專利名稱:新的多肽的制作方法
在中性pH條件下與人胰島素的電荷相此帶有正電荷的胰島素衍生物可用來制備有長效胰島素活性的制劑。在這些胰島素的衍生物中，在B27位取代一個堿性的氨基酸和/或在A4位，A17位，B13位和/或B21位插入一個中性氨基酸，A鏈的C-終端即ASn21可被另外的氨基酸取代以便增加其在制劑的微酸性溶液中的穩(wěn)定性，B鏈的C-端羧基可進一步地用酰胺基或酯基保護，如果A21為ASn，則B30羧基應(yīng)為游離的。
本發(fā)明是有關(guān)新的胰島素化合物以及有長效胰島素作用的新的注射液的。
在治療糖尿病的過程中，已提出和使用了很多種的胰島素制劑，其中一些制劑是速效的而另外一些則有不同程度的長效作用。通過注射胰島素的微晶懸浮液可取得長效的作用，這些結(jié)晶制劑可通過在鋅的存在下使胰島素結(jié)晶(例如商標(biāo)為Lente的制劑，見Schlichtkrull胰島素結(jié)晶和胰島素-鋅懸浮液及其化學(xué)和生物學(xué)的研究，Munksgaard，1958)或在鋅和魚精蛋白的存在下使其結(jié)晶(如NPH-胰島素，見Rep.Steno Mem.Hosp.1(1946)，60)。
使用這些已知的鋅-胰島素或鋅-魚精旦白-胰島素的懸浮液的一個缺點是必須不斷振搖藥瓶才能保證它的濃度不變，才能保證注射準(zhǔn)確量的胰島素。在商標(biāo)為Penfill的藥筒中不能有空氣存在，長效的胰島素懸浮液還需要藥筒中有一個固體物質(zhì)以使其能搖動，與空氣一起搖動胰島素懸浮液和胰島素溶液本質(zhì)上是一個不合要求的步驟，因為隨著水與空氣的界面形成纖絲，胰島素有變性的傾向。因而就需要一些具有長效作用的胰島素的溶液。
通過讓胰島素的氨基和苯異氰酸酯反應(yīng)可制得長效的胰島素衍生物(所謂的異胰島素，見Hallas-Moeller根據(jù)胰島素和苯異氰酸酯的反應(yīng)對胰島素化學(xué)和生物學(xué)的研究、哥本哈根，1945)。類似地，Al，B29-di-Boc(Boc指叔丁氧羰基)取代的胰島素皮下注射后顯示長效胰島素活性(見Geiger和Enzmann前胰島素、胰島素、C-多肽;前胰島素、胰島素、C-多肽學(xué)術(shù)報告會會議記錄，〔日〕德島，1978;阿姆斯特丹-牛津 1979，306～310)。Al，B29-di-Boc取代胰島素的延效作用太微弱，以致于不能用于臨床。
結(jié)構(gòu)未改變的胰島素若顯示長效作用需要大量的鋅離子(如0.4～1毫克/單位胰島素)(見藥理學(xué)雜志 55.1935.206)，注射這樣大劑量的鋅離子可能會導(dǎo)致疼痛，因而這些溶液從未用于治療。
胰島素的等電點約為5.5，有人嘗試將其等電點上移以降低胰島素衍生物在中性pH條件下的溶解度，如通過在B-鏈N-端加一個堿性氨基酸如賴氨酸和精氨酸(見，如德國公開書，第2，042，299號)或堿性二肽精氨酰基精氨酸(見上述的Geiger和Enzmann的報告)。然而，在它的等電點附近，ArgB(-1)-ArgBO胰島素的溶解度遠遠高于母體胰島素。
日本專利申請?zhí)?5-144032是有關(guān)B30-氨基酸被一個至少含5個碳原子的氨基酸或其酰胺和酯取代的人胰島素的類似物。這些胰島素類似物被用于已經(jīng)產(chǎn)生了對哺乳動物胰島素有抗體的病人，在這個日本專利申請中，描述了六個具體的化合物，沒有提到其中任何一個具有長效作用，在這個日本專利申請中沒有描述具體的注射制劑。
歐洲專利申請?zhí)?4108442.9是有關(guān)胰島素類似物的，其中在B30-氨基酸上連有一個堿性的有機基團，因而在中性pH時引入一個正電荷。在這些類似物中，B30-氨基酸為中性的，人胰島素中為蘇氨酸時更好。德國專利申請?zhí)?，327，709.5是有關(guān)上述歐洲專利申請中的衍生物以及一個芳香羥基化合物的結(jié)晶懸浮液。德國專利申請?zhí)?，326，473.2是有關(guān)一種含多種胰島素化合物的制劑，其中至少有一種是上述歐洲專利申請中提到的。
歐洲專利申請?zhí)?94，864早在1985年3月12日要求優(yōu)先權(quán)中涉及C-端B30基被酰胺或?；Ｗo起來的胰島素衍生物，就象人胰島素中一樣，這些衍生物的A21氨基酸總是天門冬酰胺。
本發(fā)明包括一些新的人胰島素類似物，它們與人胰島素不同的是a).B-鏈C-端羧基上可以有酰胺或酯基，b).pH7時至少此人胰島素多一個電荷，最多不超過4個，c).A-鏈C-端天門冬酰胺殘基，AsnA21，可以被任何其它由核甘酸序列密碼表達的天然存在的氨基酸所取代。
d).如果通過掩蔽B30氨基酸的羧基使電荷發(fā)生變化的話，則A21氨基酸殘基應(yīng)為不同于天門冬酰胺的氨基酸殘基。
使電荷發(fā)生變化，可通過取代，得到與人胰島素相比多一個或多個氨基酸殘基產(chǎn)物，需要的話，可掩蔽B30氨基酸的羧基。
具體地講，本發(fā)明中付諸實施的重要化合物有如下特征A4、A17、B13、B21位四個谷氨酸殘基中的一個或多個被天然存在的中性氨基酸殘基取代，較好的是谷氨酰胺殘基;和/或B27位的蘇氨酸殘基被天然存在的堿性氨基酸殘基取代，較好的是L-精氨酸或L-賴氨酸殘基;和/或B30位的蘇氨酸殘基被一個或2個堿性氨基酸殘基取代，一個的較好;B-鏈的C-端羧基可被保護起來，同時A21位的天門冬酰胺殘基被一個L型的氨基酸殘基取代。
本發(fā)明還包括下面分子式Ⅰ中化合物的溶液，其中鋅離子的濃度可任意調(diào)控。因而胰島素作用的延長程度可被提高和控制。
令人十分驚奇的是用單一的一種具有通式Ⅰ的胰島素衍生物，作為有效成分制得的注射液，兼有短效和長效胰島素作用，通式Ⅰ為
