專利名稱：編碼11-順式視黃醇脫氫酶的核酸分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有11-順式視黃醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與表達(dá)于例如視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)中的細(xì)胞質(zhì)視黃醇-結(jié)合蛋白(RBP)的膜受體的特異性部分形成復(fù)合物，本發(fā)明更具體地涉及32KDa的具有11-順式視黃醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與63KDa的結(jié)合RBP的膜蛋白形成復(fù)合物。本發(fā)明還涉及32KDa蛋白質(zhì)(p32)的分離，以及編碼p32的核酸分子或與該編碼序列互補(bǔ)的核酸分子，和這些物質(zhì)的多種應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Retinoid(維生素A-衍生物)在多種生物學(xué)過程中具有重要的生理學(xué)功能。在胚胎生長(zhǎng)和發(fā)育過程中，以及在成年生物體的生長(zhǎng)和分化過程中，retinoid行使激素的功能并參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞類型的基因表達(dá)，見Lied等人，Trends Genet.,17:427-433(1992)。據(jù)信這些作用是通過兩類受核配體控制的轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的，它們是視黃酸受體(RAR)和retinoid X受體(RXR),Benbrook等人，自然，333:669-672(1988)；Brand等人，自然，332:850-853(1988)；Giguere等人，自然，330:624-629(1987)；Mangelsdorf等人，自然，345:224-229(1990)；Mangelsdorf等人，Genes Dev.6:329-344(1992)；Petkovich等人，自然，330:440-450(1987)；和Zelent等人，自然，339:714-717(1989)。
除了在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中作為激素起作用以外，retinoid也參與視覺過程，這是因?yàn)橐朁S醛的立體異構(gòu)體11-順式視黃醛是視色素的生色團(tuán)，例見Bridges,The Retinoids,vol.2,pp125-176,Academic Press,Orlando,Florida,(1984)。
在正常的生理狀態(tài)下，大多數(shù)細(xì)胞(眼和非眼細(xì)胞)得到全反式視黃醇作為它們r(jià)etinoid的主要來源。盡管不同的組織中發(fā)生著許多不同的代謝事件，但已知已逐漸形成了共用的視黃醇胞外轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)。具體地說，在細(xì)胞質(zhì)中視黃醇由細(xì)胞質(zhì)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)轉(zhuǎn)運(yùn)，見Goodman等人，The Retinoids,Academic Press,Orlando,Florida,vol.2,pp41-88(1984)，然后，通過使用特殊機(jī)制的細(xì)胞轉(zhuǎn)變產(chǎn)生視黃醇的活性衍生物，即非眼組織中的視黃酸和對(duì)于眼組織而言，大多為11-順式視黃醛。迄今為止，在分子水平上仍未完全確定任何一個(gè)這種機(jī)制，所涉及的幾種酶也只是通過酶解活性得以鑒定，見Lion等人，Biochem.Biophys.Acta.384:283-292(1975)；Zimmermann等人，Exp.Eye Res.21:325-332(1975)；Zimmermann等人，Exp.Eye Res.23:159-164(1976)和Posch等人，生物化學(xué)，30:6224-6230(1991)。
關(guān)于retinoid的攝取，極化的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)是獨(dú)一無二的，因?yàn)槿词揭朁S醇通過兩種不同的機(jī)制進(jìn)入這些細(xì)胞。由RBP積累的視黃醇可通過堿性側(cè)的質(zhì)膜攝入，而可能由間質(zhì)中的視黃醇結(jié)合蛋白(IRBP)在漂白視色素之后攝入的全反式視黃醇可通過頂端的質(zhì)膜進(jìn)入，見Bok等人，Exp.Eye Res.22:395-402(1976)；Alder等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.108:1601-1608(1982)；Lai等人，自然，298:848-849(1982)；和Inu等人，Vision Res.22:1457-1468(1982)。
視黃醇由RBP轉(zhuǎn)移至細(xì)胞不能完全被理解，在包括RPE的大量細(xì)胞類型中，已鑒定出RBP的特異性膜受體，這與視黃醇的受體-介導(dǎo)的攝入機(jī)制是一致的。例如，在與兩種機(jī)制中的第一種相關(guān)的參考文獻(xiàn)中教導(dǎo)了分離的視黃醇結(jié)合蛋白受體，編碼這些受體的核酸分子和與這些受體結(jié)合的抗體，見Bavik等人，生物化學(xué)雜志，266:14978-14985(1991)；Bavik等人，生物化學(xué)雜志，267:23035-23042(1992)；Bavik等人，生物化學(xué)雜志，267:20540-20546(1993)；和共同待審的美國(guó)申請(qǐng)流水號(hào)083,539以及國(guó)際公開WO93/23538，上述文獻(xiàn)都列入本文的參考文獻(xiàn)中，也見Heller，生物化學(xué)雜志，250:3613-3619(1975)；和Bok等人，Exp.Eye Res.22:395-402(1976)。
在RPE的頂部攝取視黃醇以再生11-順式視黃醛的特征未能被較完善地鑒定。然而，不論全反式視黃醇的來源如何，11-順式視黃醛的合成和頂部分泌似乎是RPE中積累的視黃醇的主要途徑。目前，關(guān)于細(xì)胞通過堿性側(cè)和頂部質(zhì)膜攝取視黃醇是否使用相似的機(jī)制仍是未知的?？衫玫馁Y料只顯示出RBP的功能性受體全部表達(dá)于RPE-細(xì)胞的堿性側(cè)質(zhì)膜上，Bok等人，Exp.Eye Res.22:395-402(1976)。
還已知色素RPE表達(dá)63KDa的蛋白質(zhì)(p63)，除非另有說明，此分子量和所有其它的分子量是參照SDS-PAGE測(cè)出的。通過化學(xué)交聯(lián)還顯示出此蛋白質(zhì)可能是寡聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物的一部分，所述復(fù)合物作為RPE中細(xì)胞質(zhì)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)之膜受體行使功能，或者是RPE細(xì)胞中retinoid攝取機(jī)的組分。見Bavik等人，生物化學(xué)雜志，266:14978-14985(1991)；Bavik等人，生物化學(xué)雜志，267:23035-23042(1992)；和美國(guó)申請(qǐng)流水號(hào)083,539以及PCT申請(qǐng)WO93/23538。已分離出p63蛋白，并已克隆出相應(yīng)的cDNA，見Bavik等人，生物化學(xué)雜志，267:20540-20546(1993)。然而，這些參考文獻(xiàn)中都沒有暗示具有本發(fā)明特征的蛋白質(zhì)的存在。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)RPE膜相關(guān)蛋白，通過SDS-PAGE測(cè)定，其分子量約為32KDa。被稱為“p32”的這些蛋白質(zhì)與以前鑒定的p63蛋白形成寡聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物，所述p63蛋白是RBP膜受體的成分。本發(fā)明還公開了編碼p32蛋白的核酸分子，序列分析表明p32蛋白屬于短鏈醇脫氫酶家族，并表現(xiàn)出11-順式視黃醇脫氫酶的活性，該酶在輔因子NAD+的存在下可催化11-順式視黃醇立體特異性地轉(zhuǎn)變成11-順式視黃醛。
p32還將顯示出許多重要的用途，例如，由于其與膜結(jié)合的11-順式視黃醇脫氫酶活性，它可催化11-順式視黃醇轉(zhuǎn)變成11-順式視黃醛，這種轉(zhuǎn)變是RPE-細(xì)胞中retinoid代謝的主要代謝步驟，可導(dǎo)致色素性視網(wǎng)膜炎的retinoid的積累和代謝可能直接或間接地依賴于p32的存在，和/或p32的激活或抑制。由于還發(fā)現(xiàn)p32是短鏈醇脫氫酶特大家族的成員，很多已知的醇脫氫酶抑制劑(和激活劑)可以用于開展活性測(cè)定，從而開發(fā)針對(duì)視黃醇攝取和眼retinoid代謝的診斷材料。
本發(fā)明的另一部分是編碼如人，牛和鼠形式的哺乳動(dòng)物形式蛋白質(zhì)的核酸分子。本發(fā)明的另一部分是根據(jù)本文所述核苷酸序列的探針。
在以下具有附圖的詳細(xì)討論中將更完整地討論本發(fā)明的這些和其它方面。
附圖的簡(jiǎn)述

圖1A表示得自RPE膜并用抗p63的mAb A52免疫沉淀的經(jīng)放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析。
圖1B表示與mAb A52免疫親和柱結(jié)合和穿過柱洗脫下來的RPE膜蛋白的SDS-PAGE分析，在從免疫親和柱洗脫下來的級(jí)分中存在p32。
圖2A表示使用寡核苷酸混合物OM1和OM3得到的61 bp PCR-擴(kuò)增片段在瓊脂糖凝膠電泳中的顯示，所述兩種寡核苷酸都衍生自肽321，肽321是從經(jīng)胰蛋白酶消化的p32的部分氨基酸序列測(cè)定中推導(dǎo)的。
圖2B表示使用寡核苷酸混合物OM2和OM3得到的330 bp PCR-擴(kuò)增片段在瓊脂糖凝膠電泳中的顯示，所述兩種寡核苷酸分別衍生自肽p323和p321，所述肽是從經(jīng)胰蛋白酶消化的p32的部分氨基酸序列測(cè)定中推導(dǎo)的。
圖3闡明了pλ321的核苷酸序列和p32推導(dǎo)的氨基酸序列，部分氨基酸序列測(cè)定自分離自經(jīng)胰蛋白酶消化的p32的肽。
圖4闡明了p32和一些屬于短鏈醇脫氫酶家族的相關(guān)蛋白質(zhì)的氨基酸序列的排列。
圖5闡明了p32氨基酸序列的分析。
圖6闡明了體外合成的p32的膜相互作用。
圖7闡明了對(duì)應(yīng)于p32的轉(zhuǎn)錄本的受限制的表達(dá)。
圖8A闡明了為了11-順式視黃醇脫氫酶活性的進(jìn)一步的酶解活性分析，在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)p32。
圖8B闡明了在NAD+的存在下，11-順式視黃醇脫氫酶活性的表達(dá)，這種表達(dá)可由11-順式視黃醛的形成來表示。
圖8C闡明了在輔因子NADP的存在下11-順式視黃醇脫氫酶活性的缺乏。
圖8D闡明了不能表達(dá)p32的對(duì)照細(xì)胞，該細(xì)胞不具備將11-順式視黃醇氧化成11-順式視黃醛的能力。
