一種復(fù)合微生物秸稈降解菌劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種復(fù)合微生物秸稈降解菌劑，其特征在于，包括：長柄木霉1.0×103-5.0×104cfu/mL，假單胞菌屬菌株B6-155.0×108-1.0×1010cfu/mL。本發(fā)明所得復(fù)合微生物秸稈降解菌劑在20-25℃，15天左右就可使秸稈基本腐解，降解率可達(dá)58%。本發(fā)明微生物復(fù)合菌劑適應(yīng)北方地區(qū)，能夠在較低溫度環(huán)境下，秸稈降解率高，并且具有菌體生長速率快，培養(yǎng)條件溫和的特點(diǎn)。
【專利說明】一種復(fù)合微生物秸稈降解菌劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種復(fù)合微生物秸桿降解菌劑，具體地說，涉及一種用于玉米等農(nóng)作物秸桿的快速腐熟降解的菌劑。本發(fā)明還涉及所述復(fù)合微生物秸桿降解菌劑的制備方法以及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是農(nóng)業(yè)大國，每年產(chǎn)生的秸桿6億噸以上，20世紀(jì)90年代后期以來，隨著農(nóng)作物單產(chǎn)提高，秸桿總量迅速增加，廣大農(nóng)民為趕農(nóng)時(shí)、搶播種、圖省事，多數(shù)地區(qū)就開始集中出現(xiàn)秸桿焚燒現(xiàn)象。大面積焚燒秸桿的現(xiàn)象不僅造成了極大的環(huán)境污染，而且浪費(fèi)了寶貴的生物資源。
[0003]環(huán)境中的微生物具有增殖速度快、功能豐富多樣、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，應(yīng)用微生物學(xué)方法腐解處理秸桿具有其他物理化學(xué)方法不可替代的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。秸桿中纖維素結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜，單一微生物對纖維素的分解能力非常弱。由于分解秸桿的“三素酶”是多酶體系，酶組分之間存在著明顯的協(xié)同作用，所以，要求多菌株的配合、相互補(bǔ)充，才能促進(jìn)纖維素類物質(zhì)的分解，尤其是細(xì)菌與真菌之間具有比較強(qiáng)的相互作用。纖維素分解菌與木質(zhì)素分解菌對稻草和小麥的聯(lián)合分解能力明顯高于任何一個(gè)單一菌株。所以充分利用自然界多種微生物的協(xié)同關(guān)系，人工篩選構(gòu)建能夠產(chǎn)生多種纖維素酶的高效穩(wěn)定菌株復(fù)合系，不僅能夠解決環(huán)境污染問題，還能夠?yàn)樽魑锿寥捞峁┐罅康牡V物質(zhì)和有機(jī)質(zhì)，改良土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。秸桿還田的作用歸納為:“當(dāng)年增產(chǎn)，常年改土，災(zāi)年保苗，切實(shí)可行，簡便有效”。
[0004]國內(nèi)現(xiàn)有的秸桿腐熟劑很多，但大都由于環(huán)境溫度或菌體生長速度的限制而對秸桿的降解效果大打折扣，因此針對于北方低溫環(huán)境而研發(fā)的復(fù)合菌劑非常必要。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明針對北方低溫環(huán)境下玉米等農(nóng)作物秸桿降解困難，降解時(shí)間長的問題，提供一種適合北方環(huán)境的復(fù)合微生物秸桿降解菌劑，促進(jìn)秸桿的快速腐熟并起到改良土壤特性的目的。
[0006]本發(fā)明從126株細(xì)菌、真菌中挑選的纖維素降解率、生長速度和酶活較高的菌株，長柄木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)和假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)菌株 B6-15,經(jīng)過配比優(yōu)化后組成微生物復(fù)合菌劑，用以促進(jìn)低溫環(huán)境下秸桿的快速降解。
[0007]一種復(fù)合微生物秸桿降解菌劑，其組成為:
[0008]長柄木霉1.0 X 103-5.0 X 104cfu/mL,
[0009]假單胞菌屬菌株B6-15 5.0XlO8-L OX 10lclcfu/mL。
[0010]總菌數(shù)達(dá)到1.0X 108cfu/mL以上即可。
[0011]優(yōu)選地，所述復(fù)合微生物秸桿降解菌劑，其組成為:
[0012]長柄木霉1.0 X 104-3.0 X 104cfu/mL,[0013]假單胞菌屬菌株B6-15 L 0Χ109-8.0X109cfu/mL。
[0014]更進(jìn)一步優(yōu)選，所述復(fù)合微生物秸桿降解菌劑，其組成為:
[0015]長柄木霉2.0X104cfu/mL，
[0016]假單胞菌屬菌株B6-15 5.0X 109cfu/mL。
[0017]本發(fā)明所述的長柄木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)為北京沃土天地生物科技有限公司所出售的產(chǎn)品；
[0018]所述的假單胞菌屬(Pseudomonassp.)菌株 B6-15,保藏號 CGMCC N0.5851。
[0019]本發(fā)明還提供上述復(fù)合微生物秸桿降解菌劑的制備方法，包括如下步驟:
[0020]I).斜面培養(yǎng):將長柄木霉、假單胞菌屬菌株B6-15兩種原始菌種在無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基表面，活化菌株；