其中字母A和B以及后面括號中的數(shù)字分別代表A-鏈和B-鏈的多肽片段，E1、E2、E3和E4可以相同或不同，每個代表一個谷氨酸殘基或可被核苷酸序列密碼表達的中性氨基酸殘基，X代表一個L-蘇氨酸、L-精氨酸或L-賴氨酸殘基，Y和Z可相同或不同，每個代表一個氨基酸殘基，其中任何側(cè)鏈氨基可被酰代以及任何側(cè)鏈羥基可被烷基化，m和n可相同或不同，每個代表0或1，R代表羥基或保護B-鏈C-端羧基的酰胺或酯基殘基，以及ω代表一個氨基酸殘基，其條件是ω為天門冬酰胺殘基時，R為羥基;當(dāng)ω為天門冬酰胺殘基時，X和-Ym-Zn-R均為蘇氨酸殘基，E3為谷氨酰胺殘基時，三個E1、E2和E3不全是谷氨酸殘基;進一步的條件是六個氨基酸殘基E1、E2、E3、E4、ω和X至少有一個不同于人胰島素相應(yīng)位置的氨基酸殘基以及至少選擇八個氨基酸殘基E1、E2、E3、E4、W、X、Y、Z和基團R中的一個使所得通式Ⅰ中的化合物在pH＝7時比人胰島素至少多一個電荷。
具有通式Ⅰ的化合物的一個分組是一些新的具有通式Ⅰ的化合物，其中字母A、B以及后面括號中的數(shù)字分別代表A鏈和B鏈的多肽片段，E1、E2、E3和E4可以相同或不同，每個代表一個谷氨酸殘基或可被核甘酸序列密碼表達的中性氨基酸殘基，X代表一個L-蘇氨酸，L-精氨酸或L-賴氨酸殘基，Y和Z可相同或不同，每個代表一個氨基酸殘基，其中任何側(cè)鏈氨基均可被?；约叭魏蝹?cè)鏈基均可被烷基化，m和n可相同或不同，每個代表0或1，R代表用來保護B-鏈C-端羧基的酰胺或酯基殘基，W為不同于天門冬酰胺殘基的基團。
與人胰島素相比，改變電荷可以通過用精氨酸或賴氨酸殘基取代B27位的蘇氨酸和/或用中性氨基酸殘基，最好是谷氨酰胺殘基取代A4、A17、B13、B21位的四個谷氨酸殘基中的任何一個或多個來達到。另外，B-鏈C-端羧基可用酰胺或酯基來掩蔽，因而消除羧基的負電荷，還可通過在B30和/或B31位引入堿性氨基酸殘基而引入正電荷。
由于具有通式Ⅰ的化合物可以制成有長效作用的溶液用于臨床，因而它與通常采用的豬或人胰島素的懸浮液相比，其致免疫性會降低。
其作用延長的程度可通過加入鋅離子來提高和控制。
控制胰島素作用延長程度的主要參數(shù)為鋅離子濃度和通式Ⅰ中化合物的選擇。鋅離子的含量范圍可從0到大約2毫克/毫升，在用BB13和/或B27位取代的化合物時，鋅濃度宜為0到200微克/毫升而用其他的類似物時則濃度宜為20～200微克/毫升，此時制劑中化合物Ⅰ的濃度為240毫微摩爾/毫升。所用通式Ⅰ中化合物的濃度不同時，鋅離子的含量可相應(yīng)地改變。
具有分子式Ⅰ的化合物的溶液在鋅離子存在下顯示出的長效作用歸因于這些化合物在中性pH時的低溶解度。
本發(fā)明中注射液的pH最好低于生理pH，其上限為出現(xiàn)沉淀時的pH。在生理pH值條件下，本發(fā)明中的分子式為Ⅰ的化合物溶解度較低。在pH約為5.5的條件下制得了含大約240毫微摩爾/毫升的通式Ⅰ的化合物的穩(wěn)定溶液。pH的上限取決于溶液的組成，如等滲鹽，防腐劑和鋅離子濃度，并取決于所選通式Ⅰ中的化合物。注射液的pH值沒有下限，通式Ⅰ中的化合物當(dāng)W不為天門冬酰胺時，穩(wěn)定性很高，甚至在pH＝3時仍很穩(wěn)定。本發(fā)明中注射液的pH宜在約2.5到8.5之間，更好的是在大約4.5到8之間，特別好的pH范圍為2.5到5.5，最好的是3到4.5。
本發(fā)明的另一個方面是為病人提供了更大的靈活性，一種是含有通式Ⅰ的化合物的水溶液，另一種是含有鋅離子的水溶液，病人可將這兩種溶液適當(dāng)?shù)鼗旌系玫剿璧难有С潭群退幏宄霈F(xiàn)的時間。因此，病人備有這兩種溶液，可以選擇一種作用和藥峰出現(xiàn)時間適于早上注射的，也可選擇另一種適于晚上注射的。本發(fā)明中鋅溶液的濃度宜在2微克/毫升到20毫克/毫升之間。或者，備用的兩種溶液都含有鋅，濃度可相等或不等，和/或兩種備用的溶液都含有通式Ⅰ的化合物，化合物可相同或不同。
本發(fā)明的注射液中通式Ⅰ的化合物的濃度宜在大約60到6000毫微摩爾/毫升之間，當(dāng)W不是L-天門冬酰胺時，它可以是一個中性的L-型氨基酸，如纈氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、亮氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或更好的為甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸或高絲氨酸。W也可以是酸性氨基酸即谷氨酸或更好地為天門冬酸，或為一個堿性氨基酸即賴氨酸、精氨酸或更好地為組氨酸。
中性氨基酸(E1到E4)為，例如，甘氨酸，纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或更好地為天門冬酰胺，谷氨酰胺，丙氨酸，絲氨酸或蘇氨酸。
R可為酯基的一部分，如低級烷氧基，較好的為甲氧基，乙氧基以及最好的為叔丁氧基。
再者，R可為通式-NR1R2的一個基團，其中R1和R2相同或不同，每個代表氫或低級烷基。以下術(shù)語“低級”指所討論的含碳數(shù)少于7的基團，少于5更好。本發(fā)明中一個較好的具體實例中，R為-NH2。再者，R還可為一個內(nèi)酰胺的殘基，內(nèi)酰胺環(huán)中少于8個原子更好，例如一個二氨基羧酸的內(nèi)酰胺。
本發(fā)明中一個較好的實例中，R為不帶電荷的。
按照本發(fā)明中的一個較好的實例，Y和Z代表的氨基酸殘基應(yīng)為可由核甘酸序列密碼表達的L-型氨基酸的殘基。
Y和Z代表的任何氨基酸殘基的側(cè)鏈氨基均可用含2到18個碳原子的酸酰化，用含有6到18個碳原子的脂肪酸更好，如月桂酸。因而-Ym-Zn-R可以為-Lys(Lau)-NH2。