圖9表示人11-順式視黃醇脫氫酶基因的結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)討論已知細(xì)胞質(zhì)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)能與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞膜(RPE)上63 KDa蛋白質(zhì)(p63)受體的高分子量復(fù)合物化學(xué)交聯(lián)，形成RBP-RBP受體復(fù)合物，該復(fù)合物具有表觀分子量約為Mτ150,000-450,000的類似大小的球狀蛋白質(zhì)的洗脫特性，見Bavik等人，生物化學(xué)雜志，266:14978-14985(1991)和Bavik等人，生物化學(xué)雜志，267:23035-23042(1992)。負(fù)責(zé)結(jié)合RBP，其表達(dá)局限于RPE的蛋白質(zhì)已被鑒定為63 KDa的蛋白質(zhì)(p63)。通過產(chǎn)生針對(duì)63 KDa蛋白質(zhì)的能與RBP-RBP受體復(fù)合物和p63結(jié)合的單克隆抗體A52(mAb52)，并進(jìn)行免疫親和層析分析，大部分p63被洗脫成單體，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的重要部分位于對(duì)應(yīng)于較高分子量類型的位置。這表明p63以具有其它蛋白質(zhì)成分的寡聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式存在。Bavik等人，生物化學(xué)雜志，266:14978-14985(1991)和Bavik等人，生物化學(xué)雜志，267:23035-23042(1992)。因此，使用下列方法研究這種寡聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物的分子特征，以及p63是否與特異于RPE的其它蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，結(jié)果表明32KDa的膜相關(guān)蛋白(p32)實(shí)際上與p63形成了復(fù)合物。實(shí)施例1按列入本文參考文獻(xiàn)的Bavik等人，生物化學(xué)雜志，266:14978-14985(1991)的描述分離牛RPE細(xì)胞，并制備膜組分。然后用含有1％3-[(3-膽酰胺丙基)-二甲胺]-1-丙磺酸(CHAPS)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(20mM磷酸鈉，pH7.2，含有150mM NaCl)以1mg總膜蛋白/ml緩沖液的濃度溶解RPE-膜蛋白。通過以100,000×g的轉(zhuǎn)速超速離心1小時(shí)除去殘留的物質(zhì)，接著，在用含有1％CHAPS的PBS平衡過的Sepharose6柱上凝膠過濾500μl溶解膜的等分試樣。以0.2ml/min的流速操作柱，收集500μl級(jí)分。然后，使用眾所周知的氯胺T方法，用Na125Ⅰ放射性標(biāo)記洗脫到對(duì)應(yīng)于Mτ150,000-400,000的球狀蛋白質(zhì)級(jí)分中的蛋白質(zhì)。通過在填充于巴氏吸管中的Sepahadex G-25上凝膠過濾除去未摻入的125Ⅰ。
然后用含有1％CHAPS和1％牛血清白蛋白的PBS稀釋經(jīng)放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)的等分試樣，隨后使用針對(duì)p63的mAb A52(每次保溫5μg)或使用兩種針對(duì)p63的多克隆兔抗血清(每次保溫3μl血清)對(duì)上述蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫沉淀，見Bavik等人，生物化學(xué)雜志，267:23035-23042(1992)。使用不相關(guān)的mAb和預(yù)免疫的兔血清在平行的保溫中監(jiān)測(cè)非特異性的免疫沉淀。在保溫中進(jìn)入50μl 50％的A蛋白-Sepharose懸浮液達(dá)30分鐘，隨后用含有1％CHAPS的PBS小心洗滌珠，制備經(jīng)洗脫的物質(zhì)以供SDS-PAGE分析，制備過程按照Blobel等人，細(xì)胞生物學(xué)雜志，67:835-851(1975)的描述進(jìn)行。
參照?qǐng)D1A，SDS-PAGE凝膠的放射性自顯影表明兩種類型的試劑都能與p63反應(yīng)，而不相關(guān)的mAb或預(yù)免疫的兔血清不能沉淀p63。在含有經(jīng)免疫沉淀的p63的所有泳道中，富集了Mτ32,000蛋白質(zhì)。由于針對(duì)p63的mAb A52和兔抗血清對(duì)于p63具有高度的特異性(例見Bavik等人，生物化學(xué)雜志，267:23035-23042(1992))，因此可得出結(jié)論在前述的分析中Mτ32,000蛋白質(zhì)(p32)通過與p63結(jié)合得以共沉淀。分析也鑒定出與p32和p63一起沉淀的M,50,000-52,000的雙帶(圖1d,e)。實(shí)施例2然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以鑒定p32，可利用的事實(shí)是如上文所述p32能與p63特異性地相互作用，因此，使去污劑溶解的RPE-膜蛋白穿過含有mAb A52的免疫親和柱。參照?qǐng)D1B，泳道b，洗滌步驟之后，用含有CHAPS的緩沖液在高pH下洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，經(jīng)洗脫的級(jí)分的SDS-PAGE分析和考馬斯染色揭示了p63被特異性地保留并從免疫親和柱上被洗脫下來。另外，在得自A52柱的洗脫液中顯示出對(duì)應(yīng)于p32的弱染色的帶。如圖1B所示，溶解的RPE膜和A52柱經(jīng)洗脫級(jí)分的總蛋白質(zhì)分布圖的比較表明p32蛋白不能在其中有效地被保留。然而，p32在A52柱的經(jīng)洗脫級(jí)分中出現(xiàn)，但不在含有不相關(guān)Ig的柱的經(jīng)洗脫級(jí)分中出現(xiàn)，這表明p32與p63的特異性的相互作用。此結(jié)果與以前的免疫沉淀資料是一致的，并顯示出p32與p63復(fù)合，由于此復(fù)合物的形成使p32被保留于免疫親和柱上。
將p32鑒定為RPE膜中與p63的復(fù)合物中的成分之后，如下文實(shí)施例3中所述，通過得自A52免疫親和柱的溶解的RPE膜的經(jīng)洗脫級(jí)分的SDS-PAGE來分離p32蛋白自身。實(shí)施例3如上文所述，用含有1％CHAPS的PBS溶解RPE膜，通過在+4℃下末端-對(duì)著-末端旋轉(zhuǎn)使之與偶聯(lián)于Bio-Rad poly prep柱(Bio-Rad)中的被CNBr-激活的Sepharose 4B珠(Pharmacia)上的mAbA52 Ig一起保溫。保溫2小時(shí)之后，使珠穩(wěn)定下來，用5倍柱體積的含有1％CHAPS的PBS快速洗滌柱。然后用含有1％CHAPS的50mM的三乙醇胺緩沖液(pH11.2)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過加入含有1％CHAPS的1M Tris-HCl緩沖液將洗脫液的pH快速地調(diào)節(jié)至8.0。使經(jīng)洗脫的級(jí)分經(jīng)受SDS-PAGE，然后通過考馬斯藍(lán)染色可觀察到被分開的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了對(duì)應(yīng)于p32(SDS-PAGE,32KDa)的帶。
為了測(cè)定p32的一級(jí)結(jié)構(gòu)，首先切下對(duì)應(yīng)于大約2-5μg 32 KDa蛋白質(zhì)的前述考馬斯藍(lán)染色帶部分，然后凍干凝膠碎片以干燥，對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行部分氨基酸序列的分析。在含有經(jīng)修飾的胰蛋白酶的緩沖液中使凝膠重新水合并保溫以產(chǎn)生多種肽供提取和分析。優(yōu)選的方法列于下文實(shí)施例4中。實(shí)施例4切下得自實(shí)施例2的含有p32蛋白的經(jīng)考馬斯藍(lán)染色的帶，并根據(jù)稍加改動(dòng)的Rosenfeld等人，Anal.Biochem,15:173-179(1992)的方法處理此帶。在30℃下，用100μl含有50％乙腈的0.2M的碳酸氫銨緩沖液將凝膠碎片洗滌兩次，達(dá)30分鐘，然后在氮?dú)鈿饬飨峦耆稍铩Ｓ?μl含有0.02％吐溫20和0.5μg經(jīng)修飾的胰蛋白酶的0.2M的碳酸氫銨緩沖液使凝膠碎片重新水合。加入的胰蛋白酶得自在1mMHCl中制備的儲(chǔ)存液。每次加入5μl 0.2M的碳酸氫銨緩沖液以繼續(xù)水合直至凝膠碎片水合至它們?cè)瓉淼拇笮?。然后?0℃下將經(jīng)水合的凝膠碎片保溫過夜，通過加入三氟醋酸(TFA)至終濃度為1％來抑制蛋白酶的活性，回收上清液，并與用150μl 0.1％的TFA制備的兩份提取液混合于60％的乙腈中。分解有機(jī)相，使用在SMART系統(tǒng)中操作的反相mRPC C2/C18 SC 2.1/10柱對(duì)消化物進(jìn)行HPLC。用0.065％TFA中的乙腈梯度洗脫樣品，使用自動(dòng)的峰分級(jí)選擇收集含有不連續(xù)肽的級(jí)分。選擇5個(gè)經(jīng)鑒定的肽，使用裝配有120A型PTH分析儀的ABI 470A測(cè)序儀(applied Biosystems Inc.Foster City,CA)對(duì)它們進(jìn)行氨基酸序列分析，結(jié)果列于下表1。表1分離自經(jīng)胰蛋白酶消化的p32的5個(gè)肽的氨基酸序列測(cè)定p321 L-V-E-A-V-L-A-E-V-L-P-K-P-A-Q-T-V-A(SEQ ID NO:1)(D)a (W)(Y)p322 Y-S-P-G-W-D-A-K(SEQ ID NO:2)p323 T-P-V-T-N-L-E-T-L-E-D-T-L-Q-A(SEQ ID NO:3)p324 D-V-A-P-F-G-V(SEQ ID NO:4)p325 L-H-T-T-L-L-D-V-T-D-P-Q-S-I(SEQ ID NO:5)a括號(hào)中給出的氨基酸殘基是由相同位置處的cDNA序列推導(dǎo)出的殘基。
蛋白質(zhì)SEQ ID NO:1-5可以單獨(dú)使用或者通過熟知的方法與半抗原連接。
接著，為了測(cè)定p32完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)，可根據(jù)表1中已測(cè)定序列的p321和p323肽的氨基酸序列合成下表2中列出的四個(gè)簡(jiǎn)并性的寡核苷酸混合物OM1-OM4，方法見實(shí)施例5。實(shí)施例5使用熟知的技術(shù)合成衍生自肽p321和p323的四個(gè)簡(jiǎn)并的寡核苷酸混合物。兩個(gè)有義的混合物(OM1和OM3)衍生自p321的N-末端氨基酸1-5和p323的2-6。反義混合物(OM2和OM4)衍生自p321的氨基酸12-17和p323的10-15。合成出的所有核苷酸混合物都具有4bp的5突出端和一個(gè)EcoRⅠ位點(diǎn)用以隨后克隆PCR產(chǎn)物。寡核苷酸混合物的序列列于下表2，下劃線的是EcoRⅠ位點(diǎn)，含有所有四個(gè)堿基的位置用N表示。表2OM1: ACGTGAATTCTNGTNGA(A,G)GCNGT(SEQIDNO:6)OM2: ACGTGAATTCACNGT(T,C)TGNGCNGG(T,C)TT(SEQIDNO:7)OM3: ACGTGAATTCCCNGTNACNAA(T,C)(C,T)T(SEQIDNO:8)OM4: ACGTGAATTCGC(T,C)TGNA(A,G)NGT(A,G)TC(T,C)TC(SEQIDNO:9)在使用標(biāo)準(zhǔn)方法的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中使用逆轉(zhuǎn)錄自RPEmRNA的單鏈“互補(bǔ)”cDNA和上述簡(jiǎn)并的核苷酸混合物的四種聯(lián)合。擴(kuò)增程序之后，通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應(yīng)產(chǎn)物的等分試樣，所用方法見下文實(shí)施例6。實(shí)施例6為了進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過使用禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的標(biāo)準(zhǔn)方法合成cDNA的第一條鏈，使用20μg得自分離的RPE-細(xì)胞的總RNA，用寡(dT)15引發(fā)反應(yīng)。在隨后的每次PCR反應(yīng)中使用相當(dāng)于2μg總RNA的等分試樣。在100μl反應(yīng)液中使用終濃度為0.5μM的寡核苷酸混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用了Taq聚合酶，30輪循環(huán)(95℃2分鐘，55℃1分鐘和72℃2分鐘)之后，在含有5μg/ml溴化乙錠的4％GTG瓊脂糖凝膠電泳上分析反應(yīng)液的等分試樣。
如圖2A所示，使用都衍生自肽p321的寡核苷酸混合物OM1和OM2的擴(kuò)增導(dǎo)致經(jīng)擴(kuò)增的61bp片段。使用混合物OM3-OM4和OM1-OM4的擴(kuò)增不能產(chǎn)生任何產(chǎn)物。最終如圖2B所示，使用OM3-OM2的擴(kuò)增導(dǎo)致了經(jīng)擴(kuò)增的330bp片段。
隨后對(duì)61bp和330bp片段進(jìn)行的序列分析進(jìn)一步證實(shí)了已被擴(kuò)增的cDNA序列與以前氨基酸序列分析中產(chǎn)生的肽序列是相對(duì)應(yīng)的。從經(jīng)擴(kuò)增的PCR片段推導(dǎo)出的氨基酸序列與肽p321產(chǎn)生的氨基酸序列之間的差異顯示出適于分離編碼p32的全長(zhǎng)cDNA克隆的特異性探針的產(chǎn)生。
為了分離全長(zhǎng)的cDNA克隆，用330bp片段作為探針篩選RPE-特異性的λZAP-Ⅱ cDNA文庫(kù)。從大約200,000個(gè)克隆中分離出5個(gè)獨(dú)立的λ克隆，并通過體內(nèi)切割亞克隆之。cDNA克隆pλ321含有最長(zhǎng)的插入片段(大約1.1kb)，被選擇用于進(jìn)一步的研究。
