一種受產(chǎn)物抑制減弱的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種受產(chǎn)物抑制減弱的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明采用定點突變方法提高一種CGT酶的產(chǎn)環(huán)糊精能力，提供了增強來源于Bacillus circulansSTB01的β-CGT酶產(chǎn)環(huán)糊精能力的突變方案，獲得突變體A599N、A599N/Y633A。相比于野生CGT酶，突變體產(chǎn)環(huán)糊精的能力明顯增強，更適合環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種受產(chǎn)物抑制減弱的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種受產(chǎn)物抑制減弱的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，屬于基因工程 和酶工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)糊精系淀粉及相關(guān)基質(zhì)經(jīng)酶解環(huán)合后得到的由六個以上葡萄糖經(jīng)a-1，4-糖 苷鍵連結(jié)而成的環(huán)狀低聚化合物。在環(huán)糊精系列中，它們的命名是基于環(huán)中葡萄糖的數(shù)量， 由6、7和8個葡萄糖單元組成的環(huán)糊精分別稱為a-、￠-和Y-環(huán)糊精。環(huán)糊精的立體結(jié) 構(gòu)是中空圓筒形，在它的圓筒內(nèi)部有非極性的C3和C5上的氫以及通過醚鍵連接的氧原子， 故圓筒內(nèi)腔呈疏水性；而葡萄糖的C2和C3上的仲羥基位于圓筒的寬側(cè)開口處，C6上的伯 羥基位于圓筒的窄側(cè)開口處，故圓筒外部呈親水性。由于這種結(jié)構(gòu)，使它具有容納與其形狀 和大小適合的疏水性分子或基團嵌入圓筒內(nèi)而形成包合物的特性，因此，在食品、醫(yī)藥、化 工、農(nóng)業(yè)、紡織等工業(yè)領(lǐng)域中有著廣泛的應用。
[0003] 目前，環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)均采用酶法合成，即在環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (Cyclodextrin Glycosyltransferase，簡稱 CGT 酶，EC 2.4. 1. 19)催化作用下，通過環(huán)化 反應轉(zhuǎn)化淀粉及相關(guān)基質(zhì)合成環(huán)糊精。由于野生CGT酶作用淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精過程中，環(huán)糊 精會與CGT酶蛋白分子發(fā)生結(jié)合，導致CGT酶的環(huán)化活力下降，出現(xiàn)由環(huán)糊精所引起的產(chǎn)物 抑制現(xiàn)象，造成淀粉轉(zhuǎn)化率相對偏低，環(huán)糊精生產(chǎn)成本居高不下，環(huán)糊精在工業(yè)中的應用受 到極大的限制。
[0004] 本發(fā)明中所使用的來源于環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans) STBOl的0-CGT 酶，環(huán)糊精產(chǎn)物對其環(huán)化活力有明顯的抑制作用，因此，減弱產(chǎn)物抑制作用，提高環(huán)糊精得 率，將有利于環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種受產(chǎn)物抑制減弱的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體， 即將氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的野生CGT酶的第599位丙氨酸（Ala)突變?yōu)樘於?胺（Asn)，得到單突變體A599N;或再將單突變體A599N的第633位酪氨酸（Tyr)突變?yōu)楸?氨酸（Ala)，得到雙突變體A599N/Y633A。
[0006] 編碼所述野生CGT酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，來源于環(huán)狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans)STBOl〇
