專利名稱：用于疾病篩查的血樣采集卡及含有該血樣采集卡的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于疾病，特別是遺傳性疾病篩查的血樣采集卡及含有該血樣采集卡的試劑盒。
背景技術(shù)：
新生兒疾病篩查是指對(duì)剛出生的寶寶，通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)某些危害嚴(yán)重的先天性遺傳代謝性疾病，從而早期診斷、早期治療，避免寶寶因腦、肝、腎等損害導(dǎo)致智力、體力發(fā)育障礙甚至死亡。血樣采集卡是新生兒疾病篩查主要血液樣本保存的載體之一，目前大多使用進(jìn)口的FTA卡或進(jìn)口 903濾紙作為載體，價(jià)格高昂且受制于國外貨源，為避免出現(xiàn)因進(jìn)口貨源緊 張從而影響我國新生兒疾病篩查的血樣采集工作開展，亟待開發(fā)一種原料易得且價(jià)格低廉的遺傳性疾病血樣采集卡及與其相適用的DNA提取方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于疾病，特別是遺傳性疾病篩查的血樣采集卡。本發(fā)明的另一目的是提供含有上述血樣采集卡的用于血樣DNA提取的試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于疾病篩查的血樣采集卡，包括用于吸附血液樣本的吸附材料和紙張，所述吸附材料附著于紙張一側(cè)，吸附材料上印刷有采集圈，所述紙張包含如下信息個(gè)人信息登記、采血方法及注意事項(xiàng)；所述用于吸附血液樣本的吸附材料可以是任何能夠吸附血液的片狀材料，包括各種紙張和布料等材料，如棉質(zhì)布料、書寫紙、定性濾紙、定量濾紙、903#濾紙或生活衛(wèi)生用紙等。其是采用粘貼、裝訂或縫合等方法使吸附材料附著于紙張上。所述血樣采集卡由無菌塑料袋封裝,有效防止血樣與異物接觸或被擠壓破損而污染。優(yōu)選在所述無菌塑料袋內(nèi)添加少量防潮劑。前述的血樣采集卡，所述采集圈的形狀為圓形或其它幾何形狀。優(yōu)選所述采集圈為直徑I. 5cm的圓形，采集圈的數(shù)量為3-5個(gè)?？蓪⒓s50 μ I抗凝全血滴至圓形采集圈中心，抗凝全血擴(kuò)散邊緣應(yīng)不超過采集圈邊緣，即全血擴(kuò)散直徑不超過I. 5cm。前述的血樣采集卡，記錄采樣對(duì)象相關(guān)信息的紙張為無碳復(fù)寫三聯(lián)單，記錄內(nèi)容詳細(xì)具體并有電子版?zhèn)浞?，可設(shè)有條形碼粘貼處，通過條形碼掃描便于查找樣本記錄信息。對(duì)于醫(yī)療條件比較差的地區(qū)，采集的血樣不能被及時(shí)檢測(cè)的，可將血液樣本滴在血樣采集卡上保存，然后運(yùn)輸或郵寄送往具備檢測(cè)手段和設(shè)施的單位進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明還提供含有上述血樣采集卡述的用于血樣DNA提取的試劑盒。該試劑盒還含有組織消化液、LiCl溶液、蛋白酶K和TE溶液。其中，組織消化液為8mMTris-HCl+8mM EDTA+8mM NaCl+0. 5%SDS ；LiCl 溶液 6. 5mol/l ;蛋白酶 K 20mg/ml ;TE 溶液為 IOmMTris-HCl+0. ImM EDTA。本發(fā)明還提供上述試劑盒在提取血樣DNA中的應(yīng)用。包括步驟
I)用血樣采集卡采集血樣，室溫保存；2)將干血片置于離心管中；3)向離心管中加入組織消化液，再加入蛋白酶K，震蕩；4)置于50°C水浴中消化，消化過程中顛倒混勻；5)消化后，加入LiCl溶液，震蕩，冰?。?) 13000rpm離心10分鐘，取500 μ I上清移入另一離心管中；7)加入Iml冰預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻后室溫放置10分鐘；8) 13000rpm離心10分鐘,棄上清,加入Iml冰預(yù)冷70%乙醇,顛倒混勻；
9) 13000rpm離心5分鐘，棄上清，瞬時(shí)離心I次，去除殘留乙醇，室溫干燥至乙醇揮發(fā)完全；10)用TE溶液或水溶解DNA。具體地，利用上述試劑盒提取血樣DNA，包括如下步驟I)用血樣采集卡采集血樣，每片50 μ 1，室溫保存；2)將I片干血片置入I. 5ml離心管中；3)向離心管中加入350 μ I組織消化液，再加入5 μ I蛋白酶K，用渦旋混合器震蕩5秒鐘；4)置于50°C水浴中消化2小時(shí)，分別在消化30分鐘、60分鐘時(shí)顛倒混勻；5)消化2小時(shí)后，每管加入300 μ I LiCl溶液，用渦旋混合器震蕩5秒鐘，冰浴10分鐘；6) 13000rpm離心10分鐘，取500 μ I上清移入另一離心管中；7)加入Iml冰預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻后室溫放置10分鐘；8) 13000rpm離心10分鐘,棄上清,加入Iml冰預(yù)冷70%乙醇,顛倒混勻；9) 13000rpm離心5分鐘，棄上清，瞬時(shí)離心I次，去除殘留乙醇，室溫干燥30分鐘至乙醇揮發(fā)完全；10)用50 μ I TE溶液或水溶解DNA。