一株染色體整合表達(dá)木糖代謝途徑的工業(yè)釀酒酵母菌株的制作方法
【專利摘要】一株染色體整合表達(dá)木糖代謝途徑的工業(yè)釀酒酵母菌株，且不含任何篩選標(biāo)記基因的工業(yè)釀酒酵母菌株ZQ5，屬于微生物生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該菌株分類命名為Saccharomyces?cerevisiae，菌株的登記入冊編號為CGMCC?7463，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2013年4月11日。本發(fā)明還公開了重組菌株ZQ5的基因工程構(gòu)建方法，包括三個外源木糖初始利用基因的獲得，染色體整合載體的構(gòu)建，以及菌株的木糖生長實驗。重組菌株ZQ5可以利用木糖作為碳源生長，且自身不攜帶任何抗生素篩選標(biāo)記基因，故適合用于工業(yè)生產(chǎn)中。
【專利說明】一株染色體整合表達(dá)木糖代謝途徑的エ業(yè)釀酒酵母菌株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一株具有木糖利用能力，且不含有任何篩選標(biāo)記基因的エ業(yè)釀酒酵母ZQ5。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，我國能源短缺問題不斷突出。第二代生物こ醇以纖維素原材料，包括農(nóng)作物秸桿，林業(yè)廢棄物等發(fā)酵生產(chǎn)こ醇。與第一代生物こ醇不同之處在于，纖維素こ醇避免了與人爭糧，與糧征地的弊端。我國擁有大量閑置的纖維素原材料，如果能夠充分有效地利用這筆天然資源，變廢為寶，既可以保護(hù)環(huán)境，保持農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，同時也可以降低我國對于進(jìn)口石油能源的依賴和消耗。
[0003]木質(zhì)纖維素原材料基本結(jié)構(gòu)含有三個部分:纖維素，半纖維素和木質(zhì)素，由復(fù)雜的多糖結(jié)構(gòu)交織而成。纖維素水解液成分是葡萄糖，半纖維素水解液主要含有木糖。釀酒酵母作為エ業(yè)こ醇發(fā)酵的首選出發(fā)菌株，具有較強(qiáng)的葡萄糖發(fā)酵能力，但是卻不能利用木糖生長和發(fā)酵。因此，需要從天然木糖利用菌，包括細(xì)菌，假絲酵母和絲狀真菌中克隆木糖代謝途徑的相關(guān)基因，再利用基因工程手段將基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母，構(gòu)建出可利用木糖作為碳源的木糖重組菌。常用的代謝工程改造方法是在釀酒酵母中表達(dá)畢赤酵母的木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因，所獲得的重組酵母菌可將木糖在NADPH依賴的木糖還原酶作用下還原為木糖醇，再經(jīng)過NAD+依賴的木糖醇脫氫酶氧化下轉(zhuǎn)為木酮糖，經(jīng)過木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖，進(jìn)入釀酒酵母代謝。
[0004]國內(nèi)外很多研究者幾十年來專注于木糖重組菌構(gòu)建的研究，但多采用多拷貝載體提高木糖代謝途徑的酶活表 達(dá)，這類載體大都為游離質(zhì)粒載體，需要抗生素篩選，穩(wěn)定性較差，且易丟失拷貝，不能在エ業(yè)上穩(wěn)定應(yīng)用。也有采用單ー拷貝整合載體攜帯外源基因片段的，但也同時攜帶抗生素篩選標(biāo)記基因，或利用營養(yǎng)缺陷型載體，如色氨酸，亮氨酸，組氨酸等缺陷型作為篩選標(biāo)記，但是這類篩選標(biāo)記載體無法適用于大規(guī)模的エ業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用，營養(yǎng)缺陷型酵母菌的生長受到影響。本發(fā)明采用的PAUR135整合表達(dá)載體，不僅避免了利用抗生素選擇，可穩(wěn)定遺傳，在完成整合后還可以自動刪除抗性片段，只保留外源片段在染色體組上，更適合用于大規(guī)模エ業(yè)生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一株可以利用木糖作為碳源的重組エ業(yè)釀酒酵母菌株，從而更可以利用纖維素原料水解液中的木糖作為碳源。
[0006]本發(fā)明涉及一株染色體整合表達(dá)木糖代謝途徑的エ業(yè)釀酒酵母菌株，且不含任何篩選標(biāo)記基因的エ業(yè)釀酒酵母菌株ZQ5,該菌株分類命名為Saccharomyces cerevisiae(釀酒酵母)，菌株的登記入冊編號為CGMCC N0.7463，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年4月11日。所述菌株含有木糖代謝途徑，利用木糖生長。所述菌株含有三個木糖利用基因木糖還原酶基因PsXR，木糖脫氫酶PsXDH，木酮糖激酶基因ScXK，前兩個基因來自樹干畢赤酵母Pichia stipitis JCM10742，最后ー個基因來自實驗室模式釀酒酵母S288c?；蛐蛄械?GenBank 登錄號分別為 X59465，AF127801.1，NM_001181323。PGKl 啟動子序列 GenBank登錄號為FJ415226.1，CYCl終止子序列GenBank登錄號為EF210198.1。采用釀酒酵母第十六條染色體YPRCdeltal5,LTR(Long Tandem Repeat)位點整合,選擇其上游700bp和下游650bp序列作為同源臂進(jìn)行同源整合。
