專利名稱：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的載體，它包括不含導(dǎo)致中和抗體產(chǎn)生的型特異性表位的人乳頭瘤病毒的修飾的主要衣殼蛋白L1(HPV-L1蛋白)。本發(fā)明還包括編碼所述載體的寡核苷酸或多核苷酸、包含所述載體或所述寡核苷酸或多核苷酸的疫苗以及在抵抗病毒性、細(xì)菌性或寄生蟲感染的疫苗接種中和抵抗某些癌癥的發(fā)展的過程中所述載體或所述寡核苷酸或多核苷酸的使用方法。尤其認(rèn)識(shí)到了人乳頭瘤病毒感染和作為這類感染的結(jié)果的癌癥的發(fā)展。
HPVs存在100多種不同類型。盡管類型由遺傳同源性來確定，但是迄今已經(jīng)證實(shí)基因型與血清型之間具有顯著良好的一致性，即針對一種類型的超免疫抗血清僅能中和相同類型而不能中和其它基因型。僅報(bào)導(dǎo)了對某些密切相關(guān)類型的交叉中和且已經(jīng)具有的效價(jià)比型特異性中和低2個(gè)數(shù)量級(jí)(2、3)。
HPV殼體由72個(gè)各自含有HPV主要衣殼蛋白L1的5個(gè)拷貝的殼粒組成。小衣殼蛋白L2以極小的量存在于殼體中(與L1蛋白相比為1∶12)且L2的位置是不確定的(2)。
許多小病毒表達(dá)衣殼蛋白，即當(dāng)表達(dá)時(shí)自組裝成病毒樣顆粒(VLPs)(即顆粒在形態(tài)上與病毒顆粒相似，但缺乏病毒基因組)。其中對HPV主要衣殼蛋白L1研究的最多(2)。僅含有L1的HPV VLPs在形態(tài)上類似于含有L1和L2的VLPs(2)。僅含L1的顆粒和含有L1/L2的顆粒均可以在幾種動(dòng)物模型系統(tǒng)(家兔、牛、狗和恒河猴)中非常有效地引起高效價(jià)的中和抗體反應(yīng)，甚至在免疫佐劑不存在的情況下也是如此(2)。
已經(jīng)證實(shí)接種乳頭瘤病毒VLPs，由中和抗體介導(dǎo)可非常有效地預(yù)防隨后的皮膚和粘膜乳頭瘤病毒的挑戰(zhàn)，但僅以型特異性方式進(jìn)行(2)。這種強(qiáng)的特異性是出人意料的，因?yàn)镠PVs的主要衣殼蛋白是一種高度進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)，它在遺傳相關(guān)的HPV類型之間具有極少的蛋白質(zhì)改變而沒有交叉中和性。
最常見的致癌HPVs是HPV16、18、31和45。在約50％的宮頸癌中發(fā)現(xiàn)了HPV16、發(fā)現(xiàn)HPV18的約占20％且這4種類型相當(dāng)于全部宮頸癌的＞80％以上。因此，通常關(guān)注的策略是制備同時(shí)含有這4種最常見HPV類型的HPV殼體的疫苗(2)。
盡管這種策略看起來能夠獲得顯著減少癌癥的作用，但是它存在某些明顯的缺陷。含有彼此混合的4種活性成分的疫苗制劑包括主要在生產(chǎn)和功效測試以及每種成分的質(zhì)量控制方面有相當(dāng)多的附加費(fèi)用。
此外，約10-20％的宮頸癌是由來包括在目前生產(chǎn)的疫苗候選物中的HPV類型所導(dǎo)致的。除疫苗不能夠預(yù)防這些類型這一事實(shí)外，還存在4種最常見的致癌HPV類型的消除可能導(dǎo)致其它致癌HPV類型廣泛出現(xiàn)的可能性，由此進(jìn)一步減少了預(yù)防癌癥的增益。正如根據(jù)種群生物學(xué)研究所預(yù)計(jì)的，如果在不同病毒類型之間存在干擾，那么上述后一種情況可能發(fā)生。作為間接證據(jù)的幾種株系確實(shí)表現(xiàn)出在HPV類型之間確實(shí)存在干擾。
幾種其它HPV類型導(dǎo)致明顯的發(fā)病率和死亡率，最值得注意的是HPV6和11導(dǎo)致生殖器疣和復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤病，而HPVs 5和8在免疫抑制宿主中導(dǎo)致皮膚癌。盡管廣泛交叉反應(yīng)性疫苗具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，但是尚未提出通過修飾L1蛋白以便不含免疫顯性型特異性表位來產(chǎn)生廣泛交叉反應(yīng)性疫苗的可能性。使幾種表面暴露的和交叉反應(yīng)性表位暴露在乳頭瘤病毒顆粒上(WO 96/33737)，不過它們在有免疫顯性型特異性表位存在的情況下不具有免疫原性(4)。因此，通過修飾L1以便除去免疫顯性型特異性表位、使用修飾的HPV-L1蛋白作為表面暴露的HPV衍生的抗體表位的載體應(yīng)能夠產(chǎn)生交叉反應(yīng)性乳頭瘤病毒疫苗。
