專利名稱：β－葡聚糖在抵抗生物戰(zhàn)爭武器和包括炭疽在內(nèi)的病原體中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對生物戰(zhàn)爭武器的傷害的預(yù)防或治療，尤其涉及炭疽等病原性生物感染的預(yù)防和治療。
背景技術(shù)：
炭疽桿菌(Bacillus anthracis)，或炭疽是當(dāng)今最令民防計(jì)劃者擔(dān)心的潛在生物戰(zhàn)劑之一。這種生物可制造有效的生物恐怖武器，因?yàn)槠渚哂泻芨叩乃劳雎?，制備簡單且易于以芽孢顆粒的形式儲存，并可作為氣霧劑的形式在廣大的區(qū)域內(nèi)傳播。Thomas V.Inglesby等.，″Anthrax as a biologicalweaponMedical and Public Health Management.″JAMA，281(18)1735-1745(1999)。這使炭疽被美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)定為A類(高優(yōu)先級)試劑。
生物戰(zhàn)劑的散播可發(fā)生于氣霧劑噴射、爆炸、或食物或水污染。作為一種有效的生物武器，空氣傳播的病原體必須分散成尺寸小于5μm的精細(xì)顆粒。生物試劑的氣霧化傳播不需要先進(jìn)的傳播系統(tǒng)，可用農(nóng)業(yè)的農(nóng)藥散播機(jī)、小船或卡車上的氣霧劑發(fā)生器、背包噴射器、甚至是錢包大小的香水噴霧器進(jìn)行散播。生物武器進(jìn)攻很可能是隱蔽的，收到警報(bào)后或一旦懷疑生物戰(zhàn)劑已經(jīng)或?qū)⒁褂?，就?yīng)采取保護(hù)措施。CDC建議在鑒定所用特定生物戰(zhàn)劑之前，先使用廣譜抗生素應(yīng)對生物戰(zhàn)進(jìn)攻的可能傷害。
CDC對生物戰(zhàn)劑分有三個(gè)類別。A類生物戰(zhàn)劑是最嚴(yán)重的。美國公共衛(wèi)生系統(tǒng)和基層醫(yī)護(hù)提供者必須為應(yīng)對這些生物試劑做好充分準(zhǔn)備，這些生物試劑包括在美國很少見的病原體。作為高優(yōu)先級，A類試劑包括對國家安全造成危險(xiǎn)的生物，因?yàn)樗鼈円子谏⒉セ蛟谌伺c人之間傳播，導(dǎo)致高死亡率，具有對公眾健康造成較大影響的潛力，可能導(dǎo)致公眾恐慌和社會混亂，并需要為公共衛(wèi)生預(yù)備采取特殊行動(dòng)。這些試劑/疾病包括炭疽桿菌(Bacillus anthracis)(炭疽)，肉毒桿菌毒素(Clostridium botulinum toxin)(肉毒中毒)，鼠疫桿菌(Yersinia pestis)(鼠疫)，大天花(Variola major)(天花)，野兔熱弗朗西絲菌(Francisella tularensis)(兔熱病)，和病毒性出血熱。
接下來是B類生物戰(zhàn)劑。這是第二高優(yōu)先級試劑，包括那些中度容易散播，導(dǎo)致中度發(fā)病率和低死亡率，需要特異性增強(qiáng)CDC診斷能力和加強(qiáng)疾病監(jiān)督。這些試劑/疾病包括伯納特柯克斯體(Coxiella burnetti)(Q熱)，布魯菌屬(Brucella species)(布魯菌病)，鼻疽假單胞菌(Burkholderiamallei)(鼻疽病)，源于蓖麻(Ricinus communis)的蓖麻子蛋白毒素(蓖麻子)，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌(Clostridium perfringens)的ε毒素，葡萄球菌腸毒素B。
最后，是C類生物戰(zhàn)劑。這些是第三高優(yōu)先級試劑，包括新型病原體，因?yàn)檫@些新型病原體具有可用性、易于生產(chǎn)并傳播、并有可能具有高發(fā)病率、死亡率和重大健康影響，因此在將來可通過改造而在大范圍散播。這些試劑/疾病包括Nipah病毒(Nipah virus)，漢灘病毒(hantaviruses)，蜱傳出血熱病毒，蜱傳腦炎病毒，黃熱病(yellow fever)，和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(結(jié)核病)。
A類生物戰(zhàn)劑的一個(gè)例子是炭疽桿菌B.anthracis。炭疽桿菌是一種好氧革蘭氏陽性桿菌，通常感染食草動(dòng)物并導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)常是致死的疾病。芽孢產(chǎn)生于30℃以下的土壤和無生命的物體上，但不產(chǎn)生于活組織中。芽孢可在有限時(shí)間段內(nèi)抵御100℃以上的溫度，這使它們能高度持久。人類可因接觸被感染的動(dòng)物或動(dòng)物產(chǎn)品而獲得此疾病。一旦進(jìn)入體內(nèi)，芽孢萌發(fā)成為“生長的(vegetative)”或活躍分裂的細(xì)胞。芽孢或被感染組織與破損皮膚之間的直接接觸導(dǎo)致皮膚炭疽。接觸后的2到5天內(nèi)，形成小丘疹，然后是被水腫包圍的壞死性潰瘍。治療后的死亡很少見，但未治療人群的死亡率將近20％。攝入未熟透的肉類可以導(dǎo)致胃腸炭疽。在12到18小時(shí)內(nèi)可繼發(fā)惡心、嘔吐及胃腸出血，并導(dǎo)致出血性淋巴炎?？赡馨l(fā)生向血流的傳播并繼發(fā)死亡。
吸入性炭疽是生物戰(zhàn)爭應(yīng)用中最可能的疾病形式，也是最危險(xiǎn)的?，F(xiàn)有的關(guān)于人類對吸入性炭疽反應(yīng)的大量可用數(shù)據(jù)是1979年在前蘇聯(lián)斯維爾德洛夫斯克(Sverdlovsk)的一個(gè)軍用微生物設(shè)備中炭疽孢子意外霧化釋放的結(jié)果，導(dǎo)致了至少79例炭疽感染并且68例死亡。吸入炭疽孢子導(dǎo)致感染的最嚴(yán)重形式，在感染后1至5天內(nèi)導(dǎo)致類似感冒的癥狀。吸入性炭疽的早期診斷是困難的并需要高懷疑指數(shù)，因?yàn)樵摷膊〉牡谝浑A段是相對良性的。然而，第二階段突然發(fā)生，伴有突然發(fā)熱、呼吸困難、發(fā)汗和休克，導(dǎo)致巨大淋巴結(jié)病和出血性腦膜炎。在疾病的第二階段，發(fā)紺和低血壓迅速發(fā)展，有時(shí)幾小時(shí)內(nèi)即發(fā)生死亡。Franz D.R.，等，″Clinicalrecognition and management of patients exposed to biological warfare agents.″JAMA，278，399-411(1997)。因?yàn)榧膊“l(fā)展迅速且初始癥狀相對溫和，吸入性炭疽?guī)缀蹩偸侵旅?。Fritz等，Lab.Invest.，73，691-702(1995)。
炭疽桿菌感染的病理尚未完全了解。在最基本的水平上，通常血液中的過量復(fù)制是死于炭疽病人的死因。炭疽桿菌如此成功擴(kuò)張的能力部分來自于其致病因子的產(chǎn)生，該致病因子可深度抑制免疫系統(tǒng)。炭疽桿菌的主要致病因子是一種抑制免疫系統(tǒng)巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞攝入和破壞作用的聚-D-谷氨酸莢膜和外毒素。外毒素由三種蛋白成分組成；保護(hù)性抗原(PA)，致死因子(LF)，和水腫因子(EF)。Ballard等，PNAS，93，12531-12534(1996)。這些蛋白協(xié)同作用但并不總是結(jié)合在一起。保護(hù)性抗原結(jié)合于細(xì)胞表面以觸發(fā)一種內(nèi)涵體的形成，該內(nèi)涵體用于傳輸水腫因子和致死因子通過胞內(nèi)膜進(jìn)入靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。水腫因子擾亂通過細(xì)胞膜的離子和水流，促發(fā)腫脹。致死因子是一種蛋白酶，其精確的作用機(jī)理仍然未知。Brossier等，Infect.Immun.，68，1781-1786(2000)。然而，已知致死毒素抑制巨噬細(xì)胞釋放免疫信使白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、γ干擾素、和腫瘤壞死因子α(TNF-α)。
巨噬細(xì)胞在炭疽桿菌等許多用作生物戰(zhàn)劑的病原生物的成功與否中起著關(guān)鍵作用。通過吞噬作用，巨噬細(xì)胞是與炭疽桿菌最先相互作用的細(xì)胞。在鼠吸入模型中從肺巨噬細(xì)胞的吞噬體隔室中分離出來的囊泡是芽孢萌發(fā)的最初位點(diǎn)。Guidi-Rontani等，Mol Microbiol.，31，9-17(1999)。巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)抵御炭疽桿菌等病原體感染的宿主防御反應(yīng)，如細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒。萌發(fā)后毒性基因表達(dá)的早期開始是巨噬細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)鍵決定因素。LF蛋白對于巨噬細(xì)胞是溶解性的，亞溶解劑量的LF導(dǎo)致氧化一氮(NO)的減少和腫瘤壞死因子(TNF)的產(chǎn)生。Pellizzari等，F(xiàn)EBSLetters，462，199-204(1999)。另一方面，Hanna等人揭示亞溶解濃度的LF可通過活化的巨噬細(xì)胞而增加IL-1的生成。Hanna，等PNAS，90，10198-10201(1993)。隨著巨噬細(xì)胞的激活，自然殺傷(NK)細(xì)胞和T細(xì)胞也積極參與了抵御炭疽等疾病的保護(hù)。與抗原初次接觸后，觀察到NK細(xì)胞活性上升，然后是其顯著的抑制。Soloklin等，Zhurnal Mikrobiologii Epi.Immune.，5，72-76(1995)。應(yīng)用抗炭疽等病原體的保護(hù)性抗體可增加NK細(xì)胞活性的持續(xù)時(shí)間。這暗示巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞在抵御炭疽等生物戰(zhàn)劑的宿主防御機(jī)理中起主要作用。
