一種5’端tRNA半分子檢測(cè)方法
【專利摘要】本項(xiàng)發(fā)明是一種涉及檢測(cè)生物或醫(yī)學(xué)樣品中5′端tRNA半分子的方法。該檢測(cè)方法的特征在于其是基于poly(A)加尾、DNA探針雜交、RNase?H消化、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)5′端tRNA半分子。本方法可用于生物或醫(yī)學(xué)樣品中5′端tRNA半分子的檢測(cè)分析。
【專利說(shuō)明】—種5’端tRNA半分子檢測(cè)方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】本發(fā)明涉及一種tRNA半分子(half-tRNA)的檢測(cè)方法，本方法可用于tRNA半分子的檢測(cè)分析以及臨床標(biāo)本檢測(cè)。
[0002]【背景技術(shù)】tRNA將DNA的遺傳密碼翻譯成蛋白質(zhì)，tRNA在蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)tRNA分子還有許多其他的重要生物學(xué)功能，特別是在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用(李盛等.tRNA核質(zhì)動(dòng)態(tài)分布與細(xì)胞命運(yùn).生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，36 (3):265-268)。我們?cè)诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)血管生成素(angiogenin)是細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下切割生成tRNA半分子的核酸酶，其在tRNA的反密碼子環(huán)處對(duì)tRNA分子進(jìn)行切割，生成tRNA半分子，證實(shí)了 tRNA半分子的生成參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程(Fu H，et al.Stress induces tRNA cleavage by angiogenin in mammalian cells.Febs Lett，2009, 583(2):437-442)。越來(lái)越多的研究已經(jīng)表明tRNA半分子存在的普遍性，并具有多種潛在的生物學(xué)功能(Thompson DM, et al.Stressing out overtRNA cleavage.Cell,2009, 138(2):215-219)。特別是在血清中發(fā)現(xiàn)了 tRNA半分子的廣泛存在(Dhahbi JM, etal.5' tRNA halves are present as abundant complexes in serum, concentrated inblood cells, and modulated by aging and calorie restriction.BMC Genomics,2013,14:298)，這表明tRNA半分子可能作為新的信號(hào)分子參與生物學(xué)過(guò)程，并在疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。tRNA半分子將是極有價(jià)值的新型疾病檢測(cè)的生物標(biāo)志物分子。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法對(duì)tRNA半分子的功能研究和臨床檢測(cè)均具有重要價(jià)值。
[0003]由于tRNA半分子只有30nt左右大小，同時(shí)細(xì)胞和組織中含有大量的全長(zhǎng)的tRNA分子，檢測(cè)比較困難。目前主要是采用Northern blot雜交和測(cè)序的方法進(jìn)行檢測(cè)，方法繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，需要放射性同位素，且不易成功，尤其是不適于臨床大樣本的檢測(cè)分析。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā) 明的目的是建立一種檢測(cè)5'端tRNA半分子的簡(jiǎn)便方法，用于5'端tRNA半分子的檢測(cè)，避免放射性同位素的使用。本發(fā)明的5'端tRNA半分子檢測(cè)方法，其特征在于其是基于分離純化的細(xì)胞和組織總RNA，經(jīng)多核苷酸聚合酶在RNA分子3，端進(jìn)行Poly (A)加尾，再與DNA探針雜交，后經(jīng)RNase H消化與DNA探針互補(bǔ)的RNA序列，再由oligo (dT)12_3C1-錨定引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,以5'端tRNA半分子和錨定引物的序列為PCR反應(yīng)的上下游引物，擴(kuò)增檢測(cè)5'端tRNA半分子。
