專利名稱：治療炎性腸病的制作方法
治療炎性腸病發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及治療炎性腸病的方法和實(shí)施該方法的手段。 發(fā)明背景缺少對炎性腸病(IBD)，例如克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的永久性治愈 方法。在瑞典，每年有1400位新患者診斷患有IBD，其發(fā)病率峰值出現(xiàn)在20歲， 從而導(dǎo)致終身要用副作用嚴(yán)重的腎上腺皮質(zhì)素和/或免疫抑制藥物治療。此外，IBD 常導(dǎo)致外科腸切除術(shù)和永久的小孔(stoma)，這是主要的不利之處。潰瘍性結(jié)腸炎 還增加了大腸癌癥的風(fēng)險。據(jù)認(rèn)為，IBD是針對通常無害的粘膜抗原的免疫應(yīng)答異常所致的自身免疫疾 病。根據(jù)其中涉及的細(xì)胞因子，CD炎癥被鑒定為丁Hl細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。有人 提出UC具有th2細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答，雖然這尚未清楚地證實(shí)(Fuss I J等，1996. J. Immunol. 157:1261-70; MullinGE等，1996. Inflamm. Bowel Dis. 2:16-26)。細(xì)胞因子用作免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)劑，因?yàn)樗鼈兇碳に婕暗募?xì)胞元件分化和增 殖。CD4+輔助T細(xì)胞可分化成兩種主要的效應(yīng)細(xì)胞亞群，用IL-12刺激時的TH1 和用IL-4刺激時的TH2。 TH1細(xì)胞分泌IFN-y從而刺激了抵御胞內(nèi)微生物，例如 病毒或胞內(nèi)細(xì)菌的吞噬細(xì)胞和溶細(xì)胞性T細(xì)胞依賴性反應(yīng)。TH2細(xì)胞分泌IL-4 和IL-5從而刺激了抵御寄生蟲的嗜曙紅細(xì)胞/肥大細(xì)胞介導(dǎo)的防御機(jī)制和IgE 產(chǎn)生。th2還起到下調(diào)TH1應(yīng)答的功能。發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供治愈炎性腸病或至少長期控制該病的方法。 本發(fā)明的另一目的是提供該方法中所用的手段。通過以下發(fā)明概述、說明本發(fā)明的許多附圖、其優(yōu)選實(shí)施方式描述以及隨附 的權(quán)利要求書可了解其它目的。發(fā)明概述本發(fā)明基于這樣一種發(fā)現(xiàn)，即，給予從患者的前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph node) 收集并體外擴(kuò)增的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)能永久性治愈(permanently cure)炎性腸病， 特別是克羅恩病和/或潰瘍性結(jié)腸炎，或至少將其維持在不活動或不活躍的狀態(tài)。 從而能減輕，甚至完全抑制腸炎癥，而不用求助例如皮質(zhì)類固醇等藥物。將免疫系統(tǒng)對口服給予的抗原無反應(yīng)定義為口服耐受。很明顯，該機(jī)制防止 了針對腸道內(nèi)含物的不適當(dāng)免疫反應(yīng)，據(jù)信該機(jī)制由至少兩種途徑介導(dǎo)第一，作 為T輔助細(xì)胞家族(CD4+)成員的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg， CD4+CD25+)的活化；第二， 誘導(dǎo)T細(xì)胞的克隆排除或無反應(yīng)性。推測負(fù)責(zé)低劑量抗原接觸耐受的第一種途徑 發(fā)生在局部腸道淋巴系統(tǒng)，其依賴于細(xì)胞因子TGF-p的產(chǎn)生。推測第二種(排除) 途徑發(fā)生在系統(tǒng)淋巴組織中，由濾過性抗原(filtered antigen)激發(fā)，并與對沒有免 疫佐劑存在下靜脈內(nèi)給予的抗原的誘導(dǎo)耐受的機(jī)制相似。后一種耐受機(jī)制看來在接 觸高劑量抗原后更突出。T細(xì)胞活化受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)，從而通過避免如自身免疫中所見的過分和錯誤導(dǎo)向 的免疫應(yīng)答而能在免疫系統(tǒng)中維持平衡。在克羅恩病患者中，腸系膜淋巴結(jié)極度增 大是T細(xì)胞活化不受控的標(biāo)志。因?yàn)镮BD是一種炎癥，毗鄰炎性部位的腸系膜淋巴結(jié)主要負(fù)責(zé)該部位的引流。 處于沿炎性區(qū)域的直接途徑上的第一批淋巴結(jié)稱為前哨淋巴結(jié)。按照本發(fā)明的第一優(yōu)選方面，從引流IBD腸節(jié)段的患者淋巴結(jié)(前哨淋巴結(jié)) 收集活化狀態(tài)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，體外擴(kuò)增并重新輸注入該患者中。按照本發(fā)明的第二優(yōu)選方面，從引流健康腸節(jié)段，即未受IBD影響的腸節(jié)段 的患者淋巴結(jié)收集非活化狀態(tài)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，體外擴(kuò)增并重新輸注入該患者中。 如此收集的活化以及非活化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以被合適的物質(zhì)，例如細(xì)胞因子在 體外(進(jìn)一步)活化。