完整地測(cè)定pλ321兩條鏈的序列，使用排除接頭在外長(zhǎng)度為1104bp的插入物制備cDNA文庫(kù)，所用方法列于下文實(shí)施例7中。實(shí)施例7用EcoRⅠ消化使用OM1-OM2(61bp)和OM3-OM2(330bp)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠純化并克隆到經(jīng)EcoRⅠ切割的載體pBS中，按列入本文參考文獻(xiàn)的Bavik等人，生物化學(xué)雜志，267:20540-20546(1993)先前的描述，使用32p-標(biāo)記的330bp片段篩選RPE-特異性的λZAP Ⅱ cDNA文庫(kù)。分離出5個(gè)陽(yáng)性的λ克隆，通過遵照廠商的說明進(jìn)行體內(nèi)切割將插入物亞克隆至pBluescript中。克隆pλ321含有1.1kb的插入物，使用T3,T7或M13通用引物或內(nèi)部引物，用Sequenase完整地測(cè)定兩條鏈的序列。
pλ321的核苷酸序列和推測(cè)的p32氨基酸序列示于圖3(SEQ IDNO:10)。核苷酸數(shù)碼在左邊，氨基酸殘基的數(shù)碼在右邊，氨基酸1是起始的甲硫氨酸(“Met”)。
如圖3所示，1.1kbp的插入物含有一個(gè)編碼318個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)的開放閱讀框，所述氨基酸殘基經(jīng)計(jì)算的質(zhì)量是35,041D。根據(jù)轉(zhuǎn)錄起始的Kozak規(guī)則來看，第一個(gè)甲硫氨酸殘基位于良好的前后序列中，它可能是起始密碼子，見Kozak，細(xì)胞，44:283-292(1986)。此推論得到下列事實(shí)的支持，即如下文所述，轉(zhuǎn)錄自pλ321的合成的mRNA的體外翻譯產(chǎn)生了Mτ32,000蛋白質(zhì)(SDS-PAGE分析)，但在cDNA 5′非翻譯區(qū)上游35bp的讀框中不存在終止密碼子。圖3還顯示出100bp的3′非翻譯區(qū)以推斷的polyA-段終止，在上游序列中鑒定出polyA-信號(hào)(bp1104-1110)。
在可用于比較的62個(gè)殘基中，推斷出的pλ321氨基酸和5個(gè)經(jīng)胰蛋白酶處理產(chǎn)生的肽的氨基酸序列(表1)只有3個(gè)位置有所不同，所有這3個(gè)不同之處都發(fā)現(xiàn)于肽p321中，但第二個(gè)cDNA克隆(pλ324)的此區(qū)域中的核苷酸序列與pλ321的相同。這表示盡管不能排除差異是由p32不同的等位基因的存在引起的，但肽p321氨基酸序列的測(cè)定可能不正確。這些資料闡明了pλ321含有p32完整的編碼區(qū)。
再參照?qǐng)D3，在推導(dǎo)出的氨基酸序列的第160-162位可發(fā)現(xiàn)N-聯(lián)糖基化的共有位點(diǎn)(氨基酸殘基N-I-T)。
另外，已發(fā)現(xiàn)p32顯示出與短鏈醇脫氫酶的序列相似性，參照?qǐng)D4，遍及Swissprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的研究揭示出p32與幾種以前已測(cè)序的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)，與之最密切相關(guān)的是線粒體基質(zhì)脫氫酶，D-β-羥基丁酸脫氫酶(BDH)，Churchill等人，生物化學(xué)，31:3793-3799(1992)，p32與其它兩種蛋白質(zhì)顯示出較少但重要的相似性，所述蛋白質(zhì)是得自大腸桿菌的3-oxoacy[?；d體蛋白]還原酶(Rawlings等人，生物化學(xué)雜志，267-5751-5754(1992))和人雌二醇17β-脫氫酶(Peltoketo等人，F(xiàn)EBS Lett,239:73-77(1988)和Leu等人，Mol.Endocrinol,3:1301-1309(1989))。所有的相關(guān)蛋白質(zhì)都屬于短鏈醇脫氫酶蛋白質(zhì)特大家族中的成員。此蛋白質(zhì)特大家族包括大約50個(gè)不同的蛋白質(zhì)(Persson等人，歐洲生物化學(xué)雜志，200:537-593(1991))。p32和BDH之間的整個(gè)序列同源性大約是39％，對(duì)大腸桿菌還原酶和雌二醇17β-脫氫酶的同源性水平較低(分別為31％和33％)。
最適的重復(fù)多次的序列排列鑒定出由p32和最密切相關(guān)的蛋白質(zhì)共享的幾個(gè)保守區(qū)域(圖4中被圈的區(qū)域)。據(jù)信包括殘基63-69(使用圖4中的計(jì)數(shù)方式)，并顯示出保守的基元G-X-X-X-G-X-G的第一個(gè)區(qū)域是輔因子NAD,NADP或其還原形式的結(jié)合位點(diǎn)。在殘基148-153之間發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)保守的區(qū)域(共有序列L-V-N-N-A-G)，但仍未發(fā)現(xiàn)此序列基元具有任何功能性特征。在短鏈醇脫氫酶中，被認(rèn)為是活性位點(diǎn)的序列基元Y-X-X-X-K是最高度保守的基元，并存在于p32殘基175-179中，見Persson等人，歐洲生物化學(xué)雜志，200:537-593(1991)。這些類似性闡明p32顯示出短鏈醇脫氫酶的幾個(gè)功能性特征。
如圖5所示，對(duì)p32氨基酸序列的親水性分析顯示出幾段疏水性的序列，這表明p32是膜相關(guān)蛋白。開始的18個(gè)氨基酸是疏水性的，此區(qū)域具有典型的信號(hào)序列的特征，然而，不能鑒定出信號(hào)肽酶裂解的共有位點(diǎn)，見Von Heijne，核酸研究，14:4683-4690(1986)。殘基130-150之間的氨基酸是疏水性的，在蛋白質(zhì)的C-末端附近存在相對(duì)長(zhǎng)的疏水性序列，因此，p32顯示出幾個(gè)疏水性區(qū)域，該區(qū)域是潛在的膜跨越區(qū)段。根據(jù)上文所述的與短鏈醇脫氫酶家族成員的同源性，p32中央的疏水區(qū)(殘基130-150)可能不被用作膜錨。實(shí)際上N-末端和C-末端區(qū)域都是潛在的膜錨著域。
為了測(cè)定p32與膜相互作用的模式，通過體外翻譯以合成p32，所述翻譯使用具有由線性化的pλ321轉(zhuǎn)錄的mRNA的網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)進(jìn)行，所用方法見下文實(shí)施例8實(shí)施例8通過體外翻譯表達(dá)p32使用T7 RNA聚合酶由線性化的pλ321合成編碼p32的體外轉(zhuǎn)錄的mRNA，遵照廠商的說明使用經(jīng)核酶處理的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物進(jìn)行體外翻譯反應(yīng)，每次反應(yīng)中包括加或不加狗胰微粒體的50ng的mRNA。為了分離插入膜中的p32，在4℃下，以12,000×g的轉(zhuǎn)速離心10分鐘以收集微粒體。將微粒體小心地重懸浮于PBS中，并再次離心。
如圖6所示，在狗胰微粒體存在下進(jìn)行的翻譯表明p32幾乎定量地成為膜相關(guān)的蛋白質(zhì)，并在SDS-PAGE中作為Mτ為32,000的蛋白質(zhì)類遷移。類似地，缺乏受體膜時(shí)進(jìn)行的翻譯產(chǎn)生了Mτ32,000蛋白質(zhì)。這些資料表明N-末端疏水性序列作為信號(hào)序列起作用，但信號(hào)肽酶不能將之除去，此現(xiàn)象支持以前的觀察結(jié)果，即在推導(dǎo)的一級(jí)序列中無法鑒定出信號(hào)肽酶裂解的共有位點(diǎn)。
通過Northern印跡分析p32的組織表達(dá)，所述Northern印跡分析使用了分離自牛RPE，肝臟，腎臟，腎上腺，肺，睪丸，腦和肌肉的總RNA，所用方法見下文實(shí)施例9。實(shí)施例9Northern印跡分析在處于變性條件下的1％瓊脂糖中電泳分離自多種組織的20μg總RNA，并轉(zhuǎn)移到Hybond-N尼龍濾膜上，在嚴(yán)格條件下使濾膜與經(jīng)32P-標(biāo)記的編碼p32的全長(zhǎng)cDNA雜交?？俁NA的分離，雜交條件和洗滌方法的細(xì)節(jié)見于Bavik等人，生物化學(xué)雜志，267:20540-20546(1993)先前的描述。
在高嚴(yán)格度下，用pλ321的1.1kb插入物作為探針進(jìn)行的雜交揭示出對(duì)應(yīng)于p32的轉(zhuǎn)錄本僅在RPE中有充足的表達(dá)，而在幾種其它的組織中卻達(dá)不到可檢測(cè)的水平。主要的轉(zhuǎn)錄本的大小為1.4kb，但在RPE以及其它組織中，延長(zhǎng)濾膜的暴露時(shí)間之后可以觀察到其它較不豐富的轉(zhuǎn)錄本。實(shí)施例10p32在COS-細(xì)胞中的表達(dá)和重組p32特性的酶解分析按下述，使用真核表達(dá)載體首先在COS-細(xì)胞中表達(dá)p32，然后對(duì)得自經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的微粒體組分和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡分析以進(jìn)一步地證實(shí)p32在所需水平上的表達(dá)具體地說，將pλ321的EcoRⅠ-插入物克隆進(jìn)經(jīng)EcoRⅠ消化的真核表達(dá)載體pSG5中，見Green等人，核酸研究，16:39(1988)。在添加有10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺和抗生素的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基中培養(yǎng)COS-細(xì)胞。將細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿(4×105個(gè)細(xì)胞/皿)中，使用DEAE葡聚糖每皿用5μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，僅用等量親代載體轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞，用10％DMSO處理2分鐘后，將細(xì)胞溫育72-96小時(shí)，通過用橡皮淀帚刮擦平皿收獲細(xì)胞，然后通過低速離心收集細(xì)胞，將收集到的細(xì)胞沉淀物重新懸浮于低滲緩沖液(含有1mM苯甲基磺酰氟的10mM Tris-HCl,pH7.5)中，在冰上放置20分鐘，然后使用Dounce勻漿器勻漿細(xì)胞。離心(3000×g)15分鐘以除去未破碎的細(xì)胞和碎片，隨后通過在100,000×g下超速離心1小時(shí)以收集微粒體；將膜沉淀物儲(chǔ)存于-80℃中直至進(jìn)一步地分析。
通過給兔注射表達(dá)成與GST的融合蛋白形式的p32(氨基酸殘基19-318)以產(chǎn)生針對(duì)p32的抗血清。按廠商(Pharmacia)的推薦，使用細(xì)菌表達(dá)載體pGEX 2T，誘導(dǎo)和純化誘導(dǎo)和GST-融合蛋白。給每只兔皮下注射75μg乳化于弗氏完全佐劑中的融合蛋白，每隔2周，用50μg乳化于弗氏不完全佐劑中的融合蛋白加強(qiáng)免疫兔，每隔2周收集一次血，使免疫兔血清穿過柱，該柱含有固定于經(jīng)CNBr激活的Sepharose珠上的GST融合蛋白。用含有0.5M NaCl的0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3.0)洗脫被結(jié)合的Ig。為了除去融合蛋白GST部分上的Ig，類似地，將經(jīng)洗脫的Ig與GST-偶聯(lián)的Sepharose珠一起保溫，使用未結(jié)合的Ig組分。為了進(jìn)行過度表達(dá)的蛋白質(zhì)的免疫印跡分析，Ig的使用濃度為1μg/ml。免疫印跡方法的細(xì)節(jié)詳細(xì)描述于Bavik等人，生物化學(xué)雜志，267:23035-23042(1992)，該文被列入本文參考文獻(xiàn)。
如圖8A所示，上述方法導(dǎo)致p32在被重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)，但不在被模擬轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)。
接著，以類似于在RPE細(xì)胞的微粒體組分中研究11-順式視黃醇脫氫酶活性的方式測(cè)定表達(dá)于COS-細(xì)胞中的p32的酶解特性，見Saari等人，Anal.Biochem,213:28-13226(1993)。
具體地說，通過在輔因子NAD+或NADP的存在下，將得自前述經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和缺乏p32的對(duì)照細(xì)胞的微粒體組分與不同立體異構(gòu)的底物，即11-順式視黃醇或全-反式視黃醇的變換的組合一起保溫即可證實(shí)p32的酶解活性。
