一種利用d-乳糖醇實(shí)現(xiàn)重組蛋白高效誘導(dǎo)表達(dá)的方法
【專利摘要】一種利用D-乳糖醇代替IPTG實(shí)現(xiàn)重組蛋白高效誘導(dǎo)表達(dá)的方法，屬于基因工程藥物制備【技術(shù)領(lǐng)域】。其是取活化及擴(kuò)培后的果糖苷酶工程菌的菌液按2～5％(v/v)的接菌量接種接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃，180～220r/min過夜培養(yǎng)；當(dāng)菌液的紫外吸光值OD600為0.3～0.5時，添加誘導(dǎo)劑D-乳糖醇，使D-乳糖醇的終濃度為0.4～1.4mmol/L，然后在32～40℃條件下誘導(dǎo)3～8h，從而實(shí)現(xiàn)重組蛋白的高效誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)驗表明D-乳糖醇為誘導(dǎo)劑與IPTG誘導(dǎo)效果無差異，D-乳糖醇為食品添加劑，無毒性，不被菌體降解，不需多次添加，因此乳糖醇可以代替IPTG作為以Lac為啟動子的基因工程重組蛋白的理想誘導(dǎo)劑。
【專利說明】一種利用D-乳糖醇實(shí)現(xiàn)重組蛋白高效誘導(dǎo)表達(dá)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程藥物制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用D-乳糖醇代替IPTG實(shí)現(xiàn)重組蛋白高效誘導(dǎo)表達(dá)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]乳糖操縱子作為一種可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控型操縱子，是目前研究的最為詳盡的基因操縱子，已被廣泛應(yīng)用于大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建中。IPTG (異丙基-β-D巰基半乳糖苷)誘導(dǎo)條件簡單，是一種高效的乳糖(Iac)及其衍生物的啟動子誘導(dǎo)劑，是β_半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì)，可以直接進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮誘導(dǎo)作用，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄，它是一種非代謝性的誘導(dǎo)物，不會被菌體所消耗，只需要極少量的存在就能穩(wěn)定地誘導(dǎo)乳糖啟動子的轉(zhuǎn)錄。但其具有潛在的毒性，對菌體生長有一定的抑制作用，且價格較昂貴。
[0003]乳糖是一種二糖，作為原核細(xì)胞的常用碳源，是乳糖操縱子控制的細(xì)菌自身系列酶的天然底物，對乳糖操縱子具有天然的誘導(dǎo)作用，且價廉易得、無毒無害；但由于乳糖可以被細(xì)胞作為碳源代謝利用，其濃度是動態(tài)變化的，需要不斷向培養(yǎng)基中添加乳糖。其誘導(dǎo)機(jī)制比IPTG更為復(fù)雜，需要借助于乳糖透過酶(Permase)的作用進(jìn)入細(xì)胞，然后經(jīng)過β_半乳糖苷酶的作用轉(zhuǎn)化為異乳糖(Allolactose)才能起到誘導(dǎo)劑的作用，誘導(dǎo)條件不易掌握，同IPTG相比，乳糖作為誘導(dǎo)劑對于乳糖操縱子的誘導(dǎo)調(diào)控過程更為復(fù)雜。
[0004]乳糖醇(4-0-13_D-吡喃半乳糖基-D-葡糖醇)是一種保健型甜味劑，在自然界中并不存在，它是以乳糖為原料，經(jīng)還原反應(yīng)后精制純化而得，可用作食品添加劑，而乳糖醇具有同IPTG相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，極易溶于水，微溶于乙醇，且穩(wěn)定性較強(qiáng)，在酸，堿，光及高溫條件下仍能保持穩(wěn)定性，安全性較高也可作為誘導(dǎo)劑，且無毒無害不被菌體所替代。乳糖醇所具有的價廉易得，無毒高效的特點(diǎn)，使得利用D-乳糖醇代替IPTG作為誘導(dǎo)劑的研究，對于各種利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足之處，提供一種利用D-乳糖醇代替IPTG實(shí)現(xiàn)重組蛋白高效誘導(dǎo)表達(dá)的方法。
[0006]本發(fā)明所述的一種利用D-乳糖醇代替IPTG實(shí)現(xiàn)重組蛋白高效誘導(dǎo)表達(dá)的方法，其步驟如下:
[0007](I)取活化及擴(kuò)培后的果糖苷酶工程菌的菌液按2?5% (v/v)的接菌量接種接種于LB液體培養(yǎng)基，370C，180?220r/min過夜培養(yǎng)；
