專利名稱：華千金藤的提取及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及華千金藤(Stephaniae sinica Diels)的提取物，其具有抗血管新生之性能，可用于防止和/或治療癌細胞轉(zhuǎn)移及與病理性血管新生和新血管形成相關(guān)的健康類疾病。由此本發(fā)明涉及到新血管及癌細胞轉(zhuǎn)移病理形成的新奇干預(yù)治療法以及腫瘤的治療方法。
背景技術(shù)：
華千金藤屬防己科類成員，是一種帶有不規(guī)則塊莖根的植物，直徑約10厘米，重者達100公斤之多。其表皮為灰褐色，粗糙不平，且呈不規(guī)則的條紋狀。其根部的橫切面表露出一種白色或略帶紅色的漿狀物，味苦。華千金藤或千金藤(Stephaniae)有許多不同的科學(xué)命名或俗名，如金不換、白藥子(東方千金藤根)、血散薯(散薯根)、地不容(地藤根)、千金藤(日本千金藤根)、防己(防己藤根)和傘形千金藤。
長期以來，千金藤一直是用來減輕疼痛的藥物，如胃痛、頭痛、牙痛和風(fēng)濕病。它還被用來排除人體內(nèi)的有毒物質(zhì)及治療諸如喉嚨痛、阿弗他潰瘍、癰、蛇咬傷、痢疾和腹瀉等疾病。另外，在外科手術(shù)期間，它還被用做肌肉弛緩劑。
血管新生是一個新血管生成的過程，即原先已有血管的派生物。在這一過程中，當(dāng)?shù)鞍姿饷高M行降解作用時，內(nèi)皮細胞逐漸與基底膜產(chǎn)生分離。然后，這些內(nèi)皮細胞游離于母體血管之外，分裂并形成一種新的變異血管組織(Risau，(1997)《自然》386671-674；Wilting等，(1995)《細胞分子生物學(xué)》，參考41(4)219-232)。目前我們發(fā)現(xiàn)，多種不同的生物因子都對控制血管的形成產(chǎn)生作用(Bussolino等，(1997)“生物化學(xué)的發(fā)展趨勢”，科學(xué)》，22(7)251-256；Folkman和D’Amore，(1996)細胞871153-1155)。這些生物因子包括具有不同功能的蛋白質(zhì)，如生長因子、細胞表面受體、蛋白酶、蛋白酶抑制物和細胞外母體蛋白質(zhì)(Achen和Stacker，(1998)Int.J.Exp.Pathol.79255-265；Devalaraja和Richmond，(1999)發(fā)展趨勢；科學(xué)》，20(4)151-156；Hanahan，(1997)《科學(xué)》27748-50；Maisonpierre等，(1997)《科學(xué)》27755-60；Suri等，(1996)細胞871171-1180；Sato等，(1995)《自然》37670-74；Mignatti和Rifkin，(1996)酶蛋白49117-137；Pintucci等，(1996)Semin Thromb Hemost 22(6)517-524；Vernon和Sage，(1995)《美國藥理學(xué)期刊》147(4)873-883；Brooks等，(1994)《科學(xué)》264569-571；Koch等，(1995)《自然》376517-519)。
血管新生參與了許多基本的生理活動，如發(fā)育、繁殖及傷口愈合等。在正常的條件下，血管新生都是在嚴格控制及高度調(diào)節(jié)的方式發(fā)生的，一般是在胚胎發(fā)育期間、成長期間以及一些特殊的情形下，如傷口愈合及女性生殖周期中(Wilting和Christ，(1996)《自然科學(xué)》83153-164；Goodger和Rogers，(1995)《微循環(huán)》2329-343；Augustin等，(1995)《美國藥理學(xué)期刊》147(2)339-351)。
然而，許多疾病或健康失調(diào)，如癌細胞轉(zhuǎn)移、糖尿病視網(wǎng)膜病變、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它諸如牛皮癬之類的疾病等，都是有長期沒有規(guī)律的血管新生引起的(Folkman，(1995)《自然醫(yī)學(xué)》1(1)27-31；Walsh，(1998)《風(fēng)濕病學(xué)》38(2)103-112；Healy等，(1998)《人類生殖新知》4(5)736-396)例如，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，新的毛細血管侵襲關(guān)節(jié)并破壞了軟骨組織。在糖尿病視網(wǎng)膜病變中，視網(wǎng)膜中的新毛細血管入侵玻璃狀體，造成出血并引起失明。因此，對病理性血管新生進行有效的治療干預(yù)、控制和/或抑制可以減輕許多重要的疾病。