較好的烷基化羥基的例子為甲氧基，乙氧基和叔丁氧基。
在一組通式為Ⅰ的較好的化合物中，Y和/或Z為一個堿性氨基酸殘基，其中的側(cè)鏈氨基也可以被?；?m＝1)。
在另一組通式為Ⅰ的較好的化合物中，n為0，Y為一個堿性氨基酸殘基(m＝1)。
在另外一組通式為Ⅰ的較好的化合物中，Y和Z均為堿性氨基酸殘基(m＝1，n＝1)。
本發(fā)明中另一個具體的較好的實例為含通式Ⅰ的化合物的制劑，其中E1、E2、E3和/或E4為谷氨酰胺殘基，和/或X為Lys或Arg，和W為Gly，Ser，Thr，Ala，His，Asp或hser，在這類的通式為Ⅰ的化合物中，更好的為含有通式Ⅰ的化合物的制劑，其中-Ym-Zn-R為-Thr-NH2或-Lys-NH2。
下面是通式為Ⅰ的較好的具體化合物
GlyA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素SerA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素ThrA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素AlaA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素HisA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素AspA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素GlyA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素SerA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素ThrA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素AlaA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素HisA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素AspA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，GlyA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，SerA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，ThrA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，AlaA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，HisA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，AspA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，GlyA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，SerA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，ThrA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，AlaA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，HisA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，AspA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素本發(fā)明中另外一個較好的具體實例為含有通式為Ⅰ的化合物的制劑，其中m＝1，n＝0，Y為Thr、Ala或Ser，R為羥基，以及W為Gly，Ser，Thr，Ala，His或Asp，下面為這類化合物的一些例子
AsnA21，LysB27人胰島素SerA21，LysB27人胰島素ThrA21，LysB27人胰島素AlaA21，LysB27人胰島素HisA21，LysB27人胰島素AspA21，LysB27人胰島素GlyA21，LysB27人胰島素AsnA21，ArgB27人胰島素SerA21，ArgB27人胰島素ThrA21，ArgB27人胰島素AlaA21，ArgB27人胰島素HisA21，ArgB27人胰島素AspA21，ArgB27人胰島素GlyA21ArgB27人胰島素GlnA17，AsnA21，ArgB27人胰島素GlnA17，SerA21，ArgB27人胰島素GlnA17，ThrA21，ArgB27人胰島素GlnA17，AlaA21，ArgB27人胰島素GlnA17，HisA21，ArgB27人胰島素GlnA17，AspA21，ArgB27人胰島素GlnA12GlyA21，ArgB27人胰島素GlnA17，AsnA21，GlnB13人胰島素GlnA17，SerA21，GlnB13人胰島素GlnA17，ThrA21，GlnB13人胰島素
