一種用于圓錐掘氏梅里霉的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
【專利摘要】一種快速提高線蟲生防真菌-圓錐掘氏梅里霉生物量及縮短產(chǎn)孢周期的培養(yǎng)方法，采用培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基在室溫條件下培養(yǎng)圓錐掘氏梅里霉，通過在固體培養(yǎng)基中加入動(dòng)物的腎臟和/或肝臟，提高了該真菌的生物量，并縮短培養(yǎng)產(chǎn)孢周期。
【專利說(shuō)明】一種用于圓錐掘氏梅里霉的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種真菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，特別是涉及一 種快速提高線蟲生防真菌一一圓錐掘氏梅里霉的生物量及縮短產(chǎn)孢周期的培養(yǎng)基和培養(yǎng) 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物寄生線蟲在許多農(nóng)業(yè)及園藝經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重的損失。其中根結(jié)線蟲或胞囊 線蟲等內(nèi)寄生線蟲可以導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量損失在10% -50%。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由于植物內(nèi)寄生線蟲 造成的全世界作物損失已經(jīng)達(dá)到每年超過1000億美元。
[0003] 圓維掘氏梅里霉[Drechmeria coniospora ARSEF 6962]是一種非常重要的線蟲 內(nèi)寄生生防真菌，是內(nèi)寄生型食線蟲真菌。
[0004] 圓錐掘氏梅里霉隸屬于真菌界、子囊菌門、糞殼菌綱、肉座菌目、麥角菌科的掘氏 梅里霉屬。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道該菌具有生物防治植物寄生線蟲潛力的線蟲內(nèi)寄生真菌。被許 多科學(xué)家用作研宄真菌與線蟲識(shí)別機(jī)制的好材料。
[0005] 但是，提高圓錐掘氏梅里霉培養(yǎng)的生物量和縮短培養(yǎng)周期是目前需 要研宄的技術(shù)問題。文獻(xiàn)報(bào)道，利用現(xiàn)有的培養(yǎng)基對(duì)該真菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)， 如 PDA(potato-dextrose-agar)培養(yǎng)基、CMA(corn-meal-agar)培養(yǎng)基和 SDAY(dextrose-neopeptone-yeast extract-agar)培養(yǎng)基，真菌的產(chǎn)量低（生物量低），且 產(chǎn)孢周期長(zhǎng)（約為8-10周）。這嚴(yán)重限制了圓錐掘氏梅里霉大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)，也影響了其 使用。
[0006] 本發(fā)明針對(duì)圓錐掘氏梅里霉產(chǎn)量及應(yīng)用受到培養(yǎng)條件嚴(yán)重限制的前提下，嘗試改 善的培養(yǎng)方法，并最終克服了該真菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)周期長(zhǎng)，產(chǎn)量低的缺點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的最終目的是提供一種圓錐掘氏梅里霉[Drechmeria coniospora ARSEF 6962]的新的培養(yǎng)方法，提高生物量，縮短培養(yǎng)周期，便于其大規(guī)模生產(chǎn)。
[0008] 本發(fā)明的直接目的是找到培養(yǎng)圓錐掘氏梅里霉的培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基中提高生物 量的新的成分。
[0009] 本發(fā)明人通過大量實(shí)驗(yàn)研宄工作，首次發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入動(dòng)物的肝和/或腎， 能夠達(dá)到上述發(fā)明目的。
[0010] 特別是，發(fā)明人對(duì)本發(fā)明固體培養(yǎng)中重要成分-動(dòng)物肝臟和腎臟的含量和組成比 例與培養(yǎng)菌株的菌體生長(zhǎng)周期進(jìn)行了以下相關(guān)性分析：
[0011] 1)動(dòng)物肝臟和/或腎臟的合適用量；
[0012] 2)動(dòng)物肝臟與腎臟的用量比；
[0013] 3)所用肝臟與腎臟的動(dòng)物種類。
[0014] 從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明得到的解決方案是：
