草莓高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種草莓‘紅顏’高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化方法，包括菌種活化、植物材料準(zhǔn)備、侵染、共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、生根培養(yǎng)步驟，解決傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法中農(nóng)桿菌和雜菌的污染問題；解決草莓‘紅顏’轉(zhuǎn)化效率低的問題；解決草莓‘紅顏’轉(zhuǎn)基因從轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)基因檢測、大田移栽周期長的問題，縮短周期；解決轉(zhuǎn)基因檢測工作量大，工作繁重的問題，簡化檢測方法，加快檢測速度。在已經(jīng)建立的‘紅顏’草莓葉片再生體系的基礎(chǔ)上，對影響根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化‘紅顏’草莓葉片的各項因素進(jìn)行了研究，優(yōu)化各種參數(shù)，簡化操作過程，確定最佳轉(zhuǎn)化條件。
【專利說明】草莓高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】領(lǐng)域，尤其涉及一種草莓的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

【背景技術(shù)】
[0002] 草莓a(chǎn)flaftassa)是一種經(jīng)濟(jì)價值較高的作物，營養(yǎng)價值高，近年來草莓 產(chǎn)業(yè)在我國許多地區(qū)飛速發(fā)展，已經(jīng)成為有些地區(qū)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化的重要組成部分。因此近年 來我國科研工作者在草莓的研究中也投入了大量的精力，尤其是隨著近年來分子生物學(xué)和 基因工程的飛速發(fā)展，研究熱點轉(zhuǎn)向草莓種質(zhì)資源優(yōu)良基因的深度挖掘，并進(jìn)行分子標(biāo)記 和基因表達(dá)序列的鑒定和測定。同時在抗逆性、耐It運(yùn)、風(fēng)味品質(zhì)等遺傳改良等方面的研究 結(jié)果相繼有所報道，草莓育種正朝著分子育種方向發(fā)展。而草莓分子育種的過程中最重要 的手段就是草莓轉(zhuǎn)基因。自1990年James等成功獲得了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓遺傳轉(zhuǎn)化植株 以來，通過近二十年的研究，草莓已經(jīng)成為繼核桃、蘋果之后，第3個獲得轉(zhuǎn)基因植株的果 樹。迄今，各國學(xué)者利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將多種有經(jīng)濟(jì)價值的外源目的基因?qū)氩葺蚪M 中。另一方面，對于果樹來說，草莓從開花到結(jié)果周期短，一年中能夠多次成花，花序多，可 以四季結(jié)果，植株矮小，種植方便。因此對果樹作物來說，草莓研究來作為果樹研究的一種 模式研究，尤其是在研究果實的生長發(fā)育方面，研究草莓的果實生長發(fā)育機(jī)理更容易，具有 高效快速的優(yōu)點。
[0003] 目前常用的草莓基因轉(zhuǎn)化方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法和電擊法，其中農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的葉盤法是草莓遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法，也是迄今為止植物轉(zhuǎn)基因研究中研究最為成熟 最常用的一種轉(zhuǎn)基因方法。雖然草莓的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)路線成熟，但轉(zhuǎn)化效率很低，獲得的轉(zhuǎn) 基因植株太少，給轉(zhuǎn)基因植株的后期鑒定工作帶來了障礙，而且從轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)基因檢測、大 田移栽整個周期較長，轉(zhuǎn)基因檢測工作量大，工作繁重。傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法操作過程比較 繁瑣，在轉(zhuǎn)基因的過程中容易出現(xiàn)許多問題，比如合適載體的選擇、合適菌株的選擇、雜菌 的污染、農(nóng)桿菌無法抑制、菌液濃度過高或者過低導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因不成功、侵染時間長短的控制 等等，這些問題都會影響草莓轉(zhuǎn)基因的效率以及速度，傳統(tǒng)方法獲得的草莓植株轉(zhuǎn)基因效 率不到百分之一。因此如何獲得一個高效快速的草莓穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系，是草莓轉(zhuǎn)基因中亟待 解決的一個問題。
[0004] 草莓品種'紅顏'豐產(chǎn)性好，品質(zhì)優(yōu)良，適于設(shè)施栽培，目前國內(nèi)大范圍的栽培此品 種，也獲得了較大的經(jīng)濟(jì)效益，但是由于此品種還存在多方面的缺陷，比如抗性差，容易感 染病蟲害以及果實不耐貯藏等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種草莓'紅顏'高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化方法， 不僅解決傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法中農(nóng)桿菌和雜菌的污染問題、草莓轉(zhuǎn)化效率低的問題；而且還 解決草莓轉(zhuǎn)基因從轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)基因檢測、大田移栽周期長的問題，、轉(zhuǎn)基因檢測工作量大，工 作繁重的問題。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的。
[0007] -種草莓'紅顏'高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基， 草莓繼代培養(yǎng)基FMS1，包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，瓊脂5. 5 g/L，6-BA0. 5mg/L， NAAO. lmg/L，且培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ; 草莓共培養(yǎng)培養(yǎng)基FMS2,包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，瓊脂5. 5 g/L，TDZ 2mg/L， 2, 4-D 0. lmg/L，且培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ; 草莓篩選培養(yǎng)基FMS3,包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，瓊脂5. 5 g/L，TDZ 2mg/L， 2, 4-D 0· lmg/L，卡那霉素 0-50mg/L，羧芐青霉素 100-400 mg/L，且培養(yǎng)基的pH值為5· 8 ; 草莓生根篩選培養(yǎng)基FMS4,包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，瓊脂5. 5 g/L，ΙΒΑ 0. lmg/ L，卡那霉素 0_50mg/L，羧芐青霉素 100-400 mg/L，且培養(yǎng)基的pH值為5· 8。
[0008] 進(jìn)一步所述草莓篩選培養(yǎng)基FMS3,包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，瓊脂5. 5 g/L， TDZ 2mg/L，2,4-D 0.1mg/L，卡那霉素 20mg/L，羧節(jié)青霉素 400 mg/L;草莓生根篩選培養(yǎng)基 FMS4,包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，瓊脂5.5 g/L，IBA 0.1mg/L，卡那霉素 20mg/L，羧芐 青霉素 300 mg/L。
[0009] 進(jìn)一步所述各培養(yǎng)基每1L中MS培養(yǎng)基粉劑的用量為4. 4g ;草莓共培養(yǎng)培養(yǎng)基 FMS2高壓滅菌后冷卻至60°C分裝平板備用；草莓篩選培養(yǎng)基FMS3與草莓生根篩選培養(yǎng)基 FMS4高壓滅菌后冷卻至60°C加入卡那霉素、羧芐青霉素分裝培養(yǎng)瓶備用。
