專利名稱：超級細菌ndm和kpc基因雙重熒光定量pcr檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光定量PCR技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及檢測超級細菌耐藥基因的雙重熒光定量PCR技術(shù)及其試劑盒。
背景技術(shù)：
碳青霉烯是有著廣譜抗菌活性的一類β -內(nèi)酰胺類抗生素，常作為治療高產(chǎn)Ampc和超廣譜的β_內(nèi)酰胺酶的革蘭陰性桿菌引起的感染的最有效的藥物。但隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，細菌也逐漸獲得對此類藥物的耐藥性。近年來，耐碳青霉烯的非發(fā)酵菌已成為醫(yī)院感染的嚴重問題，而且耐碳青霉烯的腸桿菌細菌的報道也越來越多，這種耐碳青霉烯的革蘭陰性桿菌的快速傳播和流行正日益成為令人擔憂的全球性問題。細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥主要原因是產(chǎn)生碳青霉烯酶，其包括Ambler 分子分類的Α、B、D三類酶。其中A類中的新增成員KPC (Klebsiella PneumoniaeCarbapenemase)和 B 類中新增成員 NDM (New Delhi metallo-β-lactamase),因其能夠水解除頭霉素類以外幾乎所有的β_內(nèi)酰胺類抗菌藥物而引起了世界各國抗感染專家和臨床微生物工作者的極大關(guān)注。攜帶有NDM或KPC基因的細菌也被稱為“超級細菌”。特別是攜帶有NDM的“超級細菌”目前僅對替加環(huán)素和黏菌素敏感，但是前者具有毒副作用，后者只能用于治療部分種類的細菌感染，一般不適合大規(guī)模使用而且對黏菌素耐藥的多重耐藥菌株目前已有報道。由NDM或KPC型的“超級細菌’感染造成的暴發(fā)流行，往往使治療陷入無藥可用的境地，給臨床抗感染治療帶來極大挑戰(zhàn)。因此及時檢測NDM和KPC基因，對細菌耐藥表型進行監(jiān)測，控制和杜絕超級細菌的爆發(fā)流行顯得至關(guān)重要。目前主要利用分子生物學技術(shù)檢測攜帶NDM或KPC基因的超級細菌，PCR的方法更是被譽為檢測的“金標準”。但普通PCR容易產(chǎn)生非特異性擴增，甚至會因為操作的原因出現(xiàn)假陽性或假陰性，而且普通PCR的結(jié)果判斷需要對產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，操作不夠簡化。目前尚缺乏一種靈敏度高、特異性好、操作簡便，且能對同時對KPC和NDM基因進行聯(lián)合檢測的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種超級細菌NDM和KPC基因雙重熒光定量PCR檢測方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
一種超級細菌的雙重熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟
(1)提取待檢樣本的DNA|旲板；
(2)對DNA模板進行PCR擴增，所用引物和探針序列如下
NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I),
NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),NDM 基因的探針 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3),
KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4),
KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),
KPC 基因的探針 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCA TTCAAGG (SEQ ID NO. 6)；
所用探針標記的熒光基團互不相同；
(3)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束，根據(jù)待測樣本的Ct值判斷其是否為NDM、KPC基因陽性。上述雙重熒光定量PCR擴增體系為10μ I的Premix Ex Taq (Probe qPCR)(2X)，10Mmol/L 的 NDM 和 KPC 上下游上下游引物各 O. 4μ1，5Mmol/L 的 NDM-probe 和KPC-probe 各 O. 2μ1，ROX Reference Dye II 0· 4μ1，待檢 DNA 模板或陽性對照 DNA 或陰性對照 μ ，加滅菌去離子水補足體積至20μ1。上述雙重熒光定量PCR反應(yīng)條件為95°C預變性20s ;然后95°C 3s，60°C 30s，反應(yīng)40個循環(huán)。上述探針標記熒光為J0E-ECLIPSE和FAM-ECLIPSE。所用熒光定量PCR儀為美國ABI 7500 FAST。一種超級細菌的雙重熒光定量PCR檢測試劑盒，包括如下成分Premix Ex Taq(Probe qPCR) (2X)、引物、探針、ROX Reference Dye II、陽性對照品、陰性對照品，其中引物和探針序列分別為
NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I),
NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),
NDM 基因的探針 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3),
KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4),
KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),
KPC 基因的探針 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG (SEQ ID NO. 6)；
所用探針標記的熒光基團互不相同。上述陽性對照品為NDM和KPC基因陽性的DNA標本混合物，陰性對照品為滅菌去離子水。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明方法能在同一體系同時完成KPC和NDM兩個基因的檢測，較單重熒光定量PCR更加高效、省時省力。本方法特異性好、重復性佳、靈敏性高，且可以利用已建立的標準曲線對未知樣本進行定量分析。


圖I為特異性實驗擴增曲線 圖2為敏感性實驗擴增曲線 圖3為重復性試驗擴增曲線 圖4為標準曲線 圖5為臨床標本擴增曲線圖。
具體實施方式
實施例I
超級細菌NDM和KPC基因雙重熒光定量PCR檢測方法的引物和Taqman探針的設(shè)計與合成
(I)引物和探針的設(shè)計方法
在GeneBank上下載NDM和KPC基因所有亞型的序列，到目前為止NDM共六個亞型NDM-I，NDM-2, NDM-3，NDM-4，NDM-5，NDM-6 對應(yīng)的 GeneBank 序列號分別是 AB614355，JF703135，JQ734687，JQ348841，JN104597, JN967644 ;KPC 共 11 個亞型分別為 KPC-2，KPC-3，KPC-4, KPC-5, KPC-6, KPC-7，KPC-8，KPC-9，KPC-10, KPC-II, KPC-12, GeneBank 序列號依次是 AY034847，AF395881, FJ473382, EU400222, EU555534, EU729727, FJ234412, FJ624872,GQ140348，HM066995，HQ641421。利用 Beacon Designer 7 軟件分別針對 NDM 和 KPC 基因各亞型間保守的區(qū)域設(shè)計引物和探針，使引物或探針與模板的結(jié)合點避開突變區(qū)域。設(shè)計好的引物和探針通過01igo6. 44、DNAstar、Primer Premier5. 0等多種軟件進行評估，且所有 引物在NCBI數(shù)據(jù)庫(www. ncbi.nlm.nih. gov)上BLAST均未見除目的基因外的其他同源序列。(2)引物和探針序列
NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I),
NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),
NDM 基因的探針 NDM-probe JOE-TGGCAGCACACTTCCTATCTCG- ECLIPSE (SEQ ID NO. 3),KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4),
KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),
KPC 基因的探針 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG (SEQ ID NO. 6)；
所用探針標記的熒光基團互不相同；
(3)引物和Taqman探針均由大連Takara生物公司合成并進行突光標記。實施例2 Cl)菌株
選取南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院微生物室臨床分離的耐碳青霉烯的腸桿菌科細菌和耐碳青霉烯的非發(fā)酵菌中的不動桿菌和銅綠假單胞菌，同一病人多次分離的菌株若屬種相同則只留取一株，共166株，其中大腸埃希菌I株、陰溝腸桿菌I株、肺炎克雷伯菌9株、產(chǎn)酸克雷伯菌I株、鮑曼不動桿菌73株和84株銅綠假單胞菌。臨床分離的菌株利用BDPhoenixlOO全自動微生物分析儀分析系統(tǒng)及其配套細菌鑒定卡進行菌種鑒定和藥敏試驗，頭孢哌酮/舒巴坦和米諾環(huán)素藥敏試驗采用K-B法，藥敏紙片購自英國0X0ID公司。NDM和KPC基因的陽性對照株(編號分別是856和432)為本發(fā)明人常規(guī)PCR法檢測并經(jīng)測序驗證的陽性標本，GeneBank序列號分別為JN711113和JF431928。陰性株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黃色葡萄球菌ATCC25923。(2)試劑和儀器