GlnA17，AlaA21，GlnB13人胰島素GlnA17，HisA21，GlnB13人胰島素GlnA17，AspA21，GlnB13人胰島素GlnA17，GlyA21，GlnB13人胰島素ArgB27，AsnA21，GlnB13人胰島素ArgB27，SerA21，GlnB13人胰島素ArgB27，ThrA21，GlnB13人胰島素ArgB27，AlaA21，GlnB13人胰島素ArgB27，HisA21，GlnB13人胰島素ArgB27，AspA21，GlnB13人胰島素ArgB27，GlyA21，GlnB13人胰島素GlnA17，AsnA21，LysB27人胰島素GlnA17，SerA21，LysB27人胰島素GlnA17，ThrA21，LysB27人胰島素GlnA17，AlaA21，LysB27人胰島素GlnA17，HisA21，LysB27人胰島素GlnA17，AspA21，LysB27人胰島素GlnA17，GlyA21，LysB27人胰島素GlnB13，AsnA21，LysB27人胰島素GlnB13，SerA21，LysB27人胰島素GlnB13，ThrA21，LysB27人胰島素GlnB13，AlaA21，LysB27人胰島素GlnB13，HisA21，LysB27人胰島素GlnB13，AspA21，LysB27人胰島素GlnB13，GlyA21，LysB27人胰島素在一組通式為Ⅰ的較好的化合物中，E2和E3為谷氨酰胺殘基。
在另一組通式為Ⅰ的較好的化合物中，X為精氨酸或賴氨酸殘基。
另外一組通式為Ⅰ的較好的化合物中，W為Gly、Ser、Thr、Ala、His、Asp或hser。
正如技術(shù)中已熟知的，人胰島素中不是所有的氨基酸殘基對其胰島素作用都是必要的。
實際上，與人胰島素的氨基酸殘基有些差別的豬胰島素和牛胰島素均被用于糖尿病的治療。種與種之間在胰島素分子上存在著相當(dāng)大的差異。因此人胰島素中很多氨基酸殘基可被改變而不引起其胰島素活性的降低，這里也包括一些影響分子等電點的殘基。
很明顯，適當(dāng)?shù)剡x擇由E1、E2、E3、E4、R、W、X、Y和Z代表的基團，以使所得的通式Ⅰ中的化合物符合藥用的要求。
在已知的雙相胰島素制劑中，通常是將速效的可溶的胰島素和長效的結(jié)晶胰島素合并在同一種注射液中，通過使用本發(fā)明中通式Ⅰ的化合物，只需注射單一化合物的溶液便可獲得類似合并的速效和長效的胰島素作用。速效和長效作用的率隨溶液中鋅離子濃度的增加而降低。
通式Ⅰ中的化合物可通過轉(zhuǎn)移反應(yīng)制得，這里采用具有與胰島素相符合的二硫橋鍵，通式為Ⅱ的生物合成的前體化合物與通式為Ⅲ的氨基化合物反應(yīng)，通式Ⅱ
其中A和B后面括號中的數(shù)字分別代表A鏈和B鏈的多片段，Q為一個具有q個氨基酸的肽鏈，q為0到33的整數(shù)，T為Lys或Arg，r為0或1，E1、E2、E3、E4、W和X如前所定義。通式(Ⅲ)為
其中Y、Z、R、m和n如前所定義，Y、Z中的側(cè)鏈氨基和羥基可任意地用其保護基來保護，這一反應(yīng)就象美國專利№.4，343，898中所述的一樣，在水和有機溶劑的混合物中反應(yīng)，采用胰旦白酶或類似胰旦白酶的酶作催化劑。當(dāng)W為hSer時，基因中的核甘酸序列密碼則在A21位引入Met。在旦白質(zhì)中上述由Met到hSer的轉(zhuǎn)化是由溴化氰來完成的。這一過程中宜采用的通式Ⅲ中的化合物為Thr-NH2，Lys(Boc)-NH2，Thr(But)-oBut，Thr-oBut，Ala-NH2和Arg(BOC)-NH2。氨基可用一個脂肪酸使其?；?，羥基可通過烷基化使其得到保護。如果Y和Z含有可逆的氨基保護基，則這些基團在后一階段即氨基保護的中間體從胰旦白酶或類胰旦白酶分離出來后可以被除去。在類胰旦白酶中，從溶解無色桿菌(Achromobacter Lyticus)得到的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶是很有用的。
類似歐洲專利申請№.163，529所述的，通式Ⅱ中的化合物可通過采用含相應(yīng)的有關(guān)氨基酸的密碼的基因在一個宿主微生物如酵母菌中得到表達。表達新胰島素衍生物的基團插到一個合適的表達媒介中，當(dāng)它轉(zhuǎn)移到酵母菌中時，則可表達所需的化合物。根據(jù)所表達的化合物是否從細胞中分泌出來，決定是從細胞中還是從培養(yǎng)基中分離出所需的化合物。
氨基的可逆性保護基的一個例子為叔丁氧羰基，羥基的一個例子為叔丁基。這些基團可在不引起通式Ⅰ中的化合物其它不需要的變化的條件下被除去，如在三氟醋酸的條件下。
A4、A17、A21、B13、B21或B27位的變化可方便地通過基因工程完成，剩下的引入B-鏈C-端的基團則通過胰旦白酶催化的半合成來實現(xiàn)。
在胰島素分子的51個氨基酸的骨架內(nèi)引入附加的正電荷，而不是通過延長哺乳動物胰島素的超過30個氨基酸殘基的B-鏈，這樣便使形成的新的通式Ⅰ中的化合物較容易制備。在半合成的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)中，可采用大大過量的氨基酸酰胺或氨基酸酯。如果轉(zhuǎn)肽反應(yīng)用所需的是二肽酰胺或酯，則其造價或溶解度或兩者會限制其大大過量地使用，因而所得產(chǎn)物的產(chǎn)率也會降低。即使轉(zhuǎn)肽反應(yīng)中采用過量相同當(dāng)量的氨基酸酰胺和二肽酰胺，如Lys(BOC)-NH2或Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH2，并且反應(yīng)在相似的條件下進行，則用氨基酸酰胺反應(yīng)的產(chǎn)率明顯高于用二肽酰胺進行的反應(yīng)的產(chǎn)率。