[0008](2)當(dāng)菌液的紫外吸光值0D_為0.3?0.5時，添加誘導(dǎo)劑D-乳糖醇(阿拉丁，4-0- β -D-吡喃半乳糖基-D-葡糖醇)，使D-乳糖醇的終濃度為0.4?1.4mmol/L,然后在32?40°C條件下誘導(dǎo)3?8h，從而實(shí)現(xiàn)重組蛋白的高效誘導(dǎo)表達(dá)。上述方法中所述的活化及擴(kuò)培后的果糖苷酶工程菌的菌液，由如下步驟制備得到:
[0009](I)果糖苷酶工程菌(Escherchia.coil BL21 (DE3)(革蘭氏陰性球菌))的構(gòu)建:
[0010]此工程菌參照NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的Thermotoga neapolitanaDSM4359中的果糖苷酶基因序列GeneID:7378529，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計I對引物用于擴(kuò)增果糖苷酶基因:
[0011]PI: CGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGTTCAAACCCCACTACCAC(NheI)；
[0012]P2:TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTCAAGAAATCCATACG(EcorI)。
[0013]引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。
[0014]按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(百泰克)說明書提取Thermotoga neapolitanaDSM4359基因組DNA，以提取的DNA為模板，用引物Pl和P2進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性3min ;94°C變性45s、55°C退火35s、72°C延伸90s，30個循環(huán)；72°C延伸lOmin，反應(yīng)完成后PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后將含有目的基因的PCR產(chǎn)物參照柱式DNA膠回收試劑盒說明書(上海生工)進(jìn)行純化回收1305bp處條帶。用限制性內(nèi)切酶NheI和EcorI對回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切處理，之后通過1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行比較并切膠回收雙酶切產(chǎn)物。酶切條件為:8 μ L純化的PCR產(chǎn)物加入IyL Nhe 1、I μ L EcorI,2 μ L緩沖液、8 μ L去離子水，混合37°C下保溫12小時，進(jìn)行2 %的瓊脂糖凝膠電泳。對表達(dá)載體pET-28a(+)質(zhì)粒做上述同樣的處理并切膠回收雙酶切產(chǎn)物中的大條帶產(chǎn)物。混合目的基因片段和pET-28a(+)質(zhì)粒，加入T4DNA連接酶(TaKaRa)，16°C過夜連接。連接反應(yīng)體系如下:10X 連接BufferlμL、回收的目的基因4μL、pET28a⑴表達(dá)載體I μ L、T4DNA連接酶0.4 μ L，加水補(bǔ)足至10 μ L，將上述試劑冰浴加入無菌PCR管中，小心混勻，瞬間離心后，16°C過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入Escherchia.coil BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑取數(shù)個菌落分別接種于5mL含卡那霉素(Kan) 10 μ g/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜震蕩培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序鑒定。測序由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。將得到的轉(zhuǎn)化入帶有果糖苷酶基因的pET_28a(+)的液態(tài)陽性工程菌Escherchia.coil BL21(DE3)(革蘭氏陰性球菌)-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0015](2)果糖苷酶工程菌的活化及擴(kuò)培:取-801:保存的工程菌在含1^11(10 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基加入1.5% (m/v)瓊脂粉)劃線，37°C恒溫箱過夜培養(yǎng)。然后挑經(jīng)活化的工程菌單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基，200?300r/min，37°C過夜培養(yǎng)，從而得到經(jīng)擴(kuò)培后的菌液。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0017](I)本發(fā)明成功運(yùn)用D-乳糖醇代替IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。