另一方面，β-葡聚糖是一種復(fù)雜的碳水化合物并顯示出作為免疫調(diào)節(jié)劑的潛力。其通常從幾種來源得到，包括酵母、細(xì)菌、真菌和谷粒。這些來源提供有多種混合物和純度的β-葡聚糖，并有多種不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)多樣性源自葡萄糖分子可經(jīng)許多不同方式相連的事實(shí)，導(dǎo)致了具不同物理特性的化合物。例如，從細(xì)菌和藻類分離的β(1，3)-葡聚糖是線型的，這使其作為食品增稠劑很有用。香菇多糖(來自香菇(Lentinusedodes)，擔(dān)子菌(Basidiomycete)科)是一種高分子量(MW)β-葡聚糖，在(1，3)主鏈上每三個(gè)殘基含有一個(gè)單葡萄糖支鏈連于(1，6)-β端。裂裥菌素(來自Schizophyllum commune，擔(dān)子菌科)是類似的β-葡聚糖。來自大麥、燕麥或小麥的β-葡聚糖在主鏈上有混合的(1，3)-和(1，4)-β連接，但沒有(1，6)-β分支，且通常是高分子量。側(cè)鏈的頻率，通稱置換度或分支頻率，調(diào)節(jié)二級結(jié)構(gòu)和溶解度。由酵母分離的β-葡聚糖具有β(1-3)連接的葡萄糖單元的主鏈，該主鏈具有低水平的通過β(1-6)連接的分子間和分子內(nèi)分支。基于大量發(fā)表的研究，公認(rèn)面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)是優(yōu)選的β(1，3)-葡聚糖來源，這基于其所得產(chǎn)物的純度和活性。
S.cerevisiae的細(xì)胞壁主要含有β-葡聚糖，起支持其形狀和機(jī)械強(qiáng)度的作用。雖然其作為食品級生物的應(yīng)用最為人知，酵母還用于作為酵母聚糖的來源，酵母聚糖是一種用于刺激非特異性免疫應(yīng)答的不溶性粗提物。酵母的酵母聚糖可作為β(1-3)葡聚糖的豐富來源。酵母分離的β(1-3)葡聚糖似乎可刺激免疫系統(tǒng)，部分是通過激活先天免疫系統(tǒng)作為機(jī)體抵抗真菌感染的基本防御部分。酵母β(1，3)-葡聚糖是一種多糖，主要由β(1-3)-連接的葡萄糖分子組成并含周期性的經(jīng)β(1-6)連接的β(1-3)分支，更正式的名稱是聚-(1，6)-β-D-吡喃(型)葡萄糖酰-(1，3)-β-D-吡喃(型)葡萄糖(poly-(1，6)-β-D-glucopyranosyl-(1，3)-β-D-glucopyranose)。
制備了具不同性質(zhì)的多種形式的β(1，3)-葡聚糖。這些不同形式的差異在于它們的純度、顆粒尺寸和溶解度。β-葡聚糖的一種較大且較難溶的形式是全葡聚糖顆粒(whole glucan particle)。全葡聚糖顆粒是酵母細(xì)胞壁殘骸，其制備是從生長培養(yǎng)基中分離生長中的酵母，用堿處理完整的細(xì)胞壁，除去不需要的蛋白和核酸物質(zhì)，以及細(xì)胞壁的甘露聚糖成分。通常，剩下的是純化的2-5微米球形β-葡聚糖顆粒。全葡聚糖顆?？蓮娜魏魏暇厶堑恼婢?xì)胞壁資源中獲得，但優(yōu)選的來源是S.cerevisiae。生產(chǎn)全葡聚糖顆粒的方法在本領(lǐng)域公知且公布于美國專利No.4,810,646，4,4992,540，5,037,972，5,082,936，5,250,436和5,506,124，其中所有內(nèi)容在此結(jié)合一并作為參考。
β(1-3)葡聚糖另外一種被進(jìn)一步處理過的形式是PGG葡聚糖，它是全化學(xué)名稱聚-(1，6)-β-D-比喃(型)葡萄糖酰(1，3)-β-D-比喃(型)葡萄糖(poly-(1，6)-β-D-glucopyranosyl-(1，3)-β-D-glucopyranose)的簡寫。PGG葡聚糖(PGG)，在鹽水中的一種特殊制劑，以Betafectin為商標(biāo)。通常，中性未衍生的β(1，3)-葡聚糖在生理介質(zhì)中不溶，因?yàn)樗鼈兙哂行纬删o密相聯(lián)的三螺旋纖維的趨勢可抵抗水合作用。PGG由全葡聚糖顆粒制備，經(jīng)一系列酸、堿和中性處理步驟后生成構(gòu)象純的、三螺旋可溶性葡聚糖制劑，此制劑可在中性pH下保存于清澈溶液中。生產(chǎn)PGG的方法在本領(lǐng)域中公知并公布于美國專利Nos.5,322,841，5,811,542，5,663,324，5,633,369和5,817,643，其內(nèi)容在此結(jié)合一并作為參考。通過這種方法生產(chǎn)的可溶性葡聚糖是葡萄糖的帶分支聚合物，依來源生物和所用確切處理?xiàng)l件的不同而含多種比例的β(1-3)和β(1-6)連接。PGG-葡聚糖分子的平均重量通常在約5,000到500,000道爾頓。
微粒葡聚糖是精制的葡聚糖以生產(chǎn)更小片段的全葡聚糖顆粒。生產(chǎn)微粒β-葡聚糖的方法公布于美國專利Nos.5,223,491，5,397,773，5,576,015，5,702,719和5,705,184，其中內(nèi)容在此一并作為參考。用于制備微粒葡聚糖的β(1，3)-葡聚糖是通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的傳統(tǒng)方法從酵母菌細(xì)胞壁分離的。微粒葡聚糖通常的平均粒徑優(yōu)選約1.0微米或更小，更優(yōu)選約0.20微米或更小。
β葡聚糖具有多種多樣的活性。β-葡聚糖增強(qiáng)非特異性免疫和感染抗性的能力與內(nèi)毒素相似。早期關(guān)于β(1，3)-葡聚糖對免疫系統(tǒng)作用的研究集中于小鼠。后來的研究表明β(1，3)-葡聚糖在許多其它種群中具有強(qiáng)烈的免疫刺激活性，包括蚯蚓、蝦、魚、雞、大鼠、兔、豚鼠、羊、豬、牛和人類。綜述見Vetvicka V.“β-glucans as immunomodulators″，JANA，3，24-31(2001)?；谶@些研究作出結(jié)論，β(1，3)葡聚糖代表了一種活躍于進(jìn)化譜中的免疫促進(jìn)劑，可能代表了一種直接抵御真菌病原體的進(jìn)化上保守的先天免疫應(yīng)答。然而，盡管有大量研究，仍未能就用作免疫刺激劑的β(1，3)-葡聚糖的理想來源、尺寸和形式取得共識。
已經(jīng)有一些關(guān)于應(yīng)用β-葡聚糖預(yù)防感染的研究，主要在外科膿毒病的范圍內(nèi)。例如，Williams等評估了實(shí)驗(yàn)性膿毒病治療中用β-葡聚糖和抗生素(慶大霉素)進(jìn)行的組合免疫調(diào)節(jié)的作用。Williams等，″Synergistic effectof nonspecific immunostimulation and antibiotics in experimentalperitonitis″Surgery，，102(2)，208-14(1987)。這個(gè)特別的實(shí)驗(yàn)注意到預(yù)期大腸桿菌(E.coli)接種后單獨(dú)的β-葡聚糖治療對長期存活無有利影響。Kaiser進(jìn)行了相似的研究，他用PGG葡聚糖和頭孢唑啉(cefazoline)抗生素協(xié)同地預(yù)防葡萄球菌傷口感染。Kaiser A.B，Kemodle D.S.，″Synergismbetween poly-(1-6)-beta-D-glucopyranosyl-(1-3)-beta-D-glucopyranose glucanand cefazolin in prophylaxis of staphylococcal wound infection in a guinea pigmodel″，Antimicrob.Agents Chemother.，42(9)，2449-51(1998)。
β-葡聚糖的分子作用機(jī)理似乎包括嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞細(xì)胞膜上的特異性β-葡聚糖受體結(jié)合位點(diǎn)。甘露聚糖、半乳聚糖、α(1-4)連接的葡萄糖聚合物和β(1-4)連接的葡萄糖聚合物對此受體沒有親合力。近來的數(shù)據(jù)暗示CR3，C3補(bǔ)體蛋白的受體，起到β-葡聚糖主要受體的作用。結(jié)合到β-葡聚糖受體上的配基導(dǎo)致補(bǔ)體激活、吞噬作用、溶酶體酶釋放，以及前列腺素、促凝血素和白細(xì)胞三烯生成，提供了一個(gè)更加功能化的先天免疫系統(tǒng)來抵御廣泛的病原體攻擊。
近來增強(qiáng)的生物恐怖威脅，其可能導(dǎo)致一種或多種病原生物的廣泛散播，增強(qiáng)了我們的認(rèn)識即我們只擁有較少可用的預(yù)防和治療手段來保護(hù)美國公眾。1970年，一個(gè)世界衛(wèi)生組織(WHO)專家委員會估計(jì)在一個(gè)5百萬人口的發(fā)達(dá)城市通過飛機(jī)投放50公斤炭疽將導(dǎo)致250,000傷亡，如無治療預(yù)期其中100,000將會死亡。Health Aspects of Chemical and BiologicalWeapons，Geneva，Switzerland，WHO；98-99(1970)。一份來自美國國會技術(shù)評估局(Congressional Office of Technology Assessment)1993年的報(bào)告估計(jì)在華盛頓上風(fēng)處噴霧投放100公斤炭疽芽孢將引起130,000到3,000,000人死亡-致死率達(dá)到或超過了氫彈爆炸的結(jié)果。技術(shù)評估局，美國國會，Office of Technology Assessment，US Congress，Washington，DC，″Proliferation of Weapons of Mass Destruction″，US Government PrintingOffice，53-55(1993).