按照本發(fā)明的第三優(yōu)選方面，分別從引流患或未患IBD的腸節(jié)段的淋巴結(jié)收 集活化狀態(tài)或非活化狀態(tài)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞并體外擴(kuò)增。擴(kuò)增可以是連續(xù)或有間隔 的，例如間插有休息期的階段。聯(lián)用一種或多種細(xì)胞因子和炎性腸節(jié)段的抗原提取 物來活化(剌激)擴(kuò)增的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞?；蛘撸跀U(kuò)增前或各擴(kuò)增階段之間以這種方式活化(刺激)從引流患或未患IBD的腸節(jié)段的淋巴結(jié)收集調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。選自IL-2、 IL-7、 IL-IO、 TGF-P、 TSLP的一種細(xì)胞因子，優(yōu)選兩種或多種細(xì)胞因子，例如 含有IL-2、 IL-7、 IL-IO、 TGF-P，特別是TGF-)31、 TSLP的細(xì)胞因子混合物可 與炎性腸節(jié)段的抗原提取物聯(lián)用以獲得Treg活化。還優(yōu)選利用抗-CD3、抗 -CD28和雷帕霉素提供補(bǔ)充Treg活化(additional Treg activation)。擴(kuò)增后，將擴(kuò) 增和活化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞重新輸注入該患者中。用自體調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)在于副作用低，甚至沒有副作用而且療效高。按照第三優(yōu)選方面的第一種改變形式，從引流患或未患IBD腸節(jié)段的克羅恩 病患者淋巴結(jié)收集活化狀態(tài)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，聯(lián)用炎性部位的抗原提取物和用于 擴(kuò)增的低劑量細(xì)胞因子IL-2來活化，優(yōu)選再聯(lián)用抗IFN-Y和/或TNF-a的抗體，從 而能抑制Th1偏移(skewing)和TH2擴(kuò)增。還優(yōu)選以一定間隔，例如每天到每5 天，特別是在1周或更長時期內(nèi)，特別是在3-4周時期內(nèi)每天條件化(condition)培 養(yǎng)基。由此獲得了 TH2細(xì)胞群，該細(xì)胞群可用于自身輸血從而在患者中建立 TH1/TH2平衡。用CD3抗體補(bǔ)充活化可支持?jǐn)U增。為改善TH2偏移，擴(kuò)增中還可 聯(lián)用抗CD28抗體和抗IL-12抗體。按照第三優(yōu)選方面的第二種改變形式，從引流患或未患IBD腸節(jié)段的潰瘍性 結(jié)腸炎患者淋巴結(jié)收集活化狀態(tài)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，聯(lián)用炎性部位的抗原提取物和 用于擴(kuò)增的細(xì)胞因子IL-2、 IL-12及IFN-ot中的一種或多種(優(yōu)選再聯(lián)用抗IL-4和/ 或抗IL-10抗體)來活化。還優(yōu)選以一定間隔，例如每天到每5天，特別是在1周 或更長時期內(nèi)，特別是在3-4周時期內(nèi)每天條件化培養(yǎng)基。可以提供額外的刺激， 例如CD3和CD28，特別是接近擴(kuò)增期結(jié)束時。本發(fā)明的第四優(yōu)選方面提供了用藥學(xué)上可接受的載體配制的一種或多種細(xì)胞 因子，來體外活化從IBD患者，特別是受IBD影響的前哨淋巴結(jié)收集的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞。本發(fā)明的第五優(yōu)選方面提供一種獲得引流IBD腸節(jié)段的前哨淋巴結(jié)的方法， 該方法包括將淋巴染色試劑，例如專利藍(lán)(patent blue)注射入IBD患者腸道的病損 區(qū)域，鑒定該試劑染色的淋巴組織，任選用縫線標(biāo)記該染色組織并切除該染色組織。 仔細(xì)研究切除的組織(例如用顯微鏡檢查)，繼而將引流IBD腸節(jié)段的前哨淋巴結(jié)從 組織上切下。本發(fā)明的第六優(yōu)選方面提供一種從引流IBD腸節(jié)段的前哨淋巴結(jié)分離調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞的方法，該方法包括對該淋巴結(jié)施加壓力，收集由此被擠出該淋巴結(jié)的細(xì)胞 混懸液，并分離該混懸液的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。本發(fā)明的第七優(yōu)選方面提供從引流IBD腸節(jié)段的前哨淋巴結(jié)分離的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞。隨附的權(quán)利要求書包括了本發(fā)明的其它優(yōu)選方面。下文將參考由許多