本發(fā)明中胰島素制劑是通過溶解通式Ⅰ的化合物于微酸性的水溶性介質(zhì)中制得的，例如，其濃度為240或600毫微摩爾/毫升。使水溶性介質(zhì)等滲，例如用氯化鈉，醋酸鈉或甘油。另外，水溶性介質(zhì)中還可含有鋅離子，其濃度可高至大約30微克鋅離子/毫微摩爾通式Ⅰ的化合物，以及緩沖液如醋酸鹽，枸櫞酸鹽和組氨酸，防腐劑如間甲酚，羥基苯甲酸乙酯，苯酚。胰島素制劑的最終pH值取決于通式Ⅰ的化合物中改變的電荷數(shù)，鋅離子的濃度，通式為Ⅰ的化合物的濃度以及所選擇的通式為Ⅰ的化合物。為便于給藥將pH值調(diào)至大約2.5～4.5，這樣也能防止沉淀的產(chǎn)生。胰島素制劑通過無菌過濾消毒。
本發(fā)明中的胰島素制劑的使用類似已知胰島素制劑的使用。
這里所述的任何新的或相聯(lián)合的特征都被認(rèn)為實質(zhì)上是屬于本項發(fā)明的。
這里所采用的氨基酸的縮寫見《生物及化學(xué)雜志》243(1968)，3558。這里所述的氨基酸均為L-構(gòu)型的。在通式Ⅰ及其它地方提到的A(1-3)為Gly-Ile-Val，A(5-6)為Gln-Cys等，參見人胰島素中的氨基酸序列。除非個別指明，這里所述的胰島素為人胰島素。
胰島素化合物的合成正如歐洲專利申請№.163，529所述，胰島素的來源為酵母菌中表達的胰島素前體化合物。
象上述歐洲專利申請的例7中所述的那樣，發(fā)酵培養(yǎng)基中的胰島素前體化合物通過吸附到LichroprepTMRP-18上再回收。用含0.2M氯化鉀，0.001M鹽酸的33%(體積/體積)的乙醇溶液將前體物質(zhì)從柱子上洗脫下來。通過不斷地加入水(每一槽的體積為一份量)，加入固體枸櫞酸三鈉使其摩爾濃度為0.05M，最后加入醋酸鋅使其摩爾濃度為0.006M，pH值調(diào)至6.8，混合物在4℃時放置過夜，使胰島素前體物質(zhì)在槽中結(jié)晶，結(jié)晶通過離心分離，用水洗滌，真空干燥。
用于酶法半合成的保護的氨基酸和多肽是用標(biāo)準(zhǔn)的方法制備的或從Nova Biochem(瑞士)或Bachem(瑞士)購買的(常規(guī)合成)。
名稱后面的字母“TM”說明這是一個商標(biāo)。
例1到例14的原料中，由通式Ⅱ中(Qq-T)r選擇Ala-Ala-Lys并用歐洲專利申請№.163，529例10中所述的方法由酵母菌質(zhì)體PMT610得到。代表GlnB13、GlnA17、ArgB27、LysB27、AspA21、GlyA21、HisA21、SerA21和ThrA21的核甘酸密碼可通過部位特異的化學(xué)誘變?nèi)〈絇MT610上，方法見《核酸研究》11(1983)，5103～5112。
例1GlnB13、ArgB27、人胰島素的合成往5克胰島素前體GlnB13、ArgB27、B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)在50毫升2M Thr-OBut·CH3COOH(L-蘇氨酸叔丁酯與醋酸通過氫鍵形成的鹽)的DMF溶液的懸浮液中，加入25毫升25.5%(體積/體積)的水在DMF中的溶液(25.5毫升水，加DMF成為100毫升)。懸浮液在攪拌下冷至12℃，加入0.5克豬胰旦白酶在12.5毫升0.05M的醋酸鈣溶液中的溶液，繼續(xù)攪拌，直至溶解。12℃放置48小時后，將混合物傾倒入600毫升丙酮中使旦白質(zhì)沉淀，沉淀通過離心分離，用200毫升丙酮洗滌一次，離心分離后的沉淀，在氮氣流下干燥。將沉淀溶于100毫升0.04N的鹽酸溶液中，pH值調(diào)至2.5，這個溶液用于5×30厘米的制備性高壓液相(以下用HPLC表示)柱，柱子用十八烷基二甲基硅烷取代的硅膠顆粒(平均顆粒大小15微米，孔徑大小100埃)填充。柱子用比率為35.5/64.5(體積的份數(shù)比)的乙醇/0.3M氯化鉀，0.001N鹽酸水溶液平衡，用同樣的緩沖液以2升/小時的速度從柱子上洗脫旦白質(zhì)。GlnB13、ArgB27、ThrB30-OBut人胰島素的峰出現(xiàn)在55到100分鐘之間，為分離GlnB13，ArgB27，ThrB30-OBut人胰島素，不斷地向槽中加入水最后使乙醇濃度為15%(體積/體積)，加入固體枸櫞酸三鈉使枸櫞酸根摩爾濃度為0.05M，加入固體氯化鋅使鋅離子濃度為0.006M。將pH值調(diào)到6.8，室溫攪拌1小時后，在4℃繼續(xù)攪拌24小時，使其結(jié)晶，結(jié)晶離心后，用20毫升冰冷的水洗兩次，離心分離后，真空干燥，最后得到2.51克GlnB13、ArgB27、ThrB30-OBut人胰島素。
將GlnB13、Arg27、ThrB30-OBut人胰島素溶于100毫升三氟醋酸中，室溫放置兩小時。三氟醋酸用真空冷凍干燥法除去，將冷凍干燥后的物質(zhì)溶于100毫升水中，將pH值調(diào)至2.5并加入20克氯化鈉，含有GlnB13、ArgB27人胰島素的塊狀物通過離心分離出來，將其溶于850毫升水中，為使GlnB13，ArgB27人胰島素結(jié)晶，連續(xù)加入150毫升乙醇，14.7克枸櫞酸三鈉二水合物和0.82克氯化鋅，然后將其pH值調(diào)到6.8，室溫攪拌一小時后，繼續(xù)在4℃時慢慢攪拌24小時使其結(jié)晶。結(jié)晶離心后，用20毫升冰冷的水洗兩次，再次離心后真空干燥，得到1.71克GlnB13，ArgB27人胰島素，相當(dāng)于36%。
所得產(chǎn)品的氨基酸組成和理論一致，精氨酸為兩個殘基/分子。DISC PAGE電泳說明產(chǎn)品是純的，其遷移速率為人胰島素的55%，相當(dāng)于大約有2個電荷的差異。DISC PAGE電泳詳見《激素代謝研究》，補編№.5(1974)，134。結(jié)晶中鋅離子的含量為0.42%(重量/重量)。
例2～6GlnB13，GlnA17人胰島素，GlnA17，ArgB27人胰島素、ArgB27人胰島素，LysB27人胰島素和HisA21，ArgB27人胰島素的合成。
上述5個化合物是從相應(yīng)的單鏈胰島素前體化合物，即