[0010] 一種草莓'紅顏'高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化方法，該方法包括如下步驟： 1) 菌種活化：將含質(zhì)粒PK7WG2D農(nóng)桿菌EHA105在固體培養(yǎng)基上劃線，28 °C培養(yǎng)2天， 接種到液體培養(yǎng)基中于28 °C菌搖培養(yǎng)至0D600值0. 4?0. 6,將菌液離心后倒去上層清 液，收集菌體沉淀，將收集的沉淀用MS液體培養(yǎng)基懸浮液重懸，重懸后測定菌液濃度為 0. 2?0. 6,將重懸后的菌液放于冰箱備用； 2) 植物材料準(zhǔn)備：取在草莓繼代培養(yǎng)基FMS1上繼代草莓"紅顏"組培苗的葉片，剪去剪 去葉尖和葉緣，剪成〇. 4 cm2的葉塊， 3) 侵染：將菌液倒入剪好的葉片中，輕微搖勻，浸染40?60分鐘，侵染完成后倒出菌 液，將葉片在濾紙上吸干； 4) 共培養(yǎng)：侵染后的葉片接種在草莓共培養(yǎng)基FMS2中，25 ± 2°C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2? 3天； 5) 篩選培養(yǎng)：將共培養(yǎng)3天的草莓'紅顏'的葉片，接種在草莓篩選培養(yǎng)基FMS3上，在 培養(yǎng)室中25±2 °C，光照培養(yǎng)20?30天，草莓葉片邊緣有愈傷組織長出，檢測后保留抗性 愈傷，去除非抗性愈傷，將抗性愈傷經(jīng)過40?50 d的培養(yǎng)，分化出植株，再次檢測保留整個 植株葉片和葉柄都呈抗性的抗性植株； 6) 生根培養(yǎng)：抗性植株長到2-3厘米高時，將抗性植株轉(zhuǎn)入草莓生根篩選培養(yǎng)基FMS4 上生根，獲得完整的抗性苗，檢測后保留抗性苗的葉片、葉柄以及根都呈抗性的植株。
[0011] 進(jìn)一步所述步驟1)中，固體培養(yǎng)基為：LB固體培養(yǎng)基50 mL+壯觀霉素 50mg /L+ 利福平l〇〇mg/ L;其中LB固體培養(yǎng)基配方：每一升LB固體培養(yǎng)基中包含胰蛋白胨10g，酵 母提取物5g,氯化鈉 10g以及Agar (瓊脂）15g ; 液體培養(yǎng)基為：LB液體培養(yǎng)基50mL+壯觀霉素 50mg /L+利福平100mg/ L ;其中LB液 體培養(yǎng)基配方：每一升LB液體培養(yǎng)基中包含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉 10g。
[0012] 進(jìn)一步所述步驟1)中重懸后測定菌液濃度為0. 2?0. 3。
[0013] 所述步驟5)、步驟6)中使用體式熒光顯微鏡檢測，觀察到綠光即呈抗性。
[0014] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于： 1)提高草莓轉(zhuǎn)基因效率，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到30%以上； 2) 將菌液濃度降低，侵染時間加長，即避免農(nóng)桿菌污染，又提高了侵染效率； 3) 傳統(tǒng)方法中常添加乙酰丁香酮等輔助侵染的藥劑，會對葉片造成傷害，降低葉片再 生能力，而侵染菌液中不添加任何的輔助侵染的藥品藥劑，能減小對草莓葉片的傷害，提高 葉片培養(yǎng)的成活率和再生率； 4)使用攜帶強(qiáng)表達(dá)報告基因的載體，通過觀察可直接篩選得到轉(zhuǎn)基因植株，避免傳統(tǒng) 的檢測中繁瑣的工作，縮短了轉(zhuǎn)基因的周期。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為轉(zhuǎn)基因草莓'紅顏'的熒光檢測圖片，其中： FA:愈傷組織熒光FB:葉片熒光FC:葉柄熒光 FD :組培苗熒光 FE :花熒光 FF :果實熒光 圖2為卡那霉素濃度對草莓再生率的影響； 圖3為羧芐青霉素對草莓轉(zhuǎn)基因的影響； 圖4為不同菌液濃度和侵染時間對設(shè)·//?基因表達(dá)率的影響。

【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0017] 實施例1 : 一、材料準(zhǔn)備 1、植物材料 草莓"紅顏"組培苗，在草莓繼代培養(yǎng)基上繼代供試驗用。
