一種用于檢測藍(lán)氏賈第鞭毛蟲核酸的引物、熒光探針和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測藍(lán)氏賈第鞭毛蟲核酸的引物、熒光探針和試劑盒，屬于生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。所述用于檢測藍(lán)氏賈第鞭毛蟲核酸的引物和熒光探針，引物包括正向引物和反向引物，正向引物如序列表中SEQ?ID?NO.1；反向引物如序列表中SEQ?ID?NO.2；所述熒光探針如序列表中SEQ?ID?NO.3。所述用于檢測藍(lán)氏賈第鞭毛蟲核酸的試劑盒包括上述引物和熒光探針。本發(fā)明提供的引物和熒光探針具有高特異性及高靈敏度，均能達(dá)到100%的特異性和100%的陽性檢出率，其試劑盒能夠精確定量測定核酸的量，有效防止假陰性和假陽性結(jié)果，其檢測方法能夠快速、準(zhǔn)確地對病原體直接進(jìn)行檢測。
【專利說明】—種用于檢測藍(lán)氏賈第鞭毛蟲核酸的引物、熒光探針和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種用于檢測藍(lán)氏賈第鞭毛蟲核酸的引物、熒光探針和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia Stiles，GL)，簡稱賈第蟲，又稱蘭布爾吉亞爾氏鞭毛蟲或梨形鞭毛蟲，屬于鞭毛蟲綱，藍(lán)氏賈第鞭毛蟲能夠引起一種以腹瀉為主要癥狀的腸道疾病。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲寄生人體小腸、膽囊主要在十二指腸，可引起腹痛、腹瀉和吸收不良等癥狀，當(dāng)蟲體藍(lán)氏賈第鞭毛蟲寄生在膽道系統(tǒng)時，可能引起膽囊炎或膽管炎。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中對藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的快速檢測方法為實時熒光定量PCR (PolymeraseChain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)，實時熒光定量PCR技術(shù)與傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)方法相比，避免了核酸擴(kuò)增技術(shù)的污染以及檢測結(jié)果易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果的問題，且實時熒光定量PCR技術(shù)比核酸擴(kuò)增技術(shù)的檢測結(jié)果特異性更高。
[0004]在實現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問題:
[0005]雖然實時熒光定量PCR技術(shù)檢測的結(jié)果特異性高，但仍不能達(dá)到100%的特異性和準(zhǔn)確性，使得現(xiàn)有的檢測方法并不能準(zhǔn)確地檢測出人體上是否寄生有藍(lán)氏賈第鞭毛蟲。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測方法不準(zhǔn)確的問題，本發(fā)明實施例提供了一種用于檢測藍(lán)氏賈第鞭毛蟲核酸的引物、熒光探針和試劑盒。所述技術(shù)方案如下:
[0007]—方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測藍(lán)氏賈第鞭毛蟲核酸的引物和熒光探針，所述引物包括正向引物和反向引物，
[0008]所述正向引物如序列表中SEQ ID N0.1。
[0009]所述反向引物如序列表中SEQ ID N0.2。
[0010]所述熒光探針如序列表中SEQ ID N0.3。
[0011]所述熒光探針的5’端和3’端分別用熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)修飾，修飾所述5’端的所述熒光報告基團(tuán)為:FAM、HEX、TET, JOE、VIC、ROX, Cy3或Cy5，修飾所述3’端的淬滅基團(tuán)為:TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
[0012]另一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測藍(lán)氏賈第鞭毛蟲核酸的試劑盒，所述試劑盒包括上述的引物和熒光探針。
[0013]進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括PCR反應(yīng)液、核酸釋放試劑、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品和工作標(biāo)準(zhǔn)品，其中:
[0014]所述PCR反應(yīng)液包括:無菌水、具有5’ 一3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10XPCR Buffer和含Mg離子的溶液。
[0015]所述核酸釋放試劑由無菌水、Triton-XlOO, NP-40和Tris-HCL組成。[0016]所述陰性質(zhì)控品為不含藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的β賈第素基因的PUC57-T載體質(zhì)粒DNA。
[0017]所述陽性質(zhì)控品為1.0X 106IU/mL含所述藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的基因組DNA片段。
[0018]所述臨界陽性質(zhì)控品為1.0X 104IU/mL含所述藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的基因組DNA片段。
[0019]具體地，所述具有5’ 一 3’外切活性的DNA聚合酶為Taq酶。
