一種以山梨醇作為碳源提高發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以山梨醇作為碳源提高發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸產(chǎn)量的方法。其公開了一種生產(chǎn)莽草酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括碳源，所述的碳源為0.1～5%山梨醇，所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的山梨醇的克數(shù)。本發(fā)明的用于生產(chǎn)莽草酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中以山梨醇作為碳源，其顯著提高了菌株發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸的產(chǎn)量，其產(chǎn)量較傳統(tǒng)的以葡萄糖作為碳源提高至750%。本發(fā)明的工藝簡單有效，原料價格低廉，可應(yīng)用于生物合成莽草酸的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中，且對其它的以大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的過程優(yōu)化具有積極的指導(dǎo)作用。
【專利說明】一種以山梨醇作為碳源提高發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸產(chǎn)量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種以山梨醇作為碳源提高發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸產(chǎn)量的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 莽草酸（Shikimic acid)，化學(xué)名為[3R-(3a, 4α, 5β)]-3, 4,5-三羥基-1-環(huán)己 烯_1_羧酸，分子式為C7H ltlO5，相對分子量為174. 15。
[0003] 隨著流感病毒Η5Ν1和HlNl亞型以及2013年在中國首次發(fā)現(xiàn)的Η7Ν9亞型的連續(xù) 爆發(fā)，羅氏公司的專利藥"達菲"（磷酸奧司他韋，Oseltamivir)成為世界各國爭相貯備的 首選抗流感病毒藥物。作為"達菲"合成的關(guān)鍵手性起始原料，莽草酸也引起人們的廣泛關(guān) 注。目前，合成"達菲"所需的莽草酸大部分來自于木蘭科植物八角（Illicium verum)，但 利用八角提取莽草酸，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，得率較低，原料易受季節(jié)氣候等因素限制，難以滿足 大規(guī)模生產(chǎn)所需，而且大量砍伐植物對環(huán)境也造成了巨大危害。而利用微生物生產(chǎn)莽草酸 具有極廣闊的應(yīng)用前景，近些年的研究中，利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸也逐漸成為熱點。
[0004] 然而，本領(lǐng)域目前利用大腸桿菌生產(chǎn)莽草酸的效率仍然不高，難以滿足市場對莽 草酸的需求，因此，有必要通過一定的技術(shù)對發(fā)酵過程進行改進，以提高發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸的 產(chǎn)量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對目前發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸的效率不高的現(xiàn)狀，而提 供一種以山梨醇作為碳源提高發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸產(chǎn)量的方法。目前本領(lǐng)域還未見有利用山梨 醇作為碳源提高發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸產(chǎn)量的報道，本發(fā)明屬于首創(chuàng)，本發(fā)明通過將碳源由普通 的葡萄糖改為山梨醇，使菌株的生長性能得到了改善，最終使莽草酸的產(chǎn)量有了出乎意料 的大幅提1?。
[0006] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是：一種生產(chǎn)莽草酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包括碳源，所述 的碳源為〇. 1?5%山梨醇，所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的山梨醇的克 數(shù)，如1%表示每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中山梨醇的質(zhì)量為1克。
[0007] 本發(fā)明中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基還包括本領(lǐng)域常規(guī)的生產(chǎn)莽草酸的發(fā)酵培養(yǎng)基所包 含的組分，即所述的發(fā)酵培養(yǎng)基還包括本領(lǐng)域常規(guī)的生產(chǎn)莽草酸的發(fā)酵培養(yǎng)基所包含的氮 源、無機鹽等組分。
[0008] 較佳地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基還包括1?5%氮源和0. 1?5%無機鹽，所述的氮源選 自大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、（NH4)2SCV NH4NOjP KNO3中的一種或多種，所述的無機鹽 選自1^04、1(2即0 4、腿2?04、似2即04、111(：1 2、(^04和似(：1中的一種或多種，所述的百分比為 每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各組分的克數(shù)。
[0009] 其中，優(yōu)選地，所述大豆蛋白胨的添加量為0. 1?2%，所述胰蛋白胨的添加量為 0. 1?2%，所述酵母粉的添加量為0. 1?2%，所述（NH4)2SO4的添加量為0. 1?3%，所述 NH4NO3的添加量為0. 1?3%，所述KNO3的添加量為0. 1?3%，所述MgSO4的添加量為0. 1? 0. 6%，所述K2HPO4的添加量為0. 1?0. 7%，所述KH2PO4的添加量為0. 05?0. 7%，所述Na2HPO4 的添加量為〇. 05?0. 6%，所述MnCl2的添加量為0. 05?0. 6%，所述CuSO4的添加量為0. 1? 0. 6%，所述NaCl的添加量為0. 05?0. 6%，所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有 的各組分的克數(shù)。
[0010] 所述的氮源更優(yōu)選大豆蛋白胨和/或NH4NO3，最優(yōu)選大豆蛋白胨；所述的無機鹽更 優(yōu)選 MgS04、K2HP04、KH2PO4 和 NaCl 的組合。
[0011] 本發(fā)明中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基還可以包括本領(lǐng)域常規(guī)的可添加于發(fā)酵培養(yǎng)基中的 有機酸。
[0012] 較佳地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基還包括酪氨酸、檸檬酸、苯丙氨酸和谷氨酸鈉中的一 種或多種，優(yōu)選包括酪氨酸和檸檬酸，所述酪氨酸的添加量為0. 05?2%，所述檸檬酸的添 加量為0. 01?0. 2%，所述苯丙氨酸的添加量為0. 05?0. 2%，所述谷氨酸鈉的添加量為 0. 05?0. 5%，所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各組分的克數(shù)。