[0021]2).一級種子培養(yǎng):將步驟I)活化的菌種在無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基，150-180rpm搖床培養(yǎng)；
[0022]3).混合發(fā)酵培養(yǎng):將步驟2) —級種子接種于液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行復(fù)合菌劑搖床培養(yǎng)，得到復(fù)合微生物秸桿降解菌劑。
[0023]上述制備方法中，在步驟I)中，將長柄木霉在15-38°C條件下接種于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-5天；假單胞菌屬菌株B6-15在15-30°C條件下接種于NA固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2-3 天。
[0024]在步驟2)中，長`柄木霉15_38°C條件下接種PDA液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)2_4天；假單胞菌屬菌株B6-15在15-30°C條件下接種于NA液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)3_5天；
[0025]在步驟3)中，接種量為液體培養(yǎng)基的體積的0.5-2%，優(yōu)選1% ；
[0026]在步驟3)中，所述混合發(fā)酵培養(yǎng)條件:溫度15-25 °C ; 150_200rpm，優(yōu)選160rpm ；培養(yǎng)3-5天。
[0027]本發(fā)明所述PDA培養(yǎng)基成分表如下:
[0028]
去皮馬鈴薯200g
葡萄糖20g
蒸餾水1000ml
pH6.0-6.5
[0029]本發(fā)明所述NA培養(yǎng)基成分表如下:
[0030]牛肉膏5g
蛋白胨IOg
NaCI5g
蒸餾水1000ml
pH7.0-7.2

121.3 °C 滅菌 20min。
[0031]本發(fā)明還提供了所述復(fù)合微生物秸桿降解菌劑在促進(jìn)玉米等農(nóng)作物秸桿腐熟、改良作物土壤特性方面的應(yīng)用。具體方法是將復(fù)合微生物秸桿降解菌劑以2-3kg/畝灑于秸桿中，在環(huán)境溫度20-25°C下進(jìn)行快速腐熟。
[0032]本發(fā)明所得復(fù)合微生物秸桿降解菌劑在20_25°C，15天左右就可使秸桿基本腐解，降解率可達(dá)58%。本發(fā)明微生物復(fù)合菌劑適應(yīng)北方地區(qū)，能夠在較低溫度環(huán)境下，秸桿降解率高，并且具有菌體生長速率快，培養(yǎng)條件溫和的特點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0033]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0034]實(shí)施例1
[0035]復(fù)合微生物秸桿降解菌劑的組成:
[0036]長柄木霉2.0X 1`04cfu/mL ；
[0037]假單胞菌屬菌株B6-15 5.0X 109cfu/mL。
[0038]上述復(fù)合微生物秸桿降解菌劑的制備方法，包括如下步驟:
[0039]I).斜面培養(yǎng):將長柄木霉、假單胞菌屬菌株B6-15兩種原始菌種在無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基表面，活化菌株；
[0040]2).一級種子培養(yǎng):將步驟I)活化的菌種在無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基，160rpm搖床培養(yǎng)；
[0041]3).混合發(fā)酵培養(yǎng):將步驟2) —級種子接種于液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行復(fù)合菌劑搖床培養(yǎng)，得到復(fù)合微生物秸桿降解菌劑。
[0042]上述制備方法中，在步驟I)中，將長柄木霉在30°C條件下接種于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天；假單胞菌屬菌株B6-15在30°C條件下接種于NA固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3天。
[0043]在步驟2)中，長柄木霉25°C條件下接種PDA液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)3天；假單胞菌屬菌株B6-15在25°C條件下接種于NA液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)3天；
[0044]在步驟3)中，接種量為液體培養(yǎng)基的體積的1% ；
[0045]在步驟3)中，所述混合發(fā)酵培養(yǎng)條件:溫度25°C ； 160rpm ;培養(yǎng)5天。
[0046]實(shí)施例2
[0047]復(fù)合微生物秸桿降解菌劑的組成:
[0048]長柄木霉1.0X 104cfu/mL ；
[0049]假單胞菌屬菌株B6-15 1.0X 109cfu/mL。
[0050]所述菌劑制備方法同實(shí)施例1。區(qū)別在于:[0051]在步驟I)中，將長柄木霉在15°C條件下接種于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天；假單胞菌屬菌株B6-15在15°C條件下接種于NA固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3天。
[0052]在步驟2)中，長柄木霉15°C條件下接種PDA液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)3天；假單胞菌屬菌株B6-15在15°C條件下接種于NA液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)3天；
