一種青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列合成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法，包括以下步驟:（1）綿羊線粒體Cytb全序列的收集及與近緣線粒體Cytb序列的比對；（2）引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增；（3）PCR產(chǎn)物測序與序列組裝。本發(fā)明獲得了青藏高原15個藏羊地方品種642個個體的mtDNA?Cytb全序列。本發(fā)明的檢測方法具有速度快、成本低、易掌握等優(yōu)點，所獲得的mtDNA?Cytb全序列可應(yīng)用于青藏高原藏羊遺傳資源多樣性評估、遺傳變異分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析、母系起源和系統(tǒng)發(fā)育研究及種質(zhì)資源鑒定與保護(hù)等領(lǐng)域。
【專利說明】—種青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于綿羊基因組學(xué)領(lǐng)域,具體涉及一種青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002]家畜遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是畜牧業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)。通過研究家畜的遺傳多樣性可以進(jìn)一步了解家畜遺傳多樣性的豐富程度和品種遺傳的獨特性程度，為合理開發(fā)利用家畜遺傳資源提供依據(jù)，還可以為物種多樣性的保護(hù)提供依據(jù)。
[0003]綿羊的線粒體基因組DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)呈典型的閉合環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，長度為15.6kb，能夠自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。線粒體DNA(mtDNA)是核外遺傳物質(zhì)，具有分子量較小、進(jìn)化速度快、無組織特異性及嚴(yán)格的母系遺傳等特性，在近緣種間和種內(nèi)群體間具有豐富的多態(tài)性，是研究物種起源進(jìn)化、分類的有力工具。根據(jù)堿性氯化銫密度梯度離心中雙鏈密度不同可將mtDNA的兩條鏈分為重鏈(H)和輕鏈(L),兩條鏈都參與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。對綿羊線粒體基因 組的結(jié)構(gòu)分析表明，mtDNA可分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)。編碼區(qū)內(nèi)含37個基因，包括13個蛋白質(zhì)基因，2個rRNA基因，22個tRNA基因。其中13個蛋白質(zhì)編碼基因分別是細(xì)胞色素b基因(Cytb)、細(xì)胞色素C氧化酶三個亞基1、II和III基因(Co I ,Co II和Co III)，ATP 合成酶亞基基因(ATPase 6 和 ATPase 8)和 7 個 NADH 酶亞基 ND 1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6和ND4L ；2個rRNA基因分別是12s rRNA基因和16s rRNA基因，緊緊相鄰；線粒體的12S rRNA和16S rRNA基因位于H鏈的tRNA Phe和tRNA Leu基因之間，以tRNAVal基因為間隔，12S rRNA基因比16S rRNA基因更保守。22個tRNA基因位于rRNA和13個蛋白質(zhì)基因之間。除了 ND6和8個tRNA基因在L鏈編碼外，其余大多數(shù)蛋白質(zhì)編碼基因和2個rRNA基因都是由H鏈編碼。
[0004]Cytb是構(gòu)成線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)復(fù)合體III的蛋白質(zhì)之一，由位于線粒體基因重鏈(富含G)的核昔酸編碼得來，并由8個橫跨膜的螺旋組成，這些螺旋與一個或二個血紅素b基團(tuán)結(jié)合，它是唯一由線粒體基區(qū)編碼的蛋白質(zhì)。Cytb在不同的氧化還原過程中有著不同的特性和功能，它是線粒體呼吸鏈上進(jìn)行電子傳遞的細(xì)胞色素之一，與蛋白1、蛋白II組成復(fù)合體III的核心蛋白，該核心蛋白并沒有位于復(fù)合體III的氧化還原中心，但對其中心成員的正確裝配和集聚起重要作用。Cytb基因的結(jié)構(gòu)和功能在mtDNA的13個蛋白質(zhì)編碼基因中是被了解得最為清楚的一個，它的期望分子量為42.7KD，且能用一些通用引物擴(kuò)增。Cytb基因含有大約1140個堿基(1140bp)，不發(fā)生缺失和(或)插入，堿基置換多數(shù)是沉默的，且很大程度上傾向于轉(zhuǎn)換或顛換，并且密碼子第三位點進(jìn)化最快，而密碼子第二位點最保守。該基因的mRNA以一個含有4對核苷酸、5-prime的非編碼區(qū)開頭，緊接著是啟動子AUG’末端是終止子UAA的U堿基，側(cè)面與tRNAelu和tRNAThr相接，這些tRNA在轉(zhuǎn)錄過程中被剪切掉。Cytb基因含離散性性狀，進(jìn)化速率較快、較慢的氮基酸密碼子位點并存，Cytb基因序列第三位點替換速率遠(yuǎn)大于第一、第二位點，擁有可變區(qū)與保守區(qū)，如膜內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)，作為蛋白質(zhì)編碼基因有一定的保守性，同源性高。