的本發(fā)明優(yōu)選但非限制性的實(shí)施方式來更詳細(xì)地 解釋本發(fā)明。附圖簡述圖1顯示通過兩種表面標(biāo)記的表達(dá)鑒定了 Treg樣品中活化的Treg; 圖2顯示了功能性Treg試驗(yàn)；圖3顯示了提取自擴(kuò)增的Treg的mRNA的RT-PCR試驗(yàn)； 圖4顯示了擴(kuò)增前后Treg群的調(diào)節(jié)能力。圖5顯示了發(fā)炎的腸切片的內(nèi)源性提取物對人免疫細(xì)胞的活化作用。 圖6顯示源自前哨淋巴結(jié)的類似活化的Treg的劑量響應(yīng)。 圖7顯示了作為TH2標(biāo)記的CCR5的表達(dá)。 圖8顯示了 UC患者的Treg中IL-4的分泌。 圖9顯示了 CD患者的Treg中IFN-y的分泌。優(yōu)選實(shí)施方式描述實(shí)施例l.鑒定引流炎性腸節(jié)段的前哨淋巴結(jié)前哨淋巴結(jié)技術(shù)已應(yīng)用了十年，其對惡性腫瘤，主要是惡性黑色素瘤和乳 腺癌進(jìn)行疾病分期(staging)。利用注射入腸道中病損區(qū)域的淋巴染色試劑，例 如專利藍(lán)(CAS 129-17-9)和專利藍(lán)V (CAS 3536-49-0;常以鈣螯合的二聚體提 供)描繪癌癥的淋巴引流液，從而在外科手術(shù)期間鑒定前哨淋巴結(jié)。利用縫線或 其它手段標(biāo)記如此鑒定的前哨淋巴結(jié)。然后以常規(guī)方式切除腸道病損以及未受 影響的邊緣區(qū)和腸系膜，包括血管和局部淋巴結(jié)。仔細(xì)研究切除的組織，鑒定并除去前哨淋巴結(jié)。該方法應(yīng)用于潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病患者中引流發(fā)炎和未受影響腸道 的前哨淋巴結(jié)。此外，收集患者的靜脈血樣品。然后在實(shí)驗(yàn)室中處理外周血樣 品、淋巴結(jié)和炎性病損的樣本以及未受疾病影響的腸道節(jié)段的樣本以進(jìn)行免疫學(xué)分析和T細(xì)胞擴(kuò)增。利用菲科爾-泛影鈉(Ficoll-Hypaque)(法瑪西亞安瑪山姆 公司(Pharmacia， Amersham))純化外周血白細(xì)胞(PBL)。利用松散配合的玻璃勻 槳器(loose fit glass homogenizer)輕柔施壓以獲得淋巴結(jié)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液。用 杜恩斯(Do皿ce)勻漿器勻漿組織片段，97'C變性5分鐘來制備腸道樣品的抗原 提取物。然后對這些細(xì)胞進(jìn)行功能分析。實(shí)施例2.分離T細(xì)胞群利用瑞典烏普薩拉市安瑪山姆生物科技公司(Amersham Biosciences, Uppsala， Sweden)的菲科爾-泛影鈉正(Ficoll-Hypaque Plus)純化血液樣品或暗黃 層的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。用PBS稀釋所研究的暗黃層或血液樣品，將其小心 地層疊在菲科爾-泛影鈉溶液上，然后以400 g離心該兩相系統(tǒng)30分鐘。在菲 科爾溶液和血漿之間的中間相收集淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，而紅細(xì)胞和粒細(xì)胞在 試管的底部獲得。利用巴斯德移液管(Pasteurpipette)取出淋巴細(xì)胞層，用HBSS 洗滌這些細(xì)胞以除去過量的菲科爾-泛影鈉正、血漿和血小板。不立即使用這些 細(xì)胞時，將它們37i:保存在含有10 % HuS、 1% PeSt和1%谷氨酰胺的RPMI 培養(yǎng)基中。利用德國伯格施格拉德巴赫市米爾泰尼生物科技公司(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)的自動MACS分離器(autoMACS Separator) 純化常規(guī)的CD4+Th細(xì)胞和CD4+CD25+細(xì)胞。計數(shù)細(xì)胞，300 g離心10分鐘， 完全吸出上清液，按照每107個細(xì)胞用90pLMACS緩沖液(PBS配制的0.5。/。 BSA、 2mMEDTA、 0.01 %疊氮鈉)和10 pL生物素-抗體混合物來溶解細(xì)胞。 這樣所有非CD40+細(xì)胞群均被標(biāo)記。4。C培育10分鐘后，每107個細(xì)胞加入20 抗-生物素微珠，4"C再培育15分鐘。用約20體積的MACS緩沖液洗滌細(xì) 胞，300 g離心10分鐘，完全除去上清液，按照每108個細(xì)胞用500 |iL MACS 緩沖液來重懸細(xì)胞。用自動1\4八€8分離器進(jìn)行磁性分離以消除樣品中的非004+ 細(xì)胞。為分離CD4VCD25+細(xì)胞與CD4+細(xì)胞群，計數(shù)CD4+細(xì)胞，300 g離心10分鐘，完全除去上清液，按照107個細(xì)胞用90nLMACS緩沖液和10pLCD25 微珠來溶解沉淀物。4。C培育15分鐘后，如上所述洗滌細(xì)胞，用自動MACS分 離器進(jìn)行正向選擇來分離CD25+細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)分析所有細(xì)胞群的等份 試樣。實(shí)施例3.通過流式細(xì)胞術(shù)表征細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)研究分離的細(xì)胞群上不同表面標(biāo)記的表達(dá)。將細(xì)胞 分配入4 mL FACS試管，用2 mL FACS緩沖液(用PBS配制的2% FCS、0.05% 疊氮鈉)洗滌，30Og離心10分鐘，倒去上清液，將沉淀物重懸在100pLFACS 緩沖液中。加入7 pL待用的各抗體，4'C培育至少30分鐘，進(jìn)而再用FACS 緩沖液洗滌細(xì)胞一次，如上所述離心并重懸在1 mL用于細(xì)胞固定和紅細(xì)胞裂 解的FACS裂解溶液中，混合，4'C培育10分鐘，然后再次如上所述洗滌和離 心一次。倒去上清液，按每試管用500)nLFACS緩沖液重懸細(xì)胞，然后利用美 國新澤西州富蘭克林湖市(Fmnklin Lakes, NJ， USA)的貝克坦迪金森公司FACS 校驗(yàn)儀(Becton Dickinson FACSCalibur instrument)進(jìn)行分析。