[0018] 2、培養(yǎng)基配方及配制方法： 草莓'紅顏'繼代培養(yǎng)基FMS1 : MS4.4g/L，鹿糖 30g/L，瓊脂 5.5 g/L，6-BA0.5mg/L，NAA0.1mg/L，ρΗ5·8,高壓滅菌，備 用； 草莓'紅顏'共培養(yǎng)培養(yǎng)基FMS2 : MS4.4g/L，蔗糖 30g/L，瓊脂 5.5 g/L，TDZ 2mg/L，2,4-D 0.1mg/L，ρΗ5·8,高壓滅菌， 冷卻至60°C左右分裝平板備用； 草莓'紅顏'篩選培養(yǎng)基FMS3 : MS4.4g/L，蔗糖 30g/L，瓊脂 5.5 g/L，TDZ 2mg/L，2,4-D O.lmg/L，ρΗ5·8,高壓滅菌， 冷卻至60°C加入卡那霉素0_50mg/L，羧芐青霉素100-400 mg/L分裝培養(yǎng)瓶備用； 草莓'紅顏'生根篩選培養(yǎng)基FMS4 : MS4.4g/L，鹿糖 30g/L，瓊脂 5.5 g/L，IBA O.lmg/L，ρΗ5·8,高壓滅菌，冷卻至 60°C加 入卡那霉素0_50mg/L，羧芐青霉素100-400 mg/L分裝培養(yǎng)瓶備用。
[0019] MS :MS是MS培養(yǎng)基，是Murashige和Skoog于1962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計的，其 特點是無機(jī)鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù) 量和比例合適，能滿足植物細(xì)胞的營養(yǎng)和生理需要，因而適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培 養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。本發(fā)明使用由美國sigma公司生產(chǎn)MS培養(yǎng)基 粉劑（Murashige and Skoog basal salt mixture)，此MS培養(yǎng)基粉劑要求每配制一升培養(yǎng) 基添加4. 4克粉劑，在本培養(yǎng)基的配制中，每配制一升培養(yǎng)基需要加入MS培養(yǎng)基粉劑4. 4 克。
[0020] TDZ:TDZ是一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑，具有很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素活性，它可以促進(jìn) 植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促進(jìn)種子萌發(fā)，促進(jìn)愈傷組織生長，延緩植物衰老等， 并且可以對其它的植物激素和生理活性物質(zhì)的作用來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育過程，是一個作 用力很強(qiáng)的植物生長調(diào)節(jié)劑，在農(nóng)業(yè)上有廣泛的應(yīng)用和推廣價值在草莓的組織培養(yǎng)中也很 常用，本發(fā)明中添加2. Omg/L的TDZ能夠很好誘導(dǎo)'紅顏'葉片形成不定芽。將TDZ配制成 lmg/mL的母液供配制培養(yǎng)基使用。
[0021] 2, 4-D :2, 4-D為2, 4-二氯苯氧乙酸，對于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長非常有效，是組 織培養(yǎng)中常用的植物生長調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明中添加〇. lmg/L的2, 4-D就能夠很好的誘導(dǎo)'紅 顏'不定芽形成。將2, 4-D配制成lmg/mL的母液供配制培養(yǎng)基使用。
[0022] 6-BA :6-BA是6-芐氨基腺嘌呤，是一種細(xì)胞分裂素類的物質(zhì)，具有高效、穩(wěn)定、廉 價和易于使用等特點是組織培養(yǎng)者最喜愛的細(xì)胞分裂素。6-BA的主要作用是促進(jìn)芽的形 成，本發(fā)明中用于草莓'紅顏'繼代培養(yǎng)中。將6-BA配制成lmg/mL的母液供配制培養(yǎng)基使 用。
[0023] IBA :IBA是吲哚丁酸，能夠促進(jìn)植物主根生長，提高發(fā)芽率，成活率。高濃度吲哚 丁酸也可促進(jìn)部分組培苗的增殖。本發(fā)明中IBA主要用于轉(zhuǎn)基因植株的生根。配制成lmg/ mL的母液供配制培養(yǎng)基使用。
[0024] 卡那霉素：是生物抗生素類藥劑，購買自美國sigma公司，藥品為白色粉劑，配制 成50mg/mL的濃度供試驗用；卡那霉素是轉(zhuǎn)基因中的植物篩選標(biāo)記，通過在培養(yǎng)基中添加 卡那霉素，可以剔除掉一部分非轉(zhuǎn)基因的芽或者植株。轉(zhuǎn)基因植株抗卡那霉素，因此可以在 添加卡那霉素的培養(yǎng)基中成活，而普通植株不抗卡那霉素，會死亡。