[0053]在步驟3)中，接種量為液體培養(yǎng)基的體積的0.5% ；
[0054]在步驟3)中，所述混合發(fā)酵培養(yǎng)條件:溫度15°C ；200rpm ;培養(yǎng)4天。
[0055]實(shí)施例3
[0056]復(fù)合微生物秸桿降解菌劑的組成:
[0057]長柄木霉3.0X 104cfu/mL ；
[0058]假單胞菌屬菌株B6-15 8.0 X 109cfu/mL。
[0059]所述菌劑制備方法同實(shí)施例1。區(qū)別在于:
[0060]在步驟I)中，將長柄木霉在38°C條件下接種于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天；假單胞菌屬菌株B6-15在38 °C條件下接種于NA固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2天。
[0061]在步驟2)中，長柄木霉38°C條件下接種PDA液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)2天；假單胞菌屬菌株B6-15在30°C條件下接種于NA液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)3天；
[0062]在步驟3)中，接種量為液體培養(yǎng)基的體積的2% ；
[0063]在步驟3)中，所述混合發(fā)酵培養(yǎng)條件:溫度20°C ；150rpm ;培養(yǎng)5天。
[0064]實(shí)驗(yàn)例I 菌株篩選
[0065]假單胞菌屬菌株B6-15的生長曲線測定方法如下:將一級種子液在無菌條件下按液體培養(yǎng)基體積的1%接種于NA液體培養(yǎng)基中，于25°C, 160rpm條件下培養(yǎng)，每隔4h于無菌環(huán)境中取培養(yǎng)液lml，在600nm下測定其吸光度。同時(shí)以枯草芽孢桿菌為對照例1、地衣芽孢桿菌為對照例2。測定結(jié)果如表1所示。
[0066]表1菌株B6-15的生長測定
[0067]
【權(quán)利要求】
1.一種復(fù)合微生物秸桿降解菌劑，其特征在于，包括: 長柄木霉1.0 X 103-5.0 X 104cfu/mL, 假單胞菌屬菌株 B6-15 5.0X IO8-L O X 101Qcfu/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌劑，其特征在于，由如下組分組成: 長柄木霉1.0 X 104-3.0 X 104cfu/mL, 假單胞菌屬菌株 B6-15 1.0X 109-8.0X 109cfu/mL。
3.權(quán)利要求1或2所述菌劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 1).斜面培養(yǎng):將長柄木霉、假單胞菌屬菌株B6-15兩種原始菌種在無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基表面，活化菌株； 2).一級種子培養(yǎng):將步驟I)活化的菌種在無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基，150-180rpm搖床培養(yǎng)； 3).混合發(fā)酵培養(yǎng):將步驟2)—級種子接種于液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行復(fù)合菌劑搖床培養(yǎng)，得到復(fù)合微生物秸桿降解菌劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟I)中，將長柄木霉在15-38°C條件下接種于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-5天。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟I)中，假單胞菌屬菌株B6-15在15-30°C條件下接種于NA固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2-3天。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟2)中，長柄木霉在15-38°C條件下接種PDA液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)2-4天。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟2)中，假單胞菌屬菌株B6-15在15-30°C條件下接種于NA液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)3-5天。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟3)中，接種量為液體培養(yǎng)基的體積的0.5-2%。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟3)中，所述混合發(fā)酵培養(yǎng)條件:溫度 15-250C ；150-200rpm ;培養(yǎng) 3-5 天。
10.權(quán)利要求1或2所述菌劑在促進(jìn)農(nóng)作物秸桿腐熟、改良作物土壤特性方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/20GK103497919SQ201310488061
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】李少東, 李季, 彭生平, 任莉 申請人:北京沃土天地生物科技有限公司