為了制備底物，如Heller等人，生物化學(xué)雜志，248:6308-6316(1973)所述使用硼氫化鈉由11-順式視黃醛合成11-順式視黃醇，并在80℃下置氬氣中保存。HPLC分析證實(shí)11-順式視黃醛定量地還原成11-順式視黃醇，在柔和的光照條件下進(jìn)行使用retinoid的所有操作。
為了檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中p32的活性，保溫時(shí)11-順式視黃醇和全-反式視黃醇(得自Sigma Chemical Co.)的終濃度降低至100μM。每次保溫時(shí)使用20μg得自表達(dá)p32的COS-細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞的總膜蛋白，隨后在NAD+或NADP存在或缺乏的條件下，在37℃下保溫30分鐘。用n-己烷提取反應(yīng)混合物，取出有機(jī)相，在氬氣中干燥，然后將干燥的有機(jī)相單獨(dú)溶解于乙醇中，在普通相硅膠HPLC柱上分析等分試樣，該柱用含有4％二戊烷的n-己烷以1ml/分鐘的速度展開，見saari等人，生物化學(xué)雜志，257:13329-13333(1982)。在330nm下監(jiān)測(cè)流出液，在這些條件下，11-順式視黃醛和11-順式視黃醇分別在第7分鐘和第22.5分鐘時(shí)被洗脫出來，全-反式視黃醛和全-反式視黃醇分別在第8分鐘和第23分鐘時(shí)被洗脫出來。
如圖8B所示，前述的HPLC分析表明得自經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的級(jí)分含有p32表達(dá)的11-順式視黃醇脫氫酶蛋白，11-順式視黃醛的形成表示在NAD+存在時(shí)該蛋白具有活性。層析譜中的第二個(gè)峰是全-反式視黃醛；然而，具有11-順式視黃醛的對(duì)照保溫在缺乏細(xì)胞膜時(shí)表現(xiàn)出在所用的試驗(yàn)方法中，大量的11-順式視黃醛異構(gòu)成全-反式視黃醛。這表明全-反式視黃醛的出現(xiàn)是由于在所用的保溫過程中和提取程序中產(chǎn)生了全-反式視黃醛，而不是酶解反應(yīng)產(chǎn)物。另外，全-反式視黃醇與含有p32的細(xì)胞一起保溫證實(shí)了酶的立體特異性，因?yàn)闆]有檢測(cè)到全-反式視黃醛的顯著形成。
如圖8C所示，在輔因子NADP存在下，p32不具有酶解活性。
在圖8D中，對(duì)不表達(dá)p32的對(duì)照細(xì)胞的檢測(cè)表明這些細(xì)胞不能將11-順式視黃醇氧化成11-順式視黃醛。
因此，由上文所述可得出結(jié)論p32是立體特異性的11-順式視黃醇脫氫酶，它依賴NAD+作為它的輔因子。實(shí)施例11根據(jù)上述的工作，使用牛的材料，進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)以分離和克隆人序列。
得自人眼，位于λgt11中的cDNA文庫(kù)購(gòu)自廠商(即Clontech)，將上述文獻(xiàn)中所述的牛cDNA，即SEQ ID NO:10用作探針，通過隨機(jī)引發(fā)至高比活(約109cpm/μg DNA)用32[P]dCTP標(biāo)記cDNA。
然后使用經(jīng)標(biāo)記的牛cDNA探測(cè)人cDNA文庫(kù)，條件如下在68℃下，6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt′s溶液，25％甲酰胺中與100μg/ml的鮭精DNA雜交，接著在65℃下，用2×SSC，0.5％SDS洗滌四次，每次30分鐘，最后在42℃下，用2×SSC洗滌30分鐘。
當(dāng)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性cDNA時(shí)，根據(jù)廠商的說明切下插入物(即cDNA)，然后亞克隆至可商購(gòu)的載體pBluescript中，使用熟知的方法測(cè)定插入物的序列，1128個(gè)核苷酸的序列列于SEQ ID NO:14中，相應(yīng)的318個(gè)殘基的氨基酸序列列于SEQ ID NO:15中。實(shí)施例12在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，使用上述實(shí)施例11中的資料研究和分析牛神經(jīng)視網(wǎng)膜和鼠10天的胚胎，使用鼠胚胎是因?yàn)槌嗽撓到y(tǒng)用于研究發(fā)育生物學(xué)的一般性用途之外，在發(fā)育中視黃醇脫氫酶也十分活躍。此模型可外推至人的發(fā)育。
使用熟知的技術(shù)，從牛的神經(jīng)視網(wǎng)膜或鼠的10天胚胎中分離RNA(5-10μg)，在4μl 5×AMVRT緩沖液中，將RNA與4μl得自5mM儲(chǔ)存液的dNTP，2μl的寡dT(18聚體，終濃度為10μM)，以及0.5μl RNAse抑制劑，2μl禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(10U)相混合，終體積為20μl。在42℃下保溫所得的混合物30分鐘，然后置于冰上直至使用。
然后進(jìn)行PCR，在PCR中，使用了2μl cDNA，根據(jù)上文列出的牛eDNA的推導(dǎo)的氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，下文注明的是保守的氨基酸序列A)Cys Asp Ser Gly Phe GlyB)Pro Gly Trp Asp AlaC)Glu Ala Phe Ser AspD)His Pro Arg Thr“A”對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:12的氨基酸36-41,“B”見于此序列的氨基酸283-287,“C”見于第183-187位，“D”位于第276-279位。本文所用的“保守的”是指推導(dǎo)出的序列和肝臟RDH序列之間的保守性，后一序列見于Chai等人，生物化學(xué)雜志，270:3900-3904(1995)(全文列入本文參考文獻(xiàn))和Simon等人，生物化學(xué)雜志，270:1107-1112(1995)(也被列入本文參考文獻(xiàn))。
制備簡(jiǎn)并的寡聚體，在第一套PCR實(shí)驗(yàn)中，以A和B為基礎(chǔ)的簡(jiǎn)并寡聚體被用作引物，即5′-ACGTGAATTCTGYGAYTCNGGNWTYGG-3′(SEQ ID NO:16)5′-ACGTGAATTCTTNGCRTCCCCANCC-3′(SEQ ID NO:17)分別被用作正向和反向引物。將引物與2μl上文討論的cDNA混合，條件是94℃下變性1分鐘，50℃下退火1分鐘，72℃下延伸2分鐘，這些構(gòu)成1輪循環(huán)，進(jìn)行25輪循環(huán)。
第一套PCR之后，將5μl PCR產(chǎn)物的樣品與以“C”和“D”為基礎(chǔ)的引物混合，即5′-ACGTGAATTCGARGCNTTYTCNGA-3′(SEQ ID NO:18)5′-ACGTGAATTCCGNGTNCKNGGRTG-3′(SEQ ID NO:19)分別被用作正向和反向引物。除了退火溫度為55℃外，所用條件與第一套實(shí)驗(yàn)中完全相同。
在含有溴化乙錠的1.5％瓊脂糖凝膠中分析反應(yīng)產(chǎn)物，假定擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度應(yīng)為約300個(gè)堿基對(duì)，因此，能觀察到的任何300個(gè)堿基對(duì)的帶可證實(shí)PCR方案產(chǎn)生了適當(dāng)大小的產(chǎn)物。使用1％的低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠重復(fù)實(shí)驗(yàn)，從中洗脫出PCR產(chǎn)物，使用相同的方案重新擴(kuò)增分離的產(chǎn)物，并將該產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中(TA克隆試劑盒，Invitrogen)，使用標(biāo)準(zhǔn)的方法從轉(zhuǎn)化子中制備質(zhì)粒DNA，然后通過使用EcoRⅠ進(jìn)行限制性消化分析所述DNA，使用載體特異性的引物進(jìn)一步地分析約為300個(gè)堿基對(duì)的任何插入物。PCR產(chǎn)物示于SEQ IDNO:20-23中，從中推導(dǎo)出的氨基酸序列示于SEQ ID NO:24-27中。SEQ ID NO:20和24對(duì)應(yīng)于牛序列，而所有其它的序列為鼠序列。在這些核苷酸序列中，第一個(gè)堿基(“C”)是實(shí)驗(yàn)的人為假象，是由限制性核酸內(nèi)切酶裂解造成的。因此，測(cè)定推導(dǎo)的氨基酸序列時(shí)，序列從第二個(gè)核苷酸堿基開始。另外，應(yīng)注意未包括正常情況下應(yīng)被包括在5′和3′末端的對(duì)應(yīng)于簡(jiǎn)并寡聚體的序列。實(shí)施例13在進(jìn)一步的探測(cè)實(shí)驗(yàn)中，使用SEQ ID NO:19列出的PCR產(chǎn)物。
使用隨機(jī)標(biāo)記的SEQ ID NO:22篩選鼠8.5天的cDNA文庫(kù)(于λgt10中)，其中在42℃下，6×SSC,0.5％SDS,5×Denhardt′s溶液，50％甲酰胺中與100μg/ml的鮭精DNA發(fā)生雜交，接著在50℃下，用2×SSC,0.5％SDS洗滌1次，時(shí)間為30分鐘。鑒定陽(yáng)性的cDNA克隆，亞克隆至pBluescript中并測(cè)定其序列。核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列示于SEQ ID NO:28和29。實(shí)施例14根據(jù)上述的工作，使用人cDNA探測(cè)人基因組文庫(kù)，通過PCR制備探針，并如上文所述隨機(jī)標(biāo)記探針。
PCR中所用的引物衍生自SEQ ID NO:11的cDNA序列，引物如下正向引物5′-GCTTCGGGCGCTGTAGTA-3′(SEQ ID NO:30)和反向引物5′-AAAACAATCTCTTGCTGGAA-3′(SEQ ID NO:31)。
通過在95℃下變性，55℃下退火，72℃下延伸進(jìn)行PCR，使用2-5U的Taq聚合酶和0.2μM的各種引物，進(jìn)行30輪循環(huán)。
瓊脂糖凝膠電泳分析之后，分離1056bp的擴(kuò)增片段并將它克隆到載體PCR(可購(gòu)自Invitrogen)中。使用此探針篩選得自Stratagene的λFⅫ載體中的人基因組文庫(kù)。按照廠商的說明篩選大約1×106個(gè)噬斑形成單位，使用106cpm/ml雜交溶液，在42C下，6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt′s溶液，50％甲酰胺中與100μg/ml的鮭精DNA雜交過夜，接著在50℃下，用1×SSC,0.1％SDS洗滌1次，最后在65℃下，用0.5×SSC,0.1％SDS洗滌，每次洗滌30分鐘。分離并重新篩選幾個(gè)陽(yáng)性噬斑，使用Sambrook等人，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版，1989)(列入本文參考文獻(xiàn))中描述的甘油分級(jí)梯度法制備λDNA。
通過每次反應(yīng)使用100mg基因組λ克隆作為模板，分析PCR反應(yīng)之后得到的片段來測(cè)定分離的基因組克隆的序列。為了進(jìn)行PCR，在計(jì)數(shù)為‘1’和‘2’的兩套PCR反應(yīng)中使用不同的引物，所述引物衍生自SEQ ID NO:11的cDNA序列。
具體地說，PCR反應(yīng)1中所用的引物是SEQ ID NO:30，見上文(正向引物)和5′-CTCAGGCTGTCAGAGAAGGCCT-3′(SEQ ID NO:32)(反向引物)PCR反應(yīng)2中所用的引物是5′GACGATTTCCAGCGGGTGC-3′(SEQ ID NO:33)(正向引物)和SEQ ID NO:31，見上文通過在95℃下變性，55℃下退火，72℃下延伸進(jìn)行PCR，使用2-5U的Taq聚合酶和0.2μM的各種引物，進(jìn)行30輪循環(huán)。得自反應(yīng)1和2的擴(kuò)增片段分別為2.2kb和2.5kb，將每個(gè)片段克隆到可購(gòu)自Invitrogen的載體PCR中。
使用載體特異性的引物或內(nèi)部引物對(duì)克隆片段進(jìn)行的序列分析可鑒定出外顯子一內(nèi)含子邊界。
基因的結(jié)構(gòu)示于圖9。實(shí)施例15進(jìn)行研究以鑒定基因在染色體上的位置。
為此，從人白細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠細(xì)胞，鼠肝臟細(xì)胞和倉(cāng)鼠/人，小鼠/人體細(xì)胞雜合細(xì)胞系中分離高分子量的DNA，這些雜合細(xì)胞系各保留了一個(gè)人染色體以及嚙齒動(dòng)物基因組。