常規(guī)PCR反應(yīng)試劑和熒光定量PCR反應(yīng)試劑及細菌DNA提取試劑盒均購自寶生物工程Takara大連有限公司。質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司。Thermo公司核酸分析儀。Bio-Rad GeldocXR凝膠成像儀。德國eppendorf公司的Mastercycler梯度PCR儀。美國ABI 7500 FAST熒光定量PCR儀。DNA測序服務(wù)由北京六合華大基因公司提供。(3)擴增體系和反應(yīng)條件
①雙重實時熒光定量PCR擴增體系和反應(yīng)條件
擴增反應(yīng)在AB17500 FAST熒光定量PCR儀上進行。反應(yīng)體系為20μ1 =Premix Ex Taq(Probe qPCR) (2 X) 10μ1 ; 10Mmol/L 的 NDM 和 KPC 上下游引物各 O. 4μ1 ;5Mmol/L 的NDM-probe 和 KPC-probe 各 O. 2μ1 ；R0X Reference Dye II 0. 4μ1 ;待檢 DNA 模板或陽性對照DNA或陰性對照 μ ，加滅菌去離子水補足20μ1體積。反應(yīng)條件95°C預變性20s ；95°C變性3s，60°C退火并延伸30s，40個循環(huán)。②普通PCR擴增體系和反應(yīng)條件
NDM和KPC兩基因普通PCR反應(yīng)在德國印pendorf公司的Mastercycler梯度PCR儀上進行。所用引物序列如下
Endm-F CACCTCATGTTTGAATTCGCC (SEQ ID NO. 7)；
Endm-R CTCTGTCACATCGAAATCGC (SEQ ID NO. 8)；
Ekpc-F ATGTCACTGTATCGCCGTCT (SEQ ID NO. 9)；
Ekpc-R TTTTCAGAGCCTTACTGCCC (SEQ ID NO. 10)；
擴增反應(yīng)體系為20μ1 含Mg2+的10 X buffer 2 μ I，dNTP終濃度為200 μ mol/L,10 μ mol/L的上下游引物各為0. 8 μ 1，DNA模板I μ 1，TaqDNA聚合酶I U，加入滅菌去離子水至20 μ I。反應(yīng)條件95°C預變性5min ;95°C變性30s，57°C退火40s并72°C延伸lmin，30個循環(huán)。取5μ1擴增產(chǎn)物與 μ 6 X Loading buffer上樣緩沖液混勻,在1%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳緩沖液為0. 5 X TBE,電壓為5V/cm，電泳20分鐘。通過Bio-Rad GeldocXR凝膠成像儀自動讀取電泳結(jié)果。(4)實驗步驟 ①質(zhì)粒標準品的構(gòu)建
利用本發(fā)明人已建立的NDM和KPC常規(guī)PCR擴增法對測序確認的陽性DNA標本分別進行NDM和KPC擴增，PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳，確認目的條帶有擴增，分別將NDM和KPC基因的PCR擴增產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體上，挑取陽性克隆轉(zhuǎn)化至DH5a大腸桿菌中，增殖后提取質(zhì)粒DNA進行序列測定以鑒定插入序列，并測定質(zhì)粒DNA濃度以進行拷貝數(shù)的換
笪
ο②模板DNA的提取
按照 TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver. 3· O 的說明利用此試劑盒提取細菌基因組DNA。通過Thermo公司核酸分析儀測定0D260 / 0D280值以確定DNA濃度。③敏感性
分別將構(gòu)建的NDM和KPC質(zhì)粒標準品進行10倍梯度稀釋，使起始濃度均為IO8拷貝數(shù)/μ 終濃度均為10拷貝數(shù)/μι (IO8、107、IO6、105、IO4、103、IO2、10)。以上述一系列稀釋的質(zhì)粒標準品作為模板，按照上述反應(yīng)體系進行多重實時熒光定量PCR反應(yīng)，在同一體系內(nèi)同時擴增NDM和KPC基因，并以稀釋倍數(shù)的log值為橫坐標，擴增的Ct值為縱坐標制作標準曲線，根據(jù)曲線參數(shù)來評價實驗結(jié)果的可信度。④特異性對NDM和KPC基因均陰性的標準株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黃色葡萄球菌ATCC25923進行雙重PCR體系特異性性實驗。并將NDM (編號為856)和KPC (編號為432)基因陽性的DNA標本等比例混合后取混合的DNA樣本作為陽性對照品，以滅菌去離子水空白作為陰性對照同時進行雙重實時熒光定量PCR反應(yīng)。⑤重復性
以濃度為IO5拷貝/μ 的NDM和KPC質(zhì)粒標準品I: I混合作為模板重復8次，對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，計算變異系數(shù)(CV)。⑥檢測臨床分離菌株