這一血管新生的過程為控制體內(nèi)血管形成的干預(yù)性治療提供了節(jié)點。在實驗?zāi)Ｊ街?，我們發(fā)現(xiàn)了控制血管形成的血管新生蛋白質(zhì)抑制劑如血管阻斷素(O’Reilly等，(1994)《細胞》79(2)315-328)和內(nèi)皮抑素(O’Reilly等，(1997)《細胞》88(2)277-285)等。不過，這類蛋白質(zhì)療法生產(chǎn)起來非常昂貴，且發(fā)現(xiàn)它們很難配制，很難注射到患者體內(nèi)。目前，蛋白質(zhì)血管新生抑制劑并沒有發(fā)展成為治療患者疾病的藥物。因此，我們?nèi)匀恍枰环N可以安全地投入到患者體內(nèi)并可以有效地抑制、干預(yù)、修改和/或控制血管內(nèi)皮細胞病理性生長的治療物質(zhì)。我們本發(fā)明提供了適用于這一目的的組合物及方法。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，我們發(fā)現(xiàn)，華千金藤提取物可以抑制癌細胞轉(zhuǎn)移、內(nèi)皮細胞的生長及增生以及血管生成的過程。我們還發(fā)現(xiàn)，它對腫瘤的治療非常有用，如有效地抑制腫瘤生長。本發(fā)明提供了一種抑制、修改和/或控制內(nèi)皮細胞病理性增生的方法，包括將有效量的華千金藤提取物送到內(nèi)皮細胞中的方法。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，我們提供的是一種抑制細胞組織內(nèi)新血管形成的方法，包括將有效量的華千金藤提取物送到內(nèi)皮細胞中的方法。我們的發(fā)明還提供了一種治療腫瘤患者的方法，包括將有效量的華千金藤提取物送到患者體內(nèi)的方法。投入的華千金藤提取物可以有效地抑制腫瘤的生長。
通過投入有效量的華千金藤提取物到一個患者體內(nèi)，我們可以實踐抑制、修改和/或控制內(nèi)皮細胞病理性增生的方法及抑制細胞組織內(nèi)新血管形成的方法。其中每種方法及以上描述的治療腫瘤的方法可以進一步地包括一種針對患者的抗血管生成、抗新血管生成或抗腫瘤療法的應(yīng)用，其中，華千金藤提取物可以增強抗血管生成、抗新血管生成或抗腫瘤療法的治療效果?？寡苌?、抗新血管生成或抗腫瘤療法包括a)投入一種華千金藤提取物以外的抗血管生成劑或抗新血管生成劑(例如，鯊魚軟骨的硫酸胺沉淀物、鯊魚軟骨提取物、Shimeji DEAE alpha、Shimeji Mono-Q alpha、3-氨基苯甲酰胺和順鉑)給患者；b)投入一種抗腫瘤化療劑給患者；或c)為患者采用放射性療法。
通過給患者投入有效量的華千金藤提取物，本發(fā)明還提供了治療與內(nèi)皮細胞和/或新血管生成病理性增生相關(guān)的疾病之方法。同時，這一方法還進一步地包括了為患者采用一種抗腫瘤、抗血管生成或抗新血管生成的療法，這一療法包括化學(xué)療法、放射性療法或投入一種華千金藤提取物以外的抗血管生成或抗新血管生成劑。華千金藤提取物可以提高抗腫瘤、抗血管生成或抗新血管生成療法的效果。
本發(fā)明還提供了一種防止及抑制癌細胞轉(zhuǎn)移的方法，包括為癌癥患者投入有效量的華千金藤提取物。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，我們還提供了包括有效量華千金藤提取物和治療中使用該提取物的說明書的藥盒。這些藥盒對治療那些患有與內(nèi)皮細胞和/或新血管生成過度增生相關(guān)的疾病非常有用。
本發(fā)明進一步提供的是一種篩選識別新治療藥劑的方法以確認它們與華千金藤提取物具有相同的、類似的或更好的治療效果。這種篩選方法包括把這一藥劑對內(nèi)皮細胞增生的效果與華千金藤提取物的抗增生效果進行比較。
附圖簡述

圖1顯示在內(nèi)皮細胞測定試驗中透析過的華千金藤提取物對內(nèi)皮細胞增生抑制作用的數(shù)據(jù)。
本發(fā)明之詳細描述在本專利說明書及權(quán)利要求中，除非文中另行說明，否則所有單數(shù)形式如”a”、”an”和”the”等均包含復(fù)數(shù)含義。例如，“某個細胞”雖然為單數(shù)形式，但同樣包含該細胞的復(fù)數(shù)含義以及單數(shù)和復(fù)數(shù)混合使用的含義。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的華千金藤提取物的產(chǎn)品，其發(fā)明的方法在操作時可以使用這一產(chǎn)品而不是提取物。其中，當(dāng)過渡詞“包含”指的是一種方法、物質(zhì)或本發(fā)明的組合物時，則該方法、該物質(zhì)或該組合物既包括了詳細列舉的各個要素，也并沒有將其他未詳細列舉的要素排除在外。
本發(fā)明還提供了基本上由本發(fā)明的華千金藤提取物組成的一種產(chǎn)品，其發(fā)明的方法在操作時可以使用這一產(chǎn)品而不是提取物。這里的過渡短語“基本上由……組成”當(dāng)用來定義本專利申請中本發(fā)明的一種組合物、物質(zhì)或方法時，它表示既包含了詳細列舉的各個要素，也沒有將實質(zhì)上沒有對本發(fā)明基本及新穎特性產(chǎn)生影響的那些未詳細列舉的要素排除在外。因此，一種基本上由華千金藤提取物或醫(yī)學(xué)上可以接受的載體組成的專利申請組合物不應(yīng)將來自提取物或本質(zhì)上不影響該組合物之病理性血管形成抑制性能的物質(zhì)如磷酸緩沖液、防腐劑和氯化鈉的制備步驟中，如分離和提純方法中，產(chǎn)生的微量污染物排除在外。
術(shù)語“分離”在指稱一種天然物質(zhì)時，其含義指這一自然物質(zhì)從組成物、細胞及其他天然結(jié)合的成分中單獨獲取。
“受試者”為脊椎動物，最好是哺乳動物或人類，人類患者最佳。哺乳動物包括(但不僅限于)鼠類、猿猴類、馬、牛、豬、羊、畜類、競技類動物、寵物及人類，如人類患者。