用HindⅢ消化分離的DNA，通過電泳在瓊脂糖凝膠上分級(jí)分離所述DNA，然后轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜上，使用按上述方法標(biāo)記的上述人cDNA探測(cè)這些DNA。
使用本技術(shù)領(lǐng)域公知的技術(shù)，從淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中制備染色體的玻片，混合得自3個(gè)基因組克隆的λDNA，并通過切口平移用生物素化的16-dUTP標(biāo)記上述λDNA，按照廠商的說明，用熒光紅-dUTP標(biāo)記人染色體12著絲粒(得自ATCC，保藏號(hào)為D12Z1)的著絲粒特異性探針。探針的預(yù)退火，玻片的預(yù)處理，雜交條件，信號(hào)擴(kuò)增和檢測(cè)遵照眾所周知的技術(shù)。用4,6二氨基-2-苯基-吲哚(DAPI)復(fù)染染色體，使用熒光顯微鏡觀察信號(hào)。
對(duì)所有這些資料的分析表明人11-順式RDH的基因跨越了4千個(gè)堿基以上，該基因被分成4個(gè)編碼外顯子，長(zhǎng)度范圍是165-342個(gè)堿基對(duì)。另外，在5′非翻譯區(qū)也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)外顯子，最后一個(gè)編碼外顯子的長(zhǎng)度仍未確定。內(nèi)含子的長(zhǎng)度范圍為250個(gè)堿基對(duì)-1.9千個(gè)堿基，圖9顯示了此圖解說明。
對(duì)外顯子/內(nèi)含子邊界的研究表明所有的剪接供體和受體位點(diǎn)都遵照眾所周知的規(guī)范的GT/AG規(guī)則。起始密碼子和保守的輔因子結(jié)合位點(diǎn)由外顯子2編碼，而具有不變的酪氨酸殘基的活性位點(diǎn)由外顯子3編碼，人11-順式RDH的基因被定位于染色體12q13-14。實(shí)施例16使用SEQ ID NO:21和22中列出的核酸分子延續(xù)實(shí)施例12中所做的工作。
使用可商購(gòu)的鼠源，多組織Northern印跡。具體地說，使用標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)，用32p標(biāo)記SEQ ID NO:21和22中列出的核酸分子。然后使用標(biāo)準(zhǔn)的Northern印跡方法，用這些經(jīng)標(biāo)記的探針來測(cè)定鼠組織樣品中轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)表達(dá)水平。在42℃下，使用50％甲酰胺，6×SSPE緩沖液，0.5％SDS,2×Denhardt′s溶液，100μg/ml的鮭精DNA和1×106cpm/ml的經(jīng)標(biāo)記的探針雜交印跡過夜。在室溫下用2×SSC,0.1％SDS洗滌印跡兩次，每次洗滌30分鐘，接著在50℃下，用含有0.1％SDS的0.1×SSC再洗滌兩次。使用增感屏和柯達(dá)膠卷將印跡暴露于-70℃下過夜，肉眼觀察到的相對(duì)表達(dá)水平如下所示探針組織SEO ID NO:21SEO ID NO:22心臟 - -腦 - ++脾臟 - -肺 - -肝臟 +++++ +++++骨骼肌 - -腎臟 +++ +++睪丸- -實(shí)施例17考慮到實(shí)施例16的結(jié)果，在本實(shí)施例描述的實(shí)驗(yàn)中使用鼠肝臟，使用標(biāo)準(zhǔn)方法，在λZAP中制備鼠肝臟cDNA文庫(kù)。使用上文實(shí)施例16中描述的探針篩選文庫(kù)，具體地說，按照廠商的說明將文庫(kù)鋪平板并制備濾膜。在42℃下，50％甲酰胺，6×SSPE緩沖液，2×Denhardt′s溶液，100μg/ml的鮭精DNA中進(jìn)行預(yù)雜交，然后使用1×106cpm/ml的雜交溶液雜交濾膜，過夜雜交之后，用含有0.1％SDS的2×SSC洗滌濾膜兩次(52℃，每次洗滌30分鐘)，接著在52℃下，用含有0.1％SDS的0.1×SSC再洗滌兩次，每次洗滌20分鐘。然后按上文所述暴露濾膜，重新篩選任何陽(yáng)性的克隆兩次直至平板上所有的噬斑皆為陽(yáng)性。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過體內(nèi)切割將得自幾個(gè)陽(yáng)性克隆的插入物亞克隆至質(zhì)粒pBluescript SK(+)，測(cè)定所得的幾個(gè)克隆的序列。
當(dāng)SEQ ID NO:21被用作探針時(shí)，鑒定了3個(gè)不同的cDNA，在本文中它們被表示為SEQ ID NO:32,33和34。當(dāng)SEQ ID NO:22被用作探針時(shí)，發(fā)現(xiàn)了SEQ ID NO:35。由此推導(dǎo)的氨基酸序列分別被表示為SEQ ID NO:36-39。
因此，如上所述，本發(fā)明提供了分離和鑒定新的蛋白質(zhì)，即p32的方法，該蛋白質(zhì)與RPE的p63相關(guān)。p32的一級(jí)結(jié)構(gòu)闡明它具有功能性的短鏈醇脫氫酶的所有關(guān)鍵性的特性，包括推定的輔因子結(jié)合位點(diǎn)和催化機(jī)制所涉及的必需的殘基，即幾乎不變的含有序列基元Y-X-X-X-K的酪氨酸(Persson等人，歐洲生物化學(xué)雜志，200:537-543(1991))。受限的組織表達(dá)和RPE中p32的豐度表明此蛋白質(zhì)行使的功能對(duì)RPE而言是獨(dú)一無二的。這種可能性和下列事實(shí)表明p32的底物是retinoid，所述事實(shí)是p32與p63形成復(fù)合物，而該復(fù)合物以前已顯示出是RPE-細(xì)胞中retinoid攝取機(jī)的組分(Bavik等人，生物化學(xué)雜志，267:23035-23042(1992))。
RPE-細(xì)胞中retinoid代謝的主要代謝步驟是11-順式視黃醇轉(zhuǎn)變成11-順式視黃醛。根據(jù)上文得到的顯示出p32在RPE中受限的表達(dá)的結(jié)果，以及此蛋白質(zhì)的特殊生化特性，進(jìn)一步的研究證實(shí)了p32實(shí)際上是催化此反應(yīng)的11-順式視黃醇脫氫酶。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是產(chǎn)生重組的11-順式視黃醇脫氫酶的能力，與使用標(biāo)準(zhǔn)生化方法學(xué)得到的產(chǎn)品相比，此重組酶可被用于生產(chǎn)較高水平，較純形式的11-順式視黃醛。因此，在此上下文中，可使用本發(fā)明的包括SEQ ID NO:10的分離的核酸分子，以及在嚴(yán)格條件下可與SEQ ID NO:10雜交的那些核酸分子。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”指的是在68℃下，6×SSC,0.5％SDS,5×Denhardt′s溶液中與100μg/ml的鮭精DNA雜交，最后在50℃下，用0.5-1.0×SSC洗滌。本文中使用的此術(shù)語(yǔ)也指至少與上文中所述條件同樣嚴(yán)格的任何套參數(shù)。眾所周知，通過改變一個(gè)參數(shù)使之較不嚴(yán)格，同時(shí)改變另一個(gè)參數(shù)以增加其嚴(yán)格度可產(chǎn)生同樣的嚴(yán)格條件。因此，預(yù)期滿足本文所列的雜交標(biāo)準(zhǔn)的任何核酸分子編碼p32或p32同系物?？稍谌缟纤龅捏w外系統(tǒng)中生產(chǎn)酶，或通過用本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化真核或原核細(xì)胞系，如CHO和COS細(xì)胞或如大腸桿菌的細(xì)菌菌株或酵母菌株啤酒糖酵母(S.cervisiae)來生產(chǎn)酶。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子被包含在與啟動(dòng)子有效連接的表達(dá)載體內(nèi)。優(yōu)選互補(bǔ)的DNA，或“cDNA”，但也使用基因組DNA和mRNA。
考慮到非眼組織中發(fā)生的retinoid代謝，重要的是鑒定作為短鏈醇脫氫酶特大家族中的成員的p32，即11-順式視黃醇脫氫酶。研究表明由全-反式視黃醇產(chǎn)生全-反式視黃酸以兩步法進(jìn)行(Posch等人，生物化學(xué)，30:6224-6230(1991))，第一步，通過膜結(jié)合的視黃醇脫氫酶將視黃醇氧化為視黃醛，第二步，視黃醛被氧化成視黃酸。因此，發(fā)生于非眼組織中的視黃醇氧化為視黃醛的過程類似于視循環(huán)中由11-順式視黃醇合成11-順式視黃醛的過程中進(jìn)行的反應(yīng)。根據(jù)這些相似性，可建議使用結(jié)構(gòu)類似于本發(fā)明分離的p32 11-順式視黃醇脫氫酶的酶由全-反式視黃醇形成全-反式視黃醛。與目前持有的觀點(diǎn)相比，這些發(fā)現(xiàn)是令人驚奇的，因?yàn)橐话阏J(rèn)為此代謝步驟是由中等鏈長(zhǎng)的醇脫氫酶成員進(jìn)行的，見Duester,Alcohol Clin.Exp.Res,15:568-572(1991)；Yang等人，Alcohol Clin.Exp.Res,17:496(1993)和Zgombic-Knight等人，生物化學(xué)雜志，269:6790-6795(1994)。因此，由本發(fā)明提供的p32 11-順式視黃醇脫氫酶的鑒定和結(jié)構(gòu)特征描述也提供了以前無法預(yù)期的途徑，該途徑可用于分離和鑒定類似的涉及非眼組織中視黃醇代謝的脫氫酶。
p32蛋白和編碼它的核酸以及本發(fā)明的其它方面還有很多其它重要的用途，例如，正如上文所述，p32是寡聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物的一部分，該復(fù)合物在RPE-細(xì)胞中作為RBP的膜受體起作用，在表型/基因型診斷分析中可使用編碼p32的核酸序列以測(cè)定可導(dǎo)致色素性視網(wǎng)膜炎的retinoid積累。
另外，如上所述，p32具有11-順式視黃醇脫氫酶的活性，該酶可催化11-順式視黃醇轉(zhuǎn)變成11-順式視黃醛，在RPE-細(xì)胞的retinoid代謝中，這是由膜結(jié)合的脫氫酶進(jìn)行的主要代謝步驟。因此，retinoid的積累直接或間接地依賴p32的存在和/或其激活或抑制，例如，它與RBP受體p63的復(fù)合物的形成。
在其它應(yīng)用中，可檢測(cè)治療與p32 11-順式視黃醇脫氫酶活性有關(guān)的多種疾病的潛在的retinoid藥物的效果，因?yàn)檫@種藥物對(duì)酶有不利的作用，因此可測(cè)定出不同藥物中的哪一種對(duì)酶活性的不利作用受到限制或哪一種沒有不利的作用。
這種疾病的例子包括眼睛和皮膚的那些障礙，如牛皮癬和痤瘡。通過retinoid藥物也可檢測(cè)如T-細(xì)胞白血病的某些癌癥，因此這些藥物是檢測(cè)p32活性的候選藥物。
retinoid多種已知的功能也暗示通過檢測(cè)與特殊的視黃醇結(jié)合蛋白有關(guān)的p63/p32受體復(fù)合物的水平可診斷出多種其它的與retinoid有關(guān)的病理學(xué)狀態(tài)?？墒褂帽炯夹g(shù)領(lǐng)域熟知的技術(shù)，如免疫測(cè)定法等等來測(cè)定p63/p32受體復(fù)合物的水平是否太低或太高，即是否在正常水平上不符。
另外，由于p32與RPE細(xì)胞中retinoid攝取機(jī)制的p63組分復(fù)合，它也可以用于治療，因?yàn)楸娝苤扇苄缘氖荏w可被用于預(yù)防蛋白質(zhì)與其膜-聯(lián)受體結(jié)合。因此，通過施用可溶性受體復(fù)合物或抗體即可治療因視黃醇結(jié)合蛋白的產(chǎn)生水平增高而鑒定出的受試者，所施用的量應(yīng)足以抑制視黃醇結(jié)合蛋白或其它相關(guān)分子與其靶，即p32視黃醇脫氫酶活性的抑制劑的結(jié)合。本發(fā)明的其它方面對(duì)于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員而言是顯而易見的，本文無需重復(fù)。
在另一個(gè)應(yīng)用中，通過抗體與體液或組織樣品的結(jié)合分析可產(chǎn)生針對(duì)p32的單克隆和多克隆抗體，所述抗體對(duì)于監(jiān)測(cè)因視黃醇結(jié)合蛋白受體水平異常而鑒定出的病理學(xué)狀態(tài)的病例特別有用。通過例如使用Bavik等人，生物化學(xué)雜志，268:20540-20546(1993)所述的產(chǎn)生包括mAb A52的針對(duì)p63的抗體的方法可產(chǎn)生針對(duì)p32的抗體。