實(shí)施例4.增殖試驗(yàn)研究了純化的CD4+CD25+細(xì)胞的抑制能力。37。C用25 PBS配制的5 pg/mL抗-CD3 IgG溫育圓底96-孔板90分鐘。用200 fiL PBS洗滌各孔3次， 然后加入3種不同的細(xì)胞群。每孔加入用25 Gy照射的100 500,000細(xì)胞/mL CD4-細(xì)胞連同30 000 CD4+CD25-應(yīng)答細(xì)胞和1 pg/mL可溶性CD28 (終濃度)。 將不同數(shù)量的CD4+CD25+細(xì)胞加入各孔，從而產(chǎn)生許多不同的CD4+CD257 CD4+CD25+細(xì)胞比例。將相同數(shù)量的CD4+CD25'細(xì)胞加入一組額外孔中的應(yīng)答 細(xì)胞作為對照。將各板維持于37'C 4或5天，然后向各孔中加入1 ^Ci[3H]胸腺嘧啶，各 板溫育18小時，然后在-2(TC冷凍。融化細(xì)胞，用美國康涅狄格州哈姆登市湯 姆技術(shù)公司(TOMTEC， Hamden， CT， USA)的細(xì)胞收集器將孔內(nèi)含物轉(zhuǎn)移至芬 蘭土爾庫市華萊士公司(Wallac， Turku， Finland)的玻璃纖維濾膜。將芬蘭土爾 庫市華萊士公司的MeltiLex A-融化閃爍器片(Melt-on scintillator sheet)置于該濾膜的頂端，85。C融化。利用芬蘭土爾庫市華萊士公司的1205貝塔普雷特液 體閃爍計數(shù)器(1205 Betaplate Liquid Scintillation Counter)檢測放射性。實(shí)施例5. FoxP3的TGF-J31誘導(dǎo)如上所述從暗黃層制備CD4+CD25'細(xì)胞。制備不同供體的PBMC，并照射 (25Gy)。然后在含或不含lng/mLTGF-pi的6-孔板中，按照2mL/孔的體積用 1.25X1()6個PBMC同種異型活化(allo-activate)3Xl()6個CD4+細(xì)胞。各板維持 于37"C。取細(xì)胞樣品進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，在第2、 5和7天提取RNA。實(shí)施例6. RNA提取和cDNA合成如下所述從不同細(xì)胞群提取RNA用于隨后的PCR試驗(yàn)。按照每5-6X106 個細(xì)胞用lmL美國加利福尼亞州卡爾斯巴德市英杰公司(Invitrogen， Carlsbad， CA， USA)的TRIzol來裂解細(xì)胞，然后立即于-70。C冷凍保存樣品，或在室溫培 育5分鐘，再按照每mLTRIzol試劑0.2mL的用量加入氯仿，劇烈振蕩試管。 2-3分鐘后，在4。C以12,000 g離心15分鐘。將透明的水相轉(zhuǎn)移至新試管，第 一步驟中每用1 mL TRIzol，則用0.5 mL異丙醇沉淀RNA,室溫下培育RNA 10 分鐘，然后在4。C以12,000 g離心IO分鐘。除去上清液，第一步驟中每用lmL TRIzol，則用1 mL75。/。的乙醇洗滌沉淀物。旋振各試管，4°C以7,500 g離心5 分鐘，隨后短時風(fēng)干沉淀物(5-10分鐘)，溶解于不含RNA酶的水中，55"C培育 10分鐘。按照生產(chǎn)商的方案利用美國加利福尼亞州赫拉克勒斯市拜爾雷得公司 (Bio-Rad， Hercules， CA， USA)的艾斯克利普特cDNA合成試劑盒(iScript cDNA Synthesis Kit)合成cDNA。實(shí)施例7.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和實(shí)時定量PCRPCR利用不同細(xì)胞群的合成的cDNA。 PCR的目的是檢測FoxP3、 GAPDH 和RNA聚合酶II CRPII)的表達(dá)。引物購自瑞典胡丁厄市賽博基因AB公司 (Cybergene AB， Huddinge， Sweden)。其序列為FoxP3，正向誦CAGCACATTCCCA GAGTTCCTC ，反向-GCGTGTGAACCAGTGGTAGATC; GAPDH ，正向-GAAG GTGAAGGTCGGAGTC ，反向-GAAGATGGTGATGGGATTTC; RPII ，正向-GCACCACGTCCAATGACAT，反向-GTGCGGCTGCTTCCATAA。常規(guī)PCR使用 德國法蘭克福市新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(New England Biolabs， Frankfurt am Main, Germany)的ThermoPol反應(yīng)緩沖液和Tag DNA聚合酶，而定量實(shí)時PCR 使用美國加利福尼亞州赫拉克勒斯市拜爾雷得公司的iQSYBR綠超級混合物 (iQSYBR Green Supermix)。按照以下方案分別用美國加利福尼亞州赫拉克勒斯 市拜爾雷得公司的麥薩克勒爾熱循環(huán)儀(MyCycler Thermal Cycler)和艾薩克勒 爾iQ實(shí)時PCR檢測系統(tǒng)(iCycler iQ Real-Time PCR Detection System)進(jìn)行反應(yīng) 95°C、 30秒，48-65°C、 30秒和72。C、 30秒，至少重復(fù)循環(huán)40次。對于定量 實(shí)時PCR反應(yīng)，采用如Ginzinger D G， Exp. Hematol. 2002 30:503-12所述的相 對定量方法。用2n/。瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，利用紫外光激發(fā)摻入的溴化乙錠來檢測各條帶。實(shí)施例8.研究從IBD患者的前哨淋巴結(jié)獲得的Treg通過外科手術(shù)收集總共20位IBD患者的前哨淋巴結(jié)并研究。