聾病易感基因GJB2 235delC、299delAT突變檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了聾病易感基因GJB2?235delC、299delAT突變檢測試劑盒，該試劑盒包括擴增試劑和一系列標準品；所述擴增試劑包括：PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴增GJB2：235delC、299delAT；所述一系列標準品包括：235delC分型標準品、299delAT分型標準品。本發(fā)明以上述2個聾病易感基因位點為檢測對象，通過上述耳聾易感基因位點的擴增和熒光定量檢測，與基因分型標準品的對比，即可篩選出含有上述位點突變的個體，同時確定基因型。對聾病易感基因的檢測，尤其是對新生兒耳聾基因的篩查具有重要意義。
【專利說明】聾病易感基因GJB2235delC、299delAT突變檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及聾病易感基因GJB2235delC、299delAT突變檢測試劑盒，屬于生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]世界范圍內(nèi)對聽力語言殘疾者進行的致病因素研究表明，約60-80%患者的病因與遺傳因素有關(guān)，其中發(fā)達國家的臨床研究數(shù)據(jù)表明，遺傳性耳聾在耳聾患者中約占80%。因此近十幾年來，遺傳性耳聾的發(fā)病機制及其分子流行病學的研究成為了聾病研究最重要的內(nèi)容之一。隨著人類基因組計劃完成，聾病基因的定位和克隆取得了巨大的進步，聾病的分子遺傳學研究和分子流行病學的數(shù)據(jù)使研究者們逐步認識到聾病易感基因突變在維護聽力健康和發(fā)現(xiàn)聽力異常中的重要性。
[0003]在目前已經(jīng)定位和克隆的耳聾相關(guān)基因中，GJB2是最常見的易感基因，在先天性重度耳聾患者中約占30-50%。目前，在該基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 100多種突變類型，在中國常見的突變形式為235delC，其在所有致病性突變中約占74.14%，約22.2%的中國耳聾患者與該突變有關(guān)。另外GJB2299_300delAT的突變等位基因頻率約為3%。
[0004]目前常用的基因檢測方法有:直接測序(direct sequencing, DS)、連接酶檢測反應(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段長度多態(tài)性分析(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)、變性高效液相色譜分析(denaturing highperformance liquid chromotography,DHPLC)、基因芯片。這些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁瑣、結(jié)果不易判讀、重復性差、假陰性假陽性多等問題。對于染色體突變的基因分型，一般的熒光定量試劑盒往往需要對同一個標本進行多管檢測，才能獲得2個以上的分型信息。
[0005]本發(fā)明以上述2個聾病易感基因位點為檢測對象，通過上述耳聾易感基因位點的擴增和熒光定量檢測，與基因分型標準品的對比，即可篩選出含有上述位點突變的個體，同時確定基因型。對聾病易感基因的檢測，尤其是對新生兒耳聾基因的篩查具有重要意義；首次利用四通道/四色染料-熒光定量PCR檢測的方法實現(xiàn)了 2位點分型檢測的目標，并含有內(nèi)對照以監(jiān)控檢測過程。閉管檢測防止了開蓋檢測操作而產(chǎn)生的污染，為臨床診斷和相關(guān)領(lǐng)域科研提供可靠方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明目的是提供一種可在I個小時內(nèi)同時檢測聾病易感基因GJB2 235delC、299delAT突變，區(qū)分基因型并含有內(nèi)對照以監(jiān)控檢測過程。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，采取的技術(shù)方案:一種聾病易感基因GJB2 235delC、299delAT突變檢測試劑盒，該試劑盒包括擴增試劑和一系列標準品；
[0008]所述擴增試劑包括:PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴增GJB2:235delC、299delAT的引物混合物，對上述位點進行特異性檢測的探針混合物，對人基因組DNA進行檢測的通用探針混合物，內(nèi)對照及對內(nèi)對照進行檢測的引物探針混合物；