此外，盡管使用外源性蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫接種(5)，但是VLPs非常有效地引起細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)，且已經(jīng)報(bào)導(dǎo)VLP疫苗在預(yù)防和治療幾種小鼠模型中的可移植性癌方面非常有效(通過CD8+細(xì)胞依賴性機(jī)制)。這種高免疫原性看起來部分是由于導(dǎo)致在MHC I型呈遞途徑中加工并呈遞的衣殼蛋白的細(xì)胞感染(在不導(dǎo)入病毒基因組時(shí)設(shè)計(jì)的假擬感染)的活性機(jī)制的保護(hù)所造成的(6)。因此，從疫苗生物技術(shù)的觀點(diǎn)來看，一般關(guān)注的是VLPs，這是因?yàn)閷⑺鼈冇米鲗θ我饪乖M(jìn)行有效免疫原性轉(zhuǎn)運(yùn)的載體(7)。
已經(jīng)在例如MAGE黑素瘤抗原和人免疫缺陷病毒抗原這樣的幾種系統(tǒng)中證實(shí)了使用攜帶外源性抗原的野生型HPV VLPs的有效免疫接種。
使用VPLs作為免疫原性轉(zhuǎn)運(yùn)的載體的潛在問題由型特異性中和抗體所阻止。在瑞典，16％的成年人群屬于HPV-16血清陽性，這反映出該問題的重要性。此外，期望治療性疫苗接種需要循環(huán)治療，可能會(huì)誘發(fā)針對野生型VLP載體的型特異性抗體反應(yīng)。
因此，正如已經(jīng)描述的(8)，通過修飾L1蛋白質(zhì)以便除去導(dǎo)致中和抗體產(chǎn)生的型特異性表位，并將抗體或T-細(xì)胞表位導(dǎo)入這種載體應(yīng)能夠產(chǎn)生針對所導(dǎo)入肽的免疫反應(yīng)而沒有來自針對載體自身的型特異性中和抗體的阻礙。
發(fā)明概括本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于預(yù)防和治療病毒性、細(xì)菌性或寄生蟲感染、特別是人乳頭瘤病毒感染和這類感染的良性或惡性結(jié)果發(fā)展的方法以及用于治療和預(yù)防癌癥的方法。
本發(fā)明提供了不含導(dǎo)致中和抗體產(chǎn)生的型特異性表位的修飾的HPV-L1蛋白作為導(dǎo)入細(xì)胞的物質(zhì)的載體的用途。作為修飾的結(jié)果，這種HPV-L1蛋白載體不會(huì)誘發(fā)針對載體自身的明顯的中和抗體產(chǎn)生。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以從所述蛋白質(zhì)中缺失一種或多種氨基酸。
本發(fā)明特別提供了與一種肽融合的這樣一種HPV-L1蛋白。
本發(fā)明還提供了能夠產(chǎn)生保護(hù)性抗體反應(yīng)的這樣一種載體，所述抗體反應(yīng)可以是針對一種或多種血清學(xué)定義的人乳頭瘤病毒亞型的交叉反應(yīng)。
必須以物理方式使所融合的載體與起載體作用的肽連接，由此生成一種融合蛋白。
來源于HPV蛋白和確定線性抗體表位和T-細(xì)胞表位的肽類是特別關(guān)注的。
還關(guān)注所述載體與天然或修飾的人乳頭瘤病毒小外被蛋白(HPV-L2蛋白)的結(jié)合。此外，這種HPV-L2蛋白自身可以與一種或多種其它肽類融合。
本發(fā)明還提供了編碼所述載體的寡核苷酸或多核苷酸。本發(fā)明使得產(chǎn)生一種較好的基礎(chǔ)成為可能，這種基礎(chǔ)用于引起MHC I型介導(dǎo)的反應(yīng)，即產(chǎn)生細(xì)胞毒性T-細(xì)胞而不會(huì)產(chǎn)生針對所述載體的型特異性中和抗體或不會(huì)在開始時(shí)存在型特異性中和抗體。
還能夠使用如上所述修飾的HPV-L1蛋白作為導(dǎo)入細(xì)胞的寡核苷酸或多核苷酸的載體。
