專利名稱：納米孔聚合物上的兩親蛋白涂層的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改變納米孔聚合物(nanoporous polymer)表面的水可濕性的改變。
相關(guān)領(lǐng)域的描述WO 2004/000880 A1公開了具有稱作疏水蛋白的蛋白材料的表面涂層，所述疏水蛋白在所述表面形成兩親涂層。兩親表示該蛋白材料給涂層提供疏水和親水基團(tuán)(參見IUPAC Compendium of Chemicaltechnology，2ndEd，31，612(1972)中對(duì)兩親的定義)。疏水蛋白是一類所述蛋白材料的實(shí)例。根據(jù)疏水蛋白的兩親性質(zhì)，蛋白材料在被涂布的基質(zhì)表面自組裝以形成涂層，所述涂層具有根據(jù)涂布的表面的可濕性而定向的疏水性和親水性。如果該表面是疏水的，涂層的疏水側(cè)與涂布的疏水表面接觸，而涂層的外表面是親水性的，從而增加了涂布的表面的水可濕性。疏水蛋白樣材料公開于WO 2004/000880，它不僅僅是從自然界分離的疏水蛋白，并且也是化學(xué)修飾或遺傳修飾的疏水蛋白，但仍然具有在親水或疏水界面自組裝成兩親膜(涂層)的性質(zhì)。為了簡單，此處使用的術(shù)語“疏水蛋白”將包括疏水蛋白樣材料。自組裝前的疏水蛋白有時(shí)稱作單體，表明自組裝涉及單體在被涂布的表面的聚集或聚合，以形成兩親涂層。無論機(jī)理如何，得到的兩親涂層是不溶于水的，這與它在用于形成涂層的溶液中的水可溶性不同。涂層的水不溶性表明形成了更大的分子，這是通過聚合或其它機(jī)理。術(shù)語“疏水蛋白”也用于描述從疏水蛋白原料(單體)獲得的不溶于水的涂層。
U.S.2003/0134042 A1公開了施加到表面后在表面活性劑的存在下加熱兩親涂層，以增加涂層的穩(wěn)定性。如該專利申請(qǐng)公開的實(shí)施例2和4中公開的TEFLON聚四氟乙烯片材上所證實(shí)的，熱/表面活性劑處理的涂層在洗滌溶液中比未處理的涂層解吸更少的疏水蛋白。盡管涂層的改進(jìn)的穩(wěn)定性/耐久性是理想的，但這成為了一個(gè)必須進(jìn)行的額外步驟，并且需要加熱，對(duì)于涂層的使用者來說這將是不方便的，或者是不理想的。例如，隱形眼鏡的涂布優(yōu)選在室溫下(15-25℃)進(jìn)行，而且不使用表面活性劑。此外，熱處理過程中表面活性劑的存在，導(dǎo)致了涂層被殘留的表面活性劑污染的問題。
發(fā)明簡述本發(fā)明通過在納米孔聚合物上形成涂層，提供了不需要加熱/表面活性劑處理的穩(wěn)定/耐久的兩親蛋白涂層。聚合物的納米級(jí)的孔與涂層相互作用，出乎意料地增加了其穩(wěn)定性/耐久性。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案可以描述為包含具有兩親蛋白涂層的納米孔聚合物的復(fù)合結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的復(fù)合結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的另一個(gè)出乎意料的結(jié)果是納米孔聚合物的氧通透性基本不受到涂層的破壞。
序列表簡述從以下說明書和形成本申請(qǐng)一部分的所附序列說明，可以更完全地理解本發(fā)明。
下列序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“對(duì)含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公開內(nèi)容的專利申請(qǐng)的要求---序列規(guī)則”)，并符合世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列列表要求(管理說明的規(guī)則5.2和49.5(a-bis)，以及第208節(jié)和附錄C)。應(yīng)用于核苷酸和氨基酸序列信息的符號(hào)和格式遵循37C.F.R.§1.822所述規(guī)則。
SEQ ID NO1是成熟TT1疏水蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO2是編碼嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces thermophilus)的成熟TT1疏水蛋白的DNA序列。
SEQ ID NO3是前體TT1疏水蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO4是編碼嗜熱踝節(jié)菌的前體TT1疏水蛋白的DNA序列。
發(fā)明詳述納米孔材料公開于Cientifica，Ltd 2003年10月發(fā)表的題目為納米孔材料的文章中，其是多種材料，包括具有小于100nm的孔的聚合物。也公開了制備納米孔材料的方法。用于本發(fā)明的納米孔聚合物優(yōu)選具有小于50nm的平均納米孔(開口)徑，更優(yōu)選不超過5nm。納米孔聚合物可以是親水或疏水的，并且兩親蛋白涂層將粘附于聚合物表面，涂層的外表面改變了聚合物表面的水可濕性，使其在疏水的納米孔聚合物的情況下可濕性更高，或在親水的納米孔聚合物的情況下可濕性更低。在任一情況下，聚合物的納米孔與涂層相互作用，以增加其穩(wěn)定性/耐久性。