所使用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)僅用于描述而不是為了限制本發(fā)明，在使用這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)時(shí)不想排除所示和所述特征的任何等價(jià)物或其部分，我們認(rèn)為多種修飾可以包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人ERIKSSON等人(ⅱ)發(fā)明名稱編碼具有11-順式視黃醇脫氫酶活性的32 KDa蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，所述蛋白質(zhì)與作為視黃醇結(jié)合蛋白受體的一部分的p63相關(guān)(ⅲ)序列數(shù)目39(ⅳ)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Felfe&Lynch(B)街道805 Third Avenue(C)城市紐約(D)州紐約(F)郵編10022(ⅴ)計(jì)算機(jī)的可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤，3.5英寸，144kb內(nèi)存(B)計(jì)算機(jī)IBM(C)操作系統(tǒng)PC-DOS(D)軟件Wordperfect(ⅵ)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?8/562,114(B)申請(qǐng)日1995年11月22日(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?8/375,962(B)申請(qǐng)日1995年1月20日(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?8/258,418(B)申請(qǐng)日1994年6月10日(ⅷ)代理/代理人資料(A)姓名Hanson,NormanD(B)登記號(hào)30,946(C)參考文獻(xiàn)/文檔號(hào)LUD 5372.3-PCT(ⅸ)電信資料(A)電話(212)688-9200(B)電傳(212)838-3884SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1Leu Val Glu Ala Val Leu Ala Glu Val Leu Pro Lys Pro Ala Gln Thr5 10 15Val AlaSEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Tyr Ser Pro Gly Trp Asp Ala Lys5SEQ ID NO:3的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3Thr Pro Val Thr Asn Leu Glu Thr Leu Glu Asp Thr Leu Gln Ala5 10 15SEQ ID NO:4的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Asp Val Ala Pro Phe Gly Val5SEQ ID NO:5的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5Leu His Thr Thr Leu Leu Asp Val Thr Asp Pro Gln Ser Ile5 10SEQ ID NO:6的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6ACGTGAATTC TNGTNGARGC NGT 23SEQ ID NO:7的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7ACGTGAATTC ACNGTYTGNG CNGGYTT 27SEQ ID NO:8的資料
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8ACGTGAATTC CCNGTNACNA AYYT 24SEQ ID NO:9的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9ACGTGAATTC GCYTGNARNG TRTCYTC27SEQ ID NO:10的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1122個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞p32；11-順式視黃醇脫氫酶(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10AGCTTTCCCC TGAGGAGGTC ACCTGGGCTC CAGCC ATG TGG CTG CCT CTG CAG 53Met Trp Leu Pro Leu Leu5TGC CTG CTG CTG GGT GTC TTG CTC TGG GCA GCA CTG TGG TTG CTC AGG 101Leu Gly Val Leu Leu Trp Ala Ala Leu Trp Leu Leu Arg Asp Arg Gln10 15 20GAC CGG CCA GCC AGC GAT GCC TTT ATC TTC ATC ACC GGC TGT GAC TCG149Cys Leu Pro Ala Ser Asp Ala Phe Ile Phe Ile Thr Gly Cys Asp Ser25 30 35GGC TTT GGG CGG CTC CTT GCT CTG AGG CTG GAC CAG AGA GGC TTC CGA197Gly Phe Gly Arg Leu Leu Ala Leu Arg Leu Asp Gln Arg Gly Phe Arg40 45 50GTA CTG GCC AGC TGC CTG ACA CCC TCG GGG GCG GAG GAC CTC CAG CGG245Val Leu Ala Ser Cys Leu Thr 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100AGTACAGCGC CGCATCATGA ACCTGATCTG TGACCCAGAA CTAACGAAGG TGACCAGCTG 240CCTGGAGCAT GCCCTGACTG CTCGC265SEQ ID NO:23的資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度265個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞PCR克隆215(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23CAGCCTGAGG CGAGATGTGG CTCCTTTTGG GGTACGGGTC TCTATCGTGG AACCTGGCTT60CTTCCGAACC CCTGTGACAA ACCTGGAAAC TTTGGAGGGC ACCCTGCAGG CCTGCTGGGC 120ACGGCTGCCT CCAGCCACAC AGGCCCTCTA TGGGGAGGCC TTCCTCACCA AATACCTGAG 180AGTGCAGCAA CGTATCATGA ACATGATCTG TGATCCGGAC CTGGCCAAGG TGAGCAGGTG 240CCTGGAGCAT GCCCTAACTG CCCGT 265SEQ ID NO:24的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度87個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞PCR克隆194(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24Ser Leu Arg Arg Glu Leu Ser Tyr Phe Gly Val Lys Val Ala Met Ile5 10 15Glu Pro Gly Tyr Phe Val Thr Asn Met Thr Gln Asp Glu Gly Phe Ile20 25 30Gly Tyr Leu Gln Ala Leu Trp Asn Arg Ala Ser Pro Glu Leu Lys Glu35 40 45Leu Tyr Gly Glu Asn Phe Pro Ala Asp Phe Leu Lys Thr Leu Ser Leu50 55 60Leu Lys Pro Arg Trp Thr Gln Asn Leu Ser Leu Val Thr Asp Cys Met6570 75 80Glu His Ala Leu Thr Ala Cys85SEQ ID NO:25的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度87個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞PCR克隆207(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25Ser Leu Arg Arg Gly Leu Ser Tyr Phe Gly Val Lys Val Ala Ile Ile5 10 15Glu Pro Gly Phe Phe Leu Thr Gly Val Thr Ser Ser Ala Arg Leu Cys20 2530Ser Asn Thr Gln Met Leu Trp Asp Gln Thr Ser Ser Glu Ile Arg Glu35 40 45Ile Tyr Gly Glu Lys Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Lys Arg Leu Asn Glu50 55 60Leu Asp Lys Arg Cys Asn Lys Asp Leu Ser Leu Val Thr Asp Cys Met6570 7580Glu His Ala Leu Thr Ala Cys85SEQ ID NO:26的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度88個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞PCR克隆200(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26Ser Leu Arg Arg Asp Met Ala Pro Phe Gly Val Gln Val Ser Ile Val5 10 15Glu Pro Gly Phe Phe Arg Thr Pro Val Thr Asn Leu Glu Ser Leu Glu20 25 30Ser Thr Leu Lys Ala Cys Trp Ala Arg Leu Pro Pro Ala Ile Gln Ala35 40 45His Tyr Gly Glu Ala Phe Leu Asp Thr His Leu Arg Val Gln Arg Arg50 55 60Ile Met Asn Leu Ile Cys Asp Pro Glu Leu Thr Lys Val Thr Ser Cys6570 75 80Leu Glu His Ala Leu Thr Ala Arg85SEQ ID NO:27的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度88個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞PCR克隆215(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27Ser Leu Arg Arg Asp Val Ala Pro Phe Gly Val Arg Val Ser Ile Val5 10 15Glu Pro Gly Phe Phe Arg Thr Pro Val Thr Asn Leu Glu Thr Leu Glu20 25 30Gly Thr Leu Gln Ala Cys Trp Ala Arg Leu Pro Pro Ala Thr Gln Ala35 40 45Leu Tyr Gly Glu Ala Phe Leu Thr Lys Tyr Leu Arg Val Gln Gln Arg50 55 60Ile Met Asn Met Ile Cys Asp Pro Asp Leu Ala Lys Val Ser Arg Cys65 70 7580Leu Glu His Ala Leu Thr Ala Arg85SEQ ID NO:28的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度563個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞克隆ME207(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28GAGGCGTTCT CGGACTCCCT CAGGAGGGGG CTCTCCTACT TTGGGGTGAA GGTGGCTATT 60ATAGAGCCTG GCTTCTTCCT GACCGGTGTG ACCAGTAGTG