GlnB13，GlnA17，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)，GlnA17，ArgB27，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)，ArgB27，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)，LysB27，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)和HisA21，ArgB27，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)，用例1中所述的方法合成得到的產(chǎn)率，相對于人胰島素的電荷，在pH＝8.9時DISC PAGE電泳中相對于胰島素的遷移速率以及與人胰島素氨基酸組成的差異均列于下面的表Ⅰ。
例7～13AspA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlyA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素HisA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlyA21，ArgB27，GlnB13，ThrB30-NH2人胰島素SerA21，ArgB27，GlnB13，ThrB30-NH2人胰島素ThrA21，ArgB27，GlnB13，ThrB30-NH2人胰島素和SerA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素上述7個化合物是通過其相應(yīng)的單鏈胰島素前體化合物，即AspA21，ArgB27，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)，GlyA21，ArgB27，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)，HisA21，ArgB27，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)，GlyA21，ArgB27，GlnB13，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)，SerA21，ArgB27，GlnB13，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)，ThrA21，ArgB27，GlnB13，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)和SerA21，ArgB27，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)按歐洲專利申請№.194，864的例4和例6中所述的方法，在Thr-NH2存在下在有機水溶液中進行的類胰旦白酶催化的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)而制得的。其產(chǎn)率，相對于人胰島素的電荷，在pH＝8.9時DISC PAGE電泳中相對于胰島素的遷移速率以及與人胰島素氨基酸組成的偏差均列于表Ⅰ。
例14AspA21、ArgB27、LysB30-NH2人胰島素的合成上述的化合物可由其相應(yīng)的單鏈胰島素前體化合物即AspA21，ArgB27，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)按歐洲專利申請№.194，864的例5和例7中所述的方法制得的，它是先在Lys(BOC)-NH2的存在下在有機水溶液中進行類胰旦白酶催化的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，純化中間體Lys(BOC)B30-NH2人胰島素，然后用三氟醋酸除去保護基BOC，產(chǎn)率和分析數(shù)據(jù)見表Ⅰ。
例15通式為Ⅰ的化合物的注射液的制備用來測定其延效程度的通式為Ⅰ的化合物的無菌注射液中用1.6%(重量/體積)甘油使其等滲，用0.3%(重量/體積)的間甲酚作為防腐劑，用0.01M的醋酸鈉作為緩沖液。鋅離子的濃度為8或80微克/毫升，調(diào)節(jié)溶液的pH值使其遠離通式為Ⅰ的化合物的等電點以使其在4℃貯藏時保持透明而不析出沉淀。溶液中通式為Ⅰ的化合物的含量為240毫微摩爾/毫升，這一濃度是通過測定一個沒有間甲酚的更濃的貯藏液在276納米的吸收確定的，這里要用到一個豬胰島素的摩爾消光系數(shù)，對這些衍生物來講為6100(見《內(nèi)科學(xué)手冊》〔德〕，第七卷，第2A部分，編輯Oberdisse，1975，113頁)。對于單一組分的豬胰島素，已知的強度為28.5單位/毫克物質(zhì)的干重，即1單位相當(dāng)于5.95毫微摩爾(見《糖尿病護理》第6卷/補編1(1983)，4)。
制備了含有240毫微摩爾/毫升的通式為Ⅰ的化合物的注射液，所用化合物及注射液pH值和鋅離子含量列于表Ⅱ。
長效胰島素作用的測定按照《英國藥典》1980，A142的方法，用空腹的家兔測定了由胰島素注射液產(chǎn)生的長效降血糖作用。每一試液皮下注射的劑量為14.3毫微摩爾/家兔，并用12只體重為3到4千克的家兔測定，降血糖的過程追蹤6小時。為了對照，實驗中還采用了ActrapidTM豬胰島素制劑和中速MonotardTM人胰島素制劑，測定的結(jié)果列于表Ⅱ。
表Ⅱ
表Ⅲ