術(shù)語“腫瘤”及“贅生物”既可用作單數(shù)也可用作復(fù)數(shù)形式，它是指細胞的異常生長，通常產(chǎn)生一種細胞組織堆積塊，既可能是良性的，也可能是惡性的。
術(shù)語“癌癥”既可用作單數(shù)也可用作復(fù)數(shù)形式，它是指經(jīng)歷了惡性病變的一個細胞聚合體。在本發(fā)明中，一個癌癥細胞的定義不僅包括原代癌細胞，而且指源自癌細胞原種的任何細胞。因此，術(shù)語“癌細胞”包括轉(zhuǎn)移的癌細胞、體外培養(yǎng)及源自癌細胞的細胞株。
在本文中，“抑制”內(nèi)皮細胞生長或細胞組織的血管形成指的是阻止、推遲或延緩內(nèi)皮細胞的生長、增殖或細胞分裂、或細胞組織中血管的形成。監(jiān)測抑制的方法包括(但不限于)內(nèi)皮細胞增殖化驗、通過測定血液含量及測量血管床體積、以及定量測定血管結(jié)構(gòu)的密度。當(dāng)培養(yǎng)物質(zhì)為細胞混合體時，監(jiān)測新血管形成的過程需要通過定量測量能夠體現(xiàn)內(nèi)皮細胞特定指標的細胞加以完成，這些指標包括血管新生因子、蛋白水解酶、以及內(nèi)皮細胞的特定細胞粘附分子等。
本發(fā)明還提供了一種“藥物組合物”，目的是為了包括至少還含有其它物質(zhì)的華千金藤提取物的組合物質(zhì)，如一種載體、穩(wěn)定劑、防腐劑或另一種有效成分，如另一種治療性藥劑，從而使該組合物適合在體內(nèi)、體外進行診斷性或治療性用途?！傲硪环N治療性有效成分”的范例，包括類固醇，如強的松、脫氫皮質(zhì)(甾)醇、甲基強的松龍、氫化可的松、皮質(zhì)酮和地塞米松，以及非甾族抗炎藥物，如硫代蘋果酸鈉、硫代葡萄金、右旋青霉胺、氯喹、羥化氯喹、硫氮磺吡啶、咪唑硫嘌呤，和抗腫瘤制劑，如α干擾素、β干擾素、γ干擾素、2號白介素、阿地白介素、惠而血添(重組人粒細胞集落刺激因子)、沙格司亭(重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)、左咪唑、BCG疫苗、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟脫氧尿苷、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、pentastatin、阿氟酸、克拉屈賓、二氟胞嘧啶、二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、左旋溶肉瘤素、洛莫司汀、亞硝(基)脲氮芥、司莫司汀、鏈佐星、氮烯咪胺、白消安、三胺硫磷、六甲蜜胺、異環(huán)磷酰胺、順鉑、碳鉑、甲基芐肼、放線菌素D、普卡霉素、博來霉素、亞德里亞霉素、道諾霉素、去甲柔紅霉素、mitoxanthrone、絲裂霉素、長春新堿、長春堿、長春瑞賓、依托泊甙、替尼泊甙、太平洋紫杉醇、鹽酸拓撲替康、天(門)冬酰胺酶、羥基脲、氯苯二氯乙烷、地塞米松、氨格魯米特、雌二酮、乙烯雌酚、羥孕酮、甲孕酮、甲地孕酮、睪丸激素、氟羚甲基睪丸素、它莫西芬、亮丙瑞林和氟他胺。
在本文中，術(shù)語“藥物學(xué)上可接受載體”的含義包含磷酸緩沖溶液、水(最好是消毒水)、乳化劑及各種濕潤劑等任何標準的藥物學(xué)載體。藥物學(xué)載體、穩(wěn)定劑和防腐劑的實例請參閱馬丁·雷明頓1975年《藥物學(xué)標準》第15版(麥克米倫出版公司，伊斯頓市)。
“有效量”是指能夠?qū)τ欣蝾A(yù)期效果產(chǎn)生影響的充足數(shù)量。例如，治療量指能夠獲得預(yù)期療效所用的量。預(yù)防性有效量是指能夠防止疾病發(fā)作或疾病癥狀的必要量。
通過把一定量的華千金藤提取物生長抑制劑送入到細胞之中，本發(fā)明提供了一種對內(nèi)皮細胞的病理性生長進行抑制的方法。本發(fā)明還提供了一種通過把一定量抗血管形成的華千金藤提取物送到細胞組織內(nèi)而對組織內(nèi)的血管形成進行抑制的方法。這些方法既可以在體內(nèi)操作，也可以在體外操作。當(dāng)在體外操作時，內(nèi)皮細胞或血管化組織在業(yè)內(nèi)專業(yè)人士熟知的條件下進行培養(yǎng)，具體如下所述。這些細胞和/或組織既可以從現(xiàn)存的細胞株中進行培養(yǎng)，也可以從受試者即患者身上得到的活組織切片檢查中進行培養(yǎng)。然后，這些細胞和/或組織被投入一定量的華千金藤提取物，例如，可以把華千金藤提取物加入到細胞和/或組織的培養(yǎng)基中。
根據(jù)本發(fā)明，華千金藤提取物的制備方法如下將華千金藤或其中部分如葉、莖干、分枝、嫩枝、塊莖根、根肉或塊莖根內(nèi)部或塊莖根表皮(最好是過篩的、壓碎的或碾碎的)投入到一種有機溶劑中或最好是含水介質(zhì)(可以在0°到200℃之間選擇，優(yōu)選4℃到100℃，如4℃和10℃，或室溫如20℃到25℃、40℃、60℃、80℃或100℃)，從而把所得的液體與至少一些、或全部、最好是全部華千金藤的固體部分分離開來，以獲得一種液體形式的提取物，這一液體提取物還可以通過溶劑蒸發(fā)或凍干法在除去有機溶劑或水之后將之還原成固體形態(tài)，從而獲得固體形態(tài)的提取物。有機溶劑最好是極性有機溶劑，如某種醇類，如甲醇、乙醇、N-丙醇、異丙醇、N-丁醇、異丁醇和叔丁醇，最好是甲醇和乙醇。