[0013] 本發(fā)明優(yōu)選地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括0. 1?5%山梨醇、0. 1?2%大豆蛋白 胨、0· 1 ?3%ΝΗ4Ν03、0· 1 ?0· 6%MgS04、0. 05 ?0· 5% 酪氨酸、0· 05 ?0· 15% 檸檬酸、0· 1 ? 0. 7%K2HP04、0. 05?0. 7%KH2P04和0. 05?0. 6%NaCl，所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng) 基中所含有的各組分的克數(shù)。
[0014] 進一步優(yōu)選地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括0. 1?5%山梨醇、0. 5%大豆蛋白胨、 0· 6%ΝΗ4Ν03、0· 2%MgS04、0. 1%酪氨酸、0· 1%檸檬酸、0· 3%Κ2ΗΡ04、0· 1%KH2P0JP0. l%NaCl，所述 的百分比為每100暈升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各組分的克數(shù)。
[0015] 最佳地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括2%山梨醇、0. 5%大豆蛋白胨、0. 6%NH4N03、 0. 2%MgS04、0. 1% 酪氨酸、0. 1% 檸檬酸、0. 3%K2HP04、0. 1%腿#04和0. l%NaCl，所述的百分比為 每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各組分的克數(shù)。
[0016] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是：一種添加山梨醇提高發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸產(chǎn)量的方 法，其包括步驟：以前述發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，即可。
[0017] 本發(fā)明中，所述的大腸桿菌為本領(lǐng)域常規(guī)所述，只要其能夠發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸即可， 如 E. coli BL21、E. coli JW0379-1 等，本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌 E. colijw〇379-l。
[0018] 在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實 例。
[0019] 本發(fā)明所用試劑和原料除特別說明之外，均市售可得。
[0020] 本發(fā)明的積極進步效果在于：
[0021] 本發(fā)明的用于生產(chǎn)莽草酸的發(fā)酵培養(yǎng)基以山梨醇作為碳源，其顯著提高了菌株發(fā) 酵生產(chǎn)莽草酸的產(chǎn)量，其產(chǎn)量較傳統(tǒng)的以葡萄糖作為碳源提高至750%。本發(fā)明的工藝簡單 有效，原料價格低廉，可應(yīng)用于生物合成莽草酸的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中，且對其它的以大腸桿菌發(fā) 酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的過程優(yōu)化具有積極的指導(dǎo)作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為對比例1和實施例1?7發(fā)酵產(chǎn)物中莽草酸含量的測定結(jié)果，其中0為對 比例1，1?7分別為實施例1?7。

【具體實施方式】
[0023] 下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0024] 下述實施例中所用的菌株為重組大腸桿菌JW0379-1 (Baba T, Ara T, Hasegawa M, et al.Construction of Escherichia coli K-12in-frame, single-gene knockout mutants:the Keio collection. Mol Syst Biol2006. 2:1-11)，其基因型 為 F' A(araD_araB) 567, AlacZ4787 (::rrnB-3), AaroL753::kan, A'rph-l, Λ (rhaD-rhaB)568，hsdR514。該重組大腸桿菌JW0379-1菌株由本發(fā)明人于2010年I月從 E. coli Genetic Stock Center (New Haven, USA)購買獲得。
[0025] 下述實施例中：
[0026] 發(fā)酵培養(yǎng)基：具體如各實施例和對比例1所述，除發(fā)酵培養(yǎng)基不同之外，各實施例 和對比例1的其余條件均相同。
[0027] 種子培養(yǎng)基：各實施例和對比例均相同。其組成為：酵母提取物0. 5%，胰蛋白胨 1%，NaCll% (Luria-Bertani培養(yǎng)基，參照《分子克隆實驗指南》第三版，（J.薩姆布魯克 D.W.拉塞爾著)）。
[0028] 培養(yǎng)條件：各實施例和對比例均相同。將甘油管保藏的菌種接種到裝有 20mL/250mL種子培養(yǎng)基(含有25mg/L卡那霉素）的三角瓶中，在37°C、220rpm搖床上過夜 培養(yǎng)，將種子液按(體積比）3%接種量接種至20mL/250mL發(fā)酵培養(yǎng)基(含有25mg/L卡那霉 素）中，在37°C、220rpm搖床上培養(yǎng)24小時后取樣lmL，5000rpm離心5分鐘取上清進行莽 草酸含量的測定。
[0029] 莽草酸含量的測定方法：各實施例和對比例均相同。采用專利CN1351711中披露 的高碘酸氧化法對莽草酸的含量進行測定。取〇. 25mL發(fā)酵上清液加入0. 25mL高碘酸鹽 試劑（0· 5%H5I06 :0· 5%NaI04=l :1)，37°C 保溫 0· 5h 后加入(λ 5mL Na2SO3 和 NaOH 混合溶液 (0. 056M Na2SO3 :lMNa0H=2 :3)終止反應(yīng)，混勻后在382nm波長下測量吸光度。根據(jù)標準品 吸光度曲線計算樣品中所含莽草酸的產(chǎn)量。
[0030] 實施例1
[0031] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇0· 1%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、 檸檬酸0. 1%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基 中所含有的各組分的克數(shù)。
[0032] 實施例2
[0033] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇0· 5%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、 檸檬酸0. 1%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基 中所含有的各組分的克數(shù)。
[0034] 實施例3
[0035] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇1%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸 檬酸0· 1%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中 所含有的各組分的克數(shù)。
[0036] 實施例4