CCAGATTATG CTCAAATACC 120CAGATGCTGT GGGACCAGAC CAGCTCAGAA ATCAGGGAGA TCTATGGCGA GAAGTACCTG 180GCATCCTATC TGAAAAGGCT AAACGAATTG GACAAGAGGT GCAACAAGGA CCTGTCTTTG 240GTGACTGACT GCATGGAGCA TGCTCTGACT GCCTGCCACC CTCGCACGCG ATACTCAGCT 300GGCTGGGATG CTAAGCTCTT CTACCTCCCC TTGAGCTACC TGCCTACCTT TCTTGTGGAT 360GCCCTTCTCT ATTGGACTTC CCTGAAGCCT GAGAAAGCCC TCTGACGTGT TCACCTATGT 420GCATACCTGG GGAGATGTAG GTAGAGTTTG AGAGAGAGAA TATTTAGGGG AAATTTGGAG 480GGTTGAGGGA GGGAGTTTAT TACTCTGGGG TTCAGTCAAC ACACTTCATC TCATTAATTC 540TCCTATGACA CTACTGAATA CTG 563SEQ ID NO:29的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度134個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞克隆ME207(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO:29Glu Ala Phe Ser Asp Ser Leu Arg Arg Gly Leu Ser Tyr Phe Gly Val5 10 15Lys Val Ala Ile Ile Glu Pro Gly Phe Phe Leu Thr Gly Val Thr Ser20 25 30Ser Ala Arg Leu Cys Ser Asn Thr Gln Met Leu Trp Asp Gln Thr Ser3540 45Ser Glu Ile Arg Glu Ile Tyr Gly Glu Lys Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu5055 60Lys Arg Leu Asn Glu Leu Asp Lys Arg Cys Asn Lys Asp Leu Ser Leu6570 75 80Val Thr Asp Cys Met Glu His Ala Leu Thr Ala Cys His Pro Arg Thr85 90 95Arg Tyr Ser Ala Gly Trp Asp Ala Lys Leu Phe Tyr Leu Pro Leu Ser100105 110Tyr Leu Pro Thr Phe Leu Val Asp Ala Leu Leu Tyr Trp Thr Ser Leu115 120 125Lys Pro Glu Lys Ala Leu130SEQ ID NO:30的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞正向引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30GCTTCGGGCG CTGTAGTA18SEQ ID NO:31的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞反向引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31AAAACAATCT CTTGCTGGAA20SEQ ID NO:32的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1613個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32CATCCATACT GGTCAGAGGA ACATGATAGA AACCTGACATTCTCAGTGCC TATACCTTCT TGTGTAACCA GCGGCCAGCCTCATTTTGAC ACAGAATATC TCTCTCTGCT TGACTTCCACAAACCATGTG GCTCTACCTG GTTGCACTGG TGGGCCTGTGGACGCTCCTG CGCTTCTTCA GGGAGAGGCA GGTAGTGAGCCATCTCCAAG ACAAGTATGT CTTCATCACG GGCTGTGACTCTGGCTTTGG GAATCTTCTG GCCAGAGAAC TGGACAGGAGAGGCATGAGG GTGCTAGCTG CATGTCTGAC GGAGAAGGGAGCTGAGCAGC TGAGGAACAA GACATCTGAC AGGCTGGAGACAGTGATCCT GGATGTCACC AAGACAGAGA GTATTGTGGCAGCCACTCAG TGGGTGAAGG AGCGTGTTGG GAACAGAGGACTCTGGGGCC TGGTCAACAA TGCTGGCATC TGTGTCTTTGCTATCAATGA GTGGCTGAAA AAAGAGGACT TTGCAAATATACTGGATGTG AACCTGTTGG GCATGATCGA GGTGACTCTGAGCATGCTGC CCTTAGTGAG GAAGGGGAGG GGCCGTGTGTTCAACATCTC CACCTCCATG GGTCGAGTGT CTTTGTGTGGTGGTGGTTAC TGCATCTCCA AGTATGGTGT AGAGGCCTTCTCAGACTCCC TCAGGAGGGA GATCTCCTAT TTTGGGGTGAAGGTGGCTAT CATAGATCCT GGCGGGTTCA GGACTAATGTCTCCAACTAC GATAGGCTAT CACACAGCAT AGAGAAGCTGTGGGACCAGA CATCCTCGGA GGTCAAGGAG GTCTATGACAAGAATTTTCT GGACTCCTAT ATCAAAGCAA TACAGTCATTGACATACACA TGCTCAGATG ACCTGTCTGT GGTAACTGACTGCATGGAGC ACGCTCTGAC TGCCTGTCAC CCTCGCACAAGATACTCAGC TGGCTGGGAT GCCAATCTCT TCTACCTACCCTTGAGCTAC ATGCCCACCT TCCTGGTAGA TGCCATGTTGTACTGGAGCT CTGTAAAGCC TGCCCAAGCC CTGTGAATCTGCACGTGTGT GCATACTTGT GGCGGGTGGA GGGATATAATGGCATAGGGC ATGTGGTTCT TGAGACTCAT TAAAACAATTCAGCTTCCAT ACTACTCAGA ACCAGTAAAG TTCAGGGGAAAGAGGCATTA AAGTTCTGCC AAGGGGGAGT GATACAAAGGGGCTGGCAAT ATCCTGTGAA CTTAGCTTCT TGGGGCTTCATCTTGGCCTA TTGTGAGAAT CCACAGGACT GCAGAGATTGTAAACACCTA GGATGAGCTT TGCCTCTATC CTTCCTCATGACGTCCATGG GCCTGGCCAT CATGTAAGAT CGAAAGAATCCATTTCACAA TCACCTTTTT CCATGGTGTC AGGAGGGAGGGCCCCCACCC GCATTCCACA TCCTAATCGG CTTTAGGAGGTGGTTTTGCT GGTGGGATAG AATCTTGCTA AGATAAACAACAACAACAAT TTTTATTTGT CTCAAAACCA TGGTTTTTCTTTGGATTCCT TTCATTTCAG AATAAAAGTT GAAAAGATAAAAAAAAAAAA AAASEQ ID NO:33的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1384個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO:33CTTTTTTTTT TTTTTTTTTG ACACAGAGTA TCTCTCTCTCTGCTTGACTT CTACAAGCCA TGTGGCTCTA CCTGGTGGCACTGGTGGGCC TGTGGACGCT TCTGCGCTTC TTCAGGGTGAGGCAGGTGGT GAGCCATCTC CAAGACAAAT ATGTCTTCATCACGGGCTGT GATTCTGGCT TTGGGATTTT GCTGGCCAGACATCTGGACA GGAGAGGCAT GAGGGTGCTG GCTGCATGTCTGACGGAGAA GGGATCCGAG GAGCTGAGGA ACAAGACATCTGACAGGCTG GATATAGTGA TCCTGGATGT CACCAAGACAGAGAGTATTG TGACAGCCAC TCATTGGGTG AAGGAGCATGTTGGGAACAG AGGACTCTGG GGCCTGGTCA ACAACGCTGGCATCTCCACC CCCTCGGGTC CCAACGAGTG GATGAAAAAGCAGGACTTTG CACATGTACT GGATGTGAAC CTGTTGGGCATGATCGAGGT GACTCTGAGC ATGCTGCCTT TAGTGAGGAAGGCGAGGGGT CGTGTGGTCA ACGTCTCCAG TGTCATGGGTCGAGTGTCTC TCTTTGGTGG TGGTTACTGC ATCTCTAAGTATGGTGTAGA GGCCTTCTCA GACTCCCTCA GGAGGGAGCTCCGCTACTTT GGGGTGAAGG TGGCTATTAT AGAGCCTGGCTTCTCCCTGA CCGGTGTGAC CAGCAGTGCC AGATTATGCTCAAATACCCA GATGCTGTGG GACCAGACCA GCTCAGAAATCAGGGAGATC TATGGCGAGA AGTACCTGGC ATCCTATCTGAAAAGGCTAA ACAAATTGGA CAAGAGGTGC AACAAGGACCTGTCTGGGGT GACTGACTGC ATGGAGCATG CTCTGACTGCCTGTCACCCT CGTACCCGAT ACTCAGCTGG CTGGGATGCTAAGCTCTTCT ACCTCCCCTT GAGCTACCTG CCCACCTTTCTTGTGGATGC CCTTCTCTAC TGGACTTCCC TGAGGCCTGAAAAAGCCCTC TGAAAGTATT CACCTATGTG CATACCTGGGGAGATGTAGG TAGATTTTGA GAGAGAGAAT ATTTAGGGGAAATTAGGAGA GTTGGGGGGG GATTTTATTA CTCTGGGGTTCAGTCAATAC ACTTCATCTT GTTAATTCTC CTATGACACTACCCAAGACT GATGATGACC AAAGAAATAG GCAAAGAATTCTGCCAAGGG ATTCAGTTAC AAAAGAGCTG GCTGATGCCCAGATCATGAG CATCACGGCT ACCATGAAGG TCCACACAGATGAGGAGGCT GGGACAAGTT TGTGCCAAAG CACTCTCCTGTGGTCCTCCT CTGCAGGAAA TGTACATGCC CTGGCTAGTTTAAACCCCTA TGCAAGATGG AATTSEQ ID NO:34的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1240個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34CTTCTCTCTC TCTCTCTCTC TCTCTCCTCT TCTACAAACCATGTGGCTCT ACATGGTGGC GCTACTGGGC CTGTGGATGCTCCTGCGCTT TTTTAGAGAG AGGCAAGTGG TGGACCATCTTCAAGACAAG TATGTCTTCA TCACAGGCTG TGGCTCTGGCTTTGGGAACT TGCTGGCCAG ACAGCTGGAC AGGAGAGGCATGAGAGTGTT GGCTGCATGT CGGAAGGAGG ATTGAGCCGAGGAGCTGAGG AGAAAGACAT CAGAAAGGCT GGAGACAGTGATCCTGGATG TCACCAAGAC AGAGAATATT GTGGCAGCCACTCAGTGGGT GAAGGAGCGT GTTGGGAACA GAGGACTCTGGGGCCTGGTC AACAACGCTG GCACCTCCGT CCCCTCGGGTCCCAACGAGT GGATGAAAAA ACAGGACTTT GCAAGTGTACTGGATGTGAA CCTGTTGGGC TTGATCGAGG TGACTCTGAGCATGCTGCCC TTAGTGAGGA AGGCGAGGGG CCGTGTGGTCAACGTCTCCA GCATCTTGGG CATATTGTCA CTTGGTGGTAGTGGTGGTTA CTGCATCTCC AATTATGGTA TAGAGGCCTTCTCAGACTCC CTTAGGAGGG ACGTCCGCTA