[0005] Cytb蛋白分為三個功能區(qū):膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)?？缒^(qū)核苷酸突變顯著低于膜內(nèi)和膜外區(qū)，跨膜區(qū)對功能起關(guān)鍵作用的氨基酸占很大比例，哺乳動物在Cytb跨膜區(qū)包括105個氨基酸殘基，這些殘基在多細(xì)胞動物中大約2996是完全或接近保守的，在大部分多細(xì)胞動物中功能基本相同；而位于線粒體膜內(nèi)表面的膜內(nèi)區(qū)有很少殘基，只包含大約65個氨基酸殘基，其中極性較強(qiáng)而保守性較弱的氨基酸殘基占很大比例，這些極性氨基酸殘基仍有一定程度的變異。有人推測這些氨基酸執(zhí)行Ql氧化還原中心的質(zhì)子輸入功能，不過，大多數(shù)殘基功能仍不清楚，該區(qū)的變異位點與其它兩個區(qū)相比較，屬中等突變率；膜外區(qū)由大約209個氨基酸殘基組成，整個區(qū)域呈現(xiàn)明顯疏水性，而且，該區(qū)的氨基酸替換多數(shù)以疏水性氨基酸為主，如亮氨酸、異亮氨酸和緣氨酸，膜外區(qū)19%的氨基酸殘基在大多數(shù)細(xì)胞中接近保守，維持著該區(qū)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。Cytb蛋白是氧化還原復(fù)合體中重要的一部分，其中苯醌的氧化還原作用接觸反應(yīng)位點是發(fā)揮氧化還原功能最關(guān)鍵的部位，由輔酶Q識別兩個苯醌反應(yīng)接觸位點，尤其是接近Q1-苯酮還原位點和Q。-對二苯酮氧化位點相連的部位，其結(jié)構(gòu)極其保守，本身對一些微小的突變極度敏感，該位點稍有變異即影響呼吸功能。
[0006]藏羊主要有高原型(草地型)、山谷型和歐拉型三大類，各地根據(jù)其自然生態(tài)特點又細(xì)分為不同的類型，屬粗毛型綿羊地方品種。藏羊原產(chǎn)于青藏高原，主要分布于西藏自治區(qū)及青海、甘肅、四川、云南、貴州等地，由于各生態(tài)條件差異懸殊，形成了不同的類型。草地型(高原型)藏羊是主體，數(shù)量最多，主要分布于西藏境內(nèi)的網(wǎng)底斯山、念青唐古拉山以北的藏北高原和雅魯藏布江地帶；青海的藏羊主要分布在海北藏族自治州、海南藏族自治州、海西蒙古族哈薩克自治州、黃南藏族自治州、玉樹藏族自治州、果洛藏族自治州六州的廣闊高寒牧區(qū)；甘肅的甘南藏族自治州的各縣市藏羊的主要分布區(qū)域；四川境內(nèi)的藏羊分布在甘孜藏族自治州、阿壩藏族羌族自治州北部牧區(qū)。山谷型藏羊主要分布在青海省南部的班瑪、囊謙兩縣的部分地區(qū)，四川省阿壩藏族羌族自治州南部牧區(qū)，云南的昭通市、曲靖市、麗江市及保山市騰沖縣。歐拉型藏羊是藏系綿羊的一個特殊生態(tài)類型，中心產(chǎn)區(qū)位于甘肅省甘南藏族自治州的瑪曲縣歐拉鄉(xiāng)及比鄰地區(qū)及青海省河南蒙古族自治縣和久治縣等地。研究藏羊起源和進(jìn)化可以說明古今綿羊的關(guān)系，更好的解決育種、改良、選種和保種問題。通過對藏羊遺傳多樣性、系統(tǒng)進(jìn)化、母系起源的研究和認(rèn)識，不但可以調(diào)查藏羊品種遺傳資源背景狀況，而且可確定品種遺傳特征，了解各群體間的親緣關(guān)系，準(zhǔn)確區(qū)分品種，進(jìn)而為育種工作提供重要依據(jù)。因此，有必要開展藏羊mtDNA Cytb全序列研究，從基因水平揭示其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和種群遺傳多樣性水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提出一種速度快、成本低、易掌握的青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列及檢測方法，已解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
一種青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列合成方法,包括以下步驟:
(1)綿羊mtDNACytb全序列的收集與分析:
收集綿羊mtDNA Cytb全序列，并與近緣種的mtDNA Cytb全序列進(jìn)行比對，分析mtDNA Cytb全序列在近緣種的mtDNA全基因組序列上的相對位置；
(2)引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增:根據(jù)mtDNA Cytb基因在近緣種全基因組序列保守區(qū)域設(shè)計上、下游PCR引物，采用PCR方法擴(kuò)增相鄰的兩個已知序列的未知序列，其中，所述PCR弓丨物和測序弓丨物I對，其引物序列為:
Forward primer:5， -TGAAGAAAACCCCACAAAACCT -3，
Reverse primer:5’ -TTGGGTGTTGATAGTGGGGC-3J ；
(3)PCR產(chǎn)物測序與序列組裝:
通過PCR產(chǎn)物測序反應(yīng)體系對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序、序列分析，將mtDNA Cytb序列進(jìn)行組裝，獲得mtDNA Cytb全序列。
