專利名稱：一種檢測ugt1a1基因型的引物和探針、及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因型的檢測，具體講，涉及一種檢測UGTlAl基因型的引物和探針、及其試劑盒。
背景技術(shù)：
個(gè)體化治療是基于藥物基因組Pharmaco-genomics發(fā)展起來的,在腫瘤治療中扮演越來越重要的角色。個(gè)體化治療是指通過檢測腫 瘤的靶標(biāo)或患者的遺傳因素，了解患者對(duì)藥物敏感性及耐受性，從而指導(dǎo)合理用藥、提高用藥的安全性和有效性、避免不良反應(yīng)、減少藥物治療的費(fèi)用和風(fēng)險(xiǎn)。簡而言之，個(gè)體化治療的目標(biāo)就是在合適的時(shí)間，對(duì)合適的人，使用合適的藥物，處方合適的劑量。伊立替康(Irinotecan,CPT_ll,商品名為開普拓、Camptosar),是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，可誘導(dǎo)單鏈DNA損傷，從而阻斷DNA復(fù)制叉，阻止DNA鏈的重新組裝，引起DNA雙鏈的斷裂，造成細(xì)胞死亡。伊立替康主要用于治療成人晚期/轉(zhuǎn)移性大腸癌，對(duì)小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌及宮頸癌和卵巢癌亦有療效。伊立替康最主要的毒副作用為嗜中性白血球減少癥及遲發(fā)性腹瀉，后者為劑量限制性毒副反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可致命。臨床研究表明，40%以上接受伊立替康治療的患者可出現(xiàn)3 4級(jí)遲發(fā)性腹瀉，約10%患者可出現(xiàn)嗜中性白血球減少癥，從而導(dǎo)致化療方案的提前中止。伊立替康為前體藥物，在體內(nèi)經(jīng)過羧酸酯酶轉(zhuǎn)化為活性代謝物。羧酸酯酶將伊立替康分子10位的哌啶側(cè)鏈裂解，產(chǎn)生7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)，其活性較伊立替康強(qiáng)100到1000倍。SN-38經(jīng)肝臟尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-GT，主要由UGTlAl、UGT1A7和UGT1A9代謝)葡萄糖醛酸化滅活，生成葡萄糖醛酸化SN-38 (SN-38G)，從而保護(hù)健康細(xì)胞免受伊立替康毒性的影響。UGTlAl基因編碼尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，其多態(tài)性最常發(fā)生在TATA啟動(dòng)子區(qū)，表現(xiàn)為易變的TA重復(fù)。野生啟動(dòng)子序列有6個(gè)TA重復(fù)(TA)6，也被稱為UGT1A1*1，三個(gè)變異等位基因分別為5、7、8三種TA重復(fù)——(TA)5, (TA)” (TA)go其中(TA)7多態(tài)性(也叫UGT1A1*28)最常見，(TA)5和(TA)8多態(tài)性少見。突變型UGT1A1*28的雜合子比野生型對(duì)SN-38的葡萄糖醛苷化活性稍低，而UGT1A1*28的突變純合子對(duì)SN-38的葡萄糖醛苷化活性則僅是野生型的35%，從而更容易產(chǎn)生毒副作用。野生型UGTlAl (6/6)在接受伊立替康治療時(shí)產(chǎn)生毒副作用風(fēng)險(xiǎn)較低，而UGT1A1*28突變型雜合子(6/7)產(chǎn)生毒副作用的幾率為12. 5%，突變型純合子(7/7)則有50%產(chǎn)生毒副作用的可能性。該突變的影響是與劑量相關(guān)的，在使用低劑量伊立替康治療時(shí)，UGTlAl突變與否對(duì)毒副作用的風(fēng)險(xiǎn)影響大。因此，2005年,美國FDA要求在伊立替康藥品標(biāo)簽上加入警示,建議患者在使用伊立替康前先檢測是否帶有UGT1A1*28突變。在中國人中，野生型純合子￠/6)、雜合子(6/7)和突變型純合子(7/7)的發(fā)生頻率分別為70. 2%、27. 7%和2. 1%。為此，發(fā)明人根據(jù)我國人口突變特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并制造了一種檢測UGTlAl基因型的引物和探針、及其試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種檢測UGTlAl基因型的引物和探針、試劑盒。為了完成本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及一種檢測UGTlAl基因型的引物，其中，所述引物的核苷酸序列為上游引物為5’端連接Fam基團(tuán)的SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列，下游引物為由SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及一種含有述檢測UGTlAl基因型的引物的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括核酸擴(kuò)增試劑、PCR對(duì)照品、Genscan對(duì)照品；其中，核酸擴(kuò)增試劑為表I:
權(quán)利要求
1.一種檢測UGTlAl基因型的引物，其中，所述引物的核苷酸序列為 上游引物為5’端連接Fam基團(tuán)的SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列， 下游引物為由SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列。