CTTTGGGGTGAAGGTGGCTA TTATAGAGCC TGGCTTCTTC CTGACTGGTATGGCCATCAG TGCCAGATTA TGCTCAAACA TCCAGATGCTGTGGGACCAG ACCAGCTCAG AAATGCGGGA GATCTATGGAGAGAAATACC TGGCATCCTA TCTGAAAAAC CTAAACGAATTGGACCAGAG GTGCAACAAG GACCTGTCTG TGGTGACTGACTGCATGGAG CACGCTCTGA CTGCCTGTCA CCCTCGCACGAGACACTCAG CTGGCTGGGA TGCTAAGCTC TTCTTCACCCCCTTGATCTA CCTGCCCACC TTTCTTGTGG ATGCTCTTCTATACTGGACT TCTCCAAAAC CTGACAAAGC CCTGTGAAAGCTAGATCCTT TTGTGTTGTT GGGTCAATGG AAGTGCTGTGTGAGGGTGCA GANNCTCAGG AGGAGGAAGA TTCCTGTTCTCAGCCCACAT GTGCTGTGCA TAGGTGCCTG GCTTTTTCTTCCTCTGTATA ACATGGGGGA CATGGGACCA CAGGAATCTGCTATGCTTAA ATGATCATTA CCATTGTTGG TGAAAGAAAAAAAACCTCCT CCCCTGTCTC GGGTTAAAAA AAAAAAAAAASEQ ID NO:35的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1146個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35CGCTTGAGAG CTTTCCCCAG AGGCTGCCCT CAGCAGGGCATCTCATCCCA TCATGTGGCT GCCTCTGCTT CTGGGTGCCTTGCTGTGGGC AGTGCTGTGG TTGCTCAGAG ACCGGCAGAGCCTGCCGGCC ATTGATGCTT TCATCTTCAT CACTGGCTGTGACTCTGGCT TTGGGCGCCT CCTGGCACTG CAACTTGACCAGAAGGTGTT CCAAGTCCTG GCCCCCTGCC TGACCCCCTCTGGAGCAGAA GACCTGCAGC AGATGGCCTC CTCCCGCCTCCACACAACAC TACTGGATAT CACTGATCCC CAGAATGTCCAGCAAGTTGC CAAGTGGGTG AAGACACGTG TTGGAGAAACTGGACTTTTT GGTCTGGTGA ATAACGCTGG CGTAGCTGGTATCATCGGGC CCACACCATG GCTAACACAG GATGATTTCCAGAGAGTACT GAGTGTGAAC ACACTGGGGC CCATCGGTGTCACCCTTGCC CTGCTGCCCC TGCTACAGCA GGCCAGGGGTCGGGTGGTCA ACATCACCAG TGTCTTGGGC CGCATAGCAGCCAATGGCGG GGGCTACTGT GTCTCCAAGT TTGGCCTGGAGGCCTTCTCT GACAGCCTGA GGCGGGACAT GGCCCCGTTCGGAGTACAAG TCTCCATTGT GGAGCCTGGC TTCTTTCGAACCCCTGTGAC CAACCTGGAG ATTCTGGAGA GCACCCTGAAGGCTTGTTGG GCCCGGCTAC CTCCAGCTAT ACAGGCCCACTACGGGGAAG CCTTCCTCGA TACTTATCTT CGAGTACAGCGCCGCATCAT GAACCTGATC TGTGACCCAG AACCAACGAAGGTGACCAGC TGCCTGGAGC ATGCCCTGAC TGCTCGCCACCCCCCAACAC GCTACAGCCC AGGCTGGGAT GCCAAGCTGCTCTGGCTGCC TGCCTCCTAC CTTCCAGCCA GGTTGGTGGATGCTGTGCTC ACCTGGATCC TTCCCCGGCC CGCCCAGTCAGTCTCCTGAT TCCAGCTTTA CAGCAAGAGG CTGATTTTGAAAAGCAAGGC ATCTATTTCT GTGTCTACCC ATTGCTGCCTGGTTTCTGAC ACCAATTAGG CTCTCAATAA ATATGTATTGCTTTAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAGSEQ ID NO:36的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度316個(gè)氨基酸(B)類型蛋白質(zhì)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36MNLYLVALVG LWTLLFRFRE RQVVSHLODK YVFTTGCDSGFGNLLARCID RRGMRVLAAC LTEKGADQLR NKTSDRLETVILDVIKDFSI VAATCDWKIR VGNRELWGLV NNAGICVFAINDWLKKEDFA NILDVNLLGM IEVILSMIPL VRKARGRVFNISSSMGRVSL CGGGYCISKY GVEAFSDSLR REISYFGVKVAIDFPGCERC NVSNYERLSH SIEKINDQTS SEVKEVYDKNFLDSYIKAIQ SLTDTCSDDL SVVIDQMEKA LTRCKPRIKYSAGWDAKLFY LPLSYMPIFL VDRMLYNSSV KPACALSEQ ID NO:37的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度317個(gè)氨基酸(B)類型蛋白質(zhì)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37MALYLVALVG LWLLLRFFRV RQVVEHKCDK YVFITGCDSGFGTLLARCLD RRGMRVLAAC LTEKGAEELR NKTSDRLETVILDVTKTESI VIATQWVKEH VGNRGLWGLV NNASISTPSGPNEWMKKCDF AHVLDVNLLG MIEVTLSMLP LVRKARGRVVNVSSVMGRVS LFGGGYCISK YGVEAFSDSL RRFLRYFGVKVAIIFPGFFL TGVTSSARLC SNTCMLWCQT SSEIREIYGEKYLASYLKRL NKLDKKCNKD LSGVIDCMER ALTACFPRTRYSAGWDAKIF YLPLSYLPTF LVDALLYWTS LRPEKALSEQ ID NO:38的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度318個(gè)氨基酸(B)類型蛋白質(zhì)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38MLYMNVALLG LWMLLRFFRE RCVVDELCDK YVFITGDGSGFGNLLARQED RRGMRVLAAC RKEEGAFFLR RKTSERLETVILDVIKTENI VAATQWVKER VGNRGLWGLV NVAGISVPSGPNEWMKKCDF ASVLDVNLLG LIEVTLSMLP LVRKARGRVVNVSSILGRVS LGGSGGYCIS KYGIEAFSDS LRRDVRYFGVKVAIIEPGFF LTGRCSSARL CSNIGMLWDQ TSSDMREIYGELYLASYLKN LNELDQRCNK DLSVVIDCME EALTACHPRTRYSAGIDAKL FFTPLSYLPT FLVDALLYWT SPKPDKALSEQ ID NO:39的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度318個(gè)氨基酸(B)類型蛋白質(zhì)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39MWLPLLLGAL LWAVLWLLRD RCSLPASDAF IFITGCDSGFGRLLAIQLDQ KIFQVLAGCL TPSGFEDLQQ MASSRLETTLLDITDPQNVQ QVAKWVKTRV GETGEFGLVN NAGVAGIIGPTPVLTQCDFQ RVLSVNTLGP IGVTLALLPL LQQARGRVVNITSVLGRIAA NGGGYCVSKF GLEAFSDSLR RCMAPFGWQVSIVEPGFFRT PVTNLESLES TLKAGWARLP PAIQAHYGEAFLDTYLRVQR FIMNLICDPE LTKVTSCLFH ALTARHPRTRYSPGWDAKLL WLPASYLPAR VVDAVLTWIL PRPAQSVS
權(quán)利要求
1．編碼經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定分子量約為32千道爾頓的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，其中所述蛋白質(zhì)與經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定分子量約為63千道爾頓的視黃醇結(jié)合受體復(fù)合，其中所述分離的核酸分子的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格條件下能與SEQ ID NO:10的核苷酸序列雜交。
2．權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)是人蛋白質(zhì)。
3．權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)是鼠蛋白質(zhì)。
4．權(quán)利要求1的分離的核酸分子，包括cDNA。
5．權(quán)利要求1的分離的核酸分子，包括基因組DNA。
6．權(quán)利要求2的分離的核酸分子，由SEQ ID NO:14組成。
7．權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其編碼SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
8．權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其編碼SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
9．權(quán)利要求3的分離的核酸分子，其編碼SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
10．表達(dá)載體，含有與啟動(dòng)子有效連接的權(quán)利要求1的分離的核酸分子。
11．表達(dá)載體，含有與啟動(dòng)子有效連接的權(quán)利要求2的分離的核酸分子。
12．用權(quán)利要求10的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系或細(xì)菌菌株。
13．用權(quán)利要求11的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系或細(xì)菌菌株。
14．編碼具有視黃醇脫氫酶活性之蛋白質(zhì)的分離的核酸分子及其互補(bǔ)序列，所述核酸分子的互補(bǔ)序列在嚴(yán)格條件下能與至少一個(gè)選自由SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23組成之組的核酸分子雜交。
15．權(quán)利要求14的分離的核酸分子，選自由SEQ ID NO:20,22和23組成的組。
16．權(quán)利要求14的分離的核酸分子，其中所述分離的核酸分子選自由SEQ ID NO:32,33,34和35組成的組。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明,發(fā)現(xiàn)了RPE細(xì)胞膜相關(guān)蛋白,經(jīng)SDS－PAGE測(cè)定,該蛋白質(zhì)的分子量約為32KDa,被稱為“p32”的此蛋白質(zhì)與以前已鑒定的RBP膜受體組分p63蛋白形成寡聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物。已分離出編碼p32蛋白的核酸分子,序列分析表明p32蛋白屬于短鏈醇脫氫酶家族,并表現(xiàn)出11－順式視黃醇脫氫酶的活性,所述酶可催化11－順式視黃醇轉(zhuǎn)變成11－順式視黃醛。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1207768SQ96199479
公開日1999年2月10日 申請(qǐng)日期1996年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月22日
發(fā)明者烏爾夫·埃里克松, 安備雷斯·西蒙, 安娜·羅默特 申請(qǐng)人:路德維格癌癥研究所