[0037] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0. 5%、NH4N030 . 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0. 1%、檸 檬酸0· 1%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中 所含有的各組分的克數(shù)。
[0038] 實施例5
[0039] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇3%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸 檬酸0· 1%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中 所含有的各組分的克數(shù)。
[0040] 實施例6
[0041] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇4%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸 檬酸0· 1%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中 所含有的各組分的克數(shù)。
[0042] 實施例7
[0043] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇5%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸 檬酸0· 1%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中 所含有的各組分的克數(shù)。
[0044] 實施例8
[0045] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、NH4NO3O. 6%、MgSO4O. 05%、酪氨酸L 0%、 檸檬酸0. 1%、K2HP040. 02%、NaC10. 03%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的 各組分的克數(shù)。
[0046] 實施例9
[0047] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、NH4NO3O. 6%、MgSO4O. 2%、酪氨酸0· 05%、 檸檬酸0. 01%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基 中所含有的各組分的克數(shù)。
[0048] 實施例10
[0049] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸2. 0%、檸 檬酸0. 2%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中 所含有的各組分的克數(shù)。
[0050] 實施例11
[0051] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、NH4NO3O. 6%、MgSO4O. 2%、酪氨酸0· 05%、 檸檬酸0. 1%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 05%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基 中所含有的各組分的克數(shù)。
[0052] 實施例12
[0053] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸 檬酸0. 1%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 6%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中 所含有的各組分的克數(shù)。
[0054] 實施例13
[0055] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· l%、NH4N033%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 5%、檸檬 酸0· 1%、K2HPO4O. 7%、KH2PO4O. 7%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所 含有的各組分的克數(shù)。
[0056] 實施例14
[0057] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨2%、ΝΗ4Ν030· l%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸檬 酸0. 15%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 05%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中 所含有的各組分的克數(shù)。
[0058] 實施例15
[0059] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 5%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸 檬酸0. 05%、K2HPO4O. 1%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中 所含有的各組分的克數(shù)。
[0060] 實施例16
[0061] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS04l%、酪氨酸0· 1%、檸檬 酸0. 1%、K2HP041%、KH2P041%、NaC12%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的 各組分的克數(shù)。
[0062] 實施例17
[0063] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、MgSO4O. 2%、酪氨酸0· 1%、檸檬酸0· 1%、 K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各 組分的克數(shù)。
[0064] 實施例18
[0065] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、胰蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸檬 酸0· 1%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所 含有的各組分的克數(shù)。
[0066] 實施例19
[0067] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、胰蛋白胨0· 1%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸檬 酸0· 1%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所 含有的各組分的克數(shù)。
[0068] 實施例20
[0069] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、胰蛋白胨2%、NH4N030 . 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0. 1%、檸檬酸 0· 1%、Κ2ΗΡ040· 3%、ΚΗ2Ρ040· l%、NaC10. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有 的各組分的克數(shù)。
[0070] 實施例21
