治摘物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開一種重組慢病毒，其內(nèi)含有重構(gòu)后的端粒酶基因啟動(dòng)子，并且該病毒的載體質(zhì)粒內(nèi)含有一個(gè)以上外源基因。所述病毒的載體質(zhì)粒內(nèi)含的外源基因是一個(gè)標(biāo)記示蹤基因加上一個(gè)腫瘤治療基因、或者僅一個(gè)標(biāo)記示蹤基因。本發(fā)明提供的重組慢病毒可以在制備腫瘤生物顯影劑、及在制備活體端粒酶活性腫瘤的生物治療藥物中得到應(yīng)用。文檔編號(hào)A61K48/00GK101580850SQ20071007866公開日2009年11月18日申請(qǐng)日期2007年6月28日優(yōu)先權(quán)日2007年6月28日發(fā)明者余松濤,房殿春,楊仕明申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院