發(fā)明詳述在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種用于將物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的載體，它包括人乳頭瘤病毒的主要衣殼蛋白L1(HPV-L1蛋白)，已經(jīng)將該蛋白進(jìn)行了有意修飾以便除去導(dǎo)致中和抗體產(chǎn)生的型特異性的表位。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HPV-L1蛋白與一種肽融合。
優(yōu)選所述肽包括一種或多種T-細(xì)胞表位，尤其是來源于腫瘤、細(xì)菌、寄生蟲、病毒或自身抗原這樣的表位。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽包括一種或多種抗體表位，諸如腫瘤、細(xì)菌、寄生蟲、病毒或自身抗原，尤其是人乳頭瘤病毒抗原。
還可以使所述載體與人乳頭瘤病毒的小衣殼蛋白L2(HPV-L2蛋白)結(jié)合，然后可以依次使其與一種或多種其它肽類融合。這些其它肽類例如是T-細(xì)胞或抗體表位，它們可來源于腫瘤、細(xì)菌、寄生蟲、病毒或自身抗原。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述融合蛋白用作寡核苷酸或多核苷酸、例如編碼抗原或免疫刺激性(多)肽的寡核苷酸或多核苷酸的載體。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種編碼如上所定義的載體的寡核苷酸或多核苷酸。
在其它方面中，本發(fā)明提供了包括如上所述載體或寡核苷酸或多核苷酸作為活性組分的疫苗。
在本發(fā)明的其它方面中，提供了預(yù)防或治療病毒性、細(xì)菌性或寄生蟲感染的方法，該方法通過接種如上所定義載體或寡核苷酸或多核苷酸來進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述感染由人乳頭瘤病毒所引起。
還提供了預(yù)防或治療人乳頭瘤病毒感染的良性或惡性結(jié)果發(fā)展的方法，該方法通過接種如上所定義一種融合蛋白或寡核苷酸或多核苷酸來進(jìn)行。
在所述方法的實(shí)施方案中，所述人乳頭瘤病毒感染是疣或喉乳頭瘤病。
本發(fā)明的其它方面包括預(yù)防或治療癌癥的方法，該方法通過接種如上所定義一種融合蛋白或寡核苷酸或多核苷酸來進(jìn)行，所述癌癥包括宮頸癌、陰莖癌、外陰癌、陰道癌、肛門癌和口咽(orofarynx)癌。
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權(quán)利要求
1.用于將一種物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的載體，它包括人乳頭瘤病毒的主要衣殼蛋白L1(HPV-L1蛋白)，已經(jīng)將該蛋白進(jìn)行了有意修飾以便除去導(dǎo)致中和抗體產(chǎn)生的型特異性的表位。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的載體，其中已經(jīng)缺失了一種或多種氨基酸。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1的載體，其中所述HPV-L1蛋白與一種肽融合。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求3的載體，其中所述肽包括一種或多種T-細(xì)胞表位。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求4的載體，其中所述一種或多種T-細(xì)胞表位來源于包括腫瘤、細(xì)菌、寄生蟲、病毒或自身抗原在內(nèi)的一組抗原。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求3的載體，其中所述肽包括一種或多種抗體表位。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求6的載體，其中所述一種或多種抗體表位來源于包括腫瘤、細(xì)菌、寄生蟲、病毒或自身抗原在內(nèi)的一組抗原。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求7的載體，其中所述一種或多種抗體表位來源于人乳頭瘤病毒抗原。
