一種鑒定文昌魚種類的aflp引物、接頭序列及其鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定文昌魚種類的AFLP引物、接頭序列及其鑒定方法。所述AFLP引物、接頭序列為SEQ?ID?NO:1-8，應(yīng)用所述AFLP引物、接頭序列即可進(jìn)行文昌魚種類的鑒定。當(dāng)結(jié)果中有109bp的特異性條帶的，即為白氏文昌魚；有120bp特異性條帶的，即為日本文昌魚。應(yīng)用本發(fā)明的引物進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增條帶結(jié)果清晰，條帶大小便于觀察，同時(shí)方法簡單，便于操作。
【專利說明】—種鑒定文昌魚種類的AFLP引物、接頭序列及其鑒定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒定文昌魚種類的AFLP引物及其鑒定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]文昌魚(Iancelet)，隸屬脊索動物門、頭索動物亞門、文昌魚科，是處于無脊椎動物向脊椎動物進(jìn)化的中間過渡類型，有“活化石”之稱，是研究脊椎動物起源和進(jìn)化的模式動物，具有極高的科研價(jià)值。同時(shí)，文昌魚還具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，蛋白質(zhì)含量高而脂肪含量低，且體內(nèi)還有含量較高的必需氨基酸、風(fēng)味氨基酸和豐富的脂溶性維生素。由于生境破壞和過度捕撈等的原因，文昌魚自然資源量急劇減少，已被列為國家二級保護(hù)動物。近十年來，我國文昌魚人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)獲得了重要進(jìn)展，為文昌魚規(guī)?；B(yǎng)殖奠定了基礎(chǔ)。
[0003]我國沿海有兩種文昌魚分布，即日本文昌魚和白氏文昌魚，從分布范圍上看，這兩種文昌魚之間沒有明顯的界限，有報(bào)道指出在廈門海域存在這兩種文昌魚，且在形態(tài)上這兩種文昌魚極其相似，很難從外形上將它們分開。因此需要一種穩(wěn)定、靈敏技術(shù)來鑒別文昌魚種類。
[0004]不同種生物其基因序列通常有著比較固定的差異，因此可以根據(jù)基因組DNA序列的不同進(jìn)行物種的鑒別，這種方法不受生物生長發(fā)育狀態(tài)及生態(tài)環(huán)境的影響，鑒別的準(zhǔn)確性很高。其中最可靠的的方法是克隆出來某個(gè)基因，但是測序操作復(fù)雜，成本也比較高。對于魚類已經(jīng)有人建立了抽提線粒體DNA，用多種限制性內(nèi)切酶對線粒體DNA進(jìn)行切割，根據(jù)酶切結(jié)果的差異識別與鑒定魚種類的方法，但這種方法需要較多的組織樣品來抽提線粒體DNA。PCR技術(shù)是一種非常靈敏的體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，但同時(shí)有很高的特異性，通過設(shè)計(jì)適宜的引物和控制適宜的反應(yīng)條件，利用它可以鑒別出受鑒定DNA上微小的序列差異。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定文昌魚種類的AFLP引物及其鑒定方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于鑒定文昌魚種類的AFLP引物及接頭序列，其特征在于，所述序列為SEQ ID N01-8。
[0007]本發(fā)明還提供一種鑒定文昌魚種類的方法，其特征在于，所述方法使用了所述引物及其接頭序列。
[0008]包括如下步驟，
[0009]文昌魚DNA提取并Mse I與EcoR I雙酶切得到酶切產(chǎn)物；
[0010]接頭序列的制備和連接得到連接產(chǎn)物；
[0011]預(yù)擴(kuò)增得到連接產(chǎn)物；
[0012]選擇性擴(kuò)增；
[0013]電泳檢測；
[0014]結(jié)果判斷，109bp處有特異性條帶的，即為白氏文昌魚；在120bp處有特異性條帶的，即為日本文昌魚。
[0015]所述接頭序列的制備和連接為，等量混合EcoR I adapter A即SEQ ID NO:1和 EcoR I adapter B 即 SEQ ID NO: 2，95°C變性 5min，立即于 37°C 復(fù)性 Ih 得到 EcoR Iadapter ;等量混合Mse I adapter A 即 SEQ ID N0:3和Mse I adapter B 即 SEQ ID NO:4,95°C變性5min,立即于37°C復(fù)性Ih得到Mse I adapter ;再進(jìn)行連接,連接體系如下，37°C反應(yīng)3.5h即可；
[0016]
成分用量