獲得納米孔的優(yōu)選方法是使聚合物成為無定形的，如通常是通過聚合物不含晶體結(jié)構(gòu)而表明的，這是通過聚合物缺乏熔點(diǎn)而表明的。更詳細(xì)地，“無定形”表示聚合物是非晶質(zhì)的，這是通過熔解熱不超過3J/g，優(yōu)選不超過1J/g表明的，熔解熱是從聚合的聚合物的差示掃描量熱術(shù)(DSC)檢測的吸熱作用確定的。通常，即使在第一次加熱時(shí)觀察到了弱吸熱作用，在第二次DSC加熱中不會(huì)觀察到吸熱作用。當(dāng)吸熱作用的DSC描記中的“背景噪音”是大約相同的3J/g，以致于對(duì)聚合物幾乎不能檢測到結(jié)晶(熔解)熱時(shí)，3J/g的最大值被認(rèn)為表明是無定形聚合物。聚合物的無定形狀態(tài)的特征在于足夠開放的分子結(jié)構(gòu)和缺乏聚合物的晶體，以便諸如惰性氣體的小分子可以通透從這些聚合物形成的膜。
A.Y.Alentiev et al.，″High transport parameters and free volumeof perfluoro dioxole copolymers″，J.Membrane Science 126，ElsevierScience B.V.出版，pp.123-132(1997)公開了無定形聚合物狀態(tài)的效果，即該聚合物具有自由體積，自由體積是聚合物的真實(shí)密度與聚合物中存在的納米孔導(dǎo)致的實(shí)際上較低的密度之間的差異。這篇文章發(fā)現(xiàn)，全氟間二氧雜環(huán)戊烯共聚物的自由體積與聚(三甲基甲硅烷基丙炔)(PTMSP)的自由體積相同，并且高于含氟降冰片烯聚合物的自由體積。公開了正電子淹沒壽命法，用于確定自由體積和聚合物中的孔徑(稱作自由體積元件)，該文章報(bào)道了間二氧雜環(huán)戊烯共聚物的平均孔徑是小于1nm5.9-6.4 (0.59-0.64nm)，PTMSP是6.7 (0.67nm)。自由體積導(dǎo)致形成的無定形聚合物的無序狀態(tài)。聚合物中的開口(孔)貫穿聚合物的整個(gè)厚度(典型地構(gòu)造成膜)，這樣，氧可以通過膜。這樣的小孔徑將典型地形成烴類氣體的屏障。如Alentiev的文章中的報(bào)道，形成的具有結(jié)晶性的聚合物盡管具有低水平的自由體積(對(duì)于PTFE是14-18％)，但相當(dāng)程度是不能通透氧的，即，它們不是納米孔的。熔融-可流動(dòng)的部分晶質(zhì)的含氟聚合物也具有較低的自由體積，這是由它們相對(duì)不通透氧而表明的。
用于本發(fā)明的聚合物的納米孔結(jié)構(gòu)應(yīng)該與用于諸如過濾的微孔聚合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行區(qū)分，所述微孔聚合物結(jié)構(gòu)是由諸如聚酰亞胺、聚砜、乙酸纖維素、聚芳酰胺和可以以GORETEX片材獲得的多孔聚四氟乙烯的聚合物形成的，它們的孔徑是微米范圍的。1微米＝1000納米。因此，本發(fā)明采用的聚合物中的納米孔比微孔聚合物基質(zhì)中的孔小得多。
盡管微孔聚合物結(jié)構(gòu)具有氧通透性，但由于聚合物中相對(duì)大的“洞”，不以某種方式處理或修飾以提供微孔的部分晶質(zhì)的聚合物是氧的屏障，這是通過小于425厘巴(1厘巴＝(cm3×cm/cm Hg cm2)×108))的氧通透性而表明的。由于聚合物中存在結(jié)晶性，部分晶質(zhì)的聚合物不是納米孔的。必須對(duì)聚合物采用諸如上文提到的Cientifica文獻(xiàn)中公開的技術(shù)之一，使其成為納米孔的。
用于本發(fā)明的優(yōu)選無定形納米孔聚合物是無定形的全氟聚合物。用于本發(fā)明的一組無定形全氟聚合物是四氟乙烯(TFE)與含有3-8個(gè)碳原子的全氟烯烴，優(yōu)選六氟丙烯(HFP)的共聚物，如美國專利5,543,217和5,663,255中公開的該共聚物，或四氟乙烯(TFE)與全氟(烷基乙烯基醚)的共聚物，其中烷基含有1或2個(gè)碳原子，如美國專利No.5,919,878中公開的該共聚物。在這兩篇專利中，與TFE共聚的共聚單體的量足以提供得到的含氟聚合物的無定形狀態(tài)。根據(jù)這兩篇專利，摻入共聚物中以提供無定形狀態(tài)所需要的最小量的HFP或全氟(乙基乙烯基醚)(PEVE)是大約20mol％。如果存在其它共聚單體，則可以使用更少的量。在TFE/PEVE共聚物的情況下，全氟(甲基乙烯基醚)(PMVE)的量可以超過PEVE的量，前提是PEVE占含氟聚合物中PEVE和PMVE的組合重量的至少15wt％。
另一組無定形含氟聚合物是含有全氟化脂族環(huán)結(jié)構(gòu)的那些，如全氟-2，2-二甲基-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯(PDD)。含氟聚合物可以是PDD的均聚物。在另一實(shí)施方案中，含氟聚合物是PDD的共聚物(Alentiev等描述的全氟間二氧雜環(huán)戊烯聚合物)，包括具有補(bǔ)充量的至少一種選自四氟乙烯、全氟(甲基乙烯基醚)、1，1-二氟乙烯和氯三氟乙烯的單體的共聚物。由于高度的氣體通透性，優(yōu)選的含氟聚合物是PDD和補(bǔ)充量的四氟乙烯的共聚物，特別是含有大約65-99摩爾％PDD的聚合物。無定形聚合物優(yōu)選具有至少約140℃，更優(yōu)選至少約180℃的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)是本領(lǐng)域公知的，是指聚合物從易碎的、玻璃質(zhì)或玻璃樣狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橄鹉z狀或塑性狀態(tài)的溫度。