相比于現(xiàn)有疾病篩查采集卡，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(一)樣本保存方便室溫保存即可，無需低溫冷藏條件。(二)樣本保存時(shí)間長(zhǎng)存儲(chǔ)于血樣采集卡上的樣本，室溫保存20年以內(nèi)，仍能用于相關(guān)基因及致病基因的分子方法檢測(cè)。(三)樣本運(yùn)送方便快捷適合于邊遠(yuǎn)地區(qū)郵政快遞運(yùn)輸。(四)需要的血液樣本少，一般采集50微升即可。(五)血樣DNA提取效果佳，操作簡(jiǎn)單，成本低廉。(六)用于吸附血液樣本的吸附材料取材廣泛，不局限于進(jìn)口FTA卡或進(jìn)口 903#濾紙，普通紙張或布料等潔凈材料均可用作吸附材料。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例I中優(yōu)選的用于遺傳性疾病篩查的血樣采集卡的正面示意圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例I用于遺傳性疾病篩查的血樣采集卡及其制備
血樣采集卡由包括兩部分，即用于吸附血液樣本的吸附材料和含有個(gè)人信息登記表格、采血方法及注意事項(xiàng)說明的紙張。所述吸附材料附著于紙張一側(cè)，吸附材料上印刷有4個(gè)直徑為I. 5cm的圓形采集圈。這種印刷工藝便于從濾紙上完整無污染的取出血樣標(biāo)本。用于吸附血液樣本的吸附材料可以是任何能夠吸附血液的片狀材料，包括各種紙張和布料等材料，如棉質(zhì)布料、書寫紙、定性濾紙、定量濾紙、903#濾紙或生活衛(wèi)生用紙等。個(gè)人信息登記表格部分折疊完全包覆吸附材料，有效防止血樣與異物接觸或被擠壓破損而污染。收集血液樣本方法的說明打印在個(gè)人信息登記表格的背面，便于操作者正確、安全、及時(shí)的進(jìn)行血樣采集。個(gè)人信息登記表格為記錄采樣對(duì)象相關(guān)信息的無碳復(fù)寫三聯(lián)單，記錄內(nèi)容詳細(xì)具體并有電子版?zhèn)浞?，專設(shè)有條形碼粘貼處，通過條形碼掃描便于查找樣本記錄信息。血樣采集卡外面由無菌塑料自封袋封裝，內(nèi)含防潮劑。本血樣采集卡用于抗凝全血的采集、存儲(chǔ)和運(yùn)輸。血樣標(biāo)本采集卡所采集、存儲(chǔ)的血樣可用于DNA提取及PCR檢測(cè)。將50 μ I抗凝全血滴至圓形采集圈中心，抗凝全血擴(kuò)散邊緣應(yīng)不超過采集圈邊緣，即全血擴(kuò)散直徑不超過I. 5cm。對(duì)于醫(yī)療條件比較差的地區(qū)，采集的血樣不能被及時(shí)檢測(cè)的，可將血液樣本滴在血樣采集卡上保存，然后運(yùn)輸或郵寄送往具備檢測(cè)手段和設(shè)施的單位進(jìn)行檢測(cè)。圖I為優(yōu)選的用于遺傳性疾病篩查的血樣采集卡的正面示意圖。實(shí)施例2含有血樣采集卡的用于血樣DNA提取的試劑盒試劑盒組成I、實(shí)施例I的血樣采集卡；2、組織消化液8mM Tris_HCl+8mM EDTA+8mM NaCl+0. 5% SDS ；3、LiCl 溶液 6. 5mol/l ；4、蛋白酶 K 20mg/ml ；5、TE 溶液10mM Tris-HCl+0. ImM EDTA。實(shí)施例3含有血樣采集卡的試劑盒用于提取血樣DNA利用實(shí)施例2的含有血樣采集卡的試劑盒進(jìn)行血樣DNA提取，操作如下I)用血樣采集卡采集血樣，每片約50 μ I，室溫保存；2)將I片干血片置入I. 5ml離心管中；3)向離心管中加入350 μ I組織消化液，再加入5 μ I蛋白酶K，用渦旋混合器震蕩5秒鐘；4)置于50°C水浴中消化2小時(shí)，分別在消化30分鐘、60分鐘時(shí)顛倒混勻；5)消化2小時(shí)后，每管加入300 μ I LiCl溶液，用渦旋混合器震蕩5秒鐘，冰浴10分鐘；6) 13000rpm離心10分鐘，取500 μ I上清移入一個(gè)新的離心管中；7)加入Iml冰預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻后室溫放置10分鐘；8) 13000rpm離心10分鐘,棄上清(不能甩棄,吸棄時(shí)勿觸及管底部),加入Iml冰預(yù)冷70%乙醇，顛倒混勻；
9) 13000rpm離心5分鐘，棄上清，重新置于離心機(jī)內(nèi)瞬時(shí)離心I次,用移液器將殘留乙醇吸棄干凈，室溫干燥30分鐘，至乙醇完全干燥(若乙醇未完全干燥，可能會(huì)影響后續(xù)PCR擴(kuò)增)；10)用50 μ I TE溶液或水溶解DNA。實(shí)施例4含有血樣采集卡的試劑盒在檢測(cè)耳聾基因中的應(yīng)用I. I測(cè)試方法(I)以10個(gè)GJB2基因235位點(diǎn)缺失突變的人和10個(gè)GJB2基因235位點(diǎn)正常人
作為受試者。