[0005]端tRNA半分子檢測(cè)方法包括五個(gè)主要步驟:(l)tRNA半分子的poly⑷加尾；⑵DNA探針與tRNA分子雜交；(3) RNase H消化與DNA探針雜交的tRNA序列；(4)由oligo (dT)12_3Q-錨定引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；(5) PCR擴(kuò)增反應(yīng)。DNA探針的長(zhǎng)度為13-30個(gè)堿基的與待檢測(cè)的tRNA分子的3'端序列互補(bǔ)的寡聚DNA分子，其3'端的羥基被修飾，修飾基團(tuán)可以是磷酸基團(tuán)或甲氧基等。在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所用引物反轉(zhuǎn)錄olig0(dT)12_3(l-錨定引物長(zhǎng)度為40-60nt，5'端為20-30nt的錨定序列，3'端為12_30nt的dT，在3'末端加上兩個(gè)堿基的(A、G或C)/(A、G、C或T)，最后兩個(gè)堿基起錨定作用。PCR擴(kuò)增使用的上游引物是待檢測(cè)5'端tRNA半分子序列的寡聚DNA片段，下游引物是與反轉(zhuǎn)錄引物的錨定引物片段序列相同的寡聚DNA片段。
[0006]為了進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，檢測(cè)反應(yīng)中使用的PCR擴(kuò)增引物可以進(jìn)行包括熒光分子、生物素和地高辛等分子的修飾，也可以在PCR反應(yīng)體系中可以加入熒光染料或分子信標(biāo)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。
[0007]為了檢測(cè)使用方便，可依據(jù)本方法組裝成試劑盒使用，試劑盒由RNA加Poly㈧尾反應(yīng)系統(tǒng)、RNase H消化系統(tǒng)、反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和PCR擴(kuò)增系統(tǒng)和對(duì)應(yīng)的引物組成，該試劑盒包括:1)多聚核苷酸聚合酶，及其反應(yīng)緩沖液；2)RNase H，雜交用DNA探針，反應(yīng)緩沖液；3)反轉(zhuǎn)錄酶，及其反應(yīng)緩沖液；4) Taq酶，及其反應(yīng)緩沖液；5)反轉(zhuǎn)錄oligo (dT)n錨定引物、錨定引物和5'端tRNA半分子擴(kuò)增用引物。
[0008]由于5'端tRNA半分子擴(kuò)增后DNA片段較小，可用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析PCR反應(yīng)產(chǎn)物。電泳結(jié)束后，可以用EB染色和銀染的方法染色觀察。在PCR反應(yīng)體系中還可以加入內(nèi)對(duì)照引物進(jìn)行半定量PCR反應(yīng)，或?qū)CR引物進(jìn)行熒光分子標(biāo)記或加入熒光染料進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)分析。
[0009]本方法可用于5'端tRNA半分子檢測(cè)分析，以及臨床標(biāo)本的檢驗(yàn)。
[0010]本發(fā)明用下列實(shí)施例進(jìn)行解釋，這些實(shí)施例的目的只是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。
[0011]結(jié)合【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】本發(fā)明的具體實(shí)施方法。
[0012]圖1:5'端tRNA半分子檢測(cè)方法原理示意圖
實(shí)施例
[0013]實(shí)施例一
[0014]檢測(cè)細(xì)胞中5'端tRNA半分子
[0015]以檢測(cè)HeLa 細(xì)胞中 5' half-tRNA-Gly-GCC 為例。
[0016]1.相關(guān)引物設(shè)計(jì)
[0017](1)5 ; half-tRNA-Gly-GCC 片段:5 ' -GCATTGGTGGTTCAGTGGTAG-3 '，為 5'端PCR引物。
[0018](2) tRNA-Gly-GCC 的 DNA 雜交探針:5' -ATTGGCCAGGAATCGAAGCCCGGCCGCCCGC-3',?>'末端磷酸化修飾，用于與tRNA-Gly-GCC3,端雜交。
[0019](3)反轉(zhuǎn)錄 oligo (dT) Π-錨定引物:5' -GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG (T)18VN-3'，其中 V 為 A、G 或 C，N 為 A、G、C 或 Τ。
[0020](4)錨定引物:5' -GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'，為 3'端 PCR 引物。
[0021]2.RNA3'端加 Poly ⑷尾
[0022]以HeLa細(xì)胞為材料，用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取總RNA。取總RNAlO μ g，分別加入 5 μ IlOXPoly(A)聚合酶緩沖液，0.5 μ I ATP (10mmol/L), 0.5 μ IPoly(A)聚合酶(5000U/ml) (NEB公司)，DEPC水補(bǔ)至50μ 1，于37°C水浴I小時(shí)。然后采用酚-氯仿和乙醇沉淀法純化回收RNA，加入20 μ I水充分溶解RNA沉淀。
[0023]3.特異DNA探針雜交及RNase H消化
[0024]取5μ g加尾 RNA，gp 10 μ I 上述 RNA產(chǎn)物，加入 2.5 μ 120ymol/L tRNA-Gly-GCC 的DNA雜交特異探針，1.5 μ 15 X反應(yīng)緩沖液。于70°C 5min，后室溫放置5min。再加入I μ IRNase H(60u/ μ 1，TaKaRa 公司)，于 30°C反應(yīng) 30min。消化全長(zhǎng)的 tRNA-Gly-GCC 分子。