[0071] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、酵母粉0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸檬酸 0· 1%、Κ2ΗΡ040· 3%、ΚΗ2Ρ040· l%、NaC10. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有 的各組分的克數(shù)。
[0072] 實施例22
[0073] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、酵母粉0· 1%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸檬酸 0· 1%、Κ2ΗΡ040· 3%、ΚΗ2Ρ040· l%、NaC10. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有 的各組分的克數(shù)。
[0074] 實施例23
[0075] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、酵母粉2%、NH4NO3O. 6%、MgSO4O. 2%、酪氨酸0. 1%、檸檬酸 0· 1%、Κ2ΗΡ040· 3%、ΚΗ2Ρ040· l%、NaC10. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有 的各組分的克數(shù)。
[0076] 實施例24
[0077] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、NH4NO3O. 6%、MgSO4O. 2%、酪氨酸0. 1%、檸檬酸0. 1%、 K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各 組分的克數(shù)。
[0078] 實施例25
[0079] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇 2%、（NH4)2SO4O. 6%、MgSO4O. 2%、酪氨酸 0· 1%、檸檬酸 0· 1%、 K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各 組分的克數(shù)。
[0080] 實施例26
[0081] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、KNO3O. 1%、MgSO4O. 2%、酪氨酸0· 1%、檸檬酸0· 1%、 K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各 組分的克數(shù)。
[0082] 實施例27
[0083] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、（NH4) 2S043%、MgSO4O. 2%、酪氨酸0. 1%、檸檬酸0. 1%、 K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各 組分的克數(shù)。
[0084] 實施例28
[0085] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、NH4NO3O. 6%、MgSO4O. 2%、檸檬酸0· 1%、 K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各 組分的克數(shù)。
[0086] 實施例29
[0087] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、NH4NO3O. 6%、MgSO4O. 2%、酪氨酸0· 1%、 K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各 組分的克數(shù)。
[0088] 實施例30
[0089] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇 2%、大豆蛋白胨 0· 5%、NH4NO3O. 6%、MgSO4O. 2%、K2HPO4O. 3%、 KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各組分的克數(shù)。
[0090] 實施例31
[0091] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、苯 丙氨酸〇· 1%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基 中所含有的各組分的克數(shù)。
[0092] 實施例32
[0093] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、谷 氨酸鈉0. 05%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基 中所含有的各組分的克數(shù)。
[0094] 實施例33
[0095] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、谷 氨酸鈉0. 2%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基 中所含有的各組分的克數(shù)。
[0096] 實施例34
[0097] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸 檬酸0. l%、Na2HP040. 3%、KH2P040. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各 組分的克數(shù)。
[0098] 實施例35
[0099] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、CuS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸 檬酸0· 1%、K2HPO4O. 3%、KH2PO4O. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中 所含有的各組分的克數(shù)。
[0100] 實施例36
[0101] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0. 5%、NH4N030 . 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0. 1%、檸 檬酸0. 1%、K2HP040. 3%、MnCl20. l%、NaC10. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所 含有的各組分的克數(shù)。
[0102] 實施例37
[0103] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸 檬酸0. 1%、K2HPO4O. 3%、CuSO4O. 05%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中 所含有的各組分的克數(shù)。實施例28
[0104] 實施例38
[0105] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸 檬酸0. 1%、K2HPO4O. 3%、CuSO4O. 6%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所 含有的各組分的克數(shù)。實施例29
[0106] 實施例39
[0107] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0. 5%、NH4NO3O. 6%、酪氨酸0. 1%、檸檬酸0. 1%、 NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各組分的克數(shù)。
[0108] 實施例40