[0009]所述一系列標準品包括:235delC分型標準品(10ng/uL的235delC雜合型突變DNA標本I管)、299delAT分型標準品(10ng/uL的299delAT雜合型突變DNA標本I管)。
[0010]所述用于對GJB2:235delC、299delAT突變進行特異性檢測的探針，對人基因組DNA進行檢測的通用探針，對內(nèi)對照進行檢測的探針被分為四組，分別采用四種不同的發(fā)光基團對各組探針的5’端進行標記，3’端的淬滅基團可以為相同或不同的熒光染料。
[0011]所述探針所分為的四組為:用于對GJB2:299delAT突變進行特異性檢測的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團；用于對235delC突變進行特異性檢測的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團；對人基因組DNA進行檢測的通用探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團；用于對內(nèi)對照進行特異性檢測的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團。
[0012]所述5’端不同的發(fā)光基團所使用的熒光染料可以為:ALEXAFluor350、FAM、TET、HEX/JOE/VIC、Cy3,TAMRA,RO X、/TexasRed,Cy5 ;3’端相同或不同的淬滅基團所使用的熒光染料可以為:BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL。
[0013]使用所述的試劑盒進行PCR復合擴增反應的條件:PCR擴增體系的pH值為
8.0-9.0，鎂離子濃度為1.5-3.5mM，4種dNTP的終濃度各為200-300μΜ，Taq酶的用量為
0.1-0.4U/μ L，引物探針混合物中的引物、探針的終濃度為0.2-0.4 μ M0
[0014]使用所述試劑盒進行PCR擴增時，擴增階段反應在一個復合擴增反應體系中同時擴增GJB2:235delC、299delAT，人基因組DNA目標序列，內(nèi)對照目標序列。
[0015]用于GJB2:235delC、299delAT 檢測的引物為:
[0016]SEQ N0.1:5’ -ACGTGTGCTACGATCACTACTTCC-3’ ；
[0017]SEQ N0.2:5’ -CTCCTCGATGTCCTTAAATTCACTC-3’ ；
[0018]用于GJB2:299delAT突變檢測的探針為:
[0019]SEQ N0.5:5’ -CCTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCGTC T CS'；
[0020]用于GJB2:235delC突變檢測的探針為:
[0021 ] SEQ N0.6:5 ’ -ACATCCGGCTATGGGCCT G C-3，
[0022]用于對人基因組DNA進行檢測的通用探針為:
[0023]SEQ N0.7:5，-ACGCCAGCGCTCCTAGTGGC-3，；
[0024]其中LNA核苷以黑體字表示。
[0025]3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述的內(nèi)對照為一段人工合成的序列裝載到PMD18-T的質(zhì)粒載體上得到，這段人工合成的序列(SEQ N0.4)經(jīng)過NCBI網(wǎng)站Blast沒有找到高相關(guān)的同源區(qū)。擴增序列及對內(nèi)對照進行檢測的引物探針為:
[0026]SEQ N0.8:CACCAGCATCTCCCTTCATGTTGACTACCGTAGGCTGCCACCATTTCAGAAGAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAGTTGCATGAAGGTAATATACTCGATCCGTAATTCCACTATTGAAATGGGTACATGACTGATACAGACCATC
[0027]SEQ N0.9:5’ -CACCAGCATCTCCCTTCATGT-3’
[0028]SEQ N0.10:5’ -GATGGTCTGTATCAGTCATGTACCCA-3’
[0029]SEQ N0.11:5，-GAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAG-3’
[0030]所述各位點的復合擴增采用聚合酶鏈式反應來實現(xiàn)，采用熒光定量PCR進行實時檢測，通過與標準品的同步擴增和分析，得出所測標本的分型信息或突變比例信息。