2.一種含有權(quán)利要求I所述檢測UGTlAl基因型的引物的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括核酸擴(kuò)增試劑、PCR對(duì)照品、Genscan對(duì)照品；其中，核酸擴(kuò)增試劑為
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的核酸擴(kuò)增試劑中，UGTlAlMIX-I中含有 6mmol/L 引物各 lul、5mM 的 dNTPs O. 5ul、10Xbuffer 50μ，共計(jì) 25μ1; 所述的UGT1A1MIX-2中含有Taq酶5u/反應(yīng)、UNGO. 5u/反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的PCR對(duì)照品為
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的Genscan對(duì)照品為
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒對(duì)檢測樣本的要求為，所述檢測樣本為人類基因組DNA，0D260/0D280在I. 8 2. 0，DNA總量在3 15 μ g，稀釋DNA的終濃度至50 125ng/ μ I,優(yōu)選75ng/ μ I。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟 (I)擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備 取UGTlAl MIX-I管、UGTlAl ΜΙΧ-2管，室溫融化并振蕩混勻后，2000rpm離心5 15s ；配制反應(yīng)體系21 μ I的UGTlAl MIX-I與I μ I的UGTlAl ΜΙΧ-2混合，加入到PCR反應(yīng)管中，得到PCR預(yù)混液，配制多管，存于O 4°C ；(2)加樣 從UGTlAl陰性對(duì)照管、UGTlAl PCR陽性對(duì)照管和樣本處理液管中各取3 μ 1，分別加至裝有步驟(I)制備的PCR預(yù)混液的離心管中，進(jìn)行擴(kuò)增和檢測； (3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μ I ; PCR擴(kuò)增條件為
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的結(jié)果判定方法為 (1)有效性判定 a.Genscan有效性判斷 在322 330bp范圍內(nèi)，UGTlAl Genscan陽性對(duì)照在325、327bp位置收集到ROX熒光信號(hào)，且兩個(gè)位置的高峰與低峰的熒光信號(hào)高度比< 3，判定為有效； b.PCR有效性判斷 在322 330bp范圍內(nèi)，陰性對(duì)照未收集到任何熒光信號(hào)；UGT1A1 PCR陽性對(duì)照在Genscan陽性對(duì)照相同位置收集到FAM熒光信號(hào)，熒光信號(hào)高度高于或等于Genscan陽性對(duì)照，且兩個(gè)位置的高峰與低峰的熒光信號(hào)高度比< 3，判定為有效； (2)結(jié)果判定 在322 330bp范圍內(nèi)， a.當(dāng)標(biāo)本檢測中收集到兩個(gè)熒光信號(hào)，且兩個(gè)位置的高峰與低峰的熒光信號(hào)高度比(3，則這兩個(gè)峰均判為有效；若兩個(gè)位置的高峰與低峰的熒光信號(hào)高度比> 3，則高峰判為有效峰，低峰判為無效峰； 有效峰中至少有一個(gè)的熒光信號(hào)高度> Genscan陽性對(duì)照低峰的熒光信號(hào)高度，則按檢驗(yàn)結(jié)果判定表進(jìn)行判斷；反之，則判為標(biāo)本質(zhì)量不符合檢測要求，低于本試劑盒最低檢出極限，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)； b.當(dāng)標(biāo)本檢測中收集到一個(gè)熒光信號(hào)，且熒光信號(hào)高度>Genscan陽性對(duì)照低峰的熒光信號(hào)高度，則按檢驗(yàn)結(jié)果判定表進(jìn)行判斷；反之，則判為標(biāo)本質(zhì)量不符合檢測要求，低于本試劑盒最低檢出極限，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)； c.當(dāng)標(biāo)本檢測中的未收集到熒光信號(hào)則判為標(biāo)本質(zhì)量不符合檢測要求,低于本試劑盒最低檢出極限，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)； 檢驗(yàn)結(jié)果判定表
全文摘要
本發(fā)明涉及基因型的檢測，具體講，涉及一種檢測UGT1A1基因型的引物及其試劑盒。所述引物的核苷酸序列為上游引物為5’端連接Fam基團(tuán)的SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，下游引物為由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。本發(fā)明的試劑盒操作簡單，檢測速度快；靈敏度高，最低檢出限為50ng/μl基因組DNA并可通過基因掃描技術(shù)能檢測出UGT1A1所有基因型。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102816858SQ20121032756
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月6日
發(fā)明者熊慧, 程新建, 謝立群, 陳嘉錚, 包文靜, 陶慧卿, 丁璐, 徐任 申請人:上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司