[0025] Rif :利福平是生物抗生素類藥劑，購買自美國sigma公司，藥品為深紅色粉劑，配 制成25mg/mL的濃度供試驗用。
[0026] 壯觀霉素：是生物抗生素類藥劑，購買自美國sigma公司，藥品為白色粉劑，配制 成50mg/mL的濃度供試驗用；卡那霉素是轉(zhuǎn)基因中的載體的篩選標(biāo)記，通過在LB培養(yǎng)基中 添加壯觀霉素，能夠準(zhǔn)確篩選單菌落，減小雜菌污染的幾率。
[0027] 羧芐青霉素：羧芐青霉素用于抑制轉(zhuǎn)基因后期農(nóng)桿菌的生長。
[0028] 3、菌株和植物表達(dá)載體 本發(fā)明中使用的菌株是農(nóng)桿菌菌株EHA105,該菌株是草莓轉(zhuǎn)基因中常用菌株，侵 染能力較強(qiáng)。該菌株購買于美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC (American type culture collection)〇
[0029] 植物表達(dá)載體選用基于Gateway ?技術(shù)的pK7WG2D植物表達(dá)載體，Gateway ?技術(shù) 大大地簡化了基因克隆和亞克隆的步驟，Gateway?利用了位點特異重組，所以在構(gòu)建入門 載體后，不再需要使用限制性內(nèi)切酶和連接酶。此外PK7WG2D植物表達(dá)載體攜帶超強(qiáng)表達(dá) 的報告基因 Egfp，便于轉(zhuǎn)基因植株的檢測。載體購買于Invitrogen生物技術(shù)公司。
[0030] 二、草莓'紅顏'高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化方法 1、菌種活化 1)將含質(zhì)粒PK7WG2D農(nóng)桿菌EHA105在固體培養(yǎng)基上劃線，28 °C培養(yǎng)2天；其中固體 培養(yǎng)基為：LB固體培養(yǎng)基50 mL+壯觀霉素 50mg /L+利福平100mg/ L ;其中LB固體培養(yǎng) 基配方：每一升LB固體培養(yǎng)基中包含Tryptone(胰蛋白胨）10g, YeastExtract(酵母提 取物）5g, NaCl(氯化鈉）10g以及Agar (瓊脂）15g。。
[0031] 2)挑取平板上長的好的單菌落2-3個，接種到50 mL液體培養(yǎng)基中，28 °C，220 rpm在搖床中振蕩培養(yǎng)至0D600值0. 4 (約12-16 h);其中液體培養(yǎng)基為：LB液體培養(yǎng)基 50mL+壯觀霉素50mg /L+利福平100mg/ L ;其中LB液體培養(yǎng)基配方：每一升LB液體培養(yǎng) 基中包含Tryptone (胰蛋白胨）10g, Yeast Extract (酵母提取物）5g, NaCl (氯化鈉） 10g。
[0032] 3)常溫下，5000rmp離心8分鐘，去掉上清液，在無菌濾紙上倒扣離心管，盡量將 上清液去除，用100 mLMS液體重懸菌體，在搖床中振蕩培養(yǎng)大約1小時測定0D600值為 0. 2,此數(shù)據(jù)為最佳（這個0D600值很重要，不能低于0. 2,不能高于0. 3,控制在0. 2?0. 3 之間，要接近〇. 2)?；罨玫木嚎梢杂脕碜鱿乱徊街参锊牧锨秩?。
[0033] 2、植物材料準(zhǔn)備 取在草莓繼代培養(yǎng)基FMS1上繼代草莓"紅顏"組培苗上的幼嫩、平展的30天葉齡的葉 片，剪去剪去葉尖和葉緣，剪成大約0.4 cm2的葉塊用于菌液侵染。盡量使得草莓葉片上四 周都有傷口，這樣剪容易長愈傷。
[0034] 3、侵染 將懸浮的菌液倒入剪好的葉片中，輕微搖勻，浸染40分鐘，過程中每隔5分鐘搖動一 次，增加菌液和葉片的接觸面積，侵染完成后倒出菌液，將葉片在無菌濾紙上吸干表面的菌 液。
[0035] 4、共培養(yǎng) 侵染后的葉片接種在草莓共培養(yǎng)基FMS2中，25±2°C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3天。
[0036] 5、篩選培養(yǎng) 將共培養(yǎng)3天的草莓'紅顏'葉片，接種在草莓篩選培養(yǎng)基FMS3上，使傷口與培養(yǎng)基充 分接觸，在培養(yǎng)室中25±2 °C，光照培養(yǎng)。培養(yǎng)20天左右，草莓葉片邊緣會有白色愈傷組織 長出，此時在體式熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，可以明顯看出一部分愈傷有非常亮的綠光發(fā)出， 這部分愈傷為抗性愈傷，要保留下，而一部分沒有發(fā)光，這部分愈傷為非抗性愈傷，去除掉， 通過這個步驟，將非抗性的愈傷去除，大大減小下一步工作量。保留下的抗性愈傷經(jīng)過約40 d左右的培養(yǎng)以后，可分化出抗性植株。此時再進(jìn)行一次熒光檢測，在體式熒光顯微鏡下進(jìn) 行觀察抗性植株，整個抗性植株葉片和葉柄都發(fā)綠光的保留下來，發(fā)紅光的去除掉。