對臨床分離的166株耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌提取基因組DNA后，利用已經(jīng)建立的雙重熒光定量PCR法進行KPC和NDM基因檢測，通過NDM和KPC普通PCR檢測法和測序技術(shù)·對檢測結(jié)果進行驗證并且陽性標本經(jīng)測序可進一步確定其基因亞型。(4)結(jié)果 ①特異性
NDM和KPC等比例混合的陽性對照DNA標本按照已建立的反應(yīng)體系擴增后可見兩條S型曲線即NDM的擴增曲線和KPC的擴增曲線，指數(shù)期明顯，且基線無上揚現(xiàn)象。大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黃色葡萄球菌ATCC25923均無擴增，見圖I。此結(jié)果表明本發(fā)明建立的雙重熒光定量PCR法有良好的特異性。②敏感性
在同一擴增體系中同時加入10倍梯度稀釋的NDM和KPC質(zhì)粒標準品，起始濃度均為IO8拷貝數(shù)/μ ，終濃度均為10拷貝數(shù)/μι ( ο8、 ο7、 ο6、 ο5、 ο4、 ο3、io2、10)。結(jié)果顯示ndm和KPC —系列稀釋的質(zhì)粒標準品均有良好的S型擴增曲線，基線無上揚現(xiàn)象，指數(shù)期明顯，并且有較好的平行性，見圖2。說明NDM和KPC基因均能至少檢測到10個拷貝數(shù)的質(zhì)粒，表明該方法敏感性高。③重復性
以IO5拷貝/μ 的I: I混合的NDM和KPC質(zhì)粒標準品作為模板，重復做8次試驗，計算各重復樣品反應(yīng)Ct值之間的變異系數(shù)，擴增曲線見圖3。NDM的結(jié)果為I. 8%,KPC的結(jié)果為
0.5%。對于檢測方法來說，統(tǒng)計結(jié)果的變異系數(shù)CV值〈5%即可以認為該方法的重復性良好。從本實施例的結(jié)果CV值〈5%，因此該方法具有較好的重復性。④標準曲線
為了準確定量未知的待檢模板的濃度，利用模板濃度和陽性擴增的Ct值之間的相關(guān)關(guān)系，建立的NDM和KPC基因擴增的標準曲線見圖4，NDM基因的標準曲線為Υ=_3. 273X log (X)+40. 357，KPC 基因的標準曲線為 Y=-2. 997 X log (X)+34. 248，其中 Y 為 Ct 值，X為拷貝數(shù)，R2分別為O. 971和O. 992，擴增效率分別是102. 066%和115. 615%。上述結(jié)果表明本發(fā)明建立的標準曲線線性關(guān)系較好，能夠通過標準曲線對未知濃度的樣本進行定量。⑤臨床分離菌株檢測
對臨床分離的166株耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌基因組DNA為模板分別進行常規(guī)PCR檢測和雙重熒光定量PCR檢測，雙重熒光定量PCR法檢測結(jié)果9株肺炎克雷伯菌檢出KPC基因；1株產(chǎn)酸克雷伯菌NDM陽性，I株陰溝腸桿菌NDM陽性，不動桿菌中有兩株NDM陽性；其余標本KPC和NDM均陰性，未見同時攜帶有兩個基因的標本，擴增曲線見圖5。這與常規(guī)PCR法檢測結(jié)果完全一致。NDM和KPC陽性PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，4株NDM陽性菌株均攜帶NDM-I基因，9株KPC陽性的菌株均攜帶KPC-2基因，此外兩株NDM陽性的不動桿菌進一步經(jīng)16S-23S rRNA測序驗證分別為不動3和13TU種，其余攜帶KPC和NDM的陽性菌株經(jīng)16srRNA測序技術(shù)菌種鑒定結(jié)果與BD PhoenixlOO全自動微生物分析儀鑒定結(jié)果一致。本發(fā)明建立的雙重熒光定量PCR法，對于NDM基因，其引物和Taqman探針均針對所有亞型保守區(qū)設(shè)計，可檢測到所有NDM亞型，同樣地KPC基因也可以檢測到所有的亞型。本發(fā)明已經(jīng)檢出的陽性標本經(jīng)測序分析，KPC基因均為KPC-2，NDM基因均為NDM-1，兩基因檢測出的亞型都是我國乃至全球最為常見的類型。從實驗結(jié)果來看，本方法特異性好、重復性佳、靈敏性高，至少能檢測到10個拷貝數(shù)的質(zhì)粒。質(zhì)?？截悢?shù)和擴增Ct值之間相關(guān)性較好，可利用已建立的標準曲線對未知模板濃度進行定量。 總之本發(fā)明建立的基于Taqman探針的雙重熒光定量PCR法同時針對NDM和KPC基因能在同一體系同時檢測兩個基因，可準確快速地進行NDM和KPC基因的篩選，有效防止NDM和KPC型的超級細菌傳播導致的暴發(fā)流行，較已報道的相應(yīng)單重熒光定量PCR法提高了診斷的敏感性，更高效、快捷、省時省力。