這些共聚物的實(shí)例公開于美國專利Nos.4,754,009和4,935,477。聚合物也可以是PDD與補(bǔ)充量的至少一種其它共聚單體的無定形共聚物，所述共聚物選自與全氟(丁烯基乙烯基醚)的二聚物和與全氟(丁烯基乙烯基醚)以及與第三種共聚單體的三聚物，其中第三種共聚單體可以是全鹵烯烴，其中鹵素是氟或氯中的至少一個(gè)，或是全氟(烷基乙烯基醚)；當(dāng)存在第三種共聚單體時(shí)，其量優(yōu)選最多是總組分的大約40摩爾％。所述含氟聚合物的Tg是從與四氟乙烯形成的具有較低量四氟乙烯共聚單體的二聚物的約260℃到含有至少60摩爾％四氟乙烯的含氟聚合物的小于100℃?？梢杂糜诒景l(fā)明的其它含間二氧雜環(huán)戊烯的聚合物公開于美國專利5,883,177，如TFE與4，5，二氟-2，2-三氟甲基-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯的共聚物。
用于本發(fā)明的另一組無定形含氟聚合物是具有在全氟(烯丙基乙烯基醚)或全氟(丁烯基乙烯基醚)，如CF2＝CF-O-(CF2)n-CF＝CF2的聚合中形成的全氟化脂族環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物，其中n＝1或2，以形成含有環(huán)結(jié)構(gòu) 和/或 的聚合物(其中n是整數(shù)1或2)；及其共聚物，如Nakamura等的美國專利No.4,897,457中的描述。
前述無定形含氟聚合物都是納米孔的，因此具有氧通透性。
用于涂布納米孔聚合物的原料是蛋白材料，其在形成涂層時(shí)表現(xiàn)出其兩親性質(zhì)。蛋白材料可以具有寬范圍的氨基酸序列，并且可以具有從肽到蛋白的大小。蛋白的一個(gè)實(shí)例是疏水蛋白，包括上文所述的疏水蛋白樣材料。認(rèn)為疏水蛋白包含70-125個(gè)氨基酸，而修飾的疏水蛋白可能達(dá)到150個(gè)氨基酸的長度典型地，疏水蛋白含有保守排列的8個(gè)半胱氨酸。如WO 2004/000880中所公開的，疏水蛋白可以截短為較短的氨基酸長度，其也可以用于本發(fā)明。具有更長長度，如多于約500個(gè)氨基酸的蛋白材料也可以用于本發(fā)明?？梢杂糜诒景l(fā)明的其它蛋白材料的實(shí)例是U.S.2003/0134042中公開的疏水蛋白和疏水蛋白樣材料。具體的實(shí)例是SC3和SC4疏水蛋白(約110個(gè)氨基酸)。這些是I類疏水蛋白。II類疏水蛋白的實(shí)例是HBI和HFBII(約80個(gè)氨基酸)。疏水蛋白的另一個(gè)實(shí)例是TT1(約135個(gè)氨基酸)，即來自嗜熱真菌嗜熱踝節(jié)菌的I類疏水蛋白。下文將更詳細(xì)描述該疏水蛋白。I類疏水蛋白在諸如乙醇的極性溶劑中是不溶的，II類疏水蛋白在這些溶劑中是可溶的。目前，來自多種真菌物種的超過50種疏水蛋白序列是已知的，并且可以獲得，例如獲自GenBank和國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethsda，MD)，這些疏水蛋白可以用于形成本發(fā)明中使用的兩親涂層。用于該涂布過程中的疏水蛋白可以包含其它蛋白，即，它不需要是100％純。
TT1疏水蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的嗜熱疏水蛋白，其是與本發(fā)明同一天提交的記錄標(biāo)識(shí)號(hào)CL2504的美國專利申請(qǐng)的主題。除去了分泌信號(hào)的成熟TT1蛋白的氨基酸和編碼DNA序列分別示于SEQ ID NOs1和2。具有完整分泌信號(hào)的前體TT1蛋白的氨基酸和編碼DNA序列分別示于SEQ ID NOs3和4?！錞T1蛋白樣品″是指用表達(dá)系統(tǒng)制備的部分純化的TT1蛋白，所述表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了編碼成熟或前體TT1的多核苷酸。除TT1蛋白外，樣品可以包含不排除于純化方案之外的其它表達(dá)宿主蛋白。通過重組DNA技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)用于涂布納米孔聚合物的TT1蛋白樣品的制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知如何制備包含適于在生產(chǎn)系統(tǒng)中表達(dá)前體或成熟TT1蛋白的TT1編碼區(qū)的嵌合基因。優(yōu)選的生產(chǎn)系統(tǒng)是分泌系統(tǒng)，其包括但不限于細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)，如芽孢桿菌屬(Nagarajan，V et al.1992 Gene 114121-126)、酵母表達(dá)系統(tǒng)，如糖酵母屬和畢赤酵母屬，以及真菌系統(tǒng)，如木霉屬(Berquist，P.L.etal.2004 32293-7)和曲霉屬(Gouka，RJ.et al.1997 Appl MictobiolBiotechnol 471-11)。為了表達(dá)，將TT1編碼區(qū)可操作性連接于在需要的宿主中有功能的啟動(dòng)子，并且任選連接于其它調(diào)節(jié)信號(hào)序列，以制備嵌合基因。當(dāng)用采用編碼成熟TT1蛋白的DNA時(shí)，為了指導(dǎo)分泌，必須包括在嵌合基因中可操作性連接的編碼分泌信號(hào)肽的多核苷酸序列。分泌信號(hào)肽可以來源于前體TT1蛋白，或它可以來源于異源基因。用于芽孢桿菌屬表達(dá)系統(tǒng)的分泌信號(hào)肽的實(shí)例描述于Nagarajan，V.et al.(1992，Gene 114121-126)。用于表達(dá)系統(tǒng)中的分泌信號(hào)肽可以來源于在宿主中分泌的蛋白，例如，可以將疏水蛋白信號(hào)肽用于真菌表達(dá)系統(tǒng)中的分泌。