[0009]步驟(1)中，所述綿羊mtDNA Cytb全序列的獲得方法有三種:一種是從測序獲得的基因組文庫或轉(zhuǎn)錄組文庫中查找；另一種是從GenBank數(shù)據(jù)庫中公開的綿羊基因序列中查找；第三種是通過收集近緣種的mtDNA Cytb全序列進(jìn)行同源比對，在保守區(qū)設(shè)計簡并引物，然后以藏羊的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序后獲得青藏高原15個藏羊地方品種642個個體mtDNA Cytb全序列。
[0010]步驟(1)中，所述近緣種為盤羊、東方盤羊和歐洲摩弗倫羊中。
[0011]步驟(2)中，所述PCR方法中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為30uL，包括基因組DNA模板2 uL、IOXBuffer 3 uL、2.5 mM dNTP 2 uL、Taq DNA 聚合酶(λ 2 uL、3 pM 上下游引物各 3 uL、滅菌雙蒸水16.8 uL ；PCR反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性5分鐘、94°C變性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸90秒、36個循環(huán)、 72°C延伸10分鐘，12°C保存。
[0012]步驟(3)中，所述PCR產(chǎn)物測序反應(yīng)體系為5 uL，包括基因組DNA模板(30-50 ng)3 uL、3 pM測序引物I uL、Bigdye 0.5 uL、滅菌雙蒸水0.5 uL ;PCR測序反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性120秒、95°C變性10秒、51°C退火10秒、60°C延伸190秒、25個循環(huán)，12°C保存。
[0013]步驟(3)中，所述PCR產(chǎn)物的測序方法為雙向、直接測序。
[0014]步驟(3)中，所述mtDNA Cytb序列組裝方法是:以盤羊、東方盤羊、歐洲摩弗倫羊的mtDNA Cytb全序列為參照物，將所有15個藏羊地方品種642個個體的mtDNA Cytb序列進(jìn)行拼接，獲得青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列,所述青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列長度均為1140bp。
[0015]綜上所述，本發(fā)明有益效果:
1、本發(fā)明的檢測方法具有速度快、成本低、易掌握等優(yōu)點，能夠有效檢測出青藏高原藏羊的mtDNA Cytb全序列，從而為青藏高原藏羊分子遺傳學(xué)及分子系統(tǒng)進(jìn)化學(xué)研究提供有效的研究平臺。
[0016]2、本發(fā)明提供的青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列可應(yīng)用于藏羊遺傳資源多樣性評估、遺傳變異分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析、母系起源和系統(tǒng)發(fā)育研究及種質(zhì)資源鑒定與保護(hù)等領(lǐng)域。
【具體實施方式】
[0017]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。[0018]實施例1
一種青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列合成方法,包括以下步驟:
(1)綿羊mtDNACytb全序列的收集與分析
首先，本發(fā)明從測序獲得的基因組文庫中篩選青藏高原藏羊mtDNA Cytb相關(guān)基因序列，一方面從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索青藏高原藏羊mtDNA Cytb相關(guān)基因；然后，將收集到的青藏高原藏羊mtDNA Cytb相關(guān)基因序列與近緣種盤羊、東方盤羊、歐洲摩弗倫羊的mtDNA Cytb全序列進(jìn)行比對,分析相關(guān)基因在近緣種mtDNA Cytb全序列上的相對位置；
(2)引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增
根據(jù)藏羊mtDNA Cytb全序列在近緣種基因組序列上的相對位置，以藏羊基因組為模板設(shè)計引物，采用PCR方法擴(kuò)增相鄰的兩個已知基因間的未知序列；PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為30uL，包括基因組DNA模板 2 uLUO XBuffer 3 uL、2.5 mM dNTP 2 uL、Taq DNA聚合酶0.2uL、3 pM上下游引物各3 uL、滅菌雙蒸水16.8 uL ;PCR反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性5分鐘、94°C變性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸90秒、36個循環(huán)、72°C延伸10分鐘，最后12°C保存；PCR反應(yīng)完成后，采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的質(zhì)量；
(3)PCR 產(chǎn)物測序與序列組裝
PCR產(chǎn)物測序反應(yīng)體系為5 uL，包括基因組DNA模板(30-50 ng) 3 uL、3 pM測序引物I uL、Bigdye 0.5 uL、滅菌雙蒸水0.5 uL ;PCR測序反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性120秒、95°C變性10秒、51°C退火10秒、60°C延伸190秒、25個循環(huán)，12°C保存。
