棉蚜螺蟲乙酯抗性相關cyp6a2啟動子及活性分析的制作方法
【專利摘要】棉蚜螺蟲乙酯抗性相關CYP6A2啟動子及活性分析屬生物工程【技術領域】，本發(fā)明提供了獲得的螺蟲乙酯抗性相關CYP6A2啟動子序列如SEQ ID NO:1所示，其中-1bp至-489bp區(qū)為棉蚜螺蟲乙酯抗性相關CYP6A2啟動子的DNA序列，+1bp至+56bp區(qū)為棉蚜P450基因CYP6A2的5’非翻譯區(qū)的DNA序列；一種用于細胞系轉(zhuǎn)染的真核細胞表達載體包含棉蚜螺蟲乙酯抗性相關CYP6A2啟動子序列；一種用真核細胞表達載體的表達包含棉蚜螺蟲乙酯抗性相關CYP6A2啟動子序列；本發(fā)明可用于真核基因的高效表達，用于獲得低豐度基因研究，使其獲得高水平、穩(wěn)定表達，對于目的功能研究具有積極意義。
【專利說明】棉蚜螺蟲乙酯抗性相關CYP6A2啟動子及活性分析

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬生物工程【技術領域】，涉及一段DNA序列，它可以作為啟動子調(diào)控基因的 表達，具體涉及一種來源于棉蚜P450基因CYP6A2,并在細胞中高度表達的誘導型啟動子序 列。

【背景技術】
[0002] 棉蚜（Aphis gossypii)是一種危害嚴重的世界性農(nóng)業(yè)害蟲，它通過取食和病毒傳 播來危害農(nóng)作物，并已對多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性。螺蟲乙酯是有效防治抗性棉蚜的季酮 酸類殺蟲劑。前期研究結(jié)果表明，棉蚜細胞色素P450基因CPY6A2表達量在螺蟲乙酯抗性 棉蚜中高水平表達。這可能是棉蚜對螺蟲乙酯產(chǎn)生代謝抗性的重要原因。這也顯示出棉蚜 CYP6A2基因啟動子極可能具有較高誘導活性。因此，對于新的高活性的棉蚜相關啟動子的 克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉(zhuǎn)錄 因子的研究具有重要意義，將為深入研究害蟲抗藥性機制及新型抗蟲新品種的研制奠定 基礎。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的一個目的是提供一種螺蟲乙酯抗性相關CYP6A2啟動子序列，該啟動子 序列能夠誘導目的基因高水平表達，而且該啟動子來源于棉蚜P450基因CYPA2。
[0004] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于真核細胞轉(zhuǎn)染的CYP6A2啟動子真核表達載 體，該載體指導高水平表達目的基因CYP6A2的啟動子序列和5'非翻譯區(qū)。
[0005] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種所述真核細胞表達載體的表達，該載體的表達能 反映啟動子活性的高低。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明克隆了棉蚜P450基因CYP6A2的啟動子區(qū)，并構建了真核 表達載體，所述載體包含帶有CYP6A2基因的5'非翻譯區(qū)的上述啟動子。隨后利用所述載 體在Sf9細胞中表達，并檢測到該啟動子的高水平活性。
[0007] 本發(fā)明提供一種獲得的棉蚜螺蟲乙酯抗性相關CYP6A2啟動子序列，所述啟動子 序列如SEQ ID NO: 1所示，其中SEQ ID NO :1的-Ibp至-489bp區(qū)（見序列表）為棉蚜 CYP6A2啟動子的DNA序列，在真核細胞中，本發(fā)明所述的啟動子具有高水平活性。
[0008] 獲得的棉酚螺蟲乙酯抗性相關CYP6A2啟動子序列源自棉蚜P450基因CYP6A2。
[0009] SEQ ID N0:1的+Ibp至+56bp區(qū)（見序列表）為克隆得到的棉蚜P450基因CYP6A2 的5'非翻譯區(qū)的DNA序列，本發(fā)明所述的棉蚜CYP6A2基因的5'非翻譯區(qū)能在Sf9細胞中 通過增強目標外源基因的翻譯效力，而誘導目標基因的高水平表達。
[0010] 為實現(xiàn)另一個目的，本發(fā)明提供一種用于細胞系轉(zhuǎn)染的真核細胞表達載體，所述 真核細胞表達載體包含棉蚜螺蟲乙酯抗性相關CYP6A2啟動子序列。
[0011] 上述用于Sf9細胞轉(zhuǎn)染的真核表達載體是指能夠在細胞中瞬時、高水平表達外源 基因的載體。例如PGL3載體、pGL4載體。
[0012] -種用真核細胞表達載體的表達，所述真核細胞表達包含棉蚜螺蟲乙酯抗性相關 CYP6A2啟動子序列。
[0013]關于本發(fā)明所述的用于真核細胞的表達載體（PGL3)，所述的棉蚜CYP6A2基因的 啟動子和5'非翻譯區(qū)在表達載體中位于外源基因（Luc+)的前面。本發(fā)明提供通過插入本 發(fā)明所述的棉蚜CYP6A2基因的啟動子和5'非翻譯區(qū)至含有Luc+報告基因的載體中而構 建的PGL3-CYP6A2 (-489/+134)。但是，所述Luc+報告基因是外源基因，并預期可以用任意 其它有用的外源基因來代替。
[0014] 本發(fā)明提供來自棉蚜CYP6A2基因的啟動子和5'非翻譯區(qū)，根據(jù)本發(fā)明的啟動子 和5'非翻譯區(qū)使得能夠在真核細胞中進行高水平的表達。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：可用于真核基因的高效表達，用于獲得低豐度基因研究， 使其獲得1?水平、穩(wěn)定表達，對于目的功能研究具有積極意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為棉蚜基因組電泳圖
[0017]圖 2 為 Genome walker PCR 電泳圖
[0018] 圖3為CYP6A2連T載酶切鑒定電泳圖
[0019] 圖4為CYP6A2連pGL3PCR鑒定電泳圖
[0020] 圖5為CYP6A2連pGL3酶切鑒定電泳圖
[0021] 圖6為pGL3-CYP6A2 (-489/+134)轉(zhuǎn)染Sf9細胞后啟動子活性檢測示意圖
[0022] 圖 7 為 pGL3-CYP6A2 (-489/+134)表達載體示意圖

【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖介紹具體實施步驟，將能夠使本領域技術人員更清楚地理解如何實 施本發(fā)明。盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選的【具體實施方式】來對本發(fā)明進行了描述，但是以下 描述的目的是示例性的，而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0024] 實施例1:棉蚜CYP6A2啟動子的克隆
[0025] 依據(jù)棉蚜CYP6A2mRNA序列設計染色體步移引物GSPl (5-CCTCAGGTTCACCAGACTGTT GAACAG-3)和 GSP2 (5-GTACGCCAGTAACACCGACACAACAG-3)。提取棉蚜基因組 DNA (圖 1)，并用 平切酶AfeI、EcoRV-HF、PvuII、SmaI、PmeI、StuI進行消化，純化DNA并連接接頭引物。按 照設計的特異性引物進行PCR擴增，并按照Genome walker (Clontech)PCR方法進行擴增， 擴增得到目的片段，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增出長度為623bp的條帶（圖2)，并進 行回收?；厥掌闻cPGEM-T載體連接得到重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒酶切驗證（圖3)，并測序。
[0026] 棉蚜CYP6A2啟動子（啟動子序列如SEQ ID NO: 1所示，其中SEQ ID NO: 1的-Ibp 至-489bp區(qū)為棉蚜螺蟲乙酯抗性相關CYP6A2啟動子的DNA核苷酸序列），在棉蚜CYP6A2 基因的5'區(qū)序列中得到鑒定。
[0027] 在本發(fā)明的啟動子序列表中，轉(zhuǎn)錄起始位點的堿基用+1示出，ATG用紅色標注。并 用啟動子分析網(wǎng)站分析了啟動子的核心元件。
[0028] 啟動子分析網(wǎng)站 http://www. gene-regulation. com/pub/programs/alibaba2/ index, html
[0029] 實施例2 :棉蚜CYP6A2啟動子表達載體pGL3-CYP6A2 (-489/+134)的構建
[0030] 將在實施例1中所克隆的棉蚜CYP6A2啟動子和5'非翻譯區(qū)（見序列表）插入到 pGL3 載體中，從而構建 pGL3-CYP6A2 (-489/+134)載體。
[0031]更具體地說，利用引物（5-ACGCGTCCAATCGACTTTCGTTT-3， 5-CTCGAGGTACGCCAGTAACACCG-3)擴增，并將該啟動子序列克隆到pGL3載體MluI和XhoI位 點上，構建成PGL3-CYP6A2 (-489/+134)，用于驅(qū)動Luc+的表達，經(jīng)PCR鑒定（圖4)和酶切 鑒定（圖5)獲得啟動子與載體的重組質(zhì)粒。
[0032] 實施例3:鑒定本發(fā)明所述的棉蚜CYP6A2啟動子的活性
[0033] Sf9 細胞接種于 24 孔板中（4X IO5Cells/ 孔），用 Cellfectin II 試劑 (Invitrogen ;2 μ L/ 每孔）瞬時共轉(zhuǎn)染 pGL3-CYP6A2 (-489/+134)建體（2 μ g/ 孔）和對照 報告基因質(zhì)粒PhRL-TK (Promega ;0. 2 μ g/孔）。48小時后，收獲細胞，將所得裂解物用于測 量螢光素酶活性（Promega)。如圖6所示，pGL3-CYP6A2(-489/+134)所轉(zhuǎn)染細胞具有很高 熒光素酶活性。
[0034] 實用性
[0035] 如上所述，本發(fā)明提供棉蚜CYP6A2基因啟動子和5'非翻譯區(qū)。
[0036] 本發(fā)明提供分別將棉蚜CYP6A2基因啟動子和5'非翻譯區(qū)插入至pGL3而獲得的 真核細胞表達載體。
[0037] 經(jīng)使用所述的真核細胞表達載體進行鑒定，本發(fā)明所述的棉蚜CYP6A2基因啟動 子和5'非翻譯區(qū)能夠啟動下游基因的表達。因此，表明本發(fā)明可用于提高真核基因的高效 表達，應用于獲得低豐度基因研究，使其獲得商水平、穩(wěn)定表達。
[0038]

【權利要求】
1. 一種獲得的棉蚜螺蟲乙酯抗性相關CYP6A2啟動子序列，其特征在于所述啟動子序 列如SEQ ID NO: 1所示，其中SEQ ID NO :1的-lbp至-489bp區(qū)為棉蚜螺蟲乙酯抗性相關 CYP6A2啟動子的DNA序列，SEQ ID NO: 1的+lbp至+56bp區(qū)為棉蚜P450基因 CYP6A2的5' 非翻譯區(qū)的DNA序列。
2. -種用于細胞系轉(zhuǎn)染的真核細胞表達載體，其特征在于所述真核細胞表達載體包含 權利要求1所述的棉蚜螺蟲乙酯抗性相關CYP6A2啟動子序列。
3. -種用真核細胞表達載體的表達，其特征在于所述真核細胞表達包含權利要求1所 述的棉蚜螺蟲乙酯抗性相關CYP6A2啟動子序列。
【文檔編號】C12N15/113GK104357450SQ201410632626
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月7日 優(yōu)先權日:2014年11月7日
【發(fā)明者】潘怡歐, 尚慶利, 楊晨, 彭天飛, 席景會, 畢銳, 辛雪成 申請人:吉林大學