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種獲得所述突變體A599N、A599N/Y633A的方法。根 據(jù)B. circulans STBOl野生CGT酶的基因序列，分別設計并合成引入A599N、A599N/Y633A 密碼子突變的引物，對基因進行定點突變，測定DNA序列，分別鑒別出編碼突變體A599N、 A599N/Y633A的基因，并在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)WB600中進行表達。
[0008] 本發(fā)明的一種實施方式包括以下步驟：
[0009] (1)定點突變
[0010] 單突變體A599N的定點突變：利用快速PCR技術(shù)，以含野生CGT酶基因的表達載體 為模板進行定點突變，或者將突變后的基因連接表達載體。
[0011] 引入599N密碼子的定點突變引物：
[0012] 正向引物：5 ' -AACGCGACGACGAATCTTGGGCA-3 '，下劃線為突變堿基，
[0013] 反向引物：5' -TGCCCAAGATTCGTCGTCGCGTT-3',下劃線為突變堿基；
[0014] 雙突變體A599N/Y633A的定點突變：利用快速PCR技術(shù)，以含單突變體A599N基因 的表達載體/單突變體A599N基因為模板進行定點突變。
[0015] 引入633A密碼子的定點突變引物：
[0016] 正向引物：5 ' -GTCGTTTACCAAGCACCGAACTG-3 '，下劃線為突變堿基，
[0017] 反向引物：5 ' -CAGTTCGGTGCTTGGTAAACGAC-3 '，下劃線為突變堿基；
[0018] PCR 反應體系均為：5 XPrimeSTAR BufTer(Mg2+Plus) IOii L，dNTPs (各 2. 5mM) 4 iiL，正向引物（IOiiM) Iii L，反向引物（IOiiM) Iii L，模板 DNA Iii L，PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/ u L) 0? 5 u L，加入雙蒸水 32. 5 u L。
[0019] PCR 反應擴增條件均為：98°C預變性 4min ;隨后 98°C 10s，55°C 15s，72°C 8min 進 行35個循環(huán)；最后72°C保溫IOmin。
[0020] 將PCR產(chǎn)物經(jīng)過DpnI消化2h后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌（Escherichia coli) JM 109感受 態(tài)細胞中，涂布到含有瓊脂的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培 養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒并進行測序驗證。將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達宿主B. subtilis WB600感受態(tài) 細胞中。
[0021] (2)突變體的表達與純化
[0022] 挑取含突變質(zhì)粒的表達宿主B. subtilis WB600的單克隆于LB培養(yǎng)基中，在37°C、 200r/min下培養(yǎng)8?12h，以4% (v/v)接種量接種到TB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下 發(fā)酵48h。將發(fā)酵液于4°C、IOOOOrpm離心20min以除去菌體，收集上清液采用疏水Phenyl HP柱和強陰離子交換Q-HP柱相結(jié)合的方法，分別純化得到突變體A599N、A599N/Y63A酶制 品。
[0023] 本發(fā)明的有益效果：構(gòu)建了 2個有意義的突變體A599N、A599N/Y633A，均實現(xiàn)了突 變體酶與麥芽糊精底物反應時環(huán)糊精得率的提高，比野生型CGT酶更利于環(huán)糊精的工業(yè)化 生產(chǎn)。

【具體實施方式】
[0024] 實施例1突變位點的確定
[0025] CGT酶中存在3個麥芽糖基結(jié)合位點，分別為麥芽糖基結(jié)合位點1(簡稱MBSl)、麥 芽糖基結(jié)合位點2 (簡稱MBS2)和麥芽糖基結(jié)合位點3 (MBS3)。淀粉與CGT酶反應生成環(huán)糊 精過程中，環(huán)糊精產(chǎn)物會與CGT酶中MBS2結(jié)合，阻礙淀粉進入活性中心，抑制了 CGT酶環(huán)化 活力，導致環(huán)糊精得率偏低。來源于環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus Circulans)STB01的CGT酶 的MBS2,是由第598?636位的39個氨基酸殘基組成，其中Ala599和Tyr633能與環(huán)糊精 通過氫鍵發(fā)生相互作用，可能與阻礙淀粉進入活性中心有關(guān)。因此，若改變這兩個位點的空 間結(jié)構(gòu)，可能能夠減弱環(huán)糊精對CGT酶活力的抑制，使CGT酶在較高環(huán)糊精濃度條件下，依 然能夠繼續(xù)將淀粉轉(zhuǎn)化成環(huán)糊精，提高環(huán)糊精得率。