[0007]本發(fā)明采用寶生物(大連)公司pAUR135載體(貨號D3604)進(jìn)行木糖代謝基因的整合表達(dá),PAUR135DNA可以利用載體本身的DNA序列將釀酒酵母轉(zhuǎn)化子中的載體部分序列包括抗生素選擇標(biāo)記AURl-C基因(賦予酵母菌金擔(dān)子素Aureobasidin A，AbA抗性)去除，從而實現(xiàn)抗生素標(biāo)記的循環(huán)利用。該載體上帯有的GIN11M86基因在GallO啟動子和半乳糖作用下過量表達(dá)，可以使用宿主致死，因此可用于載體除去型重組體的篩選，獲得AbA敏感型的克隆(只含目的基因，完全沒有任何外源其他片段)。
[0008]本發(fā)明的有益成果是:本發(fā)明中的釀酒酵母木糖重組菌ZQ5可以利用木糖為碳源生長。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖lpZQ5各個片段PCR擴(kuò)增。
[0010]圖2pZQ5串聯(lián)載體構(gòu)建。
[0011]圖3陽性轉(zhuǎn)化子PCR鑒定。
[0012]圖4木糖重組菌ZQ5在50g/l木糖，100g/l葡萄糖中發(fā)酵結(jié)果。
【具體實施方式】
[0013]實施例1:含木糖初始代謝途徑基因的エ業(yè)釀酒酵母的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化
[0014]本發(fā)明涉及的三個木糖初始利用基因序列來自于NCBI公共數(shù)據(jù)庫，其中PsXR基因(EC: 1.1.1.2)的登錄號是 X59465 ;PsXDH 基因(EC1.1.1.9)的登錄號是 AF127801.1 ；ScXK基因(EC2.7.1.17)的登錄號是NM_001181323。PsXR和PsXDH基因的啟動子都用PGKl啟動子，ScXK使用ADHl啟動子，三個基因都是用CYCl終止子作為終止子，并且三個基因串聯(lián)連在染色體整合載體 pAUR-PGKlp-PsXR-CYClt-PGKlp-PsXDH-CYClt-ADHlp-ScXK-CYClt，同時這個基因盒的上下游加入同源臂序列20up和20down，每個片段之間分別以不同限制性內(nèi)切酶位點連在一起，共同插入酵母第十六染色體YPRCdeltal5位點。該載體的抗生素選擇性標(biāo)記為氨芐青霉素(大腸桿菌)和金擔(dān)子素(釀酒酵母)，當(dāng)將線性化載體電轉(zhuǎn)入釀酒酵母S.cerevisiae4126后，金擔(dān)子素篩選標(biāo)記基因會自動被刪除，故在重組的ZQ5的染色體上無任何抗生素篩選標(biāo)記基因存在。
[0015]1.1釀酒酵母基因組DNA提取
[0016](I)將過夜培養(yǎng)的酵母菌液離心，12000rpm，2min，去上清；
[0017](2)向沉淀加入 480 ii L TE 溶液(pH8.0), 20 ii L lysozyme (2mg/mL),震蕩混勻后放入37°C搖床1.5小時；
[0018](3)加入適量RNase A，再次放入37°C搖床0.5小時；
[0019](4)從搖床中拿出，加入50iiL20%SDS溶液，5iiL蛋白酶K (PK濃度為20 y g/mL)混合震蕩，55°C水浴鍋中放置Ih以上；
[0020](5)離心將管蓋上附著的液體收集到管底；加入500i! L苯酚:氯仿:こ戊醇(25:24:1)，震蕩混勻后，12000rpm離心10分鐘，取上清液，轉(zhuǎn)新管；
[0021](6)加入等體積異丙醇，放入_20°C冰箱I小時以上，沉淀DNA ；
[0022](7)12000rpm離心10分鐘,去上清液，加入lmL70%こ醇,洗沉淀I一2次，12000rpm離心8分鐘，棄上清；
[0023](8) 37°C干燥后加入 TE (pH8.0)50 U L 溶解 DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0024]1.2PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因條帶
[0025]以Pichia stipitis JCM10742DNA 作為模板擴(kuò)增基因 XYLl 和 XYL2，以 S.cerevisiaeS288c DNA作為模板擴(kuò)增基因XYKS，以S.cerevisiae6525DNA作為模板擴(kuò)增基因的上下游同源臂序列，20up, 20down。引物序列如下:
[0026]表1.2-1基因擴(kuò)增引物信息
[0027]`
【權(quán)利要求】
1.一株染色體整合表達(dá)木糖代謝途徑的エ業(yè)釀酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae),其特征在干:所述菌株為不帶有任何篩選標(biāo)記基因的エ業(yè)釀酒酵母ZQ5，其登記入冊編號為CGMCC7463，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2013年4月11日。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色體整合表達(dá)木糖代謝途徑的エ業(yè)釀酒酵母菌株，其特征在于:所述菌株含有三個木糖利用基因木糖還原酶基因PsXR，木糖脫氫酶PsXDH，木酮糖激酶基因ScXK，前兩個基因來自樹干畢赤酵母Pichia stipitis JCM10742，最后ー個基因來自實驗室模式釀酒酵母S288c。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色體整合表達(dá)木糖代謝途徑的エ業(yè)釀酒酵母菌株，其特征在于:所述菌株含有木糖代謝途徑，利用木糖生長。
【文檔編號】C12R1/865GK103484388SQ201310164960
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月7日
【發(fā)明者】趙心清, 左頎, 白鳳武 申請人:大連理工大學(xué)