前哨淋巴結(jié) 獲得的淋巴細(xì)胞(SEAL)的特征在于表達(dá)了表面標(biāo)記CD4、 CD8、 CD3、 T細(xì)胞 受體(TCR)、 CD25、 CD69、 CD45RA、 CD45RO和CD14。檢領(lǐng)U 了 CD4+CD25高 Treg群的數(shù)量(圖1)。發(fā)現(xiàn)與引流未受影響腸區(qū)域的前哨淋巴結(jié)中Treg數(shù)量相 比，引流炎性腸節(jié)段的前哨淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞數(shù)量正常。然而，從引流炎性節(jié)段的前哨淋巴結(jié)純化的Treg(CD4+CD25 "和從無炎癥 的腸節(jié)段純化的Treg(CD4+CD25 "在對T細(xì)胞的調(diào)節(jié)性活化中存在實(shí)質(zhì)性不 同引流炎性部位的前哨淋巴結(jié)的Treg在調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化中表現(xiàn)不理想(圖2)。 換言之，引流受影響區(qū)域的前哨淋巴結(jié)的Treg的T細(xì)胞應(yīng)答調(diào)節(jié)能力明顯受 損。實(shí)施例9.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增對于Treg誘導(dǎo)和擴(kuò)增，用IL-2、 CD28、同種異體詞養(yǎng)細(xì)胞和TGF-|3刺激 外周血的CD4+CD25-T細(xì)胞。擴(kuò)增后，如FACS所檢測，超過85%的CD4+T 細(xì)胞表達(dá)高水平的CD25，表明了 Treg表型(未顯示)。RT-PCR證明擴(kuò)增的(細(xì) 胞)群含有Treg標(biāo)記轉(zhuǎn)錄物FoxP3，擴(kuò)增之前的CD4+CD25-細(xì)胞群中不含該轉(zhuǎn)錄物(圖3)。檢驗(yàn)誘導(dǎo)并擴(kuò)增的Treg細(xì)胞群的功能以證明其抑制T細(xì)胞活化的能力。 1: 10比例便能抑制T輔助細(xì)胞增殖(圖4)，證明擴(kuò)增的CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞 群(圖3)顯示出Treg調(diào)節(jié)特性。引流炎性腸節(jié)段的IBD患者前哨淋巴結(jié)中Treg 的數(shù)量看來正常；它們顯示不足以抑制受刺激T細(xì)胞的應(yīng)答。通過刺激和擴(kuò)增 原初T細(xì)胞，可以提供高效的T細(xì)胞調(diào)節(jié)特性。實(shí)施例10.利用從前哨淋巴結(jié)獲得的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞識別從炎性部位獲得的抗原將從前哨淋巴結(jié)、負(fù)淋巴結(jié)(negative node)獲得的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、腸道上 皮細(xì)胞和外周血白細(xì)胞在濃度不同的腸道細(xì)胞勻漿液中培育5-7天。用炎性區(qū) 域的抗原提取物刺激前哨淋巴結(jié)的Treg觀察到增殖(圖5)。然而，當(dāng)用從非炎性部位獲得的抗原提取物刺激從前哨淋巴結(jié)獲得的調(diào)節(jié) 性T細(xì)胞時，未見或僅有極其微弱的應(yīng)答(未顯示)。克羅恩病患者的結(jié)果與潰 瘍性結(jié)腸炎患者的相似。盲腸和乙狀結(jié)腸中，引流受影響區(qū)域的前哨淋巴結(jié)均識別從炎性部位獲得 的同一抗原提取物并增殖(圖6)。這些結(jié)果表明共同的抗原負(fù)責(zé)T細(xì)胞的克隆 擴(kuò)增。觀察到的高度自發(fā)增殖是前哨淋巴結(jié)中體內(nèi)克隆性T細(xì)胞擴(kuò)增(clonal T cell expansion)所致。從前哨淋巴結(jié)獲得的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞顯示細(xì)胞因子表達(dá)提高。在UC患者中， 前哨淋巴結(jié)的CD4+ T細(xì)胞是CD45RO+/CCR5+,這提示針對炎性粘膜的Th2炎 性應(yīng)答狀態(tài)增大(圖7)。用炎性部位的抗原提取物活化后，UC患者的前哨淋巴結(jié)分泌的IL-4(一種 Th2細(xì)胞因子)數(shù)量增多(圖8)。抗原特異性活化后，從克羅恩病患者獲得的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的反應(yīng)是TH1細(xì) 胞因子IFN-Y的產(chǎn)量增加(圖9)。如CCR5表達(dá)增加(圖7)和TH2細(xì)胞因子，例如IL-4產(chǎn)量增加(圖8)所示， 這些結(jié)果表明，從UC患者前哨淋巴結(jié)獲得的T細(xì)胞針對炎性部位抗原的增殖 性應(yīng)答增大，從前哨淋巴結(jié)獲得的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的反應(yīng)是TH2應(yīng)答。從克羅恩病患者前哨淋巴結(jié)獲得的T細(xì)胞顯示相反的活化模式，其主要產(chǎn)生THl細(xì)胞因子，例如IFN-y。UC潰瘍、或UC或克羅恩病患者的腸道炎性部位的內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)歷凋亡或 壞死，然后被專職抗原呈遞細(xì)胞(APC)內(nèi)吞。APC內(nèi)吞分解的內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)淋 巴管遷移至引流淋巴結(jié)(前哨淋巴結(jié))，在該處APC加工源自內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白質(zhì) (抗原)并將其呈遞至T細(xì)胞。