[0018](2)本發(fā)明的目的蛋白表達(dá)水平高，目的蛋白的表達(dá)量與IPTG誘導(dǎo)蛋白量相當(dāng)。
[0019](3)本發(fā)明除了可以誘導(dǎo)果糖苷酶外，還能誘導(dǎo)所有帶有Lac啟動子的載體工程菌所表達(dá)的目的蛋白。
[0020](4)本發(fā)明所述的發(fā)酵方法簡便，發(fā)酵時間短，生產(chǎn)成本低，此外，無IPTG存在，無毒，后處理簡單。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1:D_乳糖醇在不同濃度下對果糖苷酶誘導(dǎo)表達(dá)的影響曲線。
[0022]圖2:D-乳糖醇在不同時間下對果糖苷酶誘導(dǎo)表達(dá)的影響曲線。
[0023]圖3:D-乳糖醇在不同溫度下對果糖苷酶誘導(dǎo)表達(dá)的影響曲線。
[0024]圖4 =IPTG和D-乳糖醇對果糖苷酶活力的影響效果示意圖。D-乳糖醇的誘導(dǎo)濃度為1.0mmol/L，誘導(dǎo)時間為5h，誘導(dǎo)溫度為36°C ；IPTG的誘導(dǎo)濃度為0.8mmol/L，誘導(dǎo)時間為6h,誘導(dǎo)溫度為30°C。
[0025]圖5:D_乳糖醇在不同溫度和IPTG誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá)情況示意圖:條帶1:D_乳糖醇濃度為l.0mmol/L，時間5h，32°C下誘導(dǎo)；條帶2:D_乳糖醇濃度為l.0mmol/L，時間5h,34°C下誘導(dǎo)；條帶3:D-乳糖醇濃度為1.0mmol/L,時間5h, 36°C下誘導(dǎo)；條帶4:D_乳糖醇濃度為1.0mmol/L,時間5h,38°C下誘導(dǎo)；條帶5:D-乳糖醇濃度為1.0mmol/L,時間5h,40°C下誘導(dǎo)；條帶6 =IPTG濃度為0.8mmol/L,時間6h，30°C下誘導(dǎo)；條帶7:D-乳糖醇濃度為1.0mmol/L,時間5h,36°C下誘導(dǎo)；條帶8:未添加誘導(dǎo)劑。
[0026]圖6:Thermotoga neapolitana DSM4359中的果糖苷酶基因PCR產(chǎn)物電泳圖:條帶
I為PCR產(chǎn)物，1305bp為目的條帶。
[0027]由圖1可以看出，D-乳糖醇濃度在0.4?1.0mmol/L范圍內(nèi)，酶活力隨濃度的增加而不斷增加，1.0mmol/L時酶活百分比最大，當(dāng)濃度繼續(xù)增大時,酶活力下降,所以確定D-乳糖醇的最佳誘導(dǎo)濃度為1.0mmol/L ；
[0028]由圖2可以看出，D-乳糖醇在誘導(dǎo)時間3?5h范圍內(nèi)，酶活力隨時間的增加而不斷增加，5h時酶活百分比最大，當(dāng)時間繼續(xù)增加時，酶活力下降，所以確定D-乳糖醇的最佳誘導(dǎo)時間為5h ；
[0029]由圖3可以看出，D-乳糖醇在誘導(dǎo)溫度30?36°C范圍內(nèi)，酶活力隨溫度的增加而不斷增加，36°C時酶百分比最大，當(dāng)溫度繼續(xù)增加時，酶活力下降，所以確定D-乳糖醇的最佳誘導(dǎo)溫度為36°C。
[0030]由圖4可以看出，D-乳糖醇在誘導(dǎo)濃度為1.0mmol/L，誘導(dǎo)時間為5h，誘導(dǎo)溫度為36°C與IPTG在誘導(dǎo)濃度為0.8mmol/L，誘導(dǎo)時間為6h，誘導(dǎo)溫度為30°C誘導(dǎo)的酶活百分比無差異。
[0031]由圖5可以看出，D-乳糖醇誘導(dǎo)濃度為1.0mmol/L，誘導(dǎo)時間為5h，分別在32°C、34°〇、361:、381:、401:誘導(dǎo)時，361:時相對較好(條帶1-5);同時用IPTG在誘導(dǎo)濃度為
0.8mmol/L，誘導(dǎo)時間6h，誘導(dǎo)溫度30°C下誘導(dǎo)與D-乳糖醇在誘導(dǎo)濃度為1.0mmol/L，誘導(dǎo)時間為5h，誘導(dǎo)溫度為36°C誘導(dǎo)相差不大(條帶6、7)，未添加誘導(dǎo)劑的(條帶8)。因此可以用D-乳糖醇替代IPTG作為以乳糖(Iac)及其衍生物啟動子的基因工程重組蛋白的理想誘導(dǎo)劑。
[0032]由圖6可以看出，Thermotoga neapolitana DSM4359中的果糖苷酶基因經(jīng)PCR方法擴(kuò)增成功。

【具體實(shí)施方式】
[0033]實(shí)施例1