炭疽作為生物武器恐怖投放的第一證據(jù)將可能是尋求吸入性炭疽醫(yī)學(xué)治療的病人。一個(gè)城市或地區(qū)內(nèi)突然出現(xiàn)大量病人，具急性發(fā)作的感冒樣疾病且致死率達(dá)80％或更高，近一半的死亡發(fā)生在24到48小時(shí)內(nèi)，這些提示炭疽或肺鼠疫投放的高度可能性。診斷炭疽的快速診斷檢測，如對保護(hù)性抗原的酶聯(lián)免疫吸收劑分析和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，只在國家參考實(shí)驗(yàn)室才有。其它生物戰(zhàn)劑會同樣難于以及時(shí)的方式應(yīng)對。
傳統(tǒng)的抗微生物治療，比如抗生素，可用于治療一些生物恐怖病原體，但通常對保護(hù)公眾在接觸傳染源前免于感染沒有用處?？股厝绛h(huán)丙沙星(一種氟喹諾酮抗生素)和多西環(huán)素(一種四環(huán)素抗生素)對治療炭疽有用處；然而，即使用多種抗生素對預(yù)防有癥狀的病人死于感染也經(jīng)常是不夠的。此外，已有報(bào)告發(fā)表稱俄羅斯科學(xué)家一直在改造炭疽桿菌菌株以抵御抗生素。預(yù)防性地施用疫苗，如Ivins等公布于美國專利No.6,387,665，提供了保護(hù)公眾免于感染的另一個(gè)方法。例如，一種美國炭疽疫苗，由失活的無細(xì)胞產(chǎn)物制成，已被指定給所有美國軍隊(duì)現(xiàn)役和預(yù)備役人員。不幸的是，一種疫苗只能抵御單一的微生物而不能對多種可能的病原性恐怖威脅提供廣泛的抵御保護(hù)。而且，不建議廣泛接種疫苗來保護(hù)普通公眾，因?yàn)橐呙绻?yīng)有限，且是否以不利副作用的風(fēng)險(xiǎn)來評判其廣泛應(yīng)用仍存在爭論。開發(fā)安全有效的治療方法的期限和提供經(jīng)濟(jì)的途徑使這些治療方法用于大規(guī)模軍隊(duì)和市民人口也是個(gè)重要問題。因而，很明顯需要的是一種方法來抵御生物戰(zhàn)爭，這種方法在接觸傳染源之前和之后施用都能增加存活率，并且能對多種可能的生物戰(zhàn)劑提供有效的防御，以及對于提供給廣大公眾來說并不昂貴，還要易于存儲很長的時(shí)間。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種策略以廣泛保護(hù)軍隊(duì)和公眾免受生物戰(zhàn)爭武器的傷害，尤其是炭疽等傳染劑。申請者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種方法，在此方法中β-葡聚糖，尤其是全葡聚糖顆粒、PGG葡聚糖和微粒葡聚糖提供了一種優(yōu)秀的方法以對生物戰(zhàn)爭武器提供防御，因?yàn)樗鼈兲峁┝艘话阈悦庖?general immune)增強(qiáng)，從而提供了對多種生物威脅的增強(qiáng)了的防御。而且，β(1，3)-葡聚糖易于存儲，因?yàn)樗仁撬帉W(xué)穩(wěn)定的又相對緊密，這使它易于保存以備受到或懷疑有生物戰(zhàn)劑攻擊時(shí)使用。β(1，3)-葡聚糖使用還沒有顯著的副作用，這使其更容易應(yīng)用于不能確定生物攻擊或自然傳染病爆發(fā)是否發(fā)生的情況下。最后，(1，3)-葡聚糖除了單獨(dú)使用時(shí)有效外，還能增強(qiáng)疫苗和抗生素等其它醫(yī)療措施的效果。施用(1，3)-葡聚糖延長存活時(shí)間的能力暗示免疫調(diào)節(jié)介入也能為開始其它抗微生物治療提供時(shí)間。
應(yīng)用β-葡聚糖來廣泛保護(hù)公眾免于炭疽等多種病原微生物感染利用了β-葡聚糖的免疫系統(tǒng)增強(qiáng)作用。β-葡聚糖用于接觸前的預(yù)防用藥和/或作為接觸后治療法的一部分提供了暴露于病原性攻擊后保護(hù)公眾的兩種策略。β-葡聚糖用作免疫調(diào)節(jié)劑還能增強(qiáng)疫苗、免疫血清和/或抗生素等其它醫(yī)療措施的效果。
β(1-3)葡聚糖的抗感染活性是通過刺激白細(xì)胞的殺微生物活性介導(dǎo)的，這些白細(xì)胞主要是先天免疫系統(tǒng)的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞。雖然不打算限于理論，這種免疫刺激似乎通過兩種不同機(jī)理發(fā)生。首先，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞在β(1，3)-葡聚糖結(jié)合到其細(xì)胞表面補(bǔ)體受體類型3(CR3)后被激發(fā)出細(xì)胞毒性活性。CR3的激活需要同時(shí)結(jié)合iC3b(一種補(bǔ)體蛋白)和一種二級刺激，如β(1，3)-葡聚糖。由于炭疽等細(xì)菌缺少β(1，3)-葡聚糖，因此提供這種聚糖有利于形成對受iC3b調(diào)理了的外界物質(zhì)的增強(qiáng)的先天免疫應(yīng)答。其次，β(1，3)-葡聚糖結(jié)合能交聯(lián)呈遞于多種白細(xì)胞細(xì)胞膜上的糖脂受體，引起一系列細(xì)胞應(yīng)答。早期反應(yīng)，如由蛋白激酶C介導(dǎo)的Ca2+流入和轉(zhuǎn)錄因子激活，導(dǎo)致全面增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。這些應(yīng)答包括免疫細(xì)胞增殖和IL-1、IL-2和TNF-α等多種細(xì)胞因子的釋放。巨噬細(xì)胞的激活尤為重要，因?yàn)樗鼈兪堑钟饨缥镔|(zhì)的關(guān)鍵第一防線并被炭疽桿菌外毒素所抑制。
全身和口服施用β(1，3)-葡聚糖都能顯著提高暴露于炭疽等病原體的動(dòng)物的存活率。例如，據(jù)報(bào)道在使用傳統(tǒng)治療下，暴露于致死空氣傳播劑量炭疽人群的預(yù)期存活率只有20-30％。然而，本發(fā)明使用全葡聚糖顆粒或PGG-葡聚糖提供了＞80％的可能存活率。特定地，使用β(1，3)-葡聚糖使感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率從30％提高到80％，使致死性感染了炭疽的動(dòng)物的存活時(shí)間延長了2.5天，減少了存活的被感染動(dòng)物器官中的細(xì)菌負(fù)荷，并增加了無細(xì)菌動(dòng)物的比例。
總之，本發(fā)明提供了一種方法，通過施用預(yù)防有效量或治療有效量的β(1，3)-葡聚糖以預(yù)防生物戰(zhàn)劑對人類或動(dòng)物造成的傷害。在一個(gè)優(yōu)選的方案中，本發(fā)明提供了一種方法，通過施用預(yù)防或治療有效量或治療有效量的β(1，3)-葡聚糖來治療或預(yù)防感染在被一種或多種傳染劑感染的人或動(dòng)物中的發(fā)病。優(yōu)選地，所用的β(1，3)-葡聚糖是PGG-葡聚糖，全葡聚糖顆粒，微粒葡聚糖，或其組合。所述β(1，3)-葡聚糖可口服、局部、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)皮、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、或胃腸道施用。
在接觸感染之前或之后，β葡聚糖優(yōu)選施用的量從約0.1mg/Kg到約100mg/Kg PGG葡聚糖或約0.1mg/Kg到約500mg/Kg全葡聚糖顆粒，或其組合。更優(yōu)選地，β-葡聚糖施用量從約1mg/Kg到約10mg/Kg PGG葡聚糖或約2mg/Kg到20mg/Kg全葡聚糖顆粒，或其組合。
本發(fā)明對預(yù)期用于生物恐怖的類型的傳染劑感染提供有效的預(yù)防或治療。這些傳染劑包括CDC在A、B、C類生物戰(zhàn)劑中所列的試劑。這些傳染劑包括，但不限于，炭疽桿菌Bacillus anthracis(炭疽)，布魯菌病(Brucellosis)，鼻疽假單胞菌(Burkholderia mallei)(鼻疽)，霍亂，產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium Perfringens)毒素，剛果-克利米亞出血熱，埃博拉(Ebola)出血熱，類鼻疽，鼠疫桿菌(Yersinia pestis)瘟疫，Q熱，蓖麻毒蛋白，裂谷熱(Rift Valley Fever)，石房蛤毒素，天花，葡萄球菌腸毒素B，單端孢霉烯真菌毒素(Trichothecene Mycotoxins)，兔熱病，委內(nèi)瑞拉馬腦炎(Venezuelan Equine Encephalitis)，病毒性出血熱，Nipah病毒，漢灘病毒，黃熱病，多藥抗性結(jié)核病，馬爾堡病毒和登革熱病毒。在一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明提供一種治療和預(yù)防炭疽桿菌對人類或動(dòng)物的感染的方法。此外，全葡聚糖顆粒、PGG-葡聚糖和微粒葡聚糖有潛力提供一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑處理以預(yù)防或治療傳染劑所致感染，這些傳染劑可能不屬于生物恐怖，包括可能有藥物抗性和/或?qū)λ幬锩舾械膫魅緞?br> 除了提供一種治療和預(yù)防感染的方法，本發(fā)明還提供一種方法，通過施用預(yù)防或治療有效量的β(1，3)-葡聚糖來預(yù)防生物戰(zhàn)劑對人類或動(dòng)物的損傷。在優(yōu)選方案中使用的β-葡聚糖量與以上所列用于預(yù)防感染的量相同。在另一個(gè)方案中，本發(fā)明還提供方法，通過施用預(yù)防或治療有效量的β(1，3)-葡聚糖與抗生素的協(xié)同組合，或在接種針對生物戰(zhàn)劑的疫苗或用針對該生物戰(zhàn)劑的血清或單克隆抗體治療后再傳遞有效量的β(1，3)-葡聚糖，以預(yù)防生物戰(zhàn)劑對人類或動(dòng)物的損傷。
最后，本發(fā)明提供了一種β-葡聚糖的緊密組合物，該組合物可穩(wěn)定地室溫下儲存至少兩年。在一個(gè)優(yōu)選方案中，用于這種穩(wěn)定的、緊密的組合物的β-葡聚糖是全葡聚糖顆粒，它包含約80％量的所用組合物。擁有穩(wěn)定的抗感染試劑的可用性使β-葡聚糖在儲存以用于抵御可能的生物恐怖攻擊方面十分理想。
附圖簡述

圖1顯示了β-葡聚糖對接觸炭疽后存活時(shí)間的影響。
圖2顯示了β-葡聚糖處理后的小鼠在炭疽感染中存活的百分比。
圖3顯示了β-葡聚糖處理后肺中炭疽CFUs的減少。
圖4顯示了β-葡聚糖對無菌動(dòng)物百分比的影響。
圖5A顯示了預(yù)防性口服全葡聚糖顆粒治療法對致死性炭疽攻擊下存活率的影響。
圖5B顯示了預(yù)防性口服全葡聚糖顆粒治療法對致死性炭疽攻擊下存活率的影響。
圖6顯示了治療性口服全葡聚糖顆粒治療法對致死性炭疽攻擊下存活率的作用。
圖7顯示了全葡聚糖顆粒在室溫下兩年期間內(nèi)的穩(wěn)定性。
圖8顯示了C3-調(diào)理的酵母激活CR3同時(shí)需要iC3b結(jié)合和β-葡聚糖附著于凝集素位點(diǎn)。