另外，在制備本發(fā)明華千金藤提取物時，優(yōu)選用華千金藤的塊莖根或部分塊莖根做原料，如此，塊莖根(鮮活的或干燥的或兩種的混合)或部分塊莖根(鮮活或干燥)被放進含水介質(zhì)或有機溶劑之中，然后采用離心過濾或過濾的方法從固體物中得到液體產(chǎn)物。進一步優(yōu)選通過將華千金藤或其中的任何部分，如塊莖根的根肉，即塊莖根內(nèi)部與表皮分開，(最好是經(jīng)過篩選、粉碎或磨碎)投入到有機溶劑或含水介質(zhì)之中進行制備，從而把所得液體與華千金藤的固體部分分離開來，形成一種液體物質(zhì)，并把含有某些分子量的化合物通過透析法、超濾法或?qū)游龇◤倪@一液體物質(zhì)中除去，以獲得液體形式的提取物，所述要除去的化合物分子的分子量為約150到3500、優(yōu)選約150到2000、更優(yōu)選約150到1000，進一步優(yōu)選約200到600、再優(yōu)選約200到400或約300到500，最優(yōu)選300到400。這一液體提取物還可以在除去有機溶劑或水之后將之還原成固體，從而獲得固體形態(tài)的提取物。
腫瘤的生長，特別是固態(tài)腫瘤或固態(tài)癌癥依賴于病理性的血管新生或新血管形成。本發(fā)明還提供了一種抑制某種腫瘤生長的方法，一般是固態(tài)腫瘤、癌癥或固態(tài)癌癥，這一方法包括向腫瘤投放一定有效量的華千金藤提取物。
并不是每一個療法對對每一個體都有效，因此，采用試管化驗的方法檢測出每一個受試者(即患者)的施藥功效是有益的。本發(fā)明提供了測定華千金藤提取物療法是否能治療某一受試者(即患者)與內(nèi)皮細胞病理性增生相關(guān)的特定疾病的一種方法。例如，從該受試者體中分離出某一細胞活組織切片，然后與有效量的華千金藤提取物或含有該提取物的藥物組合物進行接觸。使用傳統(tǒng)程序(如以下要描述的CPAE化驗)測定內(nèi)皮細胞病理性生長的抑制，表明華千金藤提取物或含有該提取物的藥物組合物是否能有效地治療該受試者(即患者)的疾病。
通過向受試者(即患者)體內(nèi)投入有效藥量的華千金藤提取物或含有該提取物的藥物組合物，本發(fā)明還提供了一種治療與患者病理性新血管形成相關(guān)的失調(diào)癥之方法。在本文的上下文中，進行“治療”意味著減緩與病理性新血管形成相關(guān)的癥狀或減輕新血管形成。這類失調(diào)癥包括(但不限于)關(guān)節(jié)炎癥狀、基于新血管形成的皮膚病癥狀、糖尿病視網(wǎng)膜病變、再狹癥、卡波西氏肉瘤、老年黃斑病變、毛細血管擴張、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、創(chuàng)傷性肉芽、血管纖維瘤、遺傳性出血性毛細血管擴張癥、心肌血管新生、牛皮癬、硬皮病及一些炎癥，如由病理性血管形成或新血管形成相關(guān)或造成的痔瘡。典型的關(guān)節(jié)炎癥狀為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明還提供了一種預(yù)防或抑制(如阻止、減少、減緩或推遲)癌細胞轉(zhuǎn)移的方法，包括將華千金藤提取物投入到某個癌癥患者體內(nèi)的方法；其中，該患者確實非常需要加以預(yù)防或抑制。投入華千金藤提取物以治療關(guān)節(jié)炎癥狀會減輕軟骨(特別是關(guān)節(jié))中的血管形成，從而增強這些區(qū)域的機動性和適應(yīng)性。就治療牛皮癬而言，投入華千金藤提取物會減少一些皮膚病的癥狀，如結(jié)疤、片狀剝落和皮膚表體下的可見血管。就治療糖尿病視網(wǎng)膜病變而言，投入華千金藤提取物會減少視網(wǎng)膜中新異血管的形成，從而使視覺不受阻礙。就治療卡波西氏肉瘤而言，投入華千金藤提取物會抑制血管的生長或更進一步的形成，從而抑制住傷害的形成。
華千金藤提取物投送的方式可以是口入式、口腔式、鼻入式、直腸式、靜脈注射式、腹膜腔引流式、肌肉注射式、或局部性方法，如經(jīng)過皮膚或眼部、陰道或吸入式。當(dāng)華千金藤提取物被投入到接受治療者(如人類，人類患者，或其它哺乳動物，如老鼠、家鼠、馬、豬、羊和牛等)體內(nèi)時，這些提取物可以與醫(yī)學(xué)上可以接受的載體混合在一起，然后投入到患者體內(nèi)。華千金藤提取物的藥劑量根據(jù)熟悉這一技藝的人士之經(jīng)驗加以確定，并隨接受治療的癥狀、關(guān)聯(lián)的病理、瞄準的細胞類型以及接受治療的患者而加以變化。華千金藤提取物(固體還是液體？其中活性物的含量？)的藥劑量可以在每天0.01毫克及每天1克之間變化，優(yōu)選每天0.1到500毫克、更優(yōu)選1到100毫克、進一步優(yōu)選1到50毫克。在整個治療過程中，體內(nèi)投入可以采取一個劑量、持續(xù)性或間歇性方式進行。
藥劑組合物可以采取片劑、錠劑、顆粒、膠囊、丸劑、針劑、栓劑或氣霧劑的形式。它們還可以采用活性成分在含水或非水稀釋劑中的懸浮液、溶液和乳液形式、或者糖漿、顆?；蚍勰┑取?br> 雖然華千金藤提取物可以采取單獨投入的方式，但它還可以以藥物制劑的形式出現(xiàn)，制劑的內(nèi)容包含華千金藤提取物連同一種或多種醫(yī)學(xué)上可以接受的載體及可選的其它治療劑。每一載體必須是“可接受的”并與制劑中其它成分相容，且對受試者如人類患者無害。
藥物制劑可方便地以單位劑量形式出現(xiàn)，也可以采用加入華千金藤提取物液態(tài)載體或細分的固態(tài)載體的方法進行制備，然后，如果必要，將之制備成型。