9.一種權(quán)利要求6-8中任意一項(xiàng)的載體，它能夠產(chǎn)生保護(hù)性抗體反應(yīng)。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求9的載體，其中所述保護(hù)性抗體反應(yīng)是針對兩種或多種血清學(xué)上定義的人乳頭瘤病毒亞型的交叉反應(yīng)。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求10的載體，其中對包括來源于腫瘤誘導(dǎo)中所涉及的人乳頭瘤病毒的HPV-L1蛋白在內(nèi)的組中的兩種或多種的所述保護(hù)性反應(yīng)增加。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求11的載體，其中所述保護(hù)性抗體反應(yīng)是針對包括HPV-16、HPV-18、HPV-31和HPV-45的L1蛋白在內(nèi)的HPV-L1蛋白的組中兩種或多種的交叉反應(yīng)。
13.一種權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)的載體，它與人乳頭瘤病毒的小衣殼蛋白L2(HPV-L2蛋白)結(jié)合。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求13的載體，其中所述HPV-L2蛋白與一種或多種其它肽類融合。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求14的載體，其中所述一種或多種其它肽類選自包括腫瘤、細(xì)菌、寄生蟲、病毒或自身抗原在內(nèi)的一組抗原。
16.一種權(quán)利要求1-15中任意一項(xiàng)的載體，其中所述物質(zhì)是寡核苷酸或多核苷酸。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求16的載體，其中所述寡核苷酸或多核苷酸編碼一種或多種抗原或免疫刺激性(多)肽類。
18.一種疫苗，它包括如權(quán)利要求1-17中任意一項(xiàng)所定義的載體作為活性組分。
19.一種編碼如權(quán)利要求1-17中任意一項(xiàng)所定義的載體的多核苷酸。
20.一種疫苗，它包括如權(quán)利要求19中所定義的多核苷酸作為活性組分。
21.一種預(yù)防或治療病毒性、細(xì)菌性或寄生蟲感染的方法，該方法通過接種如權(quán)利要求1-17中任意一項(xiàng)所定義的載體來進(jìn)行。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求21的預(yù)防或治療人乳頭瘤病毒感染的方法。
23.一種預(yù)防或治療人乳頭瘤病毒感染的良性或惡性結(jié)果發(fā)展的方法，該方法通過接種如權(quán)利要求1-17中任意一項(xiàng)所定義的載體來進(jìn)行。
24.一種根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述人乳頭瘤病毒感染選自包括疣和喉乳頭瘤病在內(nèi)的組。
25.一種預(yù)防或治療癌癥的方法，該方法通過接種如權(quán)利要求1-17中任意一項(xiàng)所定義的載體來進(jìn)行。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述癌癥選自包括宮頸癌、陰莖癌、外陰癌、陰道癌、肛門癌和口咽(orofarynx)癌在內(nèi)的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的載體,它包括人乳頭瘤病毒的主要衣殼蛋白L1(HPV－L1蛋白),已經(jīng)將該蛋白進(jìn)行了有意修飾以便除去導(dǎo)致中和抗體產(chǎn)生的型特異性的表位。本發(fā)明還包括編碼所述載體的寡核苷酸或多核苷酸、包括所述載體或所述寡核苷酸或多核苷酸的疫苗以及使用所述載體或所述寡核苷酸或多核苷酸在抵抗人乳頭瘤病毒感染,或抵抗這類感染結(jié)果的發(fā)展或抵抗某些癌癥的發(fā)展的疫苗接種中的方法。
文檔編號(hào)A61P11/04GK1373771SQ00812618
公開日2002年10月9日 申請日期2000年9月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月30日
發(fā)明者P·安東森, K·克里斯藤森, M·沃倫－歐曼, J·迪爾納, P·蘭多 申請人:活躍生物技術(shù)股份公司