圖9顯示了缺乏β-葡聚糖的細(xì)菌不觸發(fā)經(jīng)CR3的吞噬作用或脫粒作用。
圖10顯示可溶性β-葡聚糖結(jié)合到CR3后激活該受體觸發(fā)脫粒并破壞iC3b靶向的細(xì)菌或腫瘤細(xì)胞。
圖11顯示胃內(nèi)注射β-葡聚糖后脾內(nèi)巨噬細(xì)胞CR3激活的動(dòng)力學(xué)。
圖12顯示了β-葡聚糖和CR3依賴的刺激NK細(xì)胞分泌TNF-α。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了方法和組合物以預(yù)防或治療暴露于病原體后的感染，所述病原體如那些應(yīng)用于生物戰(zhàn)爭的病原體。在一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明提供方法和組合物以預(yù)防或治療暴露于炭疽桿菌后的感染，炭疽桿菌也稱為炭疽。
本發(fā)明中β葡聚糖所提供的抗感染性是對廣泛保護(hù)軍隊(duì)和公眾免受那些在生物戰(zhàn)爭中使用的病原體感染的有用策略。本發(fā)明的組合物包括β-葡聚糖。更明確地，本發(fā)明的組合物包括全葡聚糖顆粒，PGG-葡聚糖，微粒葡聚糖和其組合。PGG(聚-1-6-β-D-吡喃葡萄糖酰-1-3-β-D-吡哺葡萄糖)是一種高度純化的可溶性葡萄糖聚合物，由全葡聚糖顆粒酸水解制備。β-葡聚糖組合物還可包括適當(dāng)?shù)妮d體、賦形劑、和/或輔劑。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合物，包括一種或多種前述β-葡聚糖的形式，顯著提高了被感染動(dòng)物的存活率，包括那些被炭疽感染的動(dòng)物。
β-葡聚糖制劑的結(jié)構(gòu)-功能特性決定于其獲得的來源。β-葡聚糖的來源可以是酵母或其它真菌，或其它任何含有此處所述性質(zhì)的葡聚糖的來源。酵母細(xì)胞是葡聚糖的優(yōu)選來源。本方法中使用的酵母菌株可以是任何酵母的菌株，包括，例如，S.cerevisiae，S.delbrueckii，S.rosei，S.microellipsodes，S.carlsbergensis，S.bisporus，S.fermentati，S.rouxii，Schizosaccharomycespombe，Kluyveromyces polysporus，Candida albicans，C.cloacae，C.tropicalis，C.utilis，Hansenula wingei，H.arni，H.henricii，H.americana，H.canadiensis，H.capsulata，H.polymorpha，Pichia kluyveri，P.pastoris，P.polymorpha，P.rhodanensis，P ohmeri，Torulopsis bovina和T.glabrata。
酵母細(xì)胞可通過本領(lǐng)域公知的方法生產(chǎn)。典型的生長培養(yǎng)基包括，例如，葡萄糖，蛋白胨和酵母提取物。酵母細(xì)胞可通過用于從液體培養(yǎng)基中分離生物質(zhì)的典型方法從培養(yǎng)基中收獲和提取。這些方法典型地包括過濾或離心等固-液分離過程。在本發(fā)明中，細(xì)胞優(yōu)選收獲于對數(shù)生長期的中后期，以使酵母細(xì)胞中糖原和幾丁質(zhì)的含量最少。
如前所述，本發(fā)明中所用兩種β(1，3)-葡聚糖包括一種不溶性顆粒全葡聚糖顆粒，和一種可溶性產(chǎn)物，PGG-葡聚糖(PGG)。全葡聚糖顆?？稍谔崛〕黾?xì)胞蛋白、核酸、脂和大多數(shù)非葡萄糖基寡聚糖后從面包酵母細(xì)胞壁中純化。剩下的是高度純化的，2-10微米的球狀β(1，3)-葡聚糖顆粒，這些顆粒保留了其來源細(xì)胞中葡聚糖的完整三維體內(nèi)形態(tài)。
PGG(聚-(1，6)-β-D-吡喃葡萄糖酰-(1，3)-β-D-吡喃葡萄糖)是一種高度純化的可溶性葡萄糖聚合物，由全葡聚糖顆粒酸水解制備。兩種形式葡聚糖的制備如下所述。酵母是β-(1，3)葡聚糖的優(yōu)選來源，但也能產(chǎn)生β(1，3)葡聚糖的其它來源也包括在本發(fā)明中。
微粒葡聚糖代表了本發(fā)明的另一種實(shí)施方案。通常，用于制備微粒葡聚糖的β(1，3)葡聚糖由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法從酵母細(xì)胞中分離并處理以生產(chǎn)微粒β-葡聚糖。微粒葡聚糖通常具有的平均粒徑優(yōu)選約1.0微米或更小，更優(yōu)選約0.20微米或更小。注意組合物可能包含此處所述多種形式的一種或更多。
全葡聚糖顆粒的制備描述于美國專利Nos.4,810,646，4,992,540，5,037,972，5,082,936，5,028,703，5,250,436和5,506,124，其所公開內(nèi)容在此一并作為參考。此方法產(chǎn)生一種產(chǎn)物，該產(chǎn)物保留了體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的葡聚糖的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特性，因此稱為全葡聚糖，或全葡聚糖顆粒。
全葡聚糖顆粒的制備包括用適當(dāng)濃度的堿水溶液處理酵母以溶解一部分酵母并形成堿-氫氧化物-不溶性的主要含β(1-6)和β(1-3)鍵的全葡聚糖顆粒。通常所用堿為堿-金屬的氫氧化物，如氫氧化鈉或氫氧化鉀。優(yōu)選地，原材料主要包括從生長培養(yǎng)基分離的酵母。當(dāng)用低濃縮酵母組合物作原料時(shí)，控制水溶液中氫氧化物反應(yīng)物的消耗和將反應(yīng)物濃度控制在優(yōu)選范圍內(nèi)會更加困難。注意到全葡聚糖顆粒的結(jié)構(gòu)-功能特性依賴于其獲得的來源。全葡聚糖的來源可以是酵母或其它真菌，或其它任何含有此處所述性質(zhì)的葡聚糖的來源。然而，酵母細(xì)胞是葡聚糖的優(yōu)選來源。所用酵母應(yīng)具有完整的、未破裂的細(xì)胞壁，因?yàn)樗萌暇厶穷w粒的優(yōu)選性質(zhì)依賴于一個(gè)完整的細(xì)胞壁。
處理步驟通過在氫氧化物的水溶液中提取酵母進(jìn)行。胞內(nèi)組分和細(xì)胞的甘露糖蛋白部分被溶于氫氧化物的水溶液中，留下不溶的基本不含蛋白質(zhì)的細(xì)胞壁材料，其具有基本未改變的β(1-6)和β(1-3)連接的葡聚糖三維基架。在優(yōu)選條件下實(shí)施此步驟使細(xì)胞壁中的甘露聚糖成分溶解在氫氧化物的水溶液中。胞內(nèi)組分被水解并釋放到可溶相中。優(yōu)選地，消化的條件為至少在大部分細(xì)胞中，細(xì)胞壁的三維基架結(jié)構(gòu)沒有被破壞。更優(yōu)選地，基本上所有的細(xì)胞壁葡聚糖保持未改變和完整。
氫氧化物水溶液消化步驟優(yōu)選地在具有初始當(dāng)量濃度為約0.1到約10.0的氫氧化物溶液中進(jìn)行。典型的氫氧化物溶液包括周期表中堿金屬族和堿土金屬的氫氧化物。優(yōu)選的氫氧化物水溶液為氫氧化鈉和氫氧化鉀的水溶液，因?yàn)樗鼈円子诘玫健Ｏ瘍?yōu)選地在從約20℃到約121℃之間的溫度下進(jìn)行，溫度越低需要的消化時(shí)間越長。當(dāng)用氫氧化鈉作為氫氧化物水溶液時(shí)，溫度優(yōu)選在從約80℃到約100℃，溶液的起始當(dāng)量為從約0.75到約1.5。所加氫氧化物為過量的，這樣，后面就不需要再加入。
通常每升氫氧化物溶液用約10克到約500克的干酵母。為了使蛋白等殘余污染物的含量低于只用一步接觸步驟，氫氧化物水溶液消化步驟優(yōu)選地通過一系列接觸步驟實(shí)施。即，希望從細(xì)胞中基本去除所有的蛋白物質(zhì)。優(yōu)選地這種去除要進(jìn)行到這樣的程度，即低于百分之一的蛋白保留在不溶性細(xì)胞壁葡聚糖顆粒中。另外的一個(gè)提取步驟優(yōu)選地在pH為約2.0到約6.0的弱酸溶液中進(jìn)行。典型的弱酸溶液包括鹽酸、用鹽酸和醋酸緩沖液將pH調(diào)到所需值的氯化鈉溶液。提取步驟優(yōu)選地在約20℃到約100℃溫度下進(jìn)行。如果必要，可對消化過的葡聚糖顆粒進(jìn)一步洗滌和提取以使蛋白和污染物的水平降低到文中前述的優(yōu)選含量。
通過在不破壞細(xì)胞壁的情況下實(shí)施這些方法，提取過程可在比本領(lǐng)域以前的方法可能的更嚴(yán)格的pH和溫度條件下進(jìn)行，本領(lǐng)域以前的方法包括了一個(gè)破碎細(xì)胞壁的步驟。即，本發(fā)明的方法在應(yīng)用這些嚴(yán)格的提取條件時(shí)避免了產(chǎn)物的降解，這些提取條件還允許去除耗時(shí)的多重提取步驟。氫氧化物水溶液處理后，最終的全葡聚糖產(chǎn)物包含約5％到約30％的初始酵母細(xì)胞重量；優(yōu)選地產(chǎn)物按重量計(jì)為7％到15％。
所得全葡聚糖顆粒可根據(jù)需要進(jìn)一步處理和/或進(jìn)一步純化。例如，所得葡聚糖可干燥成精細(xì)粉末(例如，通過烘箱干燥、冰凍干燥或噴霧干燥)；或可用有機(jī)溶劑處理(例如，乙醇，乙醚、丙酮、甲乙酮、氯仿)以去除任何痕量或有機(jī)可溶的物質(zhì)，或用氫氧化物溶液再處理以去除可能存在的額外的蛋白或其它雜質(zhì)。
上述方法所得的全葡聚糖顆粒由高純葡聚糖組成，主要含有β(1-6)和β(1-3)連接的葡聚糖。處理后，所得全葡聚糖顆粒含有極低量的蛋白和糖原污染。優(yōu)選地，所述全葡聚糖顆粒形狀為直徑約2微米到約10微米的球形，含高于85％重量百分比的已糖、約1％重量百分比的蛋白、無可檢出量的甘露聚糖，如傅立葉變換紅外光譜法(Fourier Transform InfraredSpectroscopy)所測。從已有方法得到的葡聚糖含有比本發(fā)明所得葡聚糖高得多的幾丁質(zhì)和糖原。
可采用次級化學(xué)處理以改變β(1-3)或β(1，6)鍵的量，所述處理中全葡聚糖顆粒用一種酶或一種酸進(jìn)行處理。對于從某些酵母菌株提取的全葡聚糖顆粒，酶處理導(dǎo)致了粘度降低，對其它的，則導(dǎo)致了粘度升高，但通常，改變了所得葡聚糖的化學(xué)特性和流體力學(xué)特性。例如用一種葡聚糖酶處理，如地衣多糖酶，改變β(1-3)鍵，這改變了全葡聚糖顆粒在水懸液中的流體力學(xué)性質(zhì)。再例如，用弱酸處理，如已酸，改變了β(1-3)連接，這又改變了全葡聚糖顆粒在水懸液中的流體力學(xué)性質(zhì)。關(guān)于這種次級化學(xué)處理的描述公開于美國專利Nos.6,020,324和6,143,731。
PGG-葡聚糖的制備述于美國專利Nos.5,322,841，5,811,542，5,663,324，5,633,369和5,817,643，其所公開內(nèi)容在此一并作為參考。這種方法包括用一系列酸和堿處理來處理全葡聚糖顆粒以產(chǎn)生在中性pH下可形成清澈溶液的可溶性葡聚糖。本發(fā)明所用全葡聚糖可以是干燥粉末的形式，由前述方法制備。沒有必要為了本發(fā)明而采用最后的有機(jī)提取和洗滌步驟。