本發(fā)明適宜口服的制劑可以采用散劑的方式，如膠囊、扁膠劑或片劑，每一種都含有預(yù)定量的華千金藤提取物；還可呈粉狀或顆粒狀；或呈一種含水或非水液態(tài)中的溶液或懸浮液狀；或水包油液體乳劑或油包水液體乳劑。華千金藤提取物也可以為大丸藥、干藥糖劑或漿狀物。
片劑可以通過華千金藤提取物的壓縮和成型進行制作，可根據(jù)需要添加一種或多種附屬成分。壓縮的片劑可以通過適當(dāng)?shù)臋C器壓縮松散形式中的有機成分(如粉末或顆粒)而制備，如果需要，還可以與粘合劑(如聚乙烯吡咯酮、凝膠、羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(如羥基乙酸淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)和表面活性劑或分散劑混合。模制片劑可以采用適當(dāng)?shù)臋C器將粉末狀的化合物混合物用惰性液體稀釋劑濕化后經(jīng)模制加工而成。如果需要，片劑還可以包衣或刻痕，還可以為使那些有效成分以緩慢而加以控制地釋放的方式進行制劑，例如采用不同比例的羥丙基甲基纖維素，就可以達到所期望的釋放形式。根據(jù)需要，片劑還可以提供腸溶包衣，使其部分在腸內(nèi)釋放而不是在胃部釋放。
適用于口腔局部投藥的制劑，包括風(fēng)味化有效成分的錠劑，所述風(fēng)味劑通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或黃蓍膠；包括含惰性基質(zhì)的華千金藤提取物的芳香熏劑，所述惰性基質(zhì)如凝膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯樹膠；包括含適當(dāng)液態(tài)載體的華千金藤提取物的漱劑。
根據(jù)本發(fā)明，適用于局部投藥的藥劑組合物可以配制成一種藥膏、乳霜、懸浮液、洗劑、粉末、溶液、軟膏、凝膠、噴劑、氣霧劑或油狀物。此外，一種制劑可能包含一種貼片劑或敷料，如浸含華千金藤提取物的繃帶或粘合劑膏藥，同時根據(jù)需要其中還可以含有一種或多種賦形劑或稀釋劑。
有些藥物制劑實施方案可以為一種局部涂敷用的含有華千金藤提取物的藥膏或乳霜。當(dāng)配制成一種藥膏時，提取物既可以與石蠟，也可以與水混合式藥膏基質(zhì)一起使用。此外，藥物成分可與水包油乳霜基質(zhì)配制成一種乳霜。
如果需要，乳霜基質(zhì)的水相可包括，例如，至少約30％w/w之多元醇，即具有兩個或多個羥基醇，如丙二醇、丁烷-1、3-二醇、甘露醇、山梨糖醇、丙三醇和聚乙二醇及以上之混合物。局部制劑可根據(jù)需要包括可促進華千金藤提取物經(jīng)由皮膚或其它感染區(qū)域吸收或穿透之化合物。這類真皮穿透增強劑的實際范例包括二甲亞砜和及相關(guān)的類似物。
本發(fā)明乳狀液之油相可用現(xiàn)有技術(shù)的成分以任何現(xiàn)有技術(shù)的方式構(gòu)成。雖然此油相可以僅僅包含一種乳化劑(即為熟知的利泄劑)，但它還可以根據(jù)需要包括至少一種乳化劑與脂肪或油或脂肪與油之混合物。較理想的是，親水的乳化劑還與用作穩(wěn)定劑的親脂乳化劑一起包括在內(nèi)。優(yōu)選既把油又把脂肪包括在內(nèi)?？傊谢虿缓蟹€(wěn)定劑的乳化劑組成了所謂的乳化蠟，蠟與油一起和/或脂肪組成了所謂的乳化藥膏，從而形成了乳霜制劑的油性分散相。
適用于本發(fā)明之制劑的利泄劑和乳化穩(wěn)定劑包括Tween 60、Span 80、十六醇和十八醇混合物、肉豆寇醇、單硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸鈉。
由于活性化合物在大多數(shù)用于醫(yī)藥學(xué)乳液制劑的油中其溶解度都非常低，所以可根據(jù)所需求的化妝品特性選擇適當(dāng)?shù)挠皖惢蛑具M行配制。因此，乳霜最好應(yīng)是具有適當(dāng)?shù)膱杂捕鹊姆怯椭?、非染色的以及可清洗的產(chǎn)物，以避免從試管或其它容器中漏出?？梢允褂弥辨湹幕蛑ф?、單或二烷基的烷基酯類，如二異己二酸酯、硬脂酸十六烷基酯、椰子脂肪酸丙二醇二酯、異丙基肉豆蔻酸酯、油酸癸酯、異丙基棕櫚酸酯、硬脂酸丁酯、2-乙基己基棕櫚酸酯或名為Crodamol CAP的支鏈酯類摻合物，后三者為較理想的酯類。這些可以單獨使用，也可以根據(jù)所要求的特性結(jié)合使用。此外，可使用高熔點的脂質(zhì)，如白色軟石蠟和/或液體石蠟或其它礦物油。
適用于眼睛局部投藥的制劑還包括眼藥水，其中之有效成分可溶解于或懸浮于適當(dāng)?shù)妮d體內(nèi)，特別是這種有效成分的含水溶劑。直腸投藥的制劑表現(xiàn)為具有適當(dāng)基質(zhì)的栓劑，包括，例如可可油和水楊酸鹽。
適用于陰道投藥的制劑可以是陰道栓劑、止血塞、乳霜、凝膠、軟膏、泡沫膠或噴霧劑等，這些制劑含有華千金藤提取物及一種或多種適宜的載體。
適用于鼻腔投藥的制劑(其載體為一種固態(tài)物質(zhì))包括顆粒大小的粗粉末，其大小從20微米到500微米左右，投藥的方式為鼻吸入式，即通過鼻腔從靠近鼻孔的容器內(nèi)快速吸入粉末。而適用于投藥的液體載體制劑表現(xiàn)為鼻噴液、鼻腔滴液或采用噴霧器進行氣霧劑投藥，這些制劑包括華千金藤提取物之含水溶液或油溶液。