可以將多種標(biāo)志物添加到嵌合基因，導(dǎo)致連接于表達(dá)的蛋白的肽標(biāo)志物的表達(dá)。這些標(biāo)志物的用途是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如，用于檢測和純化表達(dá)的蛋白，因?yàn)闃?biāo)志物肽的抗體或?qū)㈦臉?biāo)志物吸附于基質(zhì)的方法是可獲得的。所述標(biāo)志物的實(shí)例是Flag標(biāo)志物和His標(biāo)志物。
用于在木霉屬表達(dá)TT1的嵌合基因構(gòu)建體按照以下順序包含以下成分1)來自木霉屬cbhl(纖維素霉)基因的啟動(dòng)子2)編碼cbhl前體蛋白的分泌信號(hào)肽的多核苷酸3)不具有翻譯終止密碼子的編碼成熟TT1蛋白的多核苷酸4)編碼Flag八肽和His(6x)標(biāo)志物的多核苷酸，所述多核苷酸是摻入用于促進(jìn)篩選真菌轉(zhuǎn)化體，并且?guī)椭兓摱嗪塑账岷笫欠g終止密碼子5)來自cbhl基因的轉(zhuǎn)錄終止序列可以構(gòu)建包含TT1嵌合基因的質(zhì)粒載體，用于將嵌合基因轉(zhuǎn)移到宿主中。質(zhì)粒載體的選擇依賴于選定的宿主和用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法。包含指導(dǎo)外來蛋白、標(biāo)記基因和復(fù)制起點(diǎn)(如果需要)的高水平表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員充分了解為了成功轉(zhuǎn)化、選擇和繁殖含有重組DNA構(gòu)建體或嵌合基因的宿主細(xì)胞而必須在質(zhì)粒載體上存在的遺傳元件。例如，可以包含選擇標(biāo)記基因，其用于鑒定轉(zhuǎn)化體。重組DNA載體的轉(zhuǎn)化可能得到一種質(zhì)粒，其是宿主細(xì)胞的瞬時(shí)或復(fù)制穩(wěn)定的存留物，或?qū)е聦?dǎo)入的DNA的全部或部分在宿主基因組中的整合。整合載體通常包括用于定向整合的宿主基因組的同源序列的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以意識(shí)到，不同的獨(dú)立整合穩(wěn)定轉(zhuǎn)化事件將導(dǎo)致不同水平的表達(dá)，因此必須篩選多個(gè)事件，以獲得展示需要的表達(dá)水平的細(xì)胞系。所述篩選可以通過DNA的Southern分析、mRNA表達(dá)的Northern分析、蛋白表達(dá)的Western分析或表型分析而實(shí)現(xiàn)。
優(yōu)選用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法在真菌表達(dá)系統(tǒng)中制備TT1，如Scholtmeijer，M et al.(2002 Applied and EnvironmentalMicrobiology 681367-1373)對(duì)裂褶菌屬的描述，Gouka，R.J.et al.(1997 Appl Mictobiol Biotechnol 471-11)對(duì)曲霉屬的描述，和WO2000058342對(duì)木霉屬的描述。使通過選擇鑒定的含上述嵌合基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體在含纖維素的培養(yǎng)基上生長，以誘導(dǎo)cbhl基因啟動(dòng)子的表達(dá)。采用抗Flag抗體，通過免疫檢測分析TT1的產(chǎn)生，以鑒定最高表達(dá)菌株?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法對(duì)TT1多肽制備TT1的抗體，然后可以將其用作在轉(zhuǎn)化體中免疫檢測TT1的替代探針。
在真菌表達(dá)宿主中，可以阻斷內(nèi)源疏水蛋白的表達(dá)，使得內(nèi)源疏水蛋白不與生產(chǎn)的疏水蛋白共同純化?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法阻斷內(nèi)源基因表達(dá)，例如，通過去除編碼基因或基因的一部分、在編碼基因中插入阻斷基因、破壞編碼基因的啟動(dòng)子、表達(dá)內(nèi)源疏水蛋白信使RNA的反義RNA，和其它這樣的方法。優(yōu)選的是除去木霉屬表達(dá)宿主菌株中的內(nèi)源HFB II疏水蛋白表達(dá)，以生產(chǎn)TT1。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的疏水蛋白純化方法對(duì)表達(dá)的TT1蛋白進(jìn)行部分純化。這些方法通常涉及將疏水蛋白摻入其表面的泡沫的形成?？梢酝ㄟ^諸如從位于容器底部的Pt陰極釋放氫氣泡的方法，并且通過快速混合產(chǎn)生，所述容器在介質(zhì)表面下具有陽極(Scholtmeijeret al.