ddll.07? IpL
1 X T4 11 ga I i on biiffcr2.0 μ L
5 μΜ EcoR I adapter0.4 μ L
5 μ M Msc I adapterO, 4 μ L
5 U/μ L Τ4 DNA Iigasc0.1 μ L
所述游切產(chǎn)物I 0.0 μ L;
[0017]所述EcoR I adapter 的制備為:等量混合 SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2，95°C變性5min，立即于37°C復(fù)性Ih即可;
[0018]所述MseI adapter 的制備為:等量混合 SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4，95°C變性5min,立即于37°C復(fù)性Ih即可。
[0019]所述預(yù)擴(kuò)增的體系為
[0020]
,n14.4 U L

ddll.0
[0021]
1x Dream 含 Mg》的 Taq buffer2.0 μ L
10 mM dNTPs0.5pL
10 μ M SEQ ID NO; 50.5 μ L
10 μΜ SBQ ID NO: 6O, 5 μ L
5 11/ μ L Dream Taq 酶0.1 μ L
所述連接產(chǎn)物2.0pL
[0022]預(yù)擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性5min ;94°C變性30s，53 °C退火30s，72 °C延伸lmin，共20個(gè)循環(huán)；72°C延伸1min0
[0023]所述選擇性擴(kuò)增體系為，
[0024]JJttA14.4pL

ddli,0
1 X Dream 含 Mg'''的 Taq buffer2.0 μ L
10 mM dNTPs0.SpL
10 μM SEQ ID NO: 70.SpL
10 μΜ SEQ ID KO: 80.5 μ L
5 U/ μ L Dream Taq 酶0.1 μ L
預(yù)擴(kuò)增所得連接產(chǎn)物2.0 μ L
[0025]選擇性擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性5min ;94°C變性30s，65_56°C退火30s，每個(gè)循環(huán)下降1°C，72°C延伸lmin,共10個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin,共25個(gè)循環(huán)；72°C延伸1min0
[0026]本發(fā)明方法步驟為:
[0027]1.提取文昌魚肌肉組織基因組DNA。
[0028]2.用Mse I和EcoR I限制性內(nèi)切酶對文昌魚基因組DNA進(jìn)行雙酶切。
[0029]3.將人工合成的接頭在T4連接酶的作用下連接到酶切產(chǎn)物片段的兩端，形成帶有接頭的片段。EcoR I接頭序列為:5’ -CTCGTAGACTGCGTACC-3’ (SEQID NO:1)、5’ -AATTGGTACGCAGTCTAC-3’ (SEQ ID NO: 2) ；Mse I 接頭序列為:5，-GACGATGAGTCCTGAG-3’ (SEQ ID NO:3)、5，-TACTCAGGACTCAT-3，(SEQ ID NO:4)。接頭合成時(shí)是以DNA雙鏈的形式形成粘性末端，才能和雙酶切片段在T4連接酶的作用下連接。序列由上海捷瑞生物公司合成。
[0030]4.進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，EcoR I 預(yù)擴(kuò)增引物為 5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’ (SEQ ID NO:, 5),Mse I 預(yù)擴(kuò)增引物為 5，-GATGAGTCCTGAGTAAC-3，(SEQ ID NO:6)。反應(yīng)體系為 10-20 μ L，具體為:連接產(chǎn)物0.5-1 μ L5IXPCR緩沖液(含Mg2+) ；dNTPs 0.2mM ;預(yù)擴(kuò)增引物各0.25 μ M ;Taq 酶 0.5-1U。反應(yīng)程序:94°C變性 5min ;94°C變性 30s，53。。退火 30s，72。。延伸 lmin,共20個(gè)循環(huán)；72°C延伸1min。
[0031 ] 5.選擇性擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍后進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，用E-AGT/M-CTG選擇性引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)總體系為10-20 μ L，具體為預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物0.1-0.2 μ L ;