[0031]其中所檢測的人基因組DNA為:使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法對來源樣本進行處理得到的DNA ;所述的來源樣本為:來源于人類的:濾紙片血斑/ 口腔拭子樣本、FTA卡血斑/ 口腔拭子樣本、口腔拭子樣本、血液/痕、組織、羊水。
[0032]使用所述的試劑盒進行PCR擴增時，擴增階段反應在任何型號的PCR儀上進行，擴增程序:94-980C l-5min ；45 個循環(huán)的 94-98°C 5-10s, 55-65°C 30_50s。
[0033]使用的帶熒光標記并經(jīng)LNA核苷單體摻入修飾的引物，提高了探針的Tm值，縮短了探針長度，增強了探針對點突變的識別力，從而增加了探針的靈敏度和特異性，防止假陽性和假陰性的出現(xiàn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1是本發(fā)明的試劑盒對GJB2:235delC分型標準品(IOng DNA背景下235雜合突變型DNA)不同稀釋梯度情況下的檢測圖譜；
[0035]圖2是本發(fā)明的試劑盒對GJB2:299delAT分型標準品(IOng DNA背景下299雜合突變型DNA)不同稀釋梯度情況下的檢測圖譜；
[0036]圖3是根據(jù)圖1、圖2數(shù)據(jù)作出的標準曲線圖；
[0037]圖4是本發(fā)明的試劑盒對正常個體血斑來源DNA (0.5ng/20uL體系)的檢測圖譜；
[0038]圖5是本發(fā)明的試劑盒對GJB2:235delC突變的個體血斑來源DNA (0.5ng/20uL體系)的檢測圖譜；
[0039]圖6是本發(fā)明的試劑盒對GJB2:299delAT突變個體血斑來源DNA (lng/20uL體系)的檢測圖譜。
【具體實施方式】
[0040]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定。
[0041]實施例1本發(fā)明的試劑盒檢測突變及正常個體的DNA樣本
[0042]用于GJB2:235delC突變檢測的探針5’端采用FAM熒光染料標記，用于GJB2:299delAT突變檢測的探針5’端采用HEX熒光染料標記，用于人線粒體DNA檢測的探針5’端采用Cy5熒光染料標記，用于內(nèi)對照檢測的探針5’端采用ROX熒光染料標記。
[0043]1、待測樣本1000份，都已經(jīng)使用“DNA提取-PCR擴增-測序”的技術(shù)方法對各位點進行過測序檢測。其中，GJB2:235delC突變樣本I份，GJB2:299delAT突變樣本4份。
[0044]2、檢材的基因組DNA提取
[0045]Chelex提取法:剪下I-3mm血斑(標本來自于XX醫(yī)院檢驗科)置于1.5mL離心管中，加入SdH2OlmL,振蕩離心，棄上清液，重復步驟兩次，棄上清液，將5% Chelex-1OO震蕩懸浮后快速用剪掉的槍頭吸取200 μ L加入離心管中，振蕩數(shù)秒，。于56°C水浴保溫30min后，振蕩數(shù)秒。95°C沸水浴lOmin，輕微振蕩數(shù)秒。2000rpm離心5min，上清中為提取的DNA。
[0046]3、擴增和擴增產(chǎn)物的檢測分析
[0047](I) PCR 擴增體系:
【權(quán)利要求】
1.聾病易感基因GJB2235delC、299delAT突變檢測試劑盒，其特征在于包括擴增試劑和一系列標準品；所述擴增試劑包括:PCR緩沖液、1%(:12和dNTPs的反應混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴增GJB2:235delC、299delAT引物混合物，對上述位點進行特異性檢測的探針混合物，對人基因組DNA進行檢測的通用探針混合物，內(nèi)對照及對內(nèi)對照進行檢測的引物探針混合物；所述一系列標準品包括:235delC分型標準品、299delAT分型標準品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于: 用于GJB2:235delC、299delAT檢測的引物為:
SEQ N0.1:5’ -ACGTGTGCTACGATCACTACTTCC-3’ ；
SEQ N0.2:5’ -CTCCTCGATGTCCTTAAATTCACTC-3’ ； 用于GJB2:299delAT突變檢測的探針為:
SEQ N0.5:5’ -CCTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCGTC 71C-3’ ； 用于GJB2:235delC突變檢測的探針為:
SEQ N0.6:5’ -ACATCCGGCTATGGGCCT C?C_3’ 用于對人基因組DNA進行檢測的通用探針為:
SEQ N0.7:5’ -ACGCCAGCGCTCCTAGTGGC-3’ ； 其中LNA核苷以黑體字表示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述的內(nèi)對照為一段人工合成的序列裝載到PMD18-T的質(zhì)粒載體上得到，這段人工合成的序列(SEQ N0.4)經(jīng)過NCBI網(wǎng)站Blast沒有找到高相關(guān)的同源區(qū)。擴增序列及對內(nèi)對照進行檢測的引物探針為:
SEQ N0.8:CACCAGCATCTCCCTTCATGTTGACTACCGTAGGCTGCCACCATTTCAGAAGAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAGTTGCATGAAGGTAATATACTCGATCCGTAATTCCACTATTGAAATGGGTACATGACTGATACAGACCATC
SEQ N0.9:5’ -CACCAGCATCTCCCTTCATGT-3’
SEQ N0.10:5’ -GATGGTCTGTATCAGTCATGTACCCA-3’
SEQ N0.11:5’ -GAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAG-3’
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述的用于GJB2:235delC、299delAT突變檢測的探針，對人基因組DNA進行檢測的通用探針，內(nèi)對照探針，每條探針的5’端和3’端均進行熒光染料標記，5’端為發(fā)光基團和3’端為淬滅基團。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述用于對GJB2:235delC、299delAT突變進行特異性檢測的探針，對人基因組DNA進行檢測的通用探針被分為四組，分別采用四種不同的發(fā)光基團對各組探針的5’端進行標記，3’端的淬滅基團可以為相同或不同的熒光染料。
6.根據(jù)權(quán)利4要求所述的試劑盒，其特征在于:探針所分為的四組為:用于對GJB2:299delAT突變進行特異性檢測的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團；用于對235delC突變進行特異性檢測的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團；對人基因組DNA進行檢測的通用探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團；用于對內(nèi)對照進行特異性檢測的探針采用同一組發(fā)光-淬滅基團。
7.根據(jù)權(quán)利4要求所述的試劑盒，其特征在于:5’端不同的發(fā)光基團所使用的熒光染料可以為:ALEXAFluor350、FAM、TET、HEX/JOE/VIC、Cy3, TAMRA, ROX、/Texas Red、Cy5 ;3’端相同或不同的淬滅基團所使用的熒光染料可以為:BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL。
8.根據(jù)權(quán)利I要求所述的試劑盒，其特征在于:包括一系列標準品:235delC分型標準品(10ng/uL的235delC雜合型突變DNA標本I管)、299delAT分型標準品(10ng/uL的299delAT雜合型突變DNA標本I管)。
9.權(quán)利要求1所述試劑盒應用于聾病易感基因的檢測，其特征在于通過熒光定量PCR特異性檢測聾病易感基因GJB2:235delC、299delAT ;用于299delAT檢測的引物探針為:SEQ N0.USEQ N0.2,SEQ N0.5 ;用于 GJB2:235delC 突變檢測的引物探針為:SEQ N0.3,SEQN0.4、SEQ N0.6 ;用于對人基因組DNA檢測的引物探針為:SEQ N0.3、SEQ N0.4、SEQ N0.7 ；用于對內(nèi)對照檢測的引物探針為:SEQ N0.9,SEQ N0.10,SEQ N0.11。所述各位點的復合擴增采用聚合酶鏈式反應來實現(xiàn)，采用熒光定量PCR進行實時檢測，通過與標準品的同步擴增和分析，得 出所測標本的分型信息或突變比例信息。
【文檔編號】C12Q1/68GK103451300SQ201310410783
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】步迅, 夏子芳, 劉艷艷, 張全芳 申請人:步迅, 夏子芳