適用于腸胃外投藥的制劑包括含水或非水的等滲消毒注射溶液，它們可含有抗氧化劑、緩沖溶液、細菌抑制劑和使制劑與預(yù)期受體的血液等張的溶質(zhì)；它還包括水溶性或非水溶性的消毒懸浮液，如懸浮劑、增稠劑和脂質(zhì)體或其它用來使華千金藤提取物指定導(dǎo)向血成分或一個或多個器官的微顆粒系統(tǒng)。這些制劑可存在于單位劑量或多劑量密封容器之中，如安瓿和玻璃瓶，并可以存放在一個冷凍干燥(凍干的)條件下，在使用之前僅需加入消毒的液體載體，如注射用水。即用的注射溶液和懸浮液可以從先前描述的消毒粉末、顆粒和片劑進行配制。
除了以上特別提到的成分外，本發(fā)明的制劑可包括其它業(yè)內(nèi)常規(guī)的、與討論中制劑類型相關(guān)的試劑，例如，那些適用于口腔投藥的制劑可進一步包括諸如甜味劑、增稠劑和風(fēng)味劑等之類的試劑。
華千金藤提取物及包含一種或多種該提取物的組合物也可作為獸醫(yī)制劑的形式使用，可以采用業(yè)內(nèi)常規(guī)的方法進行制備。
本發(fā)明進一步提供了一種醫(yī)療藥劑的篩選方法，以抑制新血管形成或內(nèi)皮細胞的增長。其篩選要求如下(a)將一種試驗藥劑與適當(dāng)?shù)募毎蚪M織樣本接觸；(b)將適當(dāng)細胞或組織樣本的分離樣本與有效治療量的華千金藤提取物接觸，然后，(c)比較步驟a)樣本中的內(nèi)皮細胞增長和步驟b)樣本中的內(nèi)皮細胞增長，其中，步驟a)中用以抑制內(nèi)皮細胞增長的任何試驗藥劑與步驟b)中的幾乎一樣，都可以用做抑制新血管形成或內(nèi)皮細胞病理性增長的藥劑。
實施例1采用華千金藤提取物抑制內(nèi)皮細胞增生華千金藤提取物的制備將華千金藤塊莖根的表皮與其根肉分離開來。將一份20到30克的根肉在二次蒸餾水中磨碎，使其成為均勻分布的微粒；蒸餾水的體積為根肉的五倍到10倍，然后讓其在4°或100℃的溫度下駐留2到4個小時，加以攪拌，獲得一種混合物。然后，采用Miracloth雙層濾膜對這種混合物進行過濾，除去固態(tài)的殘留物質(zhì)。這種混濁的濾出液在室溫下以每分鐘約1,500的轉(zhuǎn)數(shù)加以澄清。上清液從沉淀物中輕輕倒出，獲得一種透明溶液，可用做本發(fā)明的華千金藤提取物。但在這一實驗中，可將這種透明溶液凍干，成為一種凍干的粗提取物，也可以作為本發(fā)明的華千金藤提取物而儲藏。然后，這種凍干的粗提取物在二次蒸餾水中進行溶解，并三次換用二次蒸餾水、以截止分子量為1000MW或3500MW的透析管進行透析過夜。透析后，保留在透析管內(nèi)的液體，即保留物，就成為華千金藤提取物之一種形式。將1.0K和3.5K的透析保留物凍干，從而獲得該提取物的固態(tài)形式，然后按照以下描述的方法進行生物學(xué)化驗。
內(nèi)皮細胞化驗以上制備的華千金藤提取物(即在截止點為1000MW或3500MW的管中透析后再進行凍干的)被用于一種內(nèi)皮細胞化驗之中(即CAPE)，可根據(jù)Connally等人的《模擬生物化學(xué)》(1986年)152136-140及修改稿中介紹的程序進行(Liang和Wong(2000)，《血管新生從分子到綜合的藥理學(xué)》，由Maragoudakis、Kluwer Academic/Plenum出版社編輯出版，紐約pp209-223)。為了比較之目的，這種凍干的粗提取物(即在4℃或100℃的溫度下提取后未透析的物質(zhì))也用于生物測定。
內(nèi)皮細胞培養(yǎng)化驗的結(jié)果如表1所示。經(jīng)發(fā)現(xiàn)，華千金藤提取物可以抑制內(nèi)皮細胞的增長。這一內(nèi)皮細胞化驗的結(jié)果表明，把華千金藤提取物加入到內(nèi)皮細胞化驗中，可以有效地抑制內(nèi)皮細胞的增長。在化驗中，4℃條件下的華千金藤提取物在透析前引起內(nèi)皮細胞生長90.85％之抑制率，然后3.5K的滯留物表現(xiàn)出93.29％的抑制率，1.0K的滯留物則為93.35％之抑制率。此結(jié)果強烈地顯示，在低溫條件下提取的華千金藤提取物是一種非常有效的內(nèi)皮細胞增長抑制劑。而高溫條件下(100℃)制備的華千金藤提取物也表明了較高的抑制性能(透析前為71％，其3.5K的滯留物為60.98％，其1.0K的滯留物為67.54％)。然而，高溫條件下的提取物表現(xiàn)出來的效果比低溫提取物的效果在產(chǎn)生具有抗血管新生的活性中要差一些。
表1高低溫條件下制備華千金藤提取物之內(nèi)皮細胞生長抑制率

采用凍干的華千金藤水溶性提取物(提取溫度在4℃)之1.0K保留物在抑制內(nèi)皮細胞增生的效果上與其濃度的依賴關(guān)系，如圖1所示。
實施例2作為測定華千金藤提取物藥劑量的一個動物模型范例，我們選擇了幾組裸鼠(Balb/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy加拿大)，每組都采用皮下注射的方式嫁接約105到109高增生狀態(tài)的細胞，其定義如本文所述。當(dāng)嫁接完成后，通過在嫁接的周圍采用皮下注射的方式投入提取物。測定嫁接尺寸減少的大小可以采用維內(nèi)爾測徑器每周檢查兩次。