T細(xì)胞得到活化，經(jīng)歷克隆擴(kuò)增并離開淋巴結(jié)以 找尋炎癥區(qū)域，在該區(qū)域它們變?yōu)樾?yīng)細(xì)胞并導(dǎo)致炎癥。實(shí)施例11.治療IBD可通過以下步驟治療IBD，特別是克羅恩病和/或潰瘍性結(jié)腸炎收集引流 炎性區(qū)域的患者前哨淋巴結(jié)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，體外擴(kuò)增它們并活化，通過輸注 將它們送回該患者體內(nèi)。具體地說，以抗原特異性方式體外擴(kuò)增調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 的優(yōu)點(diǎn)在于克隆擴(kuò)增的Treg累積在前哨淋巴結(jié)中。在GMP條件下擴(kuò)增IBD患 者前哨淋巴結(jié)的Treg，利用含有IL-2、 IL-7、 IL-IO、 TGF-卩的細(xì)胞因子混合物 連同炎性腸節(jié)段的抗原提取物活化以實(shí)現(xiàn)Treg的抗原特異性擴(kuò)增。采用所述的 RT-PCR、 FACS和體外抑制試驗(yàn)評估活化效力(圖4)。可利用抗-CD3、抗-CD28 和雷帕霉素的補(bǔ)充活化以優(yōu)化mDTreg的擴(kuò)增和功能性?；蛘?，如果引流炎性 腸節(jié)段的前哨淋巴結(jié)的Treg的數(shù)量和/或功能不令人滿意，可以考慮采用相同 方案擴(kuò)增引流非炎性節(jié)段的前哨淋巴結(jié)的Treg。該備選方法的原理是非炎性節(jié) 段可以視作經(jīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)，因此Treg是有功能的，雖然其數(shù)量太少以致于不能在 毗鄰腸節(jié)段中維持調(diào)節(jié)作用。將任一種類的擴(kuò)增Treg作為自身輸血輸回以有序 地恢復(fù)免疫調(diào)節(jié)。

圖1.通過表面標(biāo)記CD4+的表達(dá)和IL-2受體CD25的高水平表達(dá) (CD4+CD25 s)，鑒定Treg。圖2.功能性Treg試驗(yàn)。用從外周血純化并用抗CD3和抗CD28活化的 CD4+CD25-T輔助細(xì)胞培育引流炎性腸節(jié)段(空心圓圈)和非炎性節(jié)段(實(shí)心圓圈) 的前哨淋巴結(jié)的純化Treg。在最后16小時期間向培養(yǎng)液中加入3H胸腺嘧啶。圖3.擴(kuò)增Treg細(xì)胞。用IL-2、TGF-P、抗-CD28和飼養(yǎng)細(xì)胞活化CD4+CD25' 細(xì)胞以剌激Treg細(xì)胞擴(kuò)增。采用RT-PCR證明從擴(kuò)增的CD4+CD25+Treg提取 的mRNA和FoxP3轉(zhuǎn)錄物，顯示擴(kuò)增的細(xì)胞群是Treg。圖4.調(diào)節(jié)經(jīng)刺激的應(yīng)答T輔助細(xì)胞。含有CD4+CD25—細(xì)胞的預(yù)擴(kuò)增細(xì)胞 群不能調(diào)節(jié)(實(shí)心圓圈)，而擴(kuò)增的CD4+CD25+細(xì)胞可以獲得足夠的調(diào)節(jié)(空心圓 圈)。圖5.活化人免疫細(xì)胞。利用從潰瘍性結(jié)腸炎患者的發(fā)炎腸切片獲得的內(nèi) 源性抗原提取物活化從前哨淋巴結(jié)、非前哨淋巴結(jié)、腸道獲得的細(xì)胞以及外周 血淋巴細(xì)胞。圖6.劑量反應(yīng)圖。顯示了從引流盲腸和乙狀結(jié)腸的前哨淋巴結(jié)獲得的調(diào) 節(jié)性T細(xì)胞被從同一炎性腸切片獲得的內(nèi)源性抗原提取物活化的的劑量反應(yīng)。圖7. CCR5表達(dá)作為TH2的標(biāo)記。從UC患者前哨淋巴結(jié)獲得的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞中CD4+ CD45RO+記憶細(xì)胞上CCR5的表達(dá)升高是TH2活化的標(biāo)志。圖8. UC患者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中TH2細(xì)胞因子IL-4的分泌。用炎性抗原提 取物刺激從非前哨淋巴結(jié)(nSLN)和前哨淋巴結(jié)(SLN)獲得的細(xì)胞48小時。釆用 夾心ELISA檢測培養(yǎng)上清液中分泌的IL-4。圖9.從克羅恩病患者的前哨淋巴結(jié)獲得的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌THl細(xì)胞因 子IFN-y。用炎性抗原提取物刺激從非前哨淋巴結(jié)(nSLN)和前哨淋巴結(jié)(SLNl 和SLN2)獲得的細(xì)胞48小時。采用夾心ELISA檢測培養(yǎng)上清液中分泌的IFN-y。
權(quán)利要求
1.一種治療炎性腸病的方法，其包括(a)從引流患或未患IBD的腸節(jié)段的患者前哨淋巴結(jié)收集活化或非活化狀態(tài)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，(b)體外擴(kuò)增所收集的T細(xì)胞，和(c)將擴(kuò)增的T細(xì)胞重新輸注回該患者。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述炎性腸病是克羅恩病。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述炎性腸病是潰瘍性結(jié)腸炎。