為了制備PGG，全葡聚糖顆粒在能充分溶解酸溶性葡聚糖部分的條件下懸于酸溶液中。對于大多數(shù)葡聚糖，pH約1到約5以及溫度約20到約100℃的酸溶液就足夠了。優(yōu)選地，所用酸為能溶解酸溶性葡聚糖部分的有機(jī)酸。濃度為約0.1到約5M的乙酸或濃度為約50％到約98％(w/v)的蟻酸可用于此目的。處理優(yōu)選在約90℃下進(jìn)行。處理時(shí)間從約1小時(shí)到約20小時(shí)不等，依賴于酸濃度、溫度和全葡聚糖的來源。例如，修飾過的葡聚糖比天然存在的或野生的葡聚糖含有更多的β(1-6)分支，需要更苛刻的條件，即更長的接觸時(shí)間和更高的溫度。此酸處理步驟可在相似或不同條件下重復(fù)進(jìn)行。也可使用來自菌株S.cerevisiae R4的修飾過的全葡聚糖顆粒，其含有比天然存在的葡聚糖更高水平的β(1-6)分支。處理進(jìn)行兩次先用0.5M乙酸在90℃處理3小時(shí)，然后用0.5M乙酸在90℃處理20小時(shí)。
然后用適當(dāng)?shù)姆蛛x技術(shù)把酸不溶性葡聚糖顆粒從溶液中分離出來，例如離心或過濾。用堿性化合物如氫氧化鈉將所得淤漿的pH調(diào)至約7到約14。然后把淤漿重懸于熱堿液中，所述熱堿液具有足以溶解葡聚聚合物的濃度和溫度。可用于此步驟的堿性化合物包括堿金屬或堿土金屬的氫氧化物，如氫氧化鈉或氫氧化鉀，其濃度從約0.1到約10N。此步驟可在約4℃到約121℃，優(yōu)選地從20℃到100℃的溫度下進(jìn)行。在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所用條件為1N的氫氧化鈉溶液在約80-100℃下接觸時(shí)間為大約1-2小時(shí)。所得混合物含有溶解了的葡聚糖分子和顆粒的葡聚糖殘?jiān)?，通常因雜質(zhì)蛋白和糖的氧化而具暗棕色。用適當(dāng)?shù)姆蛛x技術(shù)去除顆粒殘?jiān)珉x心和/或過濾。
所得溶液含有可溶性葡聚糖分子?？蛇x地，此溶液可被濃縮至滲余物可溶性葡聚糖級分的5至10倍濃度以得到范圍在約1至5mg/ml的可溶性葡聚糖濃度。此步驟可采用適當(dāng)?shù)臐饪s技術(shù)進(jìn)行，例如，采用超濾，使用標(biāo)稱分子量水平(NMWL)或截流范圍在約1,000到100,000道爾頓的膜。截止分子量約10,000道爾頓的膜尤其適用于此步驟。
此步驟所得的濃縮級分富含可溶的、具生物活性的PGG。為得到藥用溶液，所得葡聚糖濃縮物被進(jìn)一步純化，例如，通過透析過濾。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用大約10倍體積的堿溶液進(jìn)行透析，堿溶液濃度范圍約0.2到0.4N。經(jīng)此步驟后可溶性葡聚糖的優(yōu)選濃度是約2到約5mg/ml。溶液的pH值用酸，如鹽酸，調(diào)節(jié)到7-9的范圍內(nèi)?？赡艽嬖诘暮哿康鞍讟游镔|(zhì)可通過將所得溶液與帶正電的介質(zhì)接觸而去除，這類介質(zhì)如DEAE-纖維素、QAE-纖維素或Q-瓊脂糖。蛋白樣物質(zhì)對葡聚糖產(chǎn)品質(zhì)量有害，可能使溶液變色并有助于形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，從而限制了所得中性葡聚糖聚合物的可溶性。經(jīng)此步驟后得到清澈的溶液。
所得高度純化的、清澈的葡聚糖溶液可使用適于腸胃外施用的藥用介質(zhì)(例如，注射用無菌水，磷酸鹽緩沖液(PBS)，等滲鹽溶液，葡萄糖)進(jìn)一步純化，例如透析。用于此透析步驟的優(yōu)選的膜具有標(biāo)稱截流分子量約10,000道爾頓。葡聚糖溶液的最終濃度調(diào)節(jié)至約0.5到5mg/ml的范圍。根據(jù)腸胃外產(chǎn)品的藥品生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，所得溶液可通過經(jīng)0.22μm過濾器而最終滅菌。從這一步驟得到的可溶性葡聚糖制劑是無菌的、非抗原性的和基本不含熱原的，并且可于室溫下長期儲存而不降解。
生產(chǎn)微粒β-葡聚糖的方法公開于美國專利Nos.5,223,491，5,397,773，5,576,015，5,702,719和5,705,184，其內(nèi)容在此一并作為參考。通常，可通過分離β(1，3)葡聚糖并將對其處理以得到小粒徑來生產(chǎn)微粒β-葡聚糖。為得到期望的更小的微粒葡聚糖粒徑的處理方法的一個(gè)例子，包括使用攪拌機(jī)、球磨機(jī)把β(1，3)葡聚糖磨碎成更小的顆粒。一種磨碎或減小粒徑的方法采用了一種帶鈍刃的攪拌機(jī)，在其中葡聚糖被攪拌足夠長的時(shí)間，優(yōu)選幾分鐘，以把顆粒完全磨碎至期望的尺寸而不使混合物過熱。另一種磨碎方法包含在一個(gè)帶10mm不銹鋼研磨珠的球磨機(jī)中研磨葡聚糖混合物。后者在期望得到約0.20微米或更小粒徑時(shí)尤其優(yōu)選。
β(1，3)葡聚糖的另一種形式是中性可溶葡聚糖。中性可溶葡聚糖(NSG)一詞雖然用于描述一種已取得專利的與PGG-葡聚糖相關(guān)的組合物，但是是一個(gè)涵蓋了所有構(gòu)型的水溶性葡聚糖的更一般性的詞匯。PGG-葡聚糖典型地指β-葡聚糖的三螺旋形式，而NSG通常指單鏈螺旋形式。
施用于本發(fā)明方法中的組合物任選地包括，除全葡聚糖顆粒以外，PGG、微粒葡聚糖或其組合，其它組分如載體、賦形劑、輔劑和/或其它的有益活性組分。這些其它有益活性組分可能包括與前述生物戰(zhàn)爭病原體相應(yīng)的抗生素。特定組合物中包括的其它組分可根據(jù)該組合物將要施用的方式而定。例如，口服施用的組合物片劑可包括，除了β-葡聚糖外，填充劑(如乳糖)、粘合劑(如羧甲基纖維素、阿拉伯膠、凝膠)、輔劑、調(diào)味劑、著色劑、其它活性試劑(如藥物、礦物質(zhì)、維生素)和包衣材料(如蠟或增塑劑)。另外，以液體形式施用的組合物可包括全葡聚糖顆粒、PGG、微粒葡聚糖或其組合，以及可選的乳化劑、調(diào)味劑和/或著色劑。另外，腸胃外施用的組合物，包括全葡聚糖顆粒、PGG、微粒葡聚糖或其組合，也可在水、無菌鹽水、PBS、葡萄糖或其它生物相容性載體中混合、溶解或乳化。
施用β-葡聚糖制劑的方式可以是口服、腸內(nèi)、局部、腸胃外、靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或鼻內(nèi)。然而，口服施用β(1，3)-葡聚糖是本發(fā)明的優(yōu)選方案，因?yàn)榭诜┯眉确奖闱趾π杂值?。另外，已發(fā)現(xiàn)口服施用有好處，因?yàn)槠淇纱碳は忍烀庖呦到y(tǒng)，特別是當(dāng)其在派伊爾氏淋巴集結(jié)(Peyer′spatches)內(nèi)開始接觸巨噬細(xì)胞后。派伊爾氏淋巴集結(jié)(Peyer′s patches)小腸內(nèi)特異化了的區(qū)間，將抗原傳遞給腸道相關(guān)淋巴組織(GALT)的免疫細(xì)胞。被激活的巨噬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)到GALT，在那里它們將存在外界抗原通知免疫系統(tǒng)的其它成員，導(dǎo)致先天免疫系統(tǒng)的其它成員如巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的激活。
組合物施用的形式(如粉末、片劑、膠囊、溶液、乳劑)將依其施用的途徑而定。組合物施用的量依個(gè)體情況而定，至少部分地決定于下列考慮，病人感染或受傷害的嚴(yán)重性、病人狀況或全面健康情況、病人體重、接受其它治療前的可用時(shí)間以及施用的方式(如口服組合物可能比全身用藥組合物施用更大的量)。通常，單劑量一般含有大約0.01mg到500mgβ-葡聚糖/每公斤體重，優(yōu)選地是1mg到250mgβ-葡聚糖/每公斤體重，更優(yōu)選地是2mg到20mgβ-葡聚糖/每公斤體重。
已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中β-葡聚糖的前述形式在長期儲存中也能保持穩(wěn)定。全葡聚糖顆?？梢运幫璧男问奖４嬗谑覝厍铱煽诜?、局部或全身施用。PGG或NSG可以溶液的形式儲存于室溫，經(jīng)常是全身施用。全葡聚糖顆粒和PGG在25℃下都能穩(wěn)定至少2年。圖7描述了對在室溫(25℃)下存放了超過25個(gè)月期間的ImucellTMWGPβ-葡聚糖實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究的結(jié)果。樣品組合物每月檢測一次，在這25個(gè)月期間，未顯示有任何活性β-葡聚糖數(shù)量的減少發(fā)生。存在的β-葡聚糖的平均百分比為79.3％，標(biāo)準(zhǔn)偏差5.3。
為了闡明β-葡聚糖組合物抵抗可能的生物武器的活性，在小鼠模型系統(tǒng)上開展了一系列研究以揭示PGG和全葡聚糖顆粒如何能增強(qiáng)對炭疽感染的抗性。在這些研究中全葡聚糖顆粒(ImucellTMWGP Glucan)純化自面包酵母的細(xì)胞壁，PGG由全葡聚糖顆粒經(jīng)酸水解而制備。
檢測了全身用PGG或全葡聚糖顆粒對隨后暴露于炭疽桿菌芽孢的小鼠組的預(yù)防性作用。所有的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次。統(tǒng)計(jì)分析基于這兩組相互獨(dú)立的數(shù)據(jù)進(jìn)行。結(jié)果顯示于圖1，清楚地表明單劑量PGG(Betafectin；2.5mg/Kg)或200μg/小鼠的全葡聚糖顆粒(10mg/Kg)顯著增加了存活時(shí)間。在這些實(shí)驗(yàn)中，感染了炭疽的對照組的平均存活時(shí)間為8.4/8.5天。而用PGG處理的組(10.2/11.5天)和用全葡聚糖顆粒處理的組(10/11.5天)平均存活時(shí)間顯著延長。對匯合自這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行的分析揭示，與對照(8.45天)相比較，PGG-處理小鼠的存活(10.86天)或全葡聚糖顆粒處理小鼠的存活(10.80天)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著升高。
用β(1，3)-葡聚糖進(jìn)行全身預(yù)防性處理的炭疽-保護(hù)作用顯示于圖2，該圖顯示了用PGG或全葡聚糖顆粒處理過的小鼠在炭疽感染期間的存活者百分比。在炭疽桿菌致命攻擊的前兩天施用單劑量PGG葡聚糖(50μg)或全葡聚糖顆粒(200μg)或?qū)φ整}水。感染后10天期間內(nèi)，每天記錄存活者的數(shù)量。在這些實(shí)驗(yàn)中，22只對照動(dòng)物中只有7只活過了觀察期。相對地，PGG處理的22只中有19只，全葡聚糖顆粒處理的22只中有18只存活了相同的時(shí)間。