，2002，Appl and Envrt.Microbio.681367-1373)。收集泡沫樣品，然后凍干?？梢詫悠分貞矣谌宜?TFA)，然后通過蒸發(fā)到干燥而除去三氟乙酸，將樣品重懸于水中。可以將TT1泡沫樣品直接溶解于水，然后用pH7.5的15mM乙酸銨脫鹽。替代的疏水蛋白純化法是將疏水蛋白吸附于表面，然后通過在低于90℃的溫度下在含有表面活性劑的溶液中溫育，溶解吸附的疏水蛋白，并且分離得到的富含疏水蛋白的溶液(US20030166960)?？梢园凑障挛乃?，將部分純化的疏水蛋白用于材料涂布應(yīng)用中?；蛘撸梢杂肏is標(biāo)志物、TT1抗體或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它蛋白純化方法制備進(jìn)一步純化的TT1蛋白。
在TT1涂布研究前，可以將TT1蛋白樣品的凍干的粉末懸浮于小體積的三氟乙酸中，蒸發(fā)到干燥，然后重懸并稀釋于除去氣體的水中。可以通過凝膠電泳分離樣品中的蛋白，目測用考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白，從而可以估計(jì)TT1的濃度。已知蛋白濃度的樣品中TT1蛋白的百分比的估計(jì)值提供了TT1的蛋白濃度?？梢栽赥T1涂層中包含于TT1共同純化的其它蛋白。TT1涂層可以是保留在材料表面的任何量的TT1，使得該表面的水接觸角改變約15°，優(yōu)選至少改變20°。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，兩種類型的疏水蛋白作為納米孔聚合物的涂層都是穩(wěn)定和耐久的。長度長得多的兩親蛋白材料的一個(gè)實(shí)例是牛血清白蛋白(BSA)，其可以獲自Sigma，并且是由超過500個(gè)氨基酸單位組成。
所有蛋白原料在水中都是可溶的，以便可以用水溶液將涂層涂布到納米孔聚合物基質(zhì)。該應(yīng)用典型地涉及將基質(zhì)浸入溶液中，維持獲得需要的涂層的時(shí)間。盡管TT1疏水蛋白表現(xiàn)出當(dāng)在高溫下進(jìn)行涂布操作時(shí)涂層形成速度增加的優(yōu)點(diǎn)，但浸入過程優(yōu)選在室溫下進(jìn)行，并且可以持續(xù)數(shù)小時(shí)。在浸入過程中，納米孔聚合物基質(zhì)對(duì)蛋白材料的親水或疏水結(jié)構(gòu)域的吸引力導(dǎo)致在基質(zhì)上形成涂層。該疏水蛋白涂層在獲得涂層的溶液中是不溶的。當(dāng)基質(zhì)疏水時(shí)，涂層的暴露表面容易是親水性的，即，表現(xiàn)出比包被前的基質(zhì)更小的接觸角。當(dāng)基質(zhì)親水時(shí)，涂層的暴露表面容易是疏水性的，即，表現(xiàn)出比包被前的基質(zhì)更大的接觸角。典型地，所述涂層在典型的1升/分鐘的典型自來水流速下進(jìn)行熱(37℃)自來水沖洗時(shí)，所述涂層也是不溶的。然后在室溫下晾干涂層。
涂層非常薄，以至于不可見；厚度通常不超過約10nm，但通過測量涂層表面的潤濕角，并且將該潤濕角于聚合物基質(zhì)的潤濕角相比，可以確定涂層的存在。優(yōu)選地，兩親涂層使?jié)櫇窠钱a(chǎn)生至少約15°的改變，更優(yōu)選改變至少20°。此處描述的潤濕角是通過van der Mei，H.C.et al.1991，Microbial Cell Surface Analysis，pp.261-267，edited byD.S.Mozes et al.，VCH，New York描述的固著液滴法測量的，所述方法采用Krus DSA MK2儀器，和液滴形狀分析軟件程序。全氟聚合物典型地表現(xiàn)出約110°的潤濕角，其優(yōu)選被本發(fā)明的蛋白涂層至少減少到90°，更優(yōu)選至少減少到75°，甚至更優(yōu)選至少減少到60°。一些功能性全氟聚合物，如TFE與大約15摩爾％PSEPVE(全氟-3，6-二氧雜-4-甲基-7-辛烯磺酰氯)的共聚物表現(xiàn)出90°的接觸角，并且仍然被認(rèn)為是疏水的，在該聚合物的基質(zhì)上形成蛋白涂層，表現(xiàn)出70°和更小的接觸角。相反，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明涂布表現(xiàn)出小于60°的接觸角的親水聚合物時(shí)，其表現(xiàn)出至少75°，更優(yōu)選至少90°的接觸角。
盡管涂層厚度非常小，但如實(shí)施例所示，其仍然可以改變聚合物基質(zhì)的水可濕性。但是，相對(duì)于聚合物基質(zhì)中納米孔的孔徑，涂層的厚度仍然是大的，實(shí)際上，在涂層溶液中浸入納米孔聚合物的涂布方法提供了使溶解的兩親蛋白材料進(jìn)入孔的機(jī)會(huì)。通過納米孔聚合物上涂層的穩(wěn)定性/耐久性的增加，表明了一些進(jìn)入。出乎意料地，涂布的納米孔聚合物基質(zhì)的氧通透性仍然是相當(dāng)高的，優(yōu)選是在聚合物基質(zhì)上形成涂層前的通透性的至少約80％。