實施例3其中，我們提供了測定本發(fā)明提取物在治療關(guān)節(jié)炎癥時的藥劑效果。受試者為美國緬因州杰克遜實驗室的MRL/lpr老鼠(MRL/MpJ-Faslpr)，其對試驗或監(jiān)測本發(fā)明提取物治療關(guān)節(jié)炎癥的功效非常有用。老鼠投入了提取物后，在X光線的監(jiān)控下，動物的關(guān)節(jié)和后腿的腫脹明顯減少，軟骨退化也有所下降，這都充分表明了這一提取物對治療關(guān)節(jié)炎癥的積極效果。
實施例4其中，我們還提供了采用動物模型測定本發(fā)明提取物在治療關(guān)節(jié)炎癥時的藥劑效果的另外一個例子。受試者為幾組Lewis老鼠(年齡8周；重30-150g，來自美國緬因州杰克遜實驗室)，采用二類(BII)牛骨膠原進行免疫處理以誘發(fā)關(guān)節(jié)炎癥狀。BII在400ug/ml的條件下在0.1M的乙酸中溶解。每只老鼠都在尾巴的底部皮內(nèi)注射了20ug(100ul)的一種乳劑，其中BII和ICFA(不完全Freund之佐劑)的量相等。當(dāng)確定了關(guān)節(jié)炎癥狀時，將本發(fā)明中的華千金藤提取物投入到老鼠體內(nèi)，然后按四級評分制對多種誘導(dǎo)性鼠體疾病進行為期28天的觀察，結(jié)果顯示，這種提取物對治療關(guān)節(jié)炎癥有效。
權(quán)利要求
1.一種含有華千金藤提取物的產(chǎn)品。
2.權(quán)利要求1的產(chǎn)品，其中，這種提取物是通過將華千金藤塊莖根投入到極性有機溶劑中制備的。
3.權(quán)利要求2的產(chǎn)品，其中，這種提取物是通過將華千金藤塊莖根之根肉投入到極性有機溶劑中制備的。
4.權(quán)利要求1中的產(chǎn)品，其中，這種提取物是通過將華千金藤塊莖根投入到含水介質(zhì)之中制備的。
5.權(quán)利要求4中的產(chǎn)品，其中，這種提取物是通過將華千金藤塊莖根之根肉投入到含水介質(zhì)之中制備的。
6.權(quán)利要求5中的產(chǎn)品，其中，含水介質(zhì)是二次蒸餾水。
7.權(quán)利要求1中的產(chǎn)品，不包含分子重量為200到400的任何化合物。
8.權(quán)利要求1中的產(chǎn)品，不包含分子重量為300到400的任何化合物。
9.抑制內(nèi)皮細胞病理性生長的一種方法，包括將權(quán)利要求1產(chǎn)品中一定量的生長抑制劑投入到內(nèi)皮細胞之中。
10.權(quán)利要求9中的方法，其中，內(nèi)皮細胞在組織和器官內(nèi)，可以取得抑制組織或器官中新血管形成的效果。
11.權(quán)利要求9中的方法，其中，該產(chǎn)品被投入到體外的內(nèi)皮細胞之中。
12.權(quán)利要求9中的方法，其中，該產(chǎn)品被投入到體內(nèi)的內(nèi)皮細胞之中。
13.權(quán)利要求12中的方法，其中，通過把有效量的藥劑投放給患者，該產(chǎn)品被投入到內(nèi)皮細胞之中。
14.權(quán)利要求13中的方法，其中，患者需要抑制其病理性血管新生。
15.權(quán)利要求14中的方法，其中，對患者治療有效的病癥選自如下的病癥，包括關(guān)節(jié)炎、基于新血管形成的皮膚病癥狀、糖尿病視網(wǎng)膜病變、老年黃斑病變、再狹癥、毛細血管擴張、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、創(chuàng)傷性肉芽、血管纖維瘤、遺傳性出血性毛細血管擴張癥、心肌血管新生、牛皮癬、硬皮病及由病理性血管形成或新血管形成相關(guān)的炎癥。
16.權(quán)利要求14中的方法，其中，關(guān)節(jié)炎是指風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎，與病理性血管新生或新血管形成有關(guān)的炎癥指牛皮癬或痔瘡。
17.權(quán)利要求13中的方法，其中，接受治療者為哺乳動物。
18.權(quán)利要求17中的方法，其中，哺乳動物為寵物、家畜或人類患者。
19.權(quán)利要求13中的方法，其中，接受治療者患有癌癥，且癌細胞轉(zhuǎn)移得到了預(yù)防、阻止、減少、減緩或推遲。
20.一種用來抑制新血管形成或內(nèi)皮細胞生長的藥劑之篩選方法包括以下步驟a.將試驗藥劑與細胞或組織樣本接觸；b.將分離的細胞或組織樣本與有效藥物劑量的權(quán)利要求1的產(chǎn)品接觸；以及c.比較步驟a)樣本中的內(nèi)皮細胞增長和步驟b)樣本中的內(nèi)皮細胞增長，其中，步驟a)中用以抑制內(nèi)皮細胞增長的任何試驗藥劑與步驟b)中的幾乎一樣，都可以用做抑制新血管形成或內(nèi)皮細胞病理性增長的藥劑。
21.治療患者病理性新血管形成相關(guān)的疾病的藥盒，包括藥用有效量的權(quán)利要求1產(chǎn)品以及治療用說明書。
22.一種制備權(quán)利要求1中產(chǎn)品的方法，包括以下步驟a，把華千斤藤或其部分投入到溶劑中，形成液體部分和固態(tài)部分，然后b，把液體部分與至少一些固態(tài)部分分離開來，以獲得作為本產(chǎn)品的液體物質(zhì)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中，步驟b后，溶劑被除去，從而獲得了本產(chǎn)品的固態(tài)物質(zhì)。