PGG(Betafectin)和全葡聚糖對宿主先天抗微生物免疫應(yīng)答的刺激導(dǎo)致了增強(qiáng)的微生物殺死，如圖3和圖4中所示處理過的動(dòng)物肺內(nèi)微生物的生物負(fù)荷的顯著降低所證明的那樣。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明單劑量的Betafectin(2.5mg/Kg)或200μg/小鼠的全葡聚糖顆粒(10mg/Kg)顯著降低了肺內(nèi)細(xì)菌負(fù)荷，并增加了觀察期末無菌小鼠的數(shù)量。β(1，3)-葡聚糖引起的宿主免疫應(yīng)答增強(qiáng)，導(dǎo)致顯著百分比的處理過的受炭疽攻擊存活小鼠(＞80％)在刺激后10天仍保持無菌，這通過肺內(nèi)炭疽桿菌CFUs的相對缺乏可知。
如前面所指出的，口服施用β(1，3)-葡聚糖是本發(fā)明的優(yōu)選方案，因?yàn)榭诜┯眉确奖?，侵害性又低，還導(dǎo)致對派爾氏淋巴集結(jié)中巨噬細(xì)胞的刺激。圖5A和圖5B顯示了預(yù)防性口服全葡聚糖顆粒治療法對在致死性炭疽攻擊下小鼠存活率的影響。圖5A所示存活結(jié)果表明每日口服預(yù)防性劑量的全葡聚糖顆粒(＞2mg/kg)顯著增加了炭疽存活者的數(shù)量。在這些實(shí)驗(yàn)中，10只對照動(dòng)物中只有5只在炭疽感染中存活(存活率50％)。相對地，用日口服劑量2或20mg/kg全葡聚糖顆粒進(jìn)行預(yù)防性處理的動(dòng)物顯示出100％存活率。每周四次口服2mg/kg的預(yù)防性劑量則不如每日劑量給藥有效，因?yàn)槿〉蔑@著的保護(hù)效果要求20mg/kg的全葡聚糖劑量(圖5B)。
上述研究表明β-葡聚糖在接觸前施用可有效抵御炭疽。圖6中顯示了在致死性炭疽攻擊后施用口服全葡聚糖顆粒治療對小鼠存活率的影響。每日口服治療劑量的全葡聚糖顆粒(＞1.5mg/kg)也顯著增加了炭疽存活者的數(shù)量。治療性給藥在感染后一小時(shí)開始。在這些實(shí)驗(yàn)中，10只對照動(dòng)物中只有3只在炭疽感染后存后(30％存活率)。相對地，在1.5mg/kg口服全葡聚糖顆粒的治療劑量水平下，80％處理過的小鼠存活，在13.3mg/kg口服全葡聚糖顆粒的治療劑量水平下，90％處理過的小鼠存活。因此，除了預(yù)防性施用外，即使在接觸后給藥，口服全葡聚糖顆粒對降低炭疽感染的致死率也是有效的。這表明β-葡聚糖在應(yīng)對未受警告而已經(jīng)暴露的市民的炭疽感染會有幫助，這是在恐怖襲擊中可能的情景，這一點(diǎn)很重要。
另外，出于幾個(gè)原因，施用β-葡聚糖比直接施用IL-1等細(xì)胞因子更有效，那些細(xì)胞因子常獨(dú)立用作免疫調(diào)節(jié)劑。首先，β-葡聚糖除了其對細(xì)胞因子的作用以外還有其它作用，如其直接激活免疫細(xì)胞的活性抵抗受調(diào)理傳染性顆粒的能力。β-葡聚糖還刺激多種細(xì)胞介質(zhì)以平衡的比例內(nèi)源性釋放，由于所誘導(dǎo)的多種免疫介質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)而提供了一個(gè)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。最后，細(xì)胞因子-正主要通過重組工程技術(shù)制造-純化困難且昂貴，并顯示出相當(dāng)大的毒性和不利副作用。
另外，具免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)的葡聚糖聚合物都帶有共同的β(1-3)連接的線性葡萄糖主鏈。許多種類，如香菇多糖和硬葡聚糖，在主鏈上還含有在葡萄糖單元的C-6原子上的周期性分支。表1列出了許多具免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)的葡聚糖及所報(bào)道的它們的一般連接結(jié)構(gòu)。
表1具有免疫活性的葡聚糖葡聚糖 來源 鍵凝膠多糖Curdlan 糞產(chǎn)堿桿菌 β(1-3)Alcaligenes faecallis
可溶性 酵母 β(1-3)磷酸化葡聚糖Cerevisiae Coriolusversicolo胺化葡聚糖 真菌，細(xì)菌，地衣 β(1-3)堿不溶性酵母葡聚糖香菇 釀酒酵母 β(1-3)/β(1-6)多糖Lentinus edodesβ(1-3)/β(1-6)硬葡聚糖Sclerotium glucanicum β(1-3)/β(1-6)Sclerotium rolfsii β(1-3)/β(1-6)裂裥菌素Schizophyllan commune β(1-3)/β(1-6)無論材料是什么來源(如，生物)，所有列于表1的分支葡聚糖在分支上都含有至少一個(gè)單葡萄糖單位通過一個(gè)β(1-6)鍵連到主鏈上。
β(1，3)-葡聚糖的抗感染作用機(jī)理主要是通過刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞而起作用。許多這些細(xì)胞被傳染性顆粒所釋放的毒素所抑制，如炭疽釋放的毒素。因此，β(1，3)-葡聚糖協(xié)助直接應(yīng)對感染的不利效果。β(1，3)-葡聚糖作用機(jī)理的細(xì)節(jié)如下所述。
CR3受體在β-葡聚糖的免疫調(diào)節(jié)活性中起到十分重要的作用。CR3在介導(dǎo)對β-葡聚糖的應(yīng)答中起的作用見于對iC3b-調(diào)理的酵母嗜中性粒細(xì)胞吞噬作用機(jī)理的深入研究。當(dāng)補(bǔ)體C3b已經(jīng)附著到一個(gè)表面，它可能被一種血清蛋白剪切生成一個(gè)更小的片斷，iC3b。如果iC3b已經(jīng)被“失活”而不能起到形成膜攻擊復(fù)合物的功能，它保持附著在該表面，在那里起到吸引嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用，后者可吞噬或相反摧毀被標(biāo)記的(“受調(diào)理的”)細(xì)胞。在嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面是結(jié)合iC3b的第3類補(bǔ)體受體(CR3)。酵母被免疫系統(tǒng)清除的過程闡述于圖8。
刺激CR3依賴的吞噬作用或脫粒作用需要CR3內(nèi)兩個(gè)不同位點(diǎn)的同時(shí)連接；一個(gè)是iC3b特異的而另一個(gè)位點(diǎn)是酵母細(xì)胞壁β-葡聚糖特異性的。如圖9所示，因?yàn)槿狈?xì)胞表面CR3-結(jié)合的β-葡聚糖，受iC3b調(diào)理的細(xì)菌經(jīng)CR3被結(jié)合于嗜中性粒細(xì)胞，但并不能有效刺激吞噬作用或脫粒作用。然而，如圖10所示，加入β-葡聚糖可結(jié)合到CR3的凝集素位點(diǎn)以激活免疫細(xì)胞載運(yùn)該受體觸發(fā)對外來物質(zhì)的脫粒和/或吞噬作用。富含甘露聚糖和β-葡聚糖的可溶性酵母聚糖衍生的多糖顯示出結(jié)合CR3的高親合性，誘導(dǎo)出被激活的受體狀態(tài)。
圖11證實(shí)了由β葡聚糖提供的CR3在免疫調(diào)節(jié)中的作用。此圖表明口服大麥葡聚糖(100mg/Kg)誘導(dǎo)了體外脾巨噬細(xì)胞對iC3b包被腫瘤靶的增強(qiáng)了的細(xì)胞毒性。口服葡聚糖的同時(shí)注射抗CR3單克隆抗體則消除了這種毒性。具體地，本圖顯示了CR3在刺激β葡聚糖引起的巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性應(yīng)答中的重要作用。如前所述，巨噬細(xì)胞經(jīng)常被炭疽等有害病原體抑制，所以它們的激活可直接應(yīng)對這種效應(yīng)。
NK細(xì)胞是對感染的先天免疫應(yīng)答中另一個(gè)重要的成員。NK細(xì)胞介導(dǎo)宿主防御的功能既包括對病原體的直接細(xì)胞毒性也包括TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，這些細(xì)胞因子可潛在地調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答并召集破壞癌細(xì)胞的巨噬細(xì)胞。盡管已表明NK細(xì)胞對病原體的直接細(xì)胞毒是由CR3的激活所介導(dǎo)的，另有研究表明這種相同的CR3激活甚至可能也觸發(fā)細(xì)胞因子的分泌。為證實(shí)此點(diǎn)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見于圖12。小分子β-葡聚糖結(jié)合到CR3導(dǎo)致受體的激活，這種激活在隨后結(jié)合至iC3b調(diào)理的靶細(xì)胞觸發(fā)下產(chǎn)生細(xì)胞因子釋放。EC3bi靶在這類多糖激活缺乏時(shí)不能觸發(fā)NK細(xì)胞細(xì)胞因子釋放，如培養(yǎng)基對照所示。在CR3被多糖激活后，與iC3b-靶細(xì)胞的結(jié)合導(dǎo)致TNF-α(也有IFN-γ，IFN-α，和IL-6，未顯示)的分泌。加入5mg/ml的抗CD11b單克隆抗體(OKM1)阻斷了NK細(xì)胞對所有四種細(xì)胞因子的分泌。抗CR3既阻斷了β-葡聚糖結(jié)合于CR3，也阻斷了激活了的CR3結(jié)合于EC3bi靶細(xì)胞上的iC3b。
圖12顯示的結(jié)果表明NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子與CR3活化產(chǎn)生細(xì)胞毒是平行發(fā)生的。顆粒β-葡聚糖，觸發(fā)有力的CR3依賴的嗜中性粒細(xì)胞過氧化物爆發(fā)，也同樣觸發(fā)NK細(xì)胞CR3依賴的細(xì)胞因子釋放。細(xì)胞因子分泌并不發(fā)生在小分子可溶性β-葡聚糖結(jié)合于CR3時(shí)發(fā)生的初始CR3激活步驟，而只是繼發(fā)于被β-葡聚糖激活的CR3與iC3b-調(diào)理的靶細(xì)胞交聯(lián)所觸發(fā)的CR3激活步驟。將NK細(xì)胞與EC3bi在培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)，并不刺激NK細(xì)胞溶解EC3bi，也不觸發(fā)細(xì)胞因子分泌。然而，當(dāng)用可溶(或顆粒)β-葡聚糖激活NK細(xì)胞CR3后再加入EC3bi，這時(shí)ELISA可檢測到TNF-α，IFN-α，IFN-γ，和IL-6的分泌。這種細(xì)胞因子釋放是CR3依賴性的，因?yàn)楫?dāng)與靶EC3bi同時(shí)加入抗CD121b單克隆抗體時(shí)其被阻斷了。