用小鼠血糖消耗實驗(《英國藥典》1980，A141-A142)測定了這些胰島素化合物的效力，由于與標(biāo)準(zhǔn)有時間差異，為減少測定效力時出現(xiàn)的問題，用于測定效力的胰島素溶液中不加鋅離子?；?76納米的吸收，使溶液中化合物的含量為240毫微摩爾/毫升，由結(jié)晶的衍生物帶進去的鋅離子在溶液中的含量為8-10微克/毫升。一些胰島素化合物的效力測定結(jié)果列入表Ⅲ。
權(quán)利要求
1.通式為Ⅰ的化合物，
其中字母A、B以及其后面括號中的數(shù)字分別代表A-鏈和B-鏈的多肽片段，E1、E2、E3、E4可相同或不同，每個代表一個谷氨酸殘基或一個可被核甘酸序列密碼表達的中性氨基酸殘基，X代表一個L-蘇氨酸，L-精氨酸或L-賴氨酸的殘基，Y和Z可相同或不同，每個代表一個氨基酸殘基，其中任何側(cè)鏈氨基可被?；约叭魏蝹?cè)鏈羥基可被烷基化，m和n可相同或不同，每個代表0或1，R代表羥基或一個掩蔽B-鏈C-端羧基的酰胺或酯基殘基，W代表一個氨基酸殘基，其條件為當(dāng)W為天門冬酰胺時，R為羥基；W為天門冬酰胺殘基時，X和-Ym-Zn-R均為蘇氨酸殘基，E3為谷氨酰胺殘基以及不是所有的三個E1、E2和E4均為谷氨酸殘基，其進一步的條件為六個氨基酸殘基E1、E2、E3、E4、W和X中至少有一個不同于人胰島素相應(yīng)位置的氨基酸殘基，至少選擇八個氨基酸殘基E1、E2、E3、E4、W、X、Y和Z中的一個以使通式為Ⅰ的化合物在PH=7時至少比人胰島素多一個電荷。
2.權(quán)項1中的化合物，其中X為賴氨酸或精氨酸殘基。
3.上述任何權(quán)項中的化合物，其中E2和E3均為谷氨酰胺殘基。
4.上述任何權(quán)項中的化合物，其中Y和/或Z為一個堿性氨基酸殘基，其中的側(cè)鏈氨基可被?；?m＝1)。
5.上述任何權(quán)項中的化合物，其中n＝0，以及Y為一個堿性氨基酸殘基(m＝1)。
6.上述任何權(quán)項中的化合物，其中Y和Z均為堿性氨基酸殘基(m＝1，n＝1)。
7.上述任何權(quán)項中的化合物，其中R為具有通式-NR1R2的基團，這里R1和R2可以相同或不同，每個代表氫或低級烷基，較好的是R為-NH2。
8.權(quán)項1～6中任何一項中的化合物，其中R為低級烷氧基，較好的為叔丁氧基。
9.權(quán)項1～6中任何一項中的化合物，其中R為內(nèi)酰胺殘基，這里內(nèi)酰胺環(huán)中最好少于8個原子。
10.上述任何權(quán)項中的化合物，其中W不為天門冬酰胺，較好的是W為Gly、Ser、Thr、Ala、His、Asp或hSer。
11.權(quán)項1中的化合物是GlyA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素SerA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素ThrA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素AlaA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素HisA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素AspA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素GlyA21，ArgB27ThrB30-NH2人胰島素SerA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素ThrA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素AlaA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素HisA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素AspA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，GlyA21ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，SerA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，ThrA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，AlaA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，HisA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，AspA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，GlyA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，SerA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，ThrA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，AlaA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，HisA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素GlnB13，AspA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素AsnA21，LysB27人胰島素SerA21，LysB27人胰島素ThrA21，LysB27人胰島素AlaA21，LysB27人胰島素HisA21，LysB27人胰島素AspA21，LysB27人胰島素GlyA21，LysB27人胰島素AsnA21，ArgB27人胰島素SerA21，ArgB27人胰島素ThrA21，ArgB27人胰島素AlaA21，ArgB27人胰島素HisA21ArgB27人胰島素AspA21，ArgB27，LysB30-NH2人胰島素AspA21，ArgB27人胰島素GlyA21，ArgB27人胰島素GlnA17，AsnA21，ArgB27人胰島素GlnA17，SerA21，ArgB27人胰島素GlnA17，ThrA21，ArgB27人胰島素GlnA17，AlaA21，ArgB27人胰島素GlnA17，HisA21，ArgB27人胰島素GlnA17，AspA21，ArgB27人胰島素GlnA17，GlyA21，ArgB27人胰島素GlnA17，AsnA21，GlnB13人胰島素GlnA17，SerA21，GlnB13人胰島素GlnA17 ，ThrA21 ，GlnB13人胰島素GlnA17，AlaA21，GlnB13人胰島素GlnA17，HisA21，GlnB13人胰島素GlnA17，AspA21，GlnB13人胰島素GlnA17，GlyA21，GlnB13人胰島素ArgB27，AsnA21，GlnB13人胰島素ArgB27，SerA21，GlnB13人胰島素ArgB27，ThrA21，GlnB13人胰島素ArgB27，AlaA21，GlnB13人胰島素ArgB27，HisA21，GlnB13人胰島素ArgB27，AspA21，GlnB13人胰島素ArgB27，GlyA21，GlnB13人胰島素GlnA17，AsnA21，LysB27人胰島素GlnA17，SerA21，LysB27人胰島素GlnA17，ThrA21，LysB27人胰島素GlnA17，AlaA21，LysB27人胰島素GlnA17，HisA21，LysB27人胰島素GlnA17，AspA21，LysB27人胰島素GlnA17，GlyA21，LysB27人胰島素GlnB13，AsnA21，LysB27人胰島素GlnB13，SerA21，LysB27人胰島素GlnB13，ThrA21，LysB27人胰島素GlnB13，AlaA21，LysB27人胰島素GlnB13，HisA21，LysB27人胰島素GlnB13，AspA21，LysB27人胰島素GlnB13，GlyA21，LysB27人胰島素hSerA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素
12.具有長效胰島素作用的注射液，其中含有通式為Ⅰ
的化合物，其中字母A、B及后面括號中的數(shù)字分別代表A-鏈和B-鏈的多肽片段，E1、E2、E3、E4可相同或不同，每個一個谷氨酸殘基或一個可由核甘酸序列密碼表達的中性氨基酸殘基，X代表一個L-蘇氨酸、L-精氨酸或L-賴氨酸殘基，Y和Z可相同或不同，每個代表一個氨基酸殘基，其中的任何側(cè)鏈氨基可被酰化以及任何側(cè)鏈羥基可被烷基化，m和n可相同或不同，每個代表0或1，R代表羥基或一個用來掩蔽B-鏈C-端羧基的酰胺或酯基殘基，W為一個氨基酸殘基，其條件為當(dāng)W為天門冬酰胺殘基時，R為羥基;當(dāng)W為天門冬酰胺殘基時，X和-Ym-Zn-R為蘇氨酸殘基，并且E3為谷氨酰胺殘基，不是所有的三個E1、E2、和E4均為谷氨酸殘基;其進一步的條件為六個氨基酸殘基E1、E2、E3、E4、W和X中至少有一個不同于人胰島素相應(yīng)位置的氨基酸殘基，至少選擇八個氨基酸殘基E1、E2、E3、E4、W、X、Y和Z中的一個以使通式為Ⅰ的化合物在pH＝7時至少比人胰島素多一個電荷。
13.權(quán)項12中的制劑，其中含有鋅離子，其濃度宜在大約2微克/毫升到大約2毫克/毫升之間，最好是在大約5微克/毫升到200微克/毫升之間。
14.根據(jù)權(quán)項12，鋅溶液與含有權(quán)項11中所述的通式為Ⅰ的化合物的溶液混合可制備長效注射液，鋅溶液中鋅的含量宜在大約10微克/毫升到20毫克/毫升之間。
15.根據(jù)權(quán)項12，一個制備注射液的方法，其特征在于它是將可以含有鋅的權(quán)項12中所述的通式為Ⅰ的化合物的溶液與含有權(quán)項12中所述的通式為Ⅰ的化合物的鋅溶液相混合，所得混合液中的鋅離子濃度可高達2毫克/毫升，較好的情況是這兩個溶液中的鋅離子濃度都少于大約4毫克/毫升。
16.一個制備權(quán)項12中所述的通式為Ⅰ的化合物的方法，它是將具有通式Ⅱ
的胰島素前體化合物，其中A、B以及后面括號中的數(shù)字分別代表A-鏈和B-鏈的多肽片段，Q為具有q個氨基酸的肽鏈，q為0到33的整數(shù)，T為Lys或Arg，r為0或1以及E1、E2、E3、E4、W和X如權(quán)項12中所定義，與具有通式Ⅲ的化合物，其中Y、Z、R、m和n如前所定義，Y和Z中的側(cè)鏈氨基和羥基可用其保護基來保護，在胰旦白酶或類胰旦白酶的催化下進行肽轉(zhuǎn)移反應(yīng)。
17.一個將權(quán)項12中的注射劑用于人類治療糖尿病的方法。
18.這里所述的是任何新的特征或相聯(lián)合的特征。
專利摘要
本發(fā)明涉及到的是新胰島素化合物和長效的新胰島素注射液。
文檔編號C07K14/575GK87104988SQ87104988
公開日1988年3月2日 申請日期1987年7月20日
發(fā)明者簡·馬庫森, 克耶爾德·諾利斯, 利賽洛特·蘭克耶爾 申請人:諾沃工業(yè)聯(lián)合股票公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan