單核苷酸多態(tài)性rs73058713在檢測麻風(fēng)病易感基因中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了單核苷酸多態(tài)性rs73058713在檢測麻風(fēng)病易感基因中的應(yīng)用。本發(fā)明所保護(hù)的一個(gè)技術(shù)方案是檢測人基因組中rs73058713的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在制備檢測與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用?？蓪z測rs73058713的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)與其它物質(zhì)(如檢測其它的與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備篩查麻風(fēng)病患者的產(chǎn)品。
【專利說明】單核苷酸多態(tài)性rs73058713在檢測麻風(fēng)病易感基因中的 應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】中單核苷酸多態(tài)性rs73058713在檢測麻風(fēng)病易感基因 中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP)指基因組單個(gè)核苷酸 的變異，它是最微小的變異單元，是由單個(gè)核苷酸對置換、顛換、插入或缺失所形成的變異 形式。單核苷酸多態(tài)性是基因組上高密度的遺傳標(biāo)志，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)的SNP數(shù)量 超過3000萬。作為第三代遺傳標(biāo)記SNP數(shù)量眾多、分布密集，易于檢測，因而是理想的基因 分型目標(biāo)。SNP分型檢測在疾病基因組（如疾病易感性），藥物基因組（藥效、藥物代謝差 異和不良反應(yīng)）和群體進(jìn)化等研究中具有重大意義。
[0003] 目前已有多種方法可用于SNP檢測，如DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性、單 鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性高效液相色譜、SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸雜交反應(yīng)的芯 片、基于單堿基延伸反應(yīng)的芯片、基于等位基因特異性引物延伸反應(yīng)的芯片、基于"一步法" 反應(yīng)的芯片、基于引物連接反應(yīng)的芯片、基于限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的芯片、基于蛋白DNA結(jié)合 反應(yīng)的芯片，及基于熒光分子DM結(jié)合反應(yīng)的芯片（張小燕等。用基因芯片檢測單核苷酸 多態(tài)性反應(yīng)原理。中國生物工程雜志。2005, 25(11):52?56)。
[0004] 麻風(fēng)病是一種由麻風(fēng)分枝桿菌感染所致的慢性傳染病，在發(fā)展中國家這仍然是一 個(gè)嚴(yán)重的健康問題，每年全球新發(fā)病例數(shù)為250000。主要侵犯皮膚和外周神經(jīng)，并導(dǎo)致不可 逆性的神經(jīng)功能損害和慢性致畸致殘。這已被證明在麻風(fēng)的流行中環(huán)境因素和宿主遺傳因 素起著至關(guān)重要的作用，估計(jì)遺傳因素高達(dá)57 %。
[0005] 世界衛(wèi)生組織的方案把麻風(fēng)病的臨床表現(xiàn)分為結(jié)核型和瘤型，分別對應(yīng)了 Thl (細(xì)胞介導(dǎo)）和Th2 (體液介導(dǎo)）組織的人體的免疫應(yīng)答。麻風(fēng)病多樣性的臨床表現(xiàn)反 映出人體對同種病原體的兩種截然不同的免疫應(yīng)答，這就說明遺傳易感性在麻風(fēng)發(fā)病中的 重要性。遺傳研究的結(jié)果表明遺傳與麻風(fēng)易感性和其臨床亞型的病情進(jìn)展都有關(guān)聯(lián)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供單核苷酸多態(tài)性rs73058713在檢測與篩查麻風(fēng)病中的應(yīng) 用。
[0007] 本發(fā)明首先提供了下述Al)-A7)中的任一用途：
[0008] Al)檢測人基因組中rs73058713的多態(tài)性（即等位基因）或基因型的物質(zhì)在制備 篩查麻風(fēng)病患者產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0009] A2)檢測人基因組中rs73058713的多態(tài)性（即等位基因）或基因型的物質(zhì)在制備 檢測麻風(fēng)病易感性產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0010] A3)檢測人基因組中rs73058713的多態(tài)性（即等位基因）或基因型的物質(zhì)在制備 檢測與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0011] A4)檢測人基因組中rs73058713的多態(tài)性（即等位基因）或基因型多態(tài)性（即等 位基因）或基因型的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品 中的應(yīng)用。
[0012] A5)人基因組中rs73058713的多態(tài)性（即等位基因）或基因型多態(tài)性（即等位基 因）或基因型在制備篩查麻風(fēng)病患者產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0013] A6)人基因組中rs73058713的多態(tài)性（即等位基因）或基因型在制備檢測麻風(fēng)病 易感性產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0014] A7)含有檢測人基因組中rs73058713的多態(tài)性（即等位基因）或基因型的物質(zhì)的 產(chǎn)品，為a)-d)中的任一種產(chǎn)品：
[0015] a)檢測與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（即等位基因）或基因型的產(chǎn)品；
[0016] b)鑒定或輔助鑒定與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（即等位基因）或基因型的產(chǎn) 品；
[0017] c)篩查麻風(fēng)病患者產(chǎn)品；
[0018] d)檢測麻風(fēng)病易感性產(chǎn)品。
[0019] 上述用途中，所述檢測人基因組中rs73058713的多態(tài)性（即等位基因）或基因型 的物質(zhì)可為擴(kuò)增包括rs73058713在內(nèi)的基因組DNA片段的PCR引物和單堿基延伸引物。
[0020] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述麻風(fēng)病具體為中國漢族人群及少數(shù)民族麻風(fēng)病。
[0021] rs73058713是人染色體5ql4. 3上的一個(gè)二等位多態(tài)性的SNP位點(diǎn)，該變異是 顛換（A/C，在其互補(bǔ)鏈上則為T/G)。所述rs73058713基因型是AA、AC或CC。所述AA 是rs73058713位點(diǎn)為A的純合型，所述CC是rs73058713位點(diǎn)為C的純合型，所述AC是 rs73058713位點(diǎn)為A和C的雜合型。所述檢測人基因組中rs73058713的多態(tài)性（即等位 基因）或基因型具體可為檢測rs73058713的核苷酸種類。
[0022] 上述用途中，所述AA和所述AC基因型的個(gè)體在麻風(fēng)病患者群體中的比例分別高 于對應(yīng)的基因型在正常人群體中的比例。
[0023] 實(shí)驗(yàn)證明，在由8313個(gè)麻風(fēng)病患者組成的病例群體和由11655個(gè)正常健康者組成 的對照群體及由4362個(gè)其他幾種免疫相關(guān)疾病患者組成的對照群體中，rs73058713的P值 是9. 54X10-9,且rs73058713的相對危險(xiǎn)度是1. 19,說明rs73058713是與麻風(fēng)病相關(guān)的單 核苷酸多態(tài)性。rs73058713的風(fēng)險(xiǎn)等位基因?yàn)锳，該等位基因在麻風(fēng)病患者群體中的比例 比該等位基因在正常人群體中的比例高11.05%。rs73058713的三個(gè)基因型中，AA基因型 的個(gè)體和AC基因型的個(gè)體在麻風(fēng)病患者群體中的比例分別高于對應(yīng)的基因型在正常人群 體中的比例，CC基因型的個(gè)體在麻風(fēng)病患者群體中的比例低于其在正常人群體中的比例。 在實(shí)際應(yīng)用中，可將檢測rs73058713的多態(tài)性（即等位基因）或基因型的物質(zhì)與其它物質(zhì) (如檢測其它的與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（即等位基因）或基因型的物質(zhì)）聯(lián)合在 一起制備篩查麻風(fēng)病患者的產(chǎn)品。
[0024] 其中，檢測人基因組中rs73058713的多態(tài)性（即等位基因）或基因型的物質(zhì)可為 通過下述至少一種方法確定rs73058713的多態(tài)性（即等位基因）或基因型所需的試劑和/ 或儀器：DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性高效液相色譜和SNP 芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸雜交反應(yīng)的芯片、基于單堿基延伸反應(yīng)的芯片、基于等 位基因特異性引物延伸反應(yīng)的芯片、基于"一步法"反應(yīng)的芯片、基于引物連接反應(yīng)的芯片、 基于限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的芯片、基于蛋白DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片，及基于熒光分子DNA結(jié)合反 應(yīng)的芯片。
[0025] 所述產(chǎn)品可為試劑或試劑盒，還可為試劑或試劑盒和儀器的組合產(chǎn)品，如由引物 和DNA測序儀組成的組合產(chǎn)品，由PCR試劑和DNA測序試劑和DNA測序儀組成的組合產(chǎn)品。
[0026] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用PCR引物擴(kuò)增包括rs73058713在內(nèi)的基因組DNA片 段，以得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用單堿基延伸引物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，對得到的延 伸產(chǎn)物的序列進(jìn)行檢測，確定rs73058713的多態(tài)性和基因型。所述PCR引物在序列上沒有 特殊要求，只要能擴(kuò)增出包括rs73058713在內(nèi)的基因組DNA片段即可，具體可為序列表中 SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的單鏈DNA。所述延伸引物根據(jù)人基因組中rs73058713 上游（不包括該SNP位點(diǎn)）設(shè)計(jì)，所述延伸引物的最后1位核苷酸對應(yīng)于人基因組中 rs73058713的前1位核苷酸，如所述延伸引物具體可為序列表中的SEQ ID No. 10所示的 單鏈DNA，當(dāng)然也可將序列表中SEQ ID No. 10所示的單鏈DNA按照人基因組中rs73058713 的下游序列延長一個(gè)以上核苷酸，或按照人基因組中rs73058713的下游序列缺失一個(gè)以 上核苷酸，只要能使該單堿基延伸引物的3'末端延伸出rs73058713位點(diǎn)的核苷酸即可。
[0027] 本發(fā)明在一個(gè)來自中國人群的樣本（8313個(gè)麻風(fēng)病患者和16017個(gè)健康者）中發(fā) 現(xiàn)rs73058713是與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性。可將檢測rs73058713的多態(tài)性（即等 位基因）或基因型的物質(zhì)與其它物質(zhì)（如檢測其它的與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（即 等位基因）或基因型的物質(zhì)）聯(lián)合在一起制備篩查麻風(fēng)病患者的廣品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為未排除以往發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)處及MHC區(qū)域的SNP的P值與在排除了以往發(fā)現(xiàn)位點(diǎn) 處及MHC區(qū)域的SNP后的SNP的P值。其中，左圖為未排除以往發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)處及MHC區(qū)域的 SNP的P值，右圖為在排除了以往發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)處及MHC區(qū)域的SNP后的SNP的P值。
[0029] 圖2為樣本的取樣區(qū)域。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0031] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033] 實(shí)施例 I、rs2221593、rs73058713、rsl0817758 和 rs77061563 是與麻風(fēng)病相關(guān)的 單核苷酸多態(tài)性
[0034] 倫理聲明
[0035] 本研究通過了山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、山東省皮膚病與性病防治研究所的倫理委員 會（IRB)批準(zhǔn)，所有麻風(fēng)病患者、其他幾種免疫相關(guān)疾病（牛皮癬（psoriasis)、白癲風(fēng) (vitilogo)、過敏性皮膚炎（atopic dermatitis)和紅斑狼瘡（SLE))患者及正常健康對照 者均簽署了知情同意書。
[0036] 研究對象
[0037] 在發(fā)現(xiàn)階段（第一階段），進(jìn)行了兩個(gè)獨(dú)立的研究。第一個(gè)獨(dú)立研究的研究對 象為樣本1和作為種群對照的4362例中國北方漢族的其他幾種免疫相關(guān)疾?。ㄅＦぐ_ (psoriasis)、白癲風(fēng)（vitilogo)、過敏性皮膚炎（atopic dermatitis)和紅斑狼瘡（SLE)) 病例，該樣本1包含706例北方漢族麻風(fēng)病例和1225例北方漢族正常健康對照，他們?nèi)?為中國北方漢族血統(tǒng)。第二個(gè)獨(dú)立研究的研究對象為樣本2,該樣本2包含2006-2011年間 在中國招募的955例（質(zhì)控篩選之后樣本總量為842例）麻風(fēng)病例和1040例（質(zhì)控篩選 之后樣本總量為925例）正常健康對照，包括中國北方漢族的436例（質(zhì)控篩選之后為376 例）麻風(fēng)病例和533例（質(zhì)控篩選之后為511例）正常健康對照，中國南方漢族的289例 (質(zhì)控篩選之后為265例）麻風(fēng)病例和305例（質(zhì)控篩選之后為263例）正常健康對照，中 國南方壯族和其他少數(shù)民族的230例（質(zhì)控篩選之后為201例）麻風(fēng)病例和202例（質(zhì)控 篩選之后為151例）正常健康對照，見表1與圖2。
[0038] 驗(yàn)證階段應(yīng)用了兩個(gè)獨(dú)立的樣本，樣本3和樣本4。驗(yàn)證階段1 (第二階段）的樣 本為樣本3,該樣本3包括北方漢族的2761例麻風(fēng)病例和3038例正常健康對照，見表1與 圖2。驗(yàn)證階段2 (第三階段）的樣本為樣本4,該樣本4包括4004例麻風(fēng)病例和6467例 正常健康對照，包括北方漢族的277例麻風(fēng)病例和2626例正常健康對照，西南漢族的1494 例麻風(fēng)病例和1474例正常健康對照，東南漢族的418例麻風(fēng)病例和306例正常健康對照， 西部漢族的418例麻風(fēng)病例和395例正常健康對照，以及南方少數(shù)民族的1397例麻風(fēng)病例 和1666例正常健康對照。驗(yàn)證階段總計(jì)6765例麻風(fēng)病例（樣本3中麻風(fēng)病例數(shù)與樣本4 中麻風(fēng)病例數(shù)之和）和9505例正常健康對照（樣本3中病例數(shù)與樣本4中正常健康對照 數(shù)之和），見表1與圖2。
[0039] 其中，中國麻風(fēng)病患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)是符合下述4條中的2條或2條以上，或符合第 3條者確立診斷：1、皮損伴有感覺障礙及閉汗，或有麻木區(qū)；2、周圍神經(jīng)受累，表現(xiàn)為神經(jīng) 干粗大伴相應(yīng)功能障礙；3、皮損組織切片或組織液涂片查到麻風(fēng)桿菌；4、病理可見特征性 改變。
[0040] 正常健康對照者的診斷標(biāo)準(zhǔn)：無麻風(fēng)病史且無麻風(fēng)的家族史（包括麻風(fēng)患者的一 級、二級和三級親屬）；無其他傳染病病史；無其他自身免疫性疾病病史、系統(tǒng)性疾病病史 及家族史。
[0041]

【權(quán)利要求】
1. 檢測人基因組中rs73058713的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備篩查麻風(fēng)病患者產(chǎn)品 中的應(yīng)用。
2. 檢測人基因組中rs73058713的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備檢測麻風(fēng)病易感性產(chǎn) 品中的應(yīng)用。
3. 檢測人基因組中rs73058713的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備檢測與麻風(fēng)病相關(guān)的 單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
4. 檢測人基因組中rs73058713的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定與麻 風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5. 人基因組中rs73058713的多態(tài)性或基因型在制備篩查麻風(fēng)病患者產(chǎn)品中的應(yīng)用。
6. 人基因組中rs73058713的多態(tài)性或基因型在制備檢測麻風(fēng)病易感性產(chǎn)品中的應(yīng) 用。
7. 含有檢測人基因組中rs73058713的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)的產(chǎn)品，為a)-d)中的任 一種產(chǎn)品： a) 檢測與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性或基因型的產(chǎn)品； b) 鑒定或輔助鑒定與麻風(fēng)病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性或基因型的產(chǎn)品； c) 篩查麻風(fēng)病患者產(chǎn)品； d) 檢測麻風(fēng)病易感性產(chǎn)品。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述檢測人基因組中rs73058713的多態(tài) 性或基因型的物質(zhì)為擴(kuò)增包括rs73058713在內(nèi)的基因組DNA片段的PCR引物和單堿基延 伸引物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述PCR引物為序列表中SEQ ID No. 3所 示的單鏈DNA和序列表中SEQ ID No. 4所示的單鏈DNA。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述單堿基延伸引物為序列表中SEQ ID No. 10所示的單鏈DNA。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293949SQ201410531170
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月10日
【發(fā)明者】張福仁 申請人:山東省皮膚病性病防治研究所