通常，本發(fā)明的組合物可在疑有暴露于病原體之前或之后施用于個(gè)體以增強(qiáng)該個(gè)體抗感染的能力。醫(yī)療領(lǐng)域內(nèi)的熟練技術(shù)人員將有能力根據(jù)患者的身體條件和所懷疑的病原體來決定施藥時(shí)長和劑量。該組合物也可作為預(yù)防處理的常規(guī)應(yīng)用，增強(qiáng)那些在具有比普通環(huán)境更高的暴露于有害病原體風(fēng)險(xiǎn)的工作環(huán)境中工作的個(gè)體的抗感染能力，如衛(wèi)生工作者或在活躍的生物戰(zhàn)爭環(huán)境中工作的士兵。
本發(fā)明在下述實(shí)施例中被進(jìn)一步闡述。
實(shí)施例實(shí)施例1β-葡聚糖對NK細(xì)胞細(xì)胞因子釋放的刺激人NK細(xì)胞與顆粒酵母β-葡聚糖或可溶性CR3-結(jié)合的多糖共同在37℃下培養(yǎng)18小時(shí)。用ELISA分析培養(yǎng)物上層清液中TNF-α。顆粒酵母β-葡聚糖(2μg/ml)和灰樹花多糖(grifolan)(≥500kDa可溶性β-葡聚糖，來自多葉奇果菌(Grifola frondosa)，2μg/ml)能夠結(jié)合并交聯(lián)CR3分子表面的凝集素位點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞活化和TNF-α和IL-6(未顯示)的分泌。與之對照，小分子(20kDa)可溶性酵母β-葡聚糖(MPβ-葡聚糖；2.0μg/ml)和SZP(可溶性酵母聚糖多糖制劑，含有β-寡聚甘露糖和/或β-葡聚糖；2.0μg/ml)只結(jié)合于單個(gè)CR3分子，而在缺乏靶細(xì)胞時(shí)不觸發(fā)細(xì)胞因子釋放。小分子β-葡聚糖與CR3的結(jié)合導(dǎo)致受體的激活，這種激活在隨后結(jié)合至iC3b調(diào)理的靶細(xì)胞(受iC3b-″+EC3b″調(diào)理的羊紅細(xì)胞)觸發(fā)下產(chǎn)生細(xì)胞因子釋放。EC3bi靶在缺乏這種多糖激活時(shí)不能觸發(fā)NK細(xì)胞細(xì)胞因子釋放，如培養(yǎng)基對照所示。在CR3被多糖激活后，與iC3b-靶細(xì)胞的結(jié)合導(dǎo)致TNF-α(也有IFN-γ，IFN-α，和IL-6，未顯示)的分泌。加入5mg/ml的抗CD11b單克隆抗體(OKM1)阻斷了NK細(xì)胞對所有四種細(xì)胞因子的分泌?？笴R3既阻斷了β-葡聚糖結(jié)合于CR3，也阻斷了激活了的CR3結(jié)合于EC3bi靶細(xì)胞上的iC3b。
實(shí)施例2感染的β-葡聚糖治療在小鼠中開發(fā)了一種膿血癥模型以表征PGG-葡聚糖在保護(hù)免疫無損宿主抵御嚴(yán)重感染中的效力。該模型采用的小鼠經(jīng)0.1ml E.coli菌株TVDL-rat(大約10CFU/ml)混懸劑腹內(nèi)攻擊24小時(shí)后，通過經(jīng)胸廓心臟穿刺單劑注射的方法靜脈內(nèi)施用PGG。小鼠送回它們的籠子并無限制供應(yīng)食物和水。一個(gè)10只小鼠的對照組在施用PGG的時(shí)間點(diǎn)用0.1ml無菌鹽水注射。攻擊后48小始記錄治療組和鹽水對照組的致死率。給鹽水小鼠的存活率為20％。然而，以0.01、0.1、1、和5mg/小鼠的劑量給PGG小鼠的存活率分別為90％，75％，70％和70％。此結(jié)果表明，與鹽水對照組相比(p＜0.05)，在低至0.01mg/小鼠(0.5mg/kg體重)的劑量下，PGG顯著降低了致死率。
實(shí)施例3炭疽動(dòng)物模型將炭疽桿菌(Bacillus anthracis)Vollum 1B，一種致命的、有莢膜的、產(chǎn)毒素菌株(來自USAMRIID，F(xiàn)t.Detrick，MD，USA)培養(yǎng)于血瓊脂平板上并懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，動(dòng)物在一個(gè)位于加拿大DRES的3級生物污染設(shè)備內(nèi)進(jìn)行攻擊。細(xì)胞懸液在PBS中80℃下熱休克11分鐘以殺死營養(yǎng)細(xì)胞，-80℃分裝保存。冰凍的芽孢儲存物稀釋后用于保護(hù)性研究。動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)于籠中，每籠最多5只小鼠，無限制供應(yīng)水和食物。注射于Biosafety Fumehoods內(nèi)在可靠的動(dòng)物上進(jìn)行。
用于炭疽的模型是公知的小鼠(Balb/c)模型，以前曾被Welkos等描述(Infect.Immun.51795-800，1986)。雌性Balb/c小鼠(6周齡，14到16克)購自Charles River。動(dòng)物的處理在BL-3通風(fēng)櫥內(nèi)在可靠的動(dòng)物上進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)所用所有方法都被DRES實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(IACC)認(rèn)可于BK01-01協(xié)議下，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)依照加拿大動(dòng)物管理委員會，《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南》卷1，第2版。給五個(gè)不同小鼠組(10只動(dòng)物/劑量)在脅腹處皮下接種大約1、5、10、102芽孢，所用芽孢來自儲存于0.1ml容器內(nèi)冰凍的炭疽芽孢儲存物(用一只1ml注射器，22號針)。通過接種0.1ml感染用懸液于血瓊脂平板來證實(shí)感染劑量。接種后24小時(shí)讀取菌落形成單位(CFUs)。
實(shí)施例4全身性PGG和全葡聚糖顆粒處理的炭疽感染動(dòng)物的存活率。
10只動(dòng)物的各組在脅腹處皮下注射(在第2天)(用1ml注射器，22號針)50μg/小鼠的Betafectin(2.5mg/Kg)或200μg/小鼠的全葡聚糖顆粒(10mg/Kg)。在第0天，給動(dòng)物皮下注射214.9±97.1炭疽芽孢/小鼠。對照組，未接受Betafectin或全葡聚糖顆粒，包含于每個(gè)系列之中。通過接種0.1ml感染用懸液于血瓊脂平板來證實(shí)感染劑量。在感染后最初的2天中每天一次對動(dòng)物進(jìn)行觀察，接下來的日子里每天觀察2次，直至研究結(jié)束。對小鼠每日觀察10到11天(或直至死亡)，垂死的動(dòng)物被人道處死。記錄存活時(shí)間并計(jì)算LD50和LD70。在感染后的第10或11天處死所有的存活者。
滴定炭疽芽孢儲存物以確定LD50和LD70；對炭疽模型中，LD50確定為227芽孢/小鼠，LD70為313芽孢/小鼠。這些研究中的平均感染劑量為214.9±97.1芽孢/小鼠。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次。結(jié)果以兩組獨(dú)立系列的數(shù)據(jù)和來自兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的匯合數(shù)據(jù)進(jìn)行表示。統(tǒng)計(jì)分析基于兩組獨(dú)立系列的數(shù)據(jù)和來自兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的匯合數(shù)據(jù)進(jìn)行。
圖1顯示的結(jié)果清楚表明，單劑量Betafectin(2.5mg/Kg)或200μg/小鼠的全葡聚糖顆粒(10mg/Kg)顯著延長了存活時(shí)間。感染了炭疽的對照組平均存活時(shí)間是8.4/8.5天。而用Betafectin處理的組(10.2(p＝0.044)/11.5(p＝0.00029)天)和用全葡聚糖顆粒處理的組(10.0(p＝0.064)/11.5(p＝0.00029)天)平均存活時(shí)間顯著延長。對匯合了實(shí)驗(yàn)1和2的數(shù)據(jù)進(jìn)行的分析揭示Betafectin-處理小鼠的存活(10.86天)或全葡聚糖顆粒處理小鼠的存活(10.80天)與對照(8.45天，分別有p＝0.00021和0.00038)相比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著升高。
圖2顯示的結(jié)果清楚表明，單劑量Betafectin(2.5mg/Kg)或200μg/小鼠的全葡聚糖顆粒(10mg/Kg)顯著增加了存活者的數(shù)量。在這些實(shí)驗(yàn)中，22只對照動(dòng)物中只有7只活過了觀察期。相對地，Betafectin處理的22只中有19只(86.36％；p＝0.00005)，全葡聚糖顆粒處理的22只中有18只(81.82％；p＝0.00024)存活了相同的時(shí)間。
實(shí)施例5全身性PGG和全葡聚糖顆粒處理的炭疽感染動(dòng)物的細(xì)菌負(fù)荷為了測定全身性PGG和全葡聚糖顆粒處理后炭疽感染動(dòng)物的細(xì)菌負(fù)荷，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如實(shí)施例3中所述行進(jìn)感染和處理。在死亡時(shí)，或感染后的第10到第11天，收獲主要器官(肝、脾、和肺)和排出感染位點(diǎn)的淋巴結(jié)，稱重并在20ml PBS中勻漿以進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。所得勻漿進(jìn)行1/10、1/100、1/1000和1/10000稀釋并用0.1ml培養(yǎng)基接種于固體培養(yǎng)基(血瓊脂培養(yǎng)皿)以估算CFU/器官的數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)前將培養(yǎng)皿在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)一次，用student′s T檢驗(yàn)確定p值。
圖3和4顯示的結(jié)果表明單劑量的Betafectin(2.5mg/Kg)或200μg/小鼠的全葡聚糖顆粒(10mg/Kg)顯著降低了肺內(nèi)細(xì)菌負(fù)荷，并增加了觀察期末無菌小鼠的數(shù)量。這些實(shí)驗(yàn)中，對照動(dòng)物顯示出在觀察期末存活者中1.77×106/3.96×105CFU/g肺的細(xì)菌負(fù)荷。相對地，Betafectin處理的存活動(dòng)物具有顯著降低的細(xì)菌負(fù)荷2.6×105CFU/g(p＜0.05)肺，全葡聚糖顆粒處理的存活動(dòng)物具有顯著降低的水平至5.5×105CFU/g肺(p＜0.05)。總計(jì)，40.9％的對照動(dòng)物在觀察期末為無細(xì)菌的，相比較之下Betafectin處理的動(dòng)物的86.4％(p＝0.0436)和全葡聚糖顆粒處理的動(dòng)物的90.9％(p＝0.0194)。