[0015] -種圓錐掘氏梅里霉的培養(yǎng)方法，采用培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基在室溫條件下培養(yǎng)圓錐 掘氏梅里霉，其特征是所述培養(yǎng)基中含有動(dòng)物的肝臟和/或腎臟，且所述動(dòng)物肝臟和腎臟 在培養(yǎng)基中的含量是：每l〇〇mL培養(yǎng)基中，含動(dòng)物肝臟lg?50g，動(dòng)物腎臟lg?50g。
[0016] 優(yōu)選含量范圍是：每100mL培養(yǎng)基中，含動(dòng)物肝臟7g?12g、動(dòng)物腎臟7g?12g。 動(dòng)物肝臟與腎臟成分能夠有效地提高該真菌生物量，縮短培養(yǎng)產(chǎn)孢周期。
[0017] 所述的培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基中的其它成分是NaCl、瓊脂及無(wú)菌水。
[0018] 上述配制的培養(yǎng)基為液體，經(jīng)過121°C滅菌后轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w，用于培養(yǎng)圓錐掘氏梅里 霉。
[0019] 在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，培養(yǎng)基成分如下：每100mL培養(yǎng)基中，含動(dòng)物肝臟10g、動(dòng) 物腎臟10g、NaCl 0. 5g、瓊脂1. 5g、加入無(wú)菌水定容。
[0020] 所述動(dòng)物肝臟和腎臟優(yōu)選新鮮或冷凍保存的組織材料。
[0021] 所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選豬、牛、羊的肝和腎。
[0022] 所述培養(yǎng)基的配制方法是：
[0023] 1)稱取動(dòng)物肝臟與動(dòng)物腎臟，切成小塊，用勻漿機(jī)將肝臟與腎臟組織打碎；
[0024] 2)在上述所得組織勻漿中加入NaCl和瓊脂粉，隨后加入蒸餾水定容；
[0025] 3) 121°C 滅菌 15min。
[0026] 用上述培養(yǎng)基對(duì)圓錐掘氏梅里霉進(jìn)行培養(yǎng)的方法是：將保存的圓錐掘氏梅里霉分 生孢子涂布在培養(yǎng)基表面。利用封口膜對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行密封，保持培養(yǎng)基中水分含量。將涂 有菌株的培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度25±2°C，培養(yǎng)周期為7-8天。
[0027] 本發(fā)明的有益效果為
[0028] 經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明首次采用含動(dòng)物肝臟和/或腎臟制備的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得 的圓錐掘氏梅里霉，生物量明顯提高，產(chǎn)孢周期8-16天，顯著縮短。相對(duì)于目前文獻(xiàn)報(bào)道的 采用PDA培養(yǎng)基、CMA培養(yǎng)基對(duì)該真菌培養(yǎng)產(chǎn)量低，產(chǎn)孢周期為8-10周相比，具有工藝簡(jiǎn)單、 設(shè)備要求低，且圓錐掘氏梅里霉生物量顯著提高，培養(yǎng)周期縮短85%以上（詳見實(shí)施例）。
[0029] 用本發(fā)明培養(yǎng)方法培養(yǎng)出來(lái)的圓錐掘氏梅里霉孢子進(jìn)行線蟲侵染實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)結(jié)果 顯示，分生孢子具有的極強(qiáng)的侵染并殺死線蟲的效果，能夠滿足生物防治植物寄生線蟲及 相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)研宄的相應(yīng)要求。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1是不同肝腎比例培養(yǎng)基中圓錐掘氏梅里霉生長(zhǎng)周期分析。圖中，縱座標(biāo)表示 培養(yǎng)基中菌株的生長(zhǎng)時(shí)間；橫座標(biāo)表不不同肝腎含量和比例的培養(yǎng)基。
[0031] 圖2是單獨(dú)添加肝臟或腎臟制備的培養(yǎng)基對(duì)圓錐掘氏梅里霉的促生功能分析。圖 中，縱座標(biāo)表不培養(yǎng)基中菌株的生長(zhǎng)時(shí)間；橫座標(biāo)表不不同肝腎含量的培養(yǎng)基。
[0032] 圖3是不同培養(yǎng)條件下獲得的圓錐掘氏梅里霉對(duì)秀麗隱桿線蟲的侵染能力進(jìn)行 比對(duì)分析。圖中，縱座標(biāo)表示菌株對(duì)線蟲的侵染效率；橫座標(biāo)表示侵染時(shí)間。圖中，LK，本發(fā) 明固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得圓錐掘氏梅里霉；SDAY，SDAY固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得圓錐掘氏梅 里霉；PDA，PDA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得圓錐掘氏梅里霉；CMA，CMA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得圓 錐掘氏梅里霉。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 說(shuō)明