由于無定形含氟聚合物具有很高的氧通透性，特別是在PDD間二氧雜環(huán)戊烯全氟聚合物的情況下，它們特別適于用作隱形眼鏡。所述隱形眼鏡比任何其它可獲得的隱形眼鏡材料更可透氣(具有更高的氧通透性)，例如，比任何其它可獲得的隱形眼鏡材料對(duì)氧的通透性高至少5倍。但是，無定形含氟聚合物是疏水性的，具有大于約95°的水接觸角。本發(fā)明的復(fù)合結(jié)構(gòu)(其中納米孔聚合物是無定形全氟聚合物膜的形式)提供了來自膜上的兩親蛋白涂層的水可濕表面，使得該富合結(jié)構(gòu)可以用作隱形眼鏡。膜僅僅是用于本發(fā)明的涂層的納米孔聚合物的一種結(jié)構(gòu)。所述膜可以是受支持的或非支持的，并且可以是單面的、彎曲的、或形成環(huán)形，如管狀。在所有這些形式中，納米孔聚合物即使在涂布后也作為膜，允許需要的分子種類如氧通過。本發(fā)明的復(fù)合結(jié)構(gòu)的其它用途包括水下應(yīng)用窗，如光學(xué)傳感器、用于液體核心波導(dǎo)器的水可濕的包覆層、水可濕的排氣管或膜、疏水的水可濕表面，如用于燃料室擴(kuò)散器的碳化PAN或PMMA片、用于可透氣但水不可濕的外衣、鞋、帽子和運(yùn)動(dòng)裝備的疏水性水可濕的織物。
實(shí)施例方法制備蛋白材料溶液通過Bailey et al.2002，Appl.Microbiol.Biotechnol 58 721-727和Linder et al.2001，Biomacromolecules 2，511-517的方法制備的純化的疏水蛋白HFBII購自VTT Biotechnology(Finland)。按照Wosten etal 1993，Plant Cell.5，1567-1574，和Scholtmeijer et al 2002，Appl.Environ.Microbiol.68，1367-1373的描述從群交裂褶菌ATCC 44200的培養(yǎng)物濾液純化疏水蛋白SC3。由VTT Bioechnology(Finland)在Trichoderma reesei中克隆和超量表達(dá)，獲得疏水蛋白TT1。將TT1融合蛋白的凍干粉末溶解于小體積的三氟乙酸中，然后蒸發(fā)到干燥，然后重新溶解和稀釋于脫氣的水中。按照下文制備其它疏水蛋白的溶液。將凍干的HFBII粉末直接重懸于去離子和脫氣的水中。將凍干的SC3粉末重懸于小體積的三氟乙酸(TFA)中，用氮流將其蒸發(fā)到干燥，然后重懸于脫氣的水中(WO 01/57528 A1)。通過溶解于脫氣的水中，將獲自Sigma(Aldrich凍干粉末，目錄號(hào)7030)的牛血清白蛋白BSA(約660個(gè)氨基酸)溶解于脫氣的水中。用Sigma(Sigma程序No.TPRO-562)供應(yīng)的Bicinchoninic Acid Protein Assay試劑盒確定所有疏水蛋白凍干粉末的蛋白濃度。制備合適的稀釋液，以提供下文實(shí)施例中的疏水蛋白濃度。
用納米孔聚合物上的兩親涂層的蛋白材料進(jìn)行表面涂布在經(jīng)過清潔(丙酮、乙醇和水清洗)和干燥的聚合物表面進(jìn)行平均孔徑是大約0.6nm的四氟乙烯/全氟-2，2-二甲基-1，3-間二氧雜環(huán)戊烯膜的無定形共聚物的涂布，所述共聚物可以以TEFLONAF2400無定形含氟共聚物獲得。清潔干燥的膜的WCA(水接觸角)是110°。室溫下將共聚物的小的膜條(0.8×22mm)浸入具有實(shí)施例中指出的濃度的蛋白材料的溶液中，持續(xù)16小時(shí)。從溶液取出浸入的條，用蒸餾水漂洗，晾干。在涂布的晾干的復(fù)合結(jié)構(gòu)上測定WCA。采用固著液滴技術(shù)，通過WCA測量值確定表面疏水性或親水性，所述技術(shù)采用Krus DSA MK2儀器和液滴形狀分析軟件程序。從未涂布的膜表面與涂布的膜表面的WCA測量值的改變，推斷出存在兩親蛋白涂層。
兩親蛋白涂層的堅(jiān)固性通過用全壓力(1升/分鐘)的熱(37℃)自來水沖洗涂層5分鐘，然后在室溫下干燥涂布的膜(為了簡便，該暴露稱作自來水)并且重新測量涂布的膜的WCA，評(píng)估兩親蛋白涂布的表面的堅(jiān)固性或穩(wěn)定性。也采用了更嚴(yán)苛的處理，如實(shí)施例3的描述。
實(shí)施例1在本實(shí)施例中，蛋白材料是各種溶液濃度的BSA，如表1所示。在施加來自每種溶液的涂層后和將涂層暴露于自來水后，確定涂布的膜的WCA。這些實(shí)驗(yàn)在膜樣品上重復(fù)，按照TEFLONAF2400的膜的相同方式清潔和干燥，其中聚合物膜是可商購的部分晶質(zhì)的四氟乙烯/全氟(丙基乙烯基醚)的共聚物，其熔點(diǎn)是大約305℃，可以以TEFLON PFA 1000LP含氟聚合物(DuPont Company，WilmingtonDE USA)獲得，WCA為110°，這些結(jié)果也示于表1。
表1.TeflonAF2400和TeflonPFA1000LP的BSA涂布
如表1所示，對(duì)于AF和PFA共聚物，隨著涂布溶液中BSA濃度的增加，可濕性也增加(接觸角減小)。但是，暴露于自來水，并沒有增加WCA(WCA的增加表示涂層的不穩(wěn)定性和缺乏耐久性)，而是表現(xiàn)出WCA的進(jìn)一步減小。相反，PFA聚合物上的涂層的WCA隨著暴露于自來水而增加。用其它兩親蛋白涂層也獲得了相似結(jié)果。因此，與部分晶質(zhì)的PFA聚合物相比，無定形聚合物基質(zhì)的納米孔結(jié)構(gòu)增加了涂層的穩(wěn)定性/耐久性，這是因?yàn)镻FA的部分晶質(zhì)性不是納米孔的。
實(shí)施例2本實(shí)施例在表2中示出了上文所述用多種來自水溶液的蛋白材料涂布納米孔聚合物的結(jié)構(gòu)，以及導(dǎo)致的WCA減小。
表2.TeflonAF2400的疏水蛋白和牛血清白蛋白涂布