實(shí)施例6用PGG和全葡聚糖顆粒對炭疽感染的小鼠進(jìn)行口服預(yù)防性處理全葡聚糖顆粒的口服預(yù)防性炭疽保護(hù)作用通過強(qiáng)飼施用全葡聚糖顆粒的水懸液(40或400μg/小鼠)(從第-7天到第0天每日，或在第-7、-4.5、-2、0天一周四次)。基于工作人員安全需求禁止操作炭疽感染的小鼠，全葡聚糖顆粒的治療性口服保護(hù)效力這樣檢測，以飲用水中0.3％w/v羧甲纖維素(CMC-P325G，PL Thomas)懸液的形式施用全葡聚糖顆粒(第0天到第+10天每日)，全葡聚糖的濃度根據(jù)每天提供0，40或400μg每小鼠/天計(jì)算，此計(jì)算基于估算的飲用水消耗為6.5ml水/小鼠/天。實(shí)際劑量通過每天測量水消耗確定，再以每天每只籠內(nèi)活著的小鼠數(shù)量為系數(shù)，計(jì)算結(jié)果為0，22.6±3.5和200.3±36.4μg每小鼠/天。對照組接受載體強(qiáng)飼或其飲用水中只有羧甲纖維素。在第0天，口服給藥后一小時(shí)，用LD60劑量的炭疽芽孢對動(dòng)物進(jìn)行皮下感染。每日觀察動(dòng)物直至研究結(jié)束(第10天)并記錄存活時(shí)間。存活百分比通過每日存活動(dòng)物的數(shù)量與每組中被感染動(dòng)物的總數(shù)(n＝10)的比值進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)口服劑量給藥實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一次。采用Fischer精確檢驗(yàn)確定P值。
圖5A所示的存活結(jié)果表明每日的全葡聚糖顆?？诜A(yù)防性給藥(＞2mg/kg)還顯著增加了炭疽存活者的數(shù)量。在這些實(shí)驗(yàn)中，10只對照動(dòng)物中只有5只在炭疽感染中存活(50％存活)。相對地，用日口服劑量2或20mg/kg全葡聚糖顆粒進(jìn)行預(yù)防性處理的動(dòng)物顯示出100％存活(p＝0.016)。相反，圖5B顯示每周四次口服2mg/kg的預(yù)防性劑量不如每日劑量有效(p＝0.41)，因?yàn)槿〉蔑@著的保護(hù)效果要求20mg/kg的全葡聚糖劑量(p＝0.016)。
每日口服治療劑量的全葡聚糖顆粒(＞1.5mg/kg)還有效增加了炭疽存活者的數(shù)量(圖6)。在這些實(shí)驗(yàn)中，10只對照動(dòng)物中只有3只在炭疽感染后存活(30％存活)。相對地，在1.5mg/kg口服全葡聚糖顆粒的治療劑量水平下，80％處理過的小鼠存活(p＝0.038)，在13.3mg/kg口服全葡聚糖顆粒的治療劑量水平下，90％處理過的小鼠存活(p＝0.01)。
雖然本發(fā)明的實(shí)施方案和應(yīng)用已被詳細(xì)展示和描述，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離此處所述本發(fā)明概念的情況下，除上述外還有許多改進(jìn)是可能的。因此本發(fā)明的范圍僅被所附權(quán)利要求所限。
權(quán)利要求
1.一種治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，包含對人或動(dòng)物施用預(yù)防或治療有效量的β(1，3)-葡聚糖。
2.權(quán)利要求1中所述的治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，其中所述β(1，3)-葡聚糖包含PGG葡聚糖。
3.權(quán)利要求1中所述的治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，其中所述β(1，3)-葡聚糖包含全葡聚糖顆粒。
4.權(quán)利要求1中所述的治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，其中所述β(1，3)-葡聚糖包含PGG葡聚糖和全葡聚糖顆粒的組合。
5.權(quán)利要求2中所述的治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，其中每天施用約0.1-100mg/Kg的PGG葡聚糖。
6.權(quán)利要求3中所述的治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，其中每天施用約0.1-500mg/Kg的全葡聚糖顆粒。
7.權(quán)利要求4中所述的治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，其中每天施用約0.1-100mg/Kg的PGG葡聚糖和約0.1-500mg/Kg的全葡聚糖顆粒的組合。
8.權(quán)利要求2中所述的治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，其中每天施用約1-10mg/Kg的PGG葡聚糖。
9.權(quán)利要求3中所述的治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，其中每天施用約2-20mg/Kg的全葡聚糖顆粒。
10.權(quán)利要求4中所述的治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，其中每天施用約1-10mg/Kg的PGG葡聚糖和約2-20mg/Kg的全葡聚糖顆粒的組合。
11.權(quán)利要求1中所述的治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，其中β(1，3)-葡聚糖通過口服、局部、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)皮、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、或經(jīng)胃腸道施用。
12.權(quán)利要求1中所述的治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，其中β(1，3)-葡聚糖通過口服施用。
13.權(quán)利要求1中所述的治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，其中所述傳染劑是A類生物戰(zhàn)劑，選自由炭疽桿菌(Bacillus anthracis)(炭疽)、肉毒桿菌毒素(Clostridium botulinum toxin)(肉毒中毒)、鼠疫桿菌(Yersinia pestis)(鼠疫)、大天花(Variola major)(天花)、野兔熱弗朗西絲菌(Francisella tularensis)(兔熱病)、和病毒性出血熱組成的組。
14.權(quán)利要求1中所述的治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，其中所述傳染劑是B類生物戰(zhàn)劑，選自由伯納特柯克斯體(Coxiella burnetti)(Q熱)、布魯菌屬(Brucella species)(布魯菌病)、鼻疽假單胞菌(Burkholderia mallei)(鼻疽病)、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌(Clostridiumperfringens)、和葡萄球菌屬(Staphylococcus)組成的組。
15.權(quán)利要求1中所述的治療或預(yù)防人或動(dòng)物中被一種或多種傳染劑感染發(fā)病的方法，其中所述傳染劑是C類生物戰(zhàn)劑，選自由Nipah病毒，漢灘病毒(hantaviruses)，蜱傳出血熱病毒，蜱傳腦炎病毒，黃熱病，和多藥抗性結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(結(jié)核病)組成的組。
16.權(quán)利要求1中所述的治療或預(yù)防感染的方法，其中所述傳染劑是炭疽桿菌。
17.一種通過施用預(yù)防或治療有效量的β(1，3)-葡聚糖來預(yù)防生物戰(zhàn)劑對人或動(dòng)物的傷害的方法。
18.權(quán)利要求17中所述的預(yù)防由一種或多種傳染劑造成的生物戰(zhàn)劑對人或動(dòng)物的傷害的方法，其中每天施用約0.1-100mg/Kg的PGG葡聚糖。
19.權(quán)利要求17中所述的預(yù)防由一種或多種傳染劑造成的生物戰(zhàn)劑對人或動(dòng)物的傷害的方法，其中每天施用約0.1-500mg/Kg的全葡聚糖顆粒。
20.權(quán)利要求17中所述的預(yù)防由一種或多種傳染劑造成的生物戰(zhàn)劑對人或動(dòng)物的傷害的方法，其中每天施用約0.1-100mg/Kg的PGG葡聚糖和約0.1-500mg/Kg的全葡聚糖顆粒的組合。
21.一種預(yù)防生物戰(zhàn)劑對人或動(dòng)物的傷害的方法，包含對人或動(dòng)物施用預(yù)防或治療有效量的β(1，3)-葡聚糖和抗生素的協(xié)同組合。
22.一種協(xié)同預(yù)防生物戰(zhàn)劑對人或動(dòng)物的傷害的方法，包含在對人或動(dòng)物接種針對所述生物戰(zhàn)劑的疫苗后再施用預(yù)防或治療有效量的β(1，3)-葡聚糖。
23.一種協(xié)同預(yù)防生物戰(zhàn)劑對人或動(dòng)物的傷害的方法，在用針對所述生物戰(zhàn)劑的免疫血清或單克隆抗體處理后再施用預(yù)防或治療有效量的β(1，3)-葡聚糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種方法以廣泛保護(hù)軍隊(duì)和公眾免受生物戰(zhàn)爭武器，尤其是如炭疽等傳染媒介物的傷害。β(1，3)－葡聚糖，尤其是全葡聚糖顆粒、PGG－葡聚糖、和微粒葡聚糖，可提供一般性免疫增強(qiáng)，因此提高了身體抵御許多不同生物威脅的能力。在感染之前和之后施用時(shí)，顯示β(1，3)－葡聚糖提高了對炭疽和其它傳染性生物感染的抗性。3(1，3)－葡聚糖的抗感染機(jī)理似乎涉及對先天免疫系統(tǒng)的刺激，這通過增加細(xì)胞因子釋放及CR3受體活化而實(shí)現(xiàn)。β(1，3)－葡聚糖在藥學(xué)上穩(wěn)定，相對緊密，并且使用中也沒有顯著的副作用。β(1，3)－葡聚糖還能增強(qiáng)其它醫(yī)療措施如抗生素、疫苗和免疫抗體等的效力。
文檔編號A61K39/395GK1723027SQ200380105493
公開日2006年1月18日 申請日期2003年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月9日
發(fā)明者加里·R·奧斯特羅夫 申請人:生物高分子工程公司