24.權(quán)利要求22中的方法，其中，溶劑指一種極性有機溶劑或含水介質(zhì)。
25.權(quán)利要求24中的方法，其中，溶劑是一種醇。
26.權(quán)利要求25中的方法，其中，溶劑是甲醇或乙醇。
27.權(quán)利要求24中的方法，其中，溶劑指含水介質(zhì)。
28.權(quán)利要求27中的方法，其中，溶劑是含水緩沖液。
29.權(quán)利要求27中的方法，其中，溶劑是水。
30.權(quán)利要求29中的方法，其中，溶劑是二次蒸餾水。
31.權(quán)利要求22的方法，其中，步驟a)是通過將華千金藤的塊莖根或其部分投入到溶劑之中完成的，以形成液體部分及固態(tài)部分。
32.權(quán)利要求31的方法，其中，步驟a)是通過將華千金藤的塊莖根根肉投入到該溶劑之中，以形成液體部分及固態(tài)部分。
33.權(quán)利要求32中的方法，其中，根肉在投入到溶劑之前或期間被壓碎、過篩或磨碎。
34.權(quán)利要求22中的方法，其中，步驟b是通過把液體部分與所有的固態(tài)部分分離開來而完成的，以獲得本產(chǎn)品的液體物質(zhì)。
35.權(quán)利要求22中的方法，其中，步驟a是通過把華千金藤塊莖根之表皮與根肉分離，并壓碎、磨碎或過篩成片狀，把這些片狀物投入到二次蒸餾水中，形成液體和固態(tài)殘留物的混合物而完成的；步驟b是通過把液體與固體殘留物分離來完成的，以獲得本產(chǎn)品的液體物質(zhì)。
36.權(quán)利要求35中的方法，其中，采用離心法將步驟b中的液體與固態(tài)殘留物分離，然后傾析產(chǎn)生的上清液作為產(chǎn)品。
37.權(quán)利要求36中的方法，其中，在步驟b的傾析后，將分子重量約300到500的化合物從上清液中除去，得到液體產(chǎn)物。
38.權(quán)利要求36中的方法，其中，采用透析法，將分子重量約200到400的化合物從上清液中除去。
39.權(quán)利要求37中的方法，其中，將水從傾析后的上清液中除去，得到本產(chǎn)品的固體物質(zhì)。
40.一種藥用組合物，包括權(quán)利要求1中的產(chǎn)品和醫(yī)學(xué)上可以接受的藥劑載體。
41.權(quán)利要求40中的藥用組合物，進一步包括至少一種其它有效藥劑。
42.權(quán)利要求41中的藥用組合物，其中，至少一種其它藥劑是至少一種類固醇、非類固醇抗炎藥物、硫代蘋果酸鈉、金硫葡糖、D-青霉胺、氯喹、羥基氯喹、硫氮磺吡啶、咪唑硫嘌呤、或抗腫瘤藥劑。
43.權(quán)利要求42中的藥用組合物，其中，至少一種其它藥劑選自下列藥劑中的至少一種，如α干擾素、β干擾素、γ干擾素、2號白介素、阿地白介素、惠而血添(重組人粒細胞集落刺激因子)、沙格司亭(重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)、左咪唑、BCG疫苗、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟脫氧尿苷、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、pentastatin、阿氟酸、克拉屈賓、二氟胞嘧啶、二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、左旋溶肉瘤素、洛莫司汀、亞硝(基)脲氮芥、司莫司汀、鏈佐星、氮烯咪胺、白消安、三胺硫磷、六甲蜜胺、異環(huán)磷酰胺、順鉑、碳鉑、甲基芐肼、放線菌素D、普卡霉素、博來霉素、亞德里亞霉素、道諾霉素、去甲柔紅霉素、mitoxanthrone、絲裂霉素、長春新堿、長春堿、長春瑞賓、依托泊甙、替尼泊甙、太平洋紫杉醇、鹽酸拓撲替康、天(門)冬酰胺酶、羥基脲、氯苯二氯乙烷、地塞米松、氨格魯米特、雌二酮、乙烯雌酚、羥孕酮、甲孕酮、甲地孕酮、睪丸激素、氟羚甲基睪丸素、它莫西芬、亮丙瑞林和氟他胺片。
44.權(quán)利要求12中的方法，進一步包括向患者施用一種抗癌療法或另一種抗血管新生或新血管形成療法。
45.權(quán)利要求44中的方法，其中，抗癌癥療法為放射性療法。
46.權(quán)利要求14中的方法，其中，接受治療者所患有的卡波西氏肉瘤或血管纖維瘤的治療取得了實效。
47.權(quán)利要求13中的方法，其中，接受治療者患有腫瘤，且這一腫瘤的治療取得了實效。
48.權(quán)利要求13中的方法，其中，接受治療者患有腫瘤，且腫瘤的生長被減少或抑制。
49.權(quán)利要求48中的方法，其中，這種腫瘤是一種固態(tài)腫瘤。
50.權(quán)利要求49中的方法，其中，這種腫瘤是一種固態(tài)癌。
全文摘要
本發(fā)明提供了華千金藤提取物用于抑制、干擾和/或控制細胞組織的病理性血管新生或新血管形成的方法。通過把有效量的華千金藤提取物送入到細胞或組織中，本發(fā)明還提供了一種抑制組織中新血管形成的方法。這里提供的還有一種通過向接受治療者投入有效量的華千金藤提取物而治療內(nèi)皮細胞和/或新血管形成相關(guān)的一種疾病之方法。
文檔編號A61K36/59GK1738634SQ200380108790
公開日2006年2月22日 申請日期2003年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月15日
發(fā)明者汪建平, 汪明中 申請人:汪建平, 汪明中