[0020]進(jìn)一步地，所述PCR反應(yīng)液中所述Taq酶的終濃度為0.01U/ μ L~0.05U/ μ L，所述dNTPs的終濃度為0.2~0.6mM,所述10 X PCR Buffer的終濃度為I X，所述MgCl2的終濃度為1.5~5.0mM，溶劑為無菌水。
[0021]具體地，所述正向引物的終濃度為0.05~0.9 μ M，所述反向引物的終濃度為
0.05~0.9 μ Μ，所述熒光探針的終濃度為0.05~0.9 μ Μ。
[0022]具體地，所述核酸釋放試劑中Triton-XlOO的終濃度為0.03~0.3%、ΝΡ-40的終濃度為0.04~0.4%以及pH值為8.3的Tris-HCL的終濃度為0.01~0.1M，溶劑為無菌水。
[0023]進(jìn)一步地，所述Tris-HCL的pH值為8.3。
[0024]進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括工作標(biāo)準(zhǔn)品，所述工作標(biāo)準(zhǔn)品為含有所述藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的β賈第素基因的72個堿基對的核苷酸片段的pUC57-T重組質(zhì)粒DNA。
[0025]具體地，所述工作標(biāo)準(zhǔn)品包括:
[0026]工作標(biāo)準(zhǔn)品1，含有1.0X 107 IU/mL所述藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的β賈第素基因的非傳染性DNA片段。
[0027]工作標(biāo)準(zhǔn)品2，含有1.0X106IU/mL所述藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的β賈第素基因的非傳染性DNA片段。
[0028]工作標(biāo)準(zhǔn)品3，含有1.0X105IU/mL所述藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的β賈第素基因的非傳染性DNA片段。
[0029]工作標(biāo)準(zhǔn)品4，含有1.0X 104IU/mL所述藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的β賈第素基因的非傳染性DNA片段。
[0030]本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:本發(fā)明實施例提供的用于檢測藍(lán)氏賈第鞭毛蟲核酸的實時TaqMan熒光定量PCR引物、熒光探針和試劑盒，其引物和熒光探針具有高特異性及高靈敏度，均能達(dá)到100%的特異性和100%的陽性檢出率，其試劑盒能夠精確定量測定核酸的量，有效防止假陰性和假陽性結(jié)果，其檢測方法能夠快速、準(zhǔn)確地對病原體直接進(jìn)行檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0032]圖1是本發(fā)明實施例二提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0033]圖2是本發(fā)明實施例三提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；[0034]圖3是本發(fā)明實施例四提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0035]圖4是本發(fā)明實施例四提供的四種標(biāo)準(zhǔn)品的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0036]圖5是本發(fā)明實施例四提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0037]圖6是本發(fā)明實施例四提供的由圖4得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實施方式】
[0038]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。
[0039]以下實施例中所用試劑主要購自寶生物工程(大連)有限公司。
[0040]實施例一
[0041]本發(fā)明實施例提供一種用于檢測藍(lán)氏賈第鞭毛蟲核酸的引物和熒光探針，其中，選擇藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的特異性保守基因β賈第素基因作為目標(biāo)檢測基因，通過美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Informatio n, NCBI)(http://www.ncb1.nlm.nih.gov),獲得藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的β賈第素基因基因序列，并在線(http://www.eb1.ac.uk/)并對藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的β賈第素基因序列進(jìn)行序列比對，在基因區(qū)選擇一段保守序列，該序列如序列表中SEQ ID N0.4所示:GCGGTCAAGCTCAGCAACATGAACCAGCGCGTCAGCAGGTTCCACGACAAGATGGAGAACGAGATCGAGGTC，利用實時 TaqMan 熒光定量 PCR的專業(yè)設(shè)計軟件BeaCOnDesigner7.0設(shè)計引物和熒光探針序列，引物和熒光探針序列要滿足軟件中各項指標(biāo)。