[0037] 6、生根培養(yǎng) 抗性植株長到大約2-3厘米高時，將抗性植株轉(zhuǎn)入草莓生根篩選培養(yǎng)基FMS4上生根， 獲得完整的抗性苗。此時的抗性苗還不能完全確定是不是轉(zhuǎn)基因苗，因此需要再進(jìn)行一次 熒光檢測，熒光檢測中抗性苗的葉片，葉柄都發(fā)亮綠光的可以確定為轉(zhuǎn)基因植株，如圖1中 FB，F(xiàn)C，F(xiàn)D所示，轉(zhuǎn)基因植株的葉片葉柄都有熒光。
[0038] 本發(fā)明還能對獲得果實進(jìn)行果實的試驗：移栽后等草莓開花結(jié)果，開花結(jié)果后為 了進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性，可在熒光顯微鏡下再次檢測花和果實不同發(fā)育階段的熒光 如圖1中FE，F(xiàn)F所示，轉(zhuǎn)基因的草莓花和果實都有強(qiáng)熒光發(fā)出。
[0039] 三、下面通過試驗來進(jìn)一步闡述本發(fā)明的有益效果。
[0040] 1、植物篩選標(biāo)記卡那霉素濃度的確定： 將外植體接種于分別含卡那霉素為0、10、15、20、25、50mg/L的FMS2培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng) 14天，轉(zhuǎn)至光下再培養(yǎng)20天，統(tǒng)計葉片褐化率，愈傷形成率和不定芽再生率確定最適的卡 那霉素選擇壓。
[0041] 草莓葉片再生對卡那霉素的濃度比較敏感，隨著培養(yǎng)基中卡那霉素濃度的增加外 植體失綠、褐化、皺褶、壞死的現(xiàn)象加重，外植體再生率也隨之下降，白化芽增多。因此，確定 合適的卡那霉素濃度是成功獲得轉(zhuǎn)基因植株的關(guān)鍵。從圖2可以看出在卡那霉素濃度為 20mg/L時，葉片褐化率達(dá)到65. 7%，有一定數(shù)量的愈傷組織形成，但是沒有不定芽生成，因 此卡那霉素濃度達(dá)到20mg/L時已完全抑制了草莓不定芽的再生?？勺鳛椴欢ㄑ糠只A段 的選擇壓（圖2)。
[0042] 2、抑菌抗生素(羧芐青霉素）濃度的選擇 侵染后經(jīng)過共培養(yǎng)后的葉片分別接種于含羧芐青霉素100、200、300、400mg/L的FMS2 培養(yǎng)基上，經(jīng)暗培養(yǎng)14天，篩選培養(yǎng)至40天后，統(tǒng)計葉片褐化率，愈傷形成率和不定芽再生 率及農(nóng)桿菌的抑菌程度確定最佳抑菌抗生素濃度。
[0043] 抑菌抗生素使用的最重要的作用是抑制轉(zhuǎn)基因過程中農(nóng)桿菌的生長，因此，抑菌 抗生素的濃度要求既能夠抑制農(nóng)桿菌生長，又不能對植物生長造成傷害。所以確定抑菌抗 生素濃度在整個轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炛惺欠浅Ｖ匾?。本試驗中抑菌抗生素濃度?00mg/L時能夠 良好抑制農(nóng)桿菌生長，同時也不傷害植株的正常生長，如圖3所示，培養(yǎng)基中沒有農(nóng)桿菌溢 出，而且植株能夠正常生長。
[0044] 3、菌液濃度、侵染時間優(yōu)化 將傳統(tǒng)方法中的菌液濃度〇D600=0. 6,侵染時間8min，與本方法中菌液濃度 0D600=0. 2,浸染時間40min相比較，比較出兩種不同方法的侵染效率高低、侵染以后葉片 成活率以及后期農(nóng)桿菌的污染程度確定最佳的菌液濃度和侵染時間。
[0045] 用/^//7基因表達(dá)率來衡量侵染時間、和菌液濃度的選擇。方法是將侵染轉(zhuǎn)化后長 出愈傷的葉片放在體式熒光顯微鏡下檢測熒光表達(dá)，統(tǒng)計有非常亮的綠光和沒有綠光的葉 片個數(shù)。
[0046] 你 f/7基因表達(dá)率=(有綠色亮光葉片數(shù)/總的外植體數(shù)）X 100% 菌液濃度和侵染時間的優(yōu)化是本發(fā)明中最重要的以部分，不同于傳統(tǒng)的草莓轉(zhuǎn)基因方 法中的菌液濃度高時間短的侵染方法，本發(fā)明中使用低濃度菌液，長時間侵染，經(jīng)過多次試 驗證明，低濃度長時間侵染能夠大幅度提高轉(zhuǎn)化效率，而且培養(yǎng)后期不容易產(chǎn)生農(nóng)桿菌污 染。如圖4所示采用低濃度菌液長時間侵染能夠顯著提高設(shè)·//?基因表達(dá)率，提高轉(zhuǎn)化效率。