[0034] 1、以下實(shí)施例中，各固體培養(yǎng)基的配制方法是：
[0035] 1)稱取動(dòng)物肝臟與動(dòng)物腎臟，切成小塊，用勻漿機(jī)將肝臟與腎臟組織打碎；
[0036] 2)在上述所得組織勻漿中加入稱取的NaCl和瓊脂粉，隨后加入蒸餾水定容；
[0037] 3) 121°C 滅菌 15min。
[0038] 2、培養(yǎng)方法為：
[0039] 將涂布有圓錐掘氏梅里霉菌株的培養(yǎng)基培養(yǎng)皿封口，并放置于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)溫 度25 °C，定期觀察培養(yǎng)皿中菌株生長(zhǎng)狀態(tài)。
[0040] 3、判斷圓錐掘氏梅里霉的生長(zhǎng)情況的方式為：
[0041] 在光學(xué)顯微鏡下觀察，對(duì)培養(yǎng)菌株的生長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行鑒定。圓錐掘氏梅里霉的生長(zhǎng) 周期主要可以分為三個(gè)階段：
[0042] 階段1 (菌絲體時(shí)期），培養(yǎng)基上能夠觀察到絲狀菌絲體形態(tài)；
[0043] 階段2 (產(chǎn)孢子時(shí)期），菌絲體上產(chǎn)生分生孢子梗，在孢子梗頂端或旁側(cè)產(chǎn)孢細(xì)胞 產(chǎn)生瓶梗，在瓶梗頂端產(chǎn)孢墊上產(chǎn)生圓錐狀分生孢子；
[0044] 階段3 (孢子成熟期），成熟的分生孢子從分生孢子梗上脫落，并在其頂端會(huì)長(zhǎng)出 微小的芽體。
[0045] 實(shí)施例1動(dòng)物肝臟與腎臟的用量研宄
[0046] 配制動(dòng)物肝臟與腎臟含量不同的固體培養(yǎng)基（見表1)，對(duì)培養(yǎng)基中接種的圓錐掘 氏梅里霉菌株生長(zhǎng)周期進(jìn)行了測(cè)定。
[0047] 各培養(yǎng)基中的其它成分是NaCl、及無(wú)菌水，在每100mL培養(yǎng)基中，含NaCl 0. 5g，瓊 脂1. 5g，其余是無(wú)菌水。
[0048] 表 1
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種培養(yǎng)圓錐掘氏梅里霉的方法，其特征是，所使用的每lOOmL培養(yǎng)基中，含動(dòng)物肝 臟lg?50g和/或動(dòng)物腎臟lg?50g，所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，每lOOmL培養(yǎng)基中，含動(dòng)物肝臟7g?12g和/或動(dòng)物腎臟 7g ?12g〇
3. 權(quán)利要求1或2所述的方法，培養(yǎng)方式是：將圓錐掘氏梅里霉分生孢子涂布在培養(yǎng) 基表面；用封口膜將培養(yǎng)皿密封后放置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
4. 權(quán)利要求3所述的方法，培養(yǎng)溫度25 ±2 °C，培養(yǎng)周期為7-8天。
5. 動(dòng)物肝臟和/或動(dòng)物腎臟在圓錐掘氏梅里霉培養(yǎng)中的應(yīng)用。
6. -種培養(yǎng)基，其特征是，每lOOmL培養(yǎng)基中，含動(dòng)物肝臟lg?50g和/或動(dòng)物腎臟 lg?50g，所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
7. 權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基，由NaCl、瓊脂及無(wú)菌水以及動(dòng)物肝臟和/或動(dòng)物腎臟組 成。
8. 權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基，所述動(dòng)物選自豬、?；蜓?。
9. 權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)基，成分如下：每lOOmL培養(yǎng)基中，含動(dòng)物肝臟10g、動(dòng)物腎臟 10g、NaCl 0. 5g、瓊脂1. 5g，其余是無(wú)菌水。
10. 權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基的制備方法，步驟為： 1) 將動(dòng)物肝臟和/或動(dòng)物腎臟切成小塊，用勻漿機(jī)將組織打碎，得組織勻漿； 2) 在所得組織勻漿中加入NaCl和瓊脂粉，隨后加入蒸餾水定容； 3) 121°C 滅菌 15min。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK104450538SQ201410691108
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】張維, 周正富, 郭倩楠, 徐玉泉, 陳明, 林敏
申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所