[0042]在本發(fā)明實施例中，修飾熒光探針的5’端的熒光報告基團(tuán)可以為:FAM，HEX，TET，J0E，VIC，R0X，Cy3*Cy5 ;修飾熒光 探針的3’端的淬滅基團(tuán)可以為:TAMRA，Eclipse，BHQl，BHQ2，BHQ3或DABCYL，該熒光報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)不影響熒光定量PCR的擴(kuò)增，只需根據(jù)探針的熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)選擇所用的儀器的型號設(shè)置可檢測的熒光信號范圍。本發(fā)明實施例提供的熒光探針熒光報告基團(tuán):FAM、HEX、TET和FAM的激發(fā)波長為470至650nm，接收波長為500至700nm ;淬滅基團(tuán):EclipSe、TAMRA、BHQl。引物合成后的純化方式可以為:HAP, PAGE和HPLC純化方式。具體設(shè)計結(jié)果如表1所示:
[0043]表1本發(fā)明實施例一提供的引物和熒光探針
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測藍(lán)氏賈第鞭毛蟲核酸的引物和熒光探針，所述引物包括正向引物和反向引物，其特征在于， 所述正向引物如序列表中SEQ ID N0.1 ； 所述反向引物如序列表中SEQ ID N0.2 ； 所述熒光探針如序列表中SEQ ID N0.3 ； 所述熒光探針的5’端和3’端分別用熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)修飾，修飾所述5’端的熒光報告基團(tuán)為:FAM、HEX、TET, JOE、VIC、ROX, Cy3或Cy5，修飾所述3’端的淬滅基團(tuán)為:TAMRA, Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
2.一種用于檢測藍(lán)氏賈第鞭毛蟲核酸的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權(quán)利要求I所述的引物和熒光探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR反應(yīng)液、核酸釋放試劑、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和臨界陽性質(zhì)控品，其中: 所述PCR反應(yīng)液包括:無菌水、具有5’ 一3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPsUOXPCRBuffer和含Mg離子的溶液； 所述核酸釋放試劑由無菌水、Triton-XlOO, NP-40和Tris-HCL組成； 所述陰性質(zhì)控品為不含藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的β賈第素基因的PUC57-T載體質(zhì)粒DNA; 所述陽性質(zhì)控品為1.0X IO 6IUAiL含所述藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的基因組DNA片段； 所述臨界陽性質(zhì)控品為1.0X IO4IUAiL含所述藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的基因組DNA片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述具有5’一3’外切活性的DNA聚合酶為Taq酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液中所述Taq酶的終濃度為 0.Ο?υ/μ L ~0.05υ/μ L，所述 dNTPs 的終濃度為 0.2 ~0.6mM，所述 10XPCR Buffer的終濃度為I X，所述MgCl2的終濃度為1.5~5.0mM,溶劑為無菌水。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述正向引物的終濃度為0.05~0.9μΜ，所述反向引物的終濃度為0.05~0.9μΜ，所述熒光探針的終濃度為0.05~0.9 μ Μ。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸釋放試劑中所述Triton-XlOO的終濃度為0.03~0.3%，所述ΝΡ-40的終濃度為0.04~0.4%，所述Tris-HCL的終濃度為0.01~0.1Μ，溶劑為無菌水。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述Tris-HCL的pH值為8.3。
9.根據(jù)權(quán)利要求3-8任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述工作標(biāo)準(zhǔn)品為含有所述藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的β賈第素基因的72個堿基對的核苷酸片段的pUC57-T重組質(zhì)粒DNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述工作標(biāo)準(zhǔn)品包括: 工作標(biāo)準(zhǔn)品1，含有1.0X IO7IUAiL所述藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的β賈第素基因的非傳染性DNA片段； 工作標(biāo)準(zhǔn)品2，含有1.0X IO6IUAiL所述藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的β賈第素基因的非傳染性DNA片段； 工作標(biāo)準(zhǔn)品3，含有1.0X IO5I UAiL所述藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的β賈第素基因的非傳染性DNA片段；工作標(biāo)準(zhǔn)品4，含有1.0X104IU/mL所述藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的β賈第素基因的非傳染性DNA片 段。
【文檔編號】C12R1/90GK103882117SQ201410043265
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月29日
【發(fā)明者】羅虹, 唐景峰, 劉緒, 霍然 申請人:武漢百泰基因工程有限公司