[0025]4.5' half-tRNA 反轉(zhuǎn)錄[0026]使用ImProm-1I?反轉(zhuǎn)錄試劑盒(promega公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取3μ1上述反應(yīng)液，加入I U g反轉(zhuǎn)錄oligo (dT)η-錨定引物，加水補(bǔ)至5 μ I。于70°C加熱5min,冰浴5min。分別加入4 μ 15 X反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，2.5 μ I MgCl2 (2.5mmol/l)，I μ IdNTP(10mmol/L),0.5μ I RNase 抑制劑，0.5 μ I 反轉(zhuǎn)錄酶，以及 6.5 μ I 水，混勻。于 25°C 放置15min，于42°C反應(yīng)30min，之后于70°C溫浴15min。
[0027]5.PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳分析
[0028]于20 μ IPCR反應(yīng)體系中分別加入5' half-tRNA-Gly-GCC弓丨物，以及3'端錨定引物各 0.5 μ l(10ymol/L)，I μ I cDNA,8y I 水，再加入 10 μ 12 X Taq Mix(GenStar)。按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增:94°C 2分，94°C 10秒、58°C 10秒、72°C 30秒，25個(gè)循環(huán)。取1 μ IPCR產(chǎn)物行10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后進(jìn)行結(jié)果分析。在約83bp處可見(jiàn)擴(kuò)增條帶，即為擴(kuò)增得到的5' half-tRNA-Gly-GCC片段。
【權(quán)利要求】
1.一種5'端tRNA半分子檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法的特征在于其是基于分離純化的細(xì)胞和組織總RNA，經(jīng)多核苷酸聚合酶在RNA分子3'端進(jìn)行Poly (A)加尾，再與DNA探針雜交，后經(jīng)RNase H消化與DNA探針互補(bǔ)的RNA序列，再由oligo (dT) 12_3(|_錨定引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以5'端tRNA半分子和錨定引物的序列為PCR反應(yīng)的上下游引物，擴(kuò)增檢測(cè)5'端tRNA半分子。
2.權(quán)利要求1中所述方法包括五個(gè)主要步驟:(I)tRNA半分子的poly (A)加尾；(2) DNA探針與tRNA分子雜交；(3) RNase H消化與DNA探針雜交的tRNA序列；(4)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；(5)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
3.權(quán)利要求1中所述的DNA探針的特征在于長(zhǎng)度為13-30個(gè)堿基的與待檢測(cè)的tRNA分子的3'端序列互補(bǔ)的寡聚DNA分子，其3'端的羥基被修飾，修飾基團(tuán)可以是磷酸基團(tuán)或甲氧基等。
4.權(quán)利要求1中所述的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所用引物的特征在于反轉(zhuǎn)錄oligo(dT)12_3C1-錨定引物長(zhǎng)度為40-60nt，5'端為20-30nt的錨定序列，3'端為12_30nt的dT，在3'末端加上兩個(gè)堿基的(A、G或C) / (A、G、C或T)，最后兩個(gè)堿基起錨定作用。
5.權(quán)利要求1中所述的PCR擴(kuò)增引物特征在于上游引物是待檢測(cè)5'端tRNA半分子序列的寡聚DNA片段，下游引物是與反轉(zhuǎn)錄引物的錨定引物片段序列相同的寡聚DNA片段。
6.權(quán)利要求1中所述的5'端tRNA半分子檢測(cè)反應(yīng)中所使用的PCR擴(kuò)增引物可以進(jìn)行包括熒光分子、生物素和地高辛等分子的修飾。
7.權(quán)利要求1中所述的PCR反應(yīng)體系中可以加入熒光染料或分子信標(biāo)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。
8.權(quán)利要求1-7中所述的檢測(cè)方法在Y端tRNA半分子檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103789447SQ201410072557
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年3月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月3日
【發(fā)明者】鄭曉飛, 付漢江, 劉荻 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所