IXPCR緩沖液(含Mg2+) ；dNTPs 0.2mM ；Mse I和EcoR I選擇性擴(kuò)增引物各0.25 μ M ;Taq酶
0.5-1U。反應(yīng)程序:94°C變性5min ;94°C變性30s，65_56°C退火30s (每個(gè)循環(huán)下降1°C )，72°C延伸lmin，共10個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，共25個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
[0032]6.PCR產(chǎn)物檢測，將所得到的選擇性PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行電泳，觀察，在109bp處有特異性條帶的，即為白氏文昌魚；在120bp處有特異性條帶的，即為日本文昌魚。
[0033]本發(fā)明的引物是發(fā)明人通過長時(shí)間才篩選出來，利用45對選擇性引物組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，去掉結(jié)果不佳的引物，比如條帶缺失嚴(yán)重的結(jié)果；最終篩選出9對擴(kuò)增條帶清晰、豐富的引物組合。
[0034]應(yīng)用本發(fā)明的引物進(jìn)行檢測，結(jié)果清晰，條帶大小便于觀察。同時(shí)方法簡單，便于操作。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1是不同來源文昌魚DNA鑒定銀染電泳圖。

【具體實(shí)施方式】
[0036]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0037]實(shí)施例1:
[0038]1、文昌魚基因組DNA提取
[0039]用采自青島、廈門和北海海域的文昌魚樣本提取DNA，取文昌魚肌肉組織30mg，研磨，用蛋白酶K-苯酚-氯仿法或DNA提取試劑盒提取總DNA，然后用超純水溶解。
[0040]2、酶切與連接
[0041]⑴酶切
[0042]使用限制性內(nèi)切酶Mse I與EcoR I對上述提取的DNA進(jìn)行雙酶切。第一步酶切，體系18yL，65°C反應(yīng)3h。具體如下:
[0043]
成分用量(μ[)
d_11.9
1x Tango buffer4.0
Msc I (10 U/ μ L)0.1
DNA (100 ng/ μ L )2.0
[0044]酶切第二步，體系20yL，37°C反應(yīng)3h。具體如下
[0045]
成分用量(μ L)
ddll.01,9
EcoR I (10 ?/μL)0.1
第一步酶切產(chǎn)物18.0
[0046]酶切產(chǎn)物80°C滅活20min，用I %瓊脂糖凝膠電泳檢酶切產(chǎn)物。
[0047](2)接頭制備與連接
[0048]接頭制備:EcoRI adapter 制備，等量混合 EcoR I adapter A 和 EcoR I adapterB,95°C變性5min,立即于37°C復(fù)性lh。Mse I adapter的制備方法同上。
[0049]連接反應(yīng)總體系20yL，37°C反應(yīng)3.5h，得到連接產(chǎn)物。具體如下:
[0050]成分用量(μ U
ddll.07.1
K) X Τ4 ligai 1n buffer2.0
EcoR I adapter (5 μΜ)0.4
Msc / adapter (5 μΜ)0.4
T4 DNA ligase (5 U/pL)0.1
酶切產(chǎn)物10.0
[0051]接頭序列:
[0052]
EcoR I adapter A CTCGTAGACTGCGTACC SEQ ID NO:1
EcoR I adapter B AATTGGTACGCAGTCTAC SEQ ID NO:2
Mse I adapter A CACGATGACTCCTGAGSEQ ID NO: 3
Msc I adapter B TACTCAOGACTCATSEQ ID NO: 4
[0053]3、預(yù)擴(kuò)增
[0054]預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 μ L，具體如下:
[0055]
成分用量(μ U
[0056]
d_14.4
10 X Dream Taq buffer (含 MgJ+)2.0
dNTPs (10 _0.5
EcoR /?妒引物(10 μ Μ)0.5
Mse I 預(yù)擴(kuò)引物(10 μ Μ)0.5
Dream Taq 酶(5 U/ μ L)0.1