4. 如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，收集活化狀態(tài)的所 述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，從引流患IBD腸節(jié)段的 淋巴結(jié)收集所述T細(xì)胞。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，聯(lián)用一種或多種細(xì)胞因子與從 發(fā)炎腸節(jié)段獲得的抗原提取物來補(bǔ)充活化所收集的T細(xì)胞。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，先活化再擴(kuò)增。
8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，活化與擴(kuò)增同時進(jìn)行。
9. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，先擴(kuò)增再活化。
10. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述一種或多種細(xì)胞因子選 自IL-2、 IL陽7、 IL-IO、 TGF-卩1、 TSLP。
11. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，包括用抗-CD3、抗-CD28和 /或雷帕霉素再活化所收集的T細(xì)胞。
12. 如權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，收集非活化狀態(tài) 的所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，從引流未患IBD腸節(jié)段的 淋巴結(jié)收集所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
14. 如權(quán)利要求12或13所述的方法，其特征在于，聯(lián)用一種或多種細(xì)胞 因子與從發(fā)炎腸節(jié)段獲得的抗原提取物來活化所收集的T細(xì)胞。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，先活化再擴(kuò)增。
16. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，活化與擴(kuò)增同時進(jìn)行。
17. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，先擴(kuò)增再活化。
18. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述一種或多種細(xì)胞因子選 自IL-2、 IL-7、 IL-IO、 TGF-(31、 TSLP。
19. 如權(quán)利要求14-18所述的方法，其特征在于，包括用抗-CD3、抗-CD28 和/或雷帕霉素再活化所收集的T細(xì)胞。
20. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，從引流患或未患IBD腸節(jié)段 的淋巴結(jié)收集調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，將它們與從炎性部位獲得的抗原提取物和低劑量 細(xì)胞因子IL-2接觸使之活化，并擴(kuò)增。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，還包括將所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 與抗IFN-y禾B/或TNF-a的抗體接觸來活化，從而抑制TH1偏移和TH2擴(kuò)增。
22. 如權(quán)利要求20或21所述的方法，其特征在于，包括以一定間隔，例 如每天到每5天，特別是在l周或更長時期內(nèi)，特別是在3-4周時期內(nèi)，每天條件 化培養(yǎng)基。
23. 如權(quán)利要求20-22中任一項所述的方法，其特征在于，包括聯(lián)用抗CD28 抗體和抗IL-12抗體來活化，從而改善Th2偏移。
24. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，從引流患或未患IBD腸節(jié)段 的淋巴結(jié)收集調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，將它們與從炎性部位獲得的抗原提取物和細(xì)胞因 子IL-2、 IL-12和IFN-a中的一種或多種接觸來活化，并擴(kuò)增。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，將調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與CD3和/ 或CD28接觸以提供補(bǔ)充活化。
26. 藥學(xué)上可接受的載體配制的一種或多種細(xì)胞因子在體外活化從IBD患 者收集的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的應(yīng)用。
27. 如權(quán)利要求26所述的應(yīng)用，其特征在于，所述IBD是克羅恩病。
28. 如權(quán)利要求26所述的應(yīng)用，其特征在于，所述IBD是潰瘍性結(jié)腸炎。
29. —種獲得引流受炎性腸病(IBD)影響的腸節(jié)段的前哨淋巴結(jié)的方法，該方 法包括(a)將淋巴染色試劑注射入IBD患者腸道的病損區(qū)域，(b)鑒定該試劑染色 的淋巴組織，(c)任選用一根或多根縫線標(biāo)記該染色的組織，(d)切除該染色組織， (e)檢査染色的組織以鑒定引流IBD腸節(jié)段的前哨淋巴結(jié)，將所鑒定的前哨淋巴結(jié) 從該組織上切下。