[0019]將上述PCR產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行雙向、直接測序。將每個PCR產(chǎn)物的雙向測序結(jié)果拼接為一條完整的序列。然后以盤羊、東方盤羊、歐洲摩弗倫羊的mtDNA Cytb全序列為參照序列，將所有的mtDNA基因進(jìn)行組裝。最后組裝獲得藏羊15個地方綿羊品種642個個體mtDNA Cytb全序列。
[0020]對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0021]此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。
【權(quán)利要求】
1.一種青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列合成方法,其特征是,包括以下步驟: (1)綿羊mtDNACytb全序列的收集與分析: 收集綿羊mtDNA Cytb全序列，并與近緣種的mtDNA Cytb全序列進(jìn)行比對，分析mtDNA Cytb全序列在近緣種的mtDNA全基因組序列上的相對位置； (2)引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增: 根據(jù)mtDNA Cytb基因在近緣種全基因組序列保守區(qū)域設(shè)計上、下游PCR引物，采用PCR方法擴(kuò)增相鄰的兩個已知序列的未知序列，其中，PCR引物和測序弓丨物I對，其引物序列為:
Forward primer:5，-TGAAGAAAACCCCACAAAACCT -3，
Reverse primer:5’ -TTGGGTGTTGATAGTGGGGC-3’ ； (3)PCR產(chǎn)物測序與序列組裝: 通過PCR產(chǎn)物測序反應(yīng)體系對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序、序列分析，將mtDNA Cytb序列進(jìn)行組裝，獲得mtDNA Cytb全序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法,其特征是，步驟(1)中，所述綿羊mtDNA Cytb全序列的獲得方法有三種:一種是從測序獲得的基因組文庫或轉(zhuǎn)錄組文庫中查找；另一種是從GenBank數(shù)據(jù)庫中公開的綿羊基因序列中查找；第三種是通過收集近緣種的mtDNA Cytb全序列進(jìn)行同源比對，在保守區(qū)設(shè)計簡并引物，然后以藏羊的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序后獲得青藏高原15個藏羊地方品種642個個體mtDNA Cytb 全序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法,其特征是，步驟(1)中，所述近緣種為盤羊、東方盤羊和歐洲摩弗倫羊。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法,其特征是，步驟(2)中，所述PCR方法中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為30uL，包括基因組DNA模板2 uL、IOXBuffer 3 uL、2.5 mM dNTP 2 uL、Taq DNA 聚合酶(λ 2 uL、3 pM 上下游引物各 3 uL、滅菌雙蒸水16.8 uL ；PCR反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性5分鐘、94°C變性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸90秒、36個循環(huán)、72°C延伸10分鐘；最后12°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法,其特征是，步驟(3)中，所述PCR產(chǎn)物測序反應(yīng)體系為5 uL，包括基因組DNA模板(30-50 ng) 3 uL、3pM測序引物I uL、Bigdye 0.5 uL、滅菌雙蒸水0.5 uL ;PCR測序反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性120秒、95°C變性10秒、51°C退火10秒、60°C延伸190秒、25個循環(huán)、12°C保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法,其特征是，步驟(3)中，所述PCR產(chǎn)物的測序方法為雙向、直接測序。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法，其特征是，步驟(3)中，所述mtDNA Cytb序列組裝方法是:以盤羊、東方盤羊和歐洲摩弗倫羊的mtDNA Cytb全序列為參照物，將所有15個藏羊地方品種642個個體的mtDNA Cytb序列進(jìn)行拼接，獲得青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青藏高原藏羊mtDNACytb全序列合成方法,其特征是，所述青藏高原藏羊mtDNA Cytb全序列長度均為1140bp。
【文檔編號】C12N15/10GK103952421SQ201410187687
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】劉建斌, 孫曉萍, 王凡, 曾玉峰, 郭健, 岳耀敬, 楊博輝, 張萬龍, 郎俠, 馮瑞林, 郭婷婷, 牛春娥, 王宏博 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所