[0057]預(yù)擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序:94°C變性5min ;94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸lmin，共20個(gè)循環(huán)；72°C延伸1min0
[0058]預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，用ddH20稀釋10倍，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0059]EcoR I 預(yù)擴(kuò)引物 GACTGCGTACCAATTCA SEQ ID N0:5
[0060]Mse I 預(yù)擴(kuò)引物 GATGAGTCCTGAGTAAC SEQ ID NO:6
[0061]4、選擇性擴(kuò)增
[0062]選擇性擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 μ L，具體如下:
[0063]

【權(quán)利要求】
1.一種用于鑒定文昌魚種類的AFLP引物及接頭序列，其特征在于，所述序列為SEQ IDN01-8。
2.一種鑒定文昌魚種類的方法，其特征在于，所述方法使用了權(quán)利要求1的引物和接頭序列。
3.權(quán)利要求2所述鑒定文昌魚種類的方法，其特征在于，包括如下步驟， 文昌魚DNA提取并Mse I與EcoR I雙酶切得到酶切產(chǎn)物； 接頭序列的制備和連接得到連接產(chǎn)物； 預(yù)擴(kuò)增得到連接產(chǎn)物； 選擇性擴(kuò)增； 電泳檢測； 結(jié)果判斷，109bp處有特異性條帶的，即為白氏文昌魚；在120bp處有特異性條帶的，即為日本文昌魚。
4.權(quán)利要求3所述鑒定文昌魚種類的方法，其特征在于，所述接頭序列的制備和連接為，等量混合 EcoR I adapter A 即 SEQ ID NO:1 和 EcoR I adapter B 即 SEQ ID NO: 2，95°C變性5min,立即于37°C復(fù)性Ih得到EcoR I adapter ;等量混合Mse I adapter A即SEQ ID N0:3 和 Mse I adapter B 即 SEQ ID N0:4，95°C變性 5min，立即于 37°C復(fù)性 Ih 得到Mse I adapter ;再進(jìn)行連接,連接體系如下，37°C反應(yīng)3.5h即可；成分用量d_7.1 μ L1 X Τ4 Ii gai1n bufFcr2.0 μ L5 μ M EcoR I adapter0, 4 μ L5 μ M Msc I adapter0.4 μ L5 U/ μ L Τ4 MA Iigasc0.1 μ L所述酶切產(chǎn)物10.ΟμΙ; 所述EcoR I adapter的制備為:等量混合SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2，95°C變性5min,立即于37°C復(fù)性Ih即可； 所述Mse I adapter 的制備為:等量混合SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4，95°C變性5min，立即于37°C復(fù)性Ih即可。
5.權(quán)利要求3所述鑒定文昌魚種類的方法，其特征在于，所述預(yù)擴(kuò)增的體系為，




14, 4 μ L

ααΙΙ,-Ο1 X Dm 遺含 Mg》的 Taq buffer2, O μL10 mM dNTPs0.5 μ L10 μΜ SEQ ID NO: 5O? 5μΙ10 μM SEQ ID NO: 60.5μΙ5 U/ μL Dream Taq 酶O, I μL所述連接產(chǎn)物2.ΟμΙ預(yù)擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性5min ;94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸lmin，共20個(gè)循環(huán)；72°C延伸1min。
6.權(quán)利要求3所述鑒定文昌魚種類的方法，其特征在于，所述選擇性擴(kuò)增體系為，
選擇性擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性5min ;94°C變性30s，65_56°C退火30s，每個(gè)循環(huán)下降1°C，72°C延伸lmin,共10個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，56。。退火30s，72。。延伸lmin，共25個(gè)循環(huán)；72°C延伸1min。
【文檔編號】C12N15/11GK104178569SQ201410393618
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】黎中寶, 戴剛 申請人:集美大學(xué)