[0047] 實施例2 :與實施例1基本相同，所不同的是：草莓'紅顏'高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化 方法，具體如下： 步驟1菌種活化中的第二步，挑取平板上長的好的單菌落2-3個，接種到50 mL LB液 體培養(yǎng)基中，28 °C，220 rpm在搖床中振蕩培養(yǎng)至0D600值0. 6。
[0048] 步驟3侵染工序：將懸浮的菌液倒入剪好的葉片中，輕微搖勻，浸染60分鐘，過程 中每隔5分鐘搖動一次，增加菌液和葉片的接觸面積，侵染完成后倒出菌液，將葉片在無菌 濾紙上吸干表面的菌液。
[0049] 步驟4共培養(yǎng)工序：侵染后的葉片接種在草莓共培養(yǎng)基FMS2中，25±2°C培養(yǎng)箱中 黑暗培養(yǎng)2天。
[0050] 步驟5篩選培養(yǎng)工序： 將共培養(yǎng)2天的草莓'紅顏'葉片，接種在草莓篩選培養(yǎng)基FMS3上，使傷口與培養(yǎng)基充 分接觸，在培養(yǎng)室中25±2 °C，光照培養(yǎng)。培養(yǎng)30天，草莓葉片邊緣會有白色愈傷組織長 出，此時在體式熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，可以明顯看出一部分愈傷有非常亮的綠光發(fā)出，這 部分愈傷為抗性愈傷，要保留下，而一部分沒有發(fā)光，這部分愈傷為非抗性愈傷，去除掉，通 過這個步驟，將非抗性的愈傷去除，大大減小下一步工作量。保留下的抗性愈傷經(jīng)過約50 d 的培養(yǎng)以后，可分化出抗性植株。此時再進(jìn)行一次熒光檢測，在體式熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察 抗性植株，整個抗性植株葉片和葉柄都發(fā)綠光的保留下來，發(fā)紅光的去除掉。
【權(quán)利要求】
1. 一種草莓'紅顏'高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基，其特征在于，包括如下成分： 草莓'紅顏'繼代培養(yǎng)基FMS1，包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，瓊脂5. 5 g/L， 6-BA0. 5mg/L，NAAO. lmg/L，且培養(yǎng)基的 pH 值為 5. 8 ; 草莓'紅顏'共培養(yǎng)培養(yǎng)基FMS2,包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，瓊脂5. 5 g/L，TDZ 2mg/L，2, 4-D 0· lmg/L，且培養(yǎng)基的 pH 值為 5. 8 ; 草莓'紅顏'篩選培養(yǎng)基FMS3,包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，瓊脂5. 5 g/L，TDZ 2mg/ L，2,4-D O.lmg/L，卡那霉素0-50mg/L，羧芐青霉素100-400 mg/L，且培養(yǎng)基的pH值為 5. 8 ； 草莓'紅顏'生根篩選培養(yǎng)基FMS4,包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，瓊脂5. 5 g/L，IBA 0· lmg/L，卡那霉素0-50mg/L，羧芐青霉素100-400 mg/L，且培養(yǎng)基的pH值為5. 8。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種草莓'紅顏'高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基，其特征在 于：所述草莓'紅顏'篩選培養(yǎng)基FMS3,包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，瓊脂5. 5 g/L，TDZ 2mg/L，2, 4-D 0· lmg/L，卡那霉素 20mg/L，羧節(jié)青霉素 400 mg/L ; 草莓生根篩選培養(yǎng)基FMS4,包括的成分有：MS，蔗糖30g/L，瓊脂5. 5 g/L，IBA 0. lmg/ L，卡那霉素20mg/L，羧節(jié)青霉素300 mg/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種草莓'紅顏'高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基，其特 征在于：各培養(yǎng)基每1L中MS培養(yǎng)基粉劑的用量為4. 4g ;草莓共培養(yǎng)培養(yǎng)基FMS2高壓滅菌 后冷卻至60°C分裝平板備用；草莓篩選培養(yǎng)基FMS3與草莓生根篩選培養(yǎng)基FMS4高壓滅菌 后冷卻至60°C加入卡那霉素、羧芐青霉素分裝培養(yǎng)瓶備用。