[0034]菌種的活化及擴(kuò)培:取經(jīng)本發(fā)明構(gòu)建的_80°C保存的果糖苷酶工程菌在LB固體培養(yǎng)基(Ig胰蛋白胨，0.5g酵母提取物，Ig NaCl，1.5g瓊脂，加水補(bǔ)至10mL)劃線活化，在37°C恒溫箱過夜培養(yǎng)。然后挑活化后的單菌落到LB液體培養(yǎng)基(Ig胰蛋白胨，0.5g酵母提取物，Ig NaCl，加水補(bǔ)至10mL)，200r/min, 37°C恒溫箱過夜擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)后其OD6tltl值
2.0左右。
[0035]實(shí)施例2
[0036]工程菌最適誘導(dǎo)濃度的確定:取實(shí)施例1所述經(jīng)37°C過夜擴(kuò)培后的菌液，以2%(v/v)的接菌量接種到LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，待菌體生長到OD6tltl為0.4時，分別加入不同濃度的D-乳糖醇，使其終濃度分別達(dá)到0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmoI/L、l.2mmol/L、l.4mmol/L, 32 °C下誘導(dǎo)6h。結(jié)果如圖1所不，從而確定最佳誘導(dǎo)濃度為
1.0mmol /I,η
[0037]實(shí)施例3
[0038]工程菌最適誘導(dǎo)時間的確定:取實(shí)施例1所述經(jīng)37°C過夜擴(kuò)培后的菌液，以2%(v/v)的接菌量接種到LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，待菌體生長到OD6tltl為0.4時，加入D-乳糖醇，使其終濃度為1.0_)1/1，分別誘導(dǎo)311、411、511、611、711、811，321:。結(jié)果如圖2所示，從而確定最佳誘導(dǎo)時間為5h。
[0039]實(shí)施例4
[0040]工程菌最適誘導(dǎo)溫度的確定:取實(shí)施例1所述經(jīng)37°C過夜擴(kuò)培后的菌液，以2%(v/v)的接菌量接種到LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，待菌體生長到OD6tltl為0.4時，加入D-乳糖醇，使其終濃度為1.011111101/1，分別在321:、341:、361:、381:、401:下誘導(dǎo)511。結(jié)果如圖3所示，從而確定最佳誘導(dǎo)溫度為36°C。
[0041]實(shí)施例5
[0042]D-乳糖醇在誘導(dǎo)濃度為1.0mmol/L，誘導(dǎo)時間為5h，誘導(dǎo)溫度為36°C與IPTG在誘導(dǎo)濃度為0.8mmol/L，誘導(dǎo)時間為6h，誘導(dǎo)溫度為30°C誘導(dǎo)的酶活百分比無差異。結(jié)果如圖4所示，所以可以用D-乳糖醇替代IPTG作為誘導(dǎo)劑。
[0043]實(shí)施例6
[0044]果糖苷酶活力測定
[0045]誘導(dǎo)后(分別采用實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4產(chǎn)物進(jìn)行酶活力測定)的菌液經(jīng)7000r/min離心機(jī)離心，棄上清，取離心后菌體沉淀，經(jīng)過3次反復(fù)凍融后，用pH5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液溶解(0.3mol/L的乙酸200mL與0.2mol/L的乙酸鈉200mL均勻混合)并超聲波破碎，然后把經(jīng)超聲波破碎后的菌液離心取上清液，得粗酶液。制樣的反應(yīng)體系為:60 μ L的ρΗ5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖液、20 μ L的50mmol/L果糖底物和20 μ L粗酶液均勻混合，水浴2h。依據(jù)葡萄糖測定試劑盒(南京建成)測酶活，計算酶活百分比。
[0046]酶活百分比的計算方法:在實(shí)驗條件下酶液催化果糖生成葡萄糖，經(jīng)葡萄糖測定試劑盒得到的吸光度(A)，空白對照測定的吸光度值為(Atl),則相應(yīng)酶活百分比為(A-Atl)/(A最大-A。)X 100%，結(jié)果如圖5所示。
【權(quán)利要求】