[0026] 實施例2突變體A599N、A599N/Y633A的制備
[0027] (1)定點突變
[0028] 單突變體A599N的定點突變：利用快速PCR技術(shù)，以含野生CGT酶基因的表達載體 pST/cgt (或其他常見枯草芽孢桿菌表達載體，如pUB110、pC194等）為模板進行定點突變。
[0029] 引入Asn599密碼子的定點突變引物：
[0030] 正向引物：5 ' -AACGCGACGACGAATCTTGGGCA-3 '，下劃線為突變堿基，
[0031] 反向引物：5' -TGCCCAAGATTCGTCGTCGCGTT-3',下劃線為突變堿基；
[0032] 雙突變體A599N/Y633A的定點突變：利用快速PCR技術(shù)，以單突變體A599N基因的 表達載體pST/cgt為模板進行定點突變。
[0033] 引入Ala633密碼子的定點突變引物：
[0034] 正向引物：5 ' -GTCGTTTACCAAGCACCGAACTG-3 '，下劃線為突變堿基，
[0035] 反向引物：5 ' -CAGTTCGGTGCTTGGTAAACGAC-3 '，下劃線為突變堿基；
[0036] PCR 反應體系均為：5 XPrimeSTAR BufTer(Mg2+Plus) IOii L，dNTPs (各 2. 5mM) 4 iiL，正向引物（IOiiM) Iii L，反向引物（IOiiM) Iii L，模板 DNA Iii L，PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/ u L) 0? 5 u L，加入雙蒸水 32. 5 u L。
[0037] PCR反應擴增條件均為：PCR擴增條件均為：98°C預變性4min ;隨后98°C 10s， 55°C 15s，72°C 8min 進行 35 個循環(huán)；最后 72°C保溫 lOmin。
[0038] 將PCR產(chǎn)物經(jīng)過DpnI消化2h后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌（Escherichia coli) JM 109感受 態(tài)細胞中，涂布到含有瓊脂的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培 養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒并進行測序驗證。將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達宿主B. Subtilis WB600感受態(tài) 細胞中。各培養(yǎng)基中均添加5 ii g/mL硫酸卡那霉素和10 ii g/mL赤霉素。
[0039] (2)突變體的表達與純化
[0040] 挑取含突變質(zhì)粒的表達宿主B. subtilis WB600的單克隆于LB培養(yǎng)基中，在37°C、 200r/min下培養(yǎng)8?12h，以4% (v/v)接種量接種到TB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下 發(fā)酵48h。將發(fā)酵液于4°C、IOOOOrpm離心20min以除去菌體，收集上清液采用疏水Phenyl HP柱和強陰離子交換Q-HP柱相結(jié)合的方法，分別純化得到突變體A599N、A599N/Y63A酶制 品。各培養(yǎng)基中添加5 ii g/mL卡那霉素和10 ii g/mL赤霉素。
[0041] 實施例3酶活測定分析
[0042] (1)酶活力的測定
[0043] a -環(huán)化活力的測定：取適當稀釋的酶液〇? ImL,加入裝有0? 9mL預先用50mM磷酸 緩沖液（pH 6. 0)配制的1% (w/v)麥芽糊精（DE = 5)溶液的試管中，在50°C下反應IOmin 后，加入I. OmL I. ON的鹽酸停止反應，再加入I. OmL用50mM磷酸緩沖液配制的0. ImM甲基 橙溶液20°C下保溫15min，在505nm下測定吸光度。以失活的酶作為空白，對應a-環(huán)糊 精標準曲線的測定出a-環(huán)糊精的含量。一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成 I ii mol的環(huán)糊精所需的酶量。
[0044] P _環(huán)化活力的測定：取適當稀釋的酶液0? ImL,加入裝有0? 9mL預先用50mM磷酸 緩沖液（pH 6. 0)配制的1% (w/v)麥芽糊精（DE = 5)溶液的試管中，在50°C下反應IOmin 后，加入3. 5mL 30mM NaOH和0. 5mL由5mM Na2CO3溶液配制的0. 02% (w/v)酚酞溶液反應， 在室溫下保溫15min，在550nm下測定吸光度。以失活的酶作為空白。一個酶活單位定義為 在上述條件下每分鐘生成I U mol 0 -環(huán)糊精所需的酶量。