4. 利用權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基進(jìn)行草莓'紅顏'高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化方法，其特征 在于，該方法包括如下步驟： 1) 菌種活化：將含質(zhì)粒PK7WG2D農(nóng)桿菌EHA105在固體培養(yǎng)基上劃線，28 °C培養(yǎng)2天， 接種到液體培養(yǎng)基中于28 °C菌搖培養(yǎng)至0D600值為0. 4?0. 6,將菌液離心后倒去上層清 液，收集菌體沉淀，將收集的沉淀用MS液體培養(yǎng)基懸浮液重懸，重懸后測定菌液0D600值 為0. 2?0. 6,將重懸后的菌液放于冰箱備用； 2) 植物材料準(zhǔn)備：取在繼代培養(yǎng)基FMS1上繼代草莓'紅顏'組培苗的葉片，剪去剪去葉 尖和葉緣，剪成0. 4 cm2的葉塊； 3) 侵染：將菌液倒入剪好的葉片中，輕微搖勻，浸染40?60分鐘，侵染完成后倒出菌 液，將葉片在濾紙上吸干； 4) 共培養(yǎng)：侵染后的葉片接種在草莓'紅顏'共培養(yǎng)基FMS2中，25±2°C培養(yǎng)箱中黑暗 培養(yǎng)2?3天； 5) 篩選培養(yǎng)：將共培養(yǎng)2?3天的草莓'紅顏'的葉片，接種在篩選培養(yǎng)基FMS3上，在 培養(yǎng)室中25±2 °C，光照培養(yǎng)20?30天的時候，葉片邊緣有愈傷組織長出，檢測后保留抗 性愈傷，去除非抗性愈傷，將抗性愈傷經(jīng)過40?50天的培養(yǎng)，分化出植株，再次檢測保留整 個植株葉片和葉柄都呈抗性的抗性植株； 6) 生根培養(yǎng)：抗性植株長到2-3厘米高時，將抗性植株轉(zhuǎn)入草莓生根篩選培養(yǎng)基FMS4 上生根，獲得完整的抗性苗，檢測后保留抗性苗的葉片、葉柄以及根都呈抗性的植株。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的草莓'紅顏'高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述 步驟1)中，固體培養(yǎng)基為：LB固體培養(yǎng)基50 mL+壯觀霉素50mg /L+利福平100mg/ L ; 其中LB固體培養(yǎng)基配方：每一升LB固體培養(yǎng)基中包含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯 化鈉 l〇g以及瓊脂15g ; 液體培養(yǎng)基為：LB液體培養(yǎng)基50mL+壯觀霉素50mg /L+利福平lOOmg/ L ;其中LB液 體培養(yǎng)基配方：每一升LB液體培養(yǎng)基中包含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的草莓'紅顏'高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述 步驟1)中重懸后測定菌液濃度為0. 2?0. 3。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的草莓'紅顏'高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述 步驟2)中的葉片為幼嫩、平展的30天葉齡的葉片。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的草莓'紅顏'高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述 步驟3)浸染過程中每隔5分鐘搖動一次。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的草莓'紅顏'高效快速穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述 步驟5)、步驟6)中使用體式熒光顯微鏡檢測，觀察到綠光即呈抗性。
【文檔編號】C12N15/84GK104195171SQ201410473471
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】王媛花, 蔡善亞, 顏志明, 董慧, 楊寶林 申請人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院