1.一種利用D-乳糖醇代替IPTG實(shí)現(xiàn)重組蛋白高效誘導(dǎo)表達(dá)的方法，其步驟如下: (1)取活化及擴(kuò)培后的果糖苷酶工程菌的菌液按2?5%(v/v)的接菌量接種接種于LB液體培養(yǎng)基，370C，180?220r/min過夜培養(yǎng)； (2)當(dāng)菌液的紫外吸光值OD_為0.3?0.5時，添加誘導(dǎo)劑D-乳糖醇，使D-乳糖醇的終濃度為0.4?1.4mmol/L，然后在32?40°C條件下誘導(dǎo)3?8h，從而實(shí)現(xiàn)重組蛋白的高效誘導(dǎo)表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種利用D-乳糖醇代替IPTG實(shí)現(xiàn)重組蛋白高效誘導(dǎo)表達(dá)的方法，其特征在于:活化及擴(kuò)培后的果糖苷酶工程菌的菌液由如下步驟制備得到， (1)果糖苷酶工程菌的構(gòu)建: 參照NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的Thermotoga neapolitana DSM4359中的果糖苷酶基因序列GeneID:7378529，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計I對引物用于擴(kuò)增果糖苷酶基因:
Pl:CGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGTTCAAACCCCACTACCAC(NheI)；
P2:TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTCAAGAAATCCATACG(EcorI)； 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取Thermotoga neapolitana DSM4359基因組DNA，以提取的DNA為模板，用引物Pl和P2進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性3min ；94°C變性45s、55°C退火35s、72°C延伸90s，30個循環(huán)；72°C延伸lOmin，反應(yīng)完成后PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測；然后將含有目的基因的PCR產(chǎn)物參照柱式DNA膠回收試劑盒說明書進(jìn)行純化回收1305bp處條帶，用限制性內(nèi)切酶NheI和EcorI對回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切處理，之后通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行比較并切膠回收雙酶切產(chǎn)物；酶切條件為8 μ L純化的PCR產(chǎn)物加入IyL Nhe IUuL Ecor1、2 μ L緩沖液、8 μ L去離子水，混合37°C下保溫12小時，進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，對表達(dá)載體pET-28a(+)質(zhì)粒做上述同樣的處理并切膠回收雙酶切產(chǎn)物中的大條帶產(chǎn)物；混合目的基因片段和pET-28a(+)質(zhì)粒，加入T4DNA連接酶(TaKaRa)，16°C過夜連接；連接反應(yīng)體系為1X連接Buffer I μ L、回收的目的基因4 μ L、pET28a(+)表達(dá)載體I μ L、T4DNA連接酶0.4 μ L，加水補(bǔ)足至10 μ L，將上述試劑冰浴加入無菌PCR管中，小心混勻，瞬間離心后，16°C過夜連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入Escherchia.coil BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞,挑取數(shù)個菌落分別接種于5mL含卡那霉素(Kan) 10 μ g/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜震蕩培養(yǎng)；提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序鑒定，將得到的轉(zhuǎn)化入帶有果糖苷酶基因的pET-28a(+)的液態(tài)陽性工程菌Escherchia.coil BL21 (DE3))_80°C保存； (2)果糖苷酶工程菌的活化及擴(kuò)培:取_80°C保存的工程菌在含Kan(10μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基劃線，37°C恒溫箱過夜培養(yǎng)，然后挑經(jīng)活化的工程菌單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基，200?300r/min，37°C過夜培養(yǎng)，從而得到經(jīng)擴(kuò)培后的菌液。
【文檔編號】C12N1/21GK104357423SQ201410692025
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】畢云楓, 姜仁鳳, 沈明浩, 徐琳琳, 陳萍 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)