實(shí)施例3本實(shí)施例在表3中顯示了在暴露于自來水時(shí)納米孔聚合物上涂層的堅(jiān)固性。在暴露于自來水時(shí)，SC3和BSA涂層表現(xiàn)出WCA幾乎沒有改變，而HFBII的WCA增加到了仍然顯著小于未涂布的聚合物的WCA的水平。暴露于調(diào)理溶液比自來水對(duì)HFBII涂層具有更小的作用。在該暴露后，BSA涂層顯示出了WCA的最小改變。隨后更嚴(yán)苛的暴露處理是設(shè)計(jì)用于從隱形眼鏡除去蛋白的酶溶液。HFBII涂層的性能與暴露于自來水時(shí)同樣好。SC3涂層也具有很好的表現(xiàn)，而BSA涂層表現(xiàn)出WCA幾乎沒有增加。蛋白涂層的穩(wěn)定性和耐久性使得它們承受了設(shè)計(jì)用于除去蛋白的溶液的去除作用。暴露于Boston清潔劑是最嚴(yán)苛的處理，如未涂布的聚合物的WCA的回復(fù)所表明的，其除去了大多數(shù)蛋白涂層。在本實(shí)施例中，與清潔劑的接觸、調(diào)理溶液和酶溶液都是根據(jù)制造商(Boston)的標(biāo)簽說明書。
表3.從TeflonAF2400除去疏水蛋白和牛血清白蛋白
制造商對(duì)隱形眼鏡應(yīng)用描述了Boston調(diào)理溶液、酶溶液和清潔劑溶液，如下所示Boston Advance Comfort調(diào)理溶液無菌水性、輕微緩沖的高滲溶液，含有陽離子纖維素衍生物聚合物、纖維素粘度調(diào)節(jié)劑(viscofier)、聚乙烯醇和衍生的聚乙二醇作為潤濕劑和緩沖劑；用葡糖酸洗必泰(0.003％)、聚氨基酸丙基雙胍(0.0005％)和乙二胺四乙酸二鈉(0.05％)作為防腐劑，用于與Boston Advance清潔劑一起使用時(shí)破壞有害生物。
Boston液體酶清潔劑一種無菌水溶液，含有蛋白水解酶(枯草桿菌蛋白酶)作為活性成分，并且含有甘油。不含防腐劑，用于除去蛋白沉積物。
Boston Advance清潔劑一種無菌、濃縮的均質(zhì)表面活性劑溶液，含有硫酸烷酯、乙氧基化的烷基苯酚、基于三季胺可可脂的磷脂和二氧化硅作為清潔劑，含有二氧化鈦用于清潔堅(jiān)固的含氟丙烯酸硅酮和丙烯酸硅酮可透氣隱形眼鏡。
實(shí)施例4本實(shí)施例顯示了涂布的納米孔聚合物的氧通透性的出乎意料的保留。根據(jù)ASTM D 3985-95中的程序確定氧通透性。從這些結(jié)果，可以看出未涂布的聚合物的氧通透性非常高。盡管HFBII和TT1的涂層(溶液中的濃度是16μg/ml)使?jié)櫇窠菧p少了至少43％，但保留了最初的氧通透性的至少85％。
表4疏水蛋白涂布的TeflonAF2400的氧通透性
序列表<110>E I du Pont de Nemours and Company<120>納米孔聚合物上的兩親蛋白涂層<130>FL0270PCT<160>4<170>PatentIn version3.2<210>1<211>135<212>PRT<213>嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces thermophilus)<400>1Leu Pro Asn Val Gly Pro Ser Gly Lys Thr Ala His Lys Pro His Gln1 5 10 15Glu Pro Phe Trp Pro Val Gln Gln Asp Val Thr Val Glu Gln Ala Lys20 25 30Ala Ile Cys Gly Glu Gly Asn Gln Val Ala Cys Cys Asn Glu Val Ser35 40 45Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Glu Ile Ala Thr Gly Pro Leu Ala Gly Thr50 55 60Leu Lys Asp Leu Leu Gly Gly Lys Asn Gly Ala Lys Gly Leu Gly Leu65 70 75 80Phe Asp Lys Cys Ser Arg Leu Ash Val Asp Leu Leu Leu Gly Leu Ser85 90 95Ser Leu Ile Asn Gln Glu Cys Lys Gln His Ile Ala Cys Cys Gln Gly100 105 110Asn Glu Ala Asp Ser Ser Asn Asp Leu Ile Gly Leu Asn Ile Pro Cys115 120 125Ile Ala Leu Gly Ser Leu Leu130 135<210>2<211>405
<212>DNA<213>嗜熱踝節(jié)菌<400>2ctgccaaacg tcggtcccag tgggaagacg gctcacaagc cgcaccagga gcctttctgg 60cctgtgcagc aggacgtgac cgtggaacag gccaaggcta tctgtggtga aggcaaccag 120gtcgcttgct gcaacgaggt cagctacgcg ggcgacacca ccgaaatcgc gaccggcccc 180ctggctggca ccctcaagga cctgctcggc ggcaagaacg gcgccaaggg cctgggtctc 240ttcgacaagt gctcgcgtct caatgtcgat ctcctgcttg gcctgtcgag cctcatcaac 300caagaatgca agcagcacat tgcctgctgc cagggcaacg aggccgattc ctccaacgac 360ctcatcggtc tcaacattcc ttgcattgcc