30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述IBD是克羅恩病。
31. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述IBD是潰瘍性結(jié)腸炎。
32. —種從引流IBD腸節(jié)段的切離前哨淋巴結(jié)分離調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法，該 方法包括(a)對該前哨淋巴結(jié)施加壓力，(b)收集被擠出該前哨淋巴結(jié)的細(xì)胞混懸 液，(c)分離該混懸液的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
33. —種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其從引流受炎性腸病(IBD)影響的腸節(jié)段的前哨淋巴 結(jié)分離。
34. 如權(quán)利要求31所述的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其特征在于，所述IBD是克羅恩病。
35. 如權(quán)利要求31所述的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其特征在于，所述IBD是潰瘍 性結(jié)腸炎。
36. —種擴(kuò)增用于治療IBD的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法，其包括(a)用合適培 養(yǎng)基提供從IBD患者的前哨淋巴結(jié)收集的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，(b)將它們與細(xì)胞因 子接觸來活化這些細(xì)胞，(c)擴(kuò)增所活化的細(xì)胞。
37. 如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，擴(kuò)增期間進(jìn)行一些或全部的 活化。
38. —種在克羅恩病患者中重建THl/TH2平衡的方法，其包括(a)從引流 患或未患克羅恩病的腸節(jié)段的患者前哨淋巴結(jié)收集活化狀態(tài)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞， (b)聯(lián)用炎性部位的抗原提取物和低劑量細(xì)胞因子IL-2來活化如此收集的T細(xì) 胞，(c)擴(kuò)增這些細(xì)胞，(d)任選在擴(kuò)增期間將這些細(xì)胞與抗IFN-Y和/或TNF誦a 的抗體接觸來抑制TH1偏移和TH2擴(kuò)增。
39. 如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，包括以一定間隔條件化培養(yǎng)基。
40. 如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，每天到每5天進(jìn)行條件化。
41. 如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，包括使這些細(xì)胞與CD3抗 體接觸來刺激擴(kuò)增。
42. 選自以下的細(xì)胞因子對于活化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的應(yīng)用，所述調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞從IBD患者的前哨淋巴結(jié)獲得IL-2、 IL-7、 IL-IO、 TGF-pl、 TSLP。
43. 抗原提取物連同細(xì)胞因子對于活化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的應(yīng)用，所述抗原提 取物從IBD患者的發(fā)炎腸節(jié)段獲得，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞從該患者的前哨淋巴結(jié)獲得。
44. 如權(quán)利要求43所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞因子選自IL-2、 IL-7、 IL-IO、 TGF-(31、 TSLP。
45. 分別如權(quán)利要求42和43-44所述應(yīng)用的組合。
全文摘要
一種治療炎性腸病(IBD)的方法，包括從引流患或未患IBD的腸節(jié)段的患者前哨淋巴結(jié)收集活化或非活化狀態(tài)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，通過將這些細(xì)胞與細(xì)胞因子和從發(fā)炎腸節(jié)段獲得的抗原提取物接觸從而任選活化這些細(xì)胞，體外擴(kuò)增這些T細(xì)胞，和將擴(kuò)增的T細(xì)胞重新輸注回該患者。還披露了獲得前哨淋巴結(jié)、擴(kuò)增T細(xì)胞、在克羅恩病患者中重建T_H1/T_H2平衡的方法，和擴(kuò)增的T細(xì)胞、細(xì)胞因子和抗原提取物以及由此活化和擴(kuò)增的T細(xì)胞的相應(yīng)應(yīng)用。
文檔編號A61P37/06GK101252941SQ200680031306
公開日2008年8月27日 申請日期2006年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月31日
發(fā)明者M·瑟恩, O·溫維斯特 申請人:Ith免疫治療控股股份公司