另外，本發(fā)明建立的方法意在全面檢出所有類型的NDM和KPC基因，大大提高了檢測效率，若需精確分型可結(jié)合DNA測序技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種超級細菌的雙重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于所述方法包括以下步驟 (I)提取待檢樣本的DNA |旲板； (2 )對DNA模板進行PCR擴增，所用引物和探針序列如下 NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I), NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),NDM 基因的探針 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3), KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4), KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),KPC 基因的探針 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG (SEQ ID NO. 6)； 所用探針標記的熒光基團互不相同； (3)結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束，根據(jù)待測樣本的Ct值判斷其是否為NDM、KPC基因陽性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種超級細菌的雙重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于所述雙重熒光定量PCR擴增體系為10 μ I的Premix Ex Taq (Probe qPCR) (2X)，10Mmol/L 的 NDM 和 KPC 上下游上下游引物各 O. 4μ1，5Mmol/L 的 NDM-probe 和 KPC-probe 各O.2μ1, ROX Reference Dye II 0. 4μ1，待檢DNA模板或陽性對照DNA或陰性對照 μ ，加滅菌去離子水補足體積至20μ1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種超級細菌的雙重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于所述雙重熒光定量PCR反應(yīng)條件為95°C預變性20s ;然后95°C 3s, 60°C 30s，反應(yīng)40個循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種超級細菌的雙重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于所述探針標記熒光為J0E-ECLIPSE和FAM-ECLIPSE。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種超級細菌的雙重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于所用熒光定量PCR儀為美國ABI 7500 FAST。
6.一種超級細菌的雙重熒光定量PCR檢測試劑盒，包括如下成分Premix Ex Taq(Probe qPCR) (2X)、引物、探針、ROX Reference Dye II、陽性對照品、陰性對照品，其中引物和探針序列分別為 NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I), NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),NDM 基因的探針 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3), KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4), KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),KPC 基因的探針 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG (SEQ ID NO. 6)； 所用探針標記的熒光基團互不相同。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種超級細菌的雙重熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于所述陽性對照品為NDM和KPC基因陽性的DNA標本混合物，陰性對照品為滅菌去離子水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種超級細菌NDM和KPC基因雙重熒光定量PCR檢測方法及其試劑盒，利用特異性設(shè)計的引物和探針，優(yōu)化擴增體系和條件，能在同一體系同時完成KPC和NDM兩個基因的檢測，較單重熒光定量PCR更加高效、省時省力，本方法特異性好、重復性佳、靈敏性高，且可以利用已建立的標準曲線對未知樣本進行定量分析。
文檔編號C12Q1/68GK102899414SQ20121038309
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者芮勇宇, 鄭芬, 孫靜靜, 王前 申請人:南方醫(yī)科大學