[0109] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0· 5%、ΝΗ4Ν030 · 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0· 1%、檸 檬酸0. 1%。所述的百分比為每100暈升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各組分的克數(shù)。
[0110] 實施例41
[0111] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇2%、大豆蛋白胨0. 5%、NH4N030 . 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0. 1%、檸 檬酸0. 1%、NaClO. 1%。所述的百分比為每100暈升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各組分的克數(shù)。
[0112] 對比例1 (除碳源為葡萄糖外，其余組分均與實施例4相同）
[0113] 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%、大豆蛋白胨0. 5%、NH4N030 . 6%、MgS040. 2%、酪氨酸0. 1%、檸 檬酸0· 1%，K2HPO4O. 3%，KH2PO4O. 1%，NaClO. 1%。所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中 所含有的各組分的克數(shù)。
[0114] 將基于對比例1工藝下的發(fā)酵法生產(chǎn)莽草酸的產(chǎn)量定為100%，作為其他實施例的參照。
[0115] 對實施例1?31和對比例1的發(fā)酵產(chǎn)物進行莽草酸含量的檢測，結(jié)果如表1和圖 1所示。從圖1可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基以山梨醇作為碳源，相比對比例1 (傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法 以葡萄糖作為碳源）所用菌株生產(chǎn)莽草酸的能力有了明顯提升。在山梨醇含量為2%時，其 產(chǎn)量較葡萄糖作為碳源提高至750%，當山梨醇添加量超過2%時，莽草酸產(chǎn)量不再增加。若 考慮到培養(yǎng)基的成本問題，則2%的山梨醇即為本發(fā)明培養(yǎng)基的最佳添加量。
[0116] 表1各實施例和對比例發(fā)酵產(chǎn)物中莽草酸相對含量的測定結(jié)果
[0117]

【權(quán)利要求】
1. 一種生產(chǎn)莽草酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，其包括碳源，所述的碳源為0. 1?5%山 梨醇，所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的山梨醇的克數(shù)。
2. 如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基還包括1?5%氮 源和0. 1?5%無機鹽，所述的氮源選自大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、（NH4)2S04、NH 4N03和 KN03 中的一種或多種，所述的無機鹽選自 MgS04、K2HP04、KH2P04、Na 2HP04、MnCl2、CuS〇dPNaCl 中的一種或多種，所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各組分的克數(shù)。
3. 如權(quán)利要求2所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述大豆蛋白胨的添加量為0. 1? 2%，所述胰蛋白胨的添加量為0. 1?2%，所述酵母粉的添加量為0. 1?2%，所述（NH4) 2S04的 添加量為〇. 1?3%，所述NH4N03的添加量為0. 1?3%，所述KN03的添加量為0. 1?3%，所 述MgS04的添加量為0. 1?0. 6%，所述K2HP04的添加量為0. 1?0. 7%，所述KH2P04的添加 量為0. 05?0. 7%，所述Na2HP04的添加量為0. 05?0. 6%，所述MnCl2的添加量為0. 05? 0. 6%，所述CuS04的添加量為0. 1?0. 6%，所述NaCl的添加量為0. 05?0. 6%，所述的百分 比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各組分的克數(shù)。
4. 如權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的氮源為大豆蛋白胨和/或 NH4N03，所述的無機鹽為MgS04、K2HP0 4、KH2P04和NaCl的組合。
5. 如權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基還包括酪氨酸、檸 檬酸、苯丙氨酸和谷氨酸鈉中的一種或多種，所述酪氨酸的添加量為〇. 05?2%，所述檸檬 酸的添加量為〇. 01?〇. 2%，所述苯丙氨酸的添加量為0. 05?2%，所述谷氨酸鈉的添加量 為0. 05?0. 5%，所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各組分的克數(shù)。
6. 如權(quán)利要求5所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括0. 1?5%山 梨醇、0. 1?2%大豆蛋白胨、0. 1?3%NH4N03、0. 1?0. 6%MgS04、0. 05?0. 5%酪氨酸、0. 05? 〇? 15% 檸檬酸、0? 1 ?0? 7%K2HP04、0. 05 ?0? 7%KH2P04 和 0? 05 ?0? 6%NaCl，所述的百分比為 每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各組分的克數(shù)。
7. 如權(quán)利要求6所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括0. 1?5% 山梨醇、0. 5% 大豆蛋白胨、0. 6%NH4N03、0. 2%MgS04、0. 1% 酪氨酸、0. 1% 檸檬酸、0. 3%K2HP04、 0. l%KH2P0jP0. l%NaCl，所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各組分的克數(shù)。
8. 如權(quán)利要求7所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括2%山梨醇、 0? 5% 大豆蛋白胨、0? 6%NH4N03、0. 2%MgS04、0. 1% 酪氨酸、0? 1% 檸檬酸、0? 3%K2HP04、0. 1%KH2P04和0. l%NaCl，所述的百分比為每100毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中所含有的各組分的克數(shù)。
9. 一種以山梨醇作為碳源提高發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸產(chǎn)量的方法，其包括步驟：以如權(quán)利要 求1?8任一項所述的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，即可。
10. 如權(quán)利要求9所述的以山梨醇作為碳源提高發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸產(chǎn)量的方法，其特征 在于，所述的大腸桿菌為E. coli JW0379-1。
【文檔編號】C12R1/19GK104372036SQ201310356435
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月15日
【發(fā)明者】朱寶泉, 劉向磊, 林軍, 胡海峰, 周斌 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院