(2)對(duì)所有受試者進(jìn)行取血50微升，滴到血樣采集卡上，晾干。(3)將20個(gè)受試者的血片進(jìn)行DNA提取，方法同實(shí)施例3。(4)將提取的20個(gè)受試者的DNA樣本進(jìn)行分子技術(shù)檢測(cè)，步驟為取一定量受試者的血樣DNA作為模板，采用設(shè)計(jì)合成的GJB2基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)測(cè)序結(jié)果判斷受試者是否為耳聾基因攜帶者。GJB2基因序列在Genbank上的登錄號(hào)為 NC_000013. 9，GI: 51511729。表I GJB2基因PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種用于疾病篩查的血樣采集卡，其特征在于，包括用于吸附血液樣本的吸附材料和紙張，所述吸附材料附著于紙張一側(cè)，吸附材料上印刷有采集圈，所述紙張包含如下信息個(gè)人信息登記、采血方法及注意事項(xiàng)；其中，所述用于吸附血液樣本的吸附材料選自棉質(zhì)布料、書寫紙或生活衛(wèi)生用紙。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血樣采集卡，其特征在于，采用粘貼、裝訂或縫合的方法使所述吸附材料附著于紙張上。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血樣采集卡，其特征在于，所述血樣采集卡由無菌塑料袋封裝。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血樣采集卡，其特征在于，所述無菌塑料袋內(nèi)還含有防潮劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血樣采集卡，其特征在于，所述采集圈的形狀為圓形或其它幾何形狀。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的血樣采集卡，其特征在于，所述采集圈為直徑I.5cm的圓形， 采集圈的數(shù)量為3-5個(gè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血樣采集卡，其特征在于，所述紙張為無碳復(fù)寫三聯(lián)單。
8.含有權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述血樣采集卡的用于血樣DNA提取的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還含有組織消化液、LiCl溶液、蛋白酶K和TE溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，組織消化液為8mMTris-HCl+8mM EDTA+8mM NaCl+0. 5%SDS ；LiCl 溶液 6. 5mol/l ;蛋白酶 K 20mg/ml ；TE 溶液為 IOmM Tris-HCl+0. ImM EDTA0
10.權(quán)利要求8或9所述試劑盒在提取血樣DNA中的應(yīng)用，其特征在于，包括步驟1)用血樣采集卡采集血樣，室溫保存；2)將干血片置于離心管中；3)向離心管中加入組織消化液，再加入蛋白酶K，震蕩；4)置于50°C水浴中消化，消化過程中顛倒混勻；5)消化后，加入LiCl溶液，震蕩，冰?。?)13000rpm離心10分鐘，取500 μ I上清移入另一離心管中；7)加入Iml冰預(yù)冷的無水乙醇,顛倒混勻后室溫放置10分鐘；8)13000rpm離心10分鐘,棄上清,加入Iml冰預(yù)冷70%乙醇,顛倒混勻；9)13000rpm離心5分鐘，棄上清，瞬時(shí)離心I次，去除殘留乙醇，室溫干燥至乙醇揮發(fā)完全；10)用TE溶液或水溶解DNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于疾病篩查的血樣采集卡，包括用于吸附血樣的吸附材料和含有個(gè)人信息登記、采血方法及注意事項(xiàng)的紙張，該吸附材料附著于紙張一側(cè)，吸附材料上印刷有采集圈，吸附材料選自棉質(zhì)布料、書寫紙或生活衛(wèi)生用紙等。本發(fā)明還提供含有該血樣采集卡的用于血樣DNA提取的試劑盒。采用本發(fā)明的血樣采集卡及試劑盒提取血樣DNA，從而進(jìn)行相關(guān)基因檢測(cè)，具有以下優(yōu)點(diǎn)樣本室溫保存即可，無需低溫冷藏條件；存儲(chǔ)于血樣采集卡上的樣本，室溫保存20年以內(nèi)，仍能用于相關(guān)基因的檢測(cè)，保存時(shí)間長(zhǎng)；樣本運(yùn)送方便快捷，適合于邊遠(yuǎn)地區(qū)郵政快遞運(yùn)輸；需要的血液樣本少，一般采血量約50μl；血樣DNA提取效果佳，操作簡(jiǎn)單，成本低廉。
文檔編號(hào)C12Q1/24GK102925346SQ20121043656
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月5日
發(fā)明者張志棟, 楊君, 黃茜, 易翔 申請(qǐng)人:中生北控生物科技股份有限公司