cttggctcgc tgctg 405<210>3<211>151<212>PRT<213>嗜熱踝節(jié)菌<400>3Met Lys Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Ala Ala Thr Ala1 5 10 15Leu Pro Asn Val Gly Pro Ser Gly Lys Thr Ala His Lys Pro His Gln20 25 30Glu Pro Phe Trp Pro Val Gln Gln Asp Val Thr Val Glu Gln Ala Lys35 40 45Ala Ile Cys Gly Glu Gly Asn Gln Val Ala Cys Cys Asn Glu Val Ser50 55 60Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Glu Ile Ala Thr Gly Pro Leu Ala Gly Thr65 70 75 80Leu Lys Asp Leu Leu Gly Gly Lys Asn Gly Ala Lys Gly Leu Gly Leu85 90 95Phe Asp Lys Cys Ser Arg Leu Asn Val Asp Leu Leu Leu Gly Leu Ser100 105 110Ser Leu Ile Asn Gln Glu Cys Lys Gln His Ile Ala Cys Cys Gln Gly115 120 125
Asn Glu Ala Asp Ser Ser Asn Asp Leu Ile Gly Leu Asn Ile Pro Cys130 135 140Ile Ala Leu Gly Ser Leu Leu145 150<2l0>4<211>453<212>DNA<213>嗜熱踝節(jié)菌<400>4atgaagttcg ccggtgtctt gcttgctgtc gccgctgcgg cgactgccct gccaaacgtc 60ggtcccagtg ggaagacggc tcacaagccg caccaggagc ctttctggcc tgtgcagcag120gacgtgaccg tggaacaggc caaggctatc tgtggtgaag gcaaccaggt cgcttgctgc180aacgaggtca gctacgcggg cgacaccacc gaaatcgcga ccggccccct ggctggcacc240ctcaaggacc tgctcggcgg caagaacggc gccaagggcctgggtctctt cgacaagtgc300tcgcgtctca atgtcgatct cctgcttggc ctgtcgagcc tcatcaacca agaatgcaag360cagcacattg cctgctgcca gggcaacgag gccgattcct ccaacgacct catcggtctc420aacattcctt gcattgccct tggctcgctg ctg 45權(quán)利要求
1.復(fù)合結(jié)構(gòu)，包含具有兩親蛋白涂層的納米孔聚合物。
2.權(quán)利要求1的復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述兩親蛋白涂層增加所述聚合物的水可濕性，所述增加的水可濕性的特征在于潤濕角減少至少約15°。
3.權(quán)利要求1的復(fù)合結(jié)構(gòu)，其氧通透性是所述納米孔聚合物的氧通透性的至少約80％。
4.權(quán)利要求1的復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述聚合物的納米孔的平均直徑不超過約5納米。
5.權(quán)利要求1的復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述納米孔聚合物是膜。
6.權(quán)利要求5的復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述膜是隱形眼鏡。
7.權(quán)利要求1的復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述納米孔聚合物是無定形聚合物。
8.權(quán)利要求1的復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述納米孔聚合物是疏水性的，特征在于潤濕角是至少約90°。
9.權(quán)利要求8的復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述聚合物是無定形的含氟聚合物。
10.權(quán)利要求8的復(fù)合結(jié)構(gòu)，其中所述兩親蛋白涂層是疏水蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及納米孔聚合物上的兩親蛋白涂層的形成。
文檔編號(hào)A61K38/16GK101022838SQ200580027899
公開日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2005年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月18日
發(fā)明者J·F·伊姆巴爾扎諾, B·斯蒂格利茨 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司