[0045] Y-環(huán)化活力的測定：取適當稀釋的酶液0? lmL，加入裝有0? 9mL預先用50mM磷酸 緩沖液（pH 6. 0)配制的1% (w/v)麥芽糊精（DE = 5)溶液的試管中，在50°C下反應IOmin 后，加入50 ii L I. ON的鹽酸停止反應，再加入2mL 0. 2M檸檬酸緩沖液（pH4. 2)和IOOii L 5mM溴甲酚綠溶液，在室溫下保溫15min，在630nm下測定吸光度。以失活的酶作為空白。一 個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成I ii mol Y -環(huán)糊精所需的酶量。
[0046] (2)酶產(chǎn)物抑制比較
[0047] CGT酶產(chǎn)物抑制的測定：控制反應溫度、pH、酶添加量不變，以麥芽糊精（DE = 5) 溶液作為反應底物，選擇反應底物濃度范圍為〇. 05?1 % (干基），測定不同底物濃度下反 應30min后a-、￠-或Y-環(huán)糊精的的含量，得到以環(huán)糊精含量為指標的初始反應速率，作 米氏方程雙倒數(shù)圖；其他條件不變，在酶反應體系中添加1或2mg/mL的￠-環(huán)糊精，測定 不同底物濃度下反應30min后a-、￠-或Y-環(huán)糊精的的含量，得到以環(huán)糊精含量為指標 的初始反應速率，作米氏方程雙倒數(shù)圖。
[0048] 實驗結(jié)果列于表1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P _環(huán)糊精對野生CGT酶及其突變體的三種環(huán)化活 力抑制類型為線性混合型抑制，方程式如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種環(huán)糊精葡萄糖基酶突變體，其特征在于，是將氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的第599位的丙氨酸突變?yōu)樘於０罚玫絾瓮蛔凅wA599N。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，在得到單突變體A599N的基礎(chǔ)上，將第 633位酪氨酸突變?yōu)楸彼幔玫诫p突變體A599N/Y633A。
3. 編碼權(quán)利要求1或2所述突變體的基因。
4. 含有權(quán)利要求3所述基因的載體或細胞。
5. -種獲得權(quán)利要求1所述突變體的方法，其特征在于，根據(jù)SEQ ID NO. 1所示的基因 序列，設計定點突變引物，對基因進行定點突變，獲得編碼突變體A599N的基因，并在枯草 芽孢桿菌中進行表達。
6. -種獲得權(quán)利要求2所述突變體的方法，其特征在于，根據(jù)SEQ ID NO. 1所示的基 因序列，設計定點突變引物，對編碼突變體A599N的基因進行定點突變，獲得編碼雙突變體 A599N/Y633A的基因，并在枯草芽孢桿菌中進行表達。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)WB600為表達宿主。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，挑取含突變質(zhì)粒的表達宿主B. Subtilis WB600的單克隆于LB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下培養(yǎng)8?12h，以4% (v/v)接種量接種 到TB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下發(fā)酵24?48h ;將發(fā)酵液于4°C、lOOOOrpm離心20min 以除去菌體，收集上清液并純化,得到突變體酶制品。
9. 一種減弱CGT酶產(chǎn)物抑制的方法，其特征在于，是將氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示 的CGT酶的第599位丙氨酸突變?yōu)樘於０罚⒌玫絾瓮蛔凅wA599N ;或在單突變體A599N 的基礎(chǔ)上，進一步將第633位酪氨酸突變?yōu)楸彼?，得到雙突變體A599N/Y633A。
10. 權(quán)利要求1或2所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體在環(huán)糊精生產(chǎn)中的應用。
【文檔編號】C12N15/54GK104293743SQ201410506112
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】李兆豐, 顧正彪, 徐琪, 李才明, 洪雁, 程力 申請人:江南大學