專利名稱：鑒別致命鵝膏的特征性核苷酸序列、核酸分子探針和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)一種常見(jiàn)毒蘑菇的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于鑒別致命鵝膏(Amanita exitialis)的特征性核苷酸序列、核酸分子探針和方法
背景技術(shù)：
鵝膏屬(Amanita)是世界性分布的大屬，隸屬于真菌界、擔(dān)子菌門、擔(dān)子菌綱、蘑菇 目、鵝膏科。據(jù)《真菌學(xué)詞典》第十版(2008)記載，全世界鵝膏屬種類已達(dá)500種，中國(guó)已知種類近100種(楊祝良，2005)，它們的一些種類如產(chǎn)于東亞的致命鵝膏(A. exitialis)、灰花紋鵝膏(A. fuliginea)等都屬于劇毒蘑菇種類。成年人若誤食致命鵝膏或灰花紋鵝膏的一個(gè)子實(shí)體，不及時(shí)搶救，就足以致命(陳作紅等，2003)。目前，誤食毒蘑菇致死是我國(guó)食物中毒致死的主要原因，蘑菇中毒的死亡率高達(dá)43. 80%,是目前死亡率最高的嚴(yán)重突發(fā)公共衛(wèi)生事件(2007)。因此，快速、準(zhǔn)確的鑒別致命鵝膏的方法對(duì)于搶救誤食致命鵝膏的患者具有重要的意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展以及計(jì)算機(jī)輔助分析技術(shù)的誕生，真菌的快速檢測(cè)已成為可能。目前常用的檢測(cè)方法主要有RAPD、RFLP, ap-PCR、rDNA序列分析和特異性引物的PCR檢測(cè)等。真菌的ITS序列是核糖體DNA上的一個(gè)非編碼區(qū)域，受外界環(huán)境因素的影響較小，進(jìn)化速度快，因而可以提供較為豐富的信息位點(diǎn)。利用真菌rDNA-ITS序列在屬、種水平上的差異，設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行真菌物種的鑒定、檢測(cè)，已經(jīng)成為國(guó)際上廣泛使用的分子生物學(xué)方法。目前，已有用于鑒別部分真菌的核苷酸特征序列獲得專利，但尚未發(fā)現(xiàn)專一性鑒別致命鵝膏的核苷酸序列專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供了一種利用分子生物學(xué)手段，獲得鑒別致命鵝膏(A. exitialis)的特征性核苷酸序列。本發(fā)明用于鑒別致命鵝膏的特征性核苷酸序列來(lái)源于致命鵝膏的核糖體rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITSU ITS2和它們之間的5. 8S rDNA基因，具體序列如SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種基于致命鵝膏的特征性核苷酸序列(SEQ IDNO. I)設(shè)計(jì)的用于鑒別致命鵝膏的核酸分子探針，該核酸分子探針序列如下ZMF 5'-GAAGTTGAAATCTGGGTG-3' ；ZMR : 5'-TAACTAGCATTGCTCCTG-3'。上述核酸分子探針序列ZMF和ZMR，它們的退火溫度相近，均不能形成引物二聚體，具有極高的專一性，僅與致命鵝膏發(fā)生反應(yīng)，而不與其他鵝膏反應(yīng)。利用該探針通過(guò)PCR擴(kuò)增可以快速的對(duì)致命鵝膏(菌絲體、子實(shí)體)進(jìn)行鑒別。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種致命鵝膏快速鑒定試劑盒，包括上述核酸分子探針ZMF和ZMR，以及常規(guī)的DNA提取試劑和常規(guī)的PCR反應(yīng)試劑。所述的致命鵝膏快速鑒定試劑盒優(yōu)選還包括真菌核糖體rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物 ITSl 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ；ITS4 :5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。該通用引物可以作為鑒定致命鵝膏的陽(yáng)性對(duì)照。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種鑒別致命鵝膏的方法。本方法是采用上述核酸分子探針ZMF和ZMR作為特異性擴(kuò)增引物，以致命鵝膏基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，獲得清晰的致命鵝膏特異性條帶，實(shí)現(xiàn)對(duì)致命鵝膏的鑒別。優(yōu)選，利 用ITSl和ITS4作為PCR引物，以致命鵝膏的基因組DNA作為模板進(jìn)行常規(guī)的PCR，以作為陽(yáng)性對(duì)照。本發(fā)明基于鑒別致命鵝膏的特征性核苷酸序列(SEQ ID NO. I)設(shè)計(jì)了特異性的核酸分子探針ZMF和ZMR，并以該核酸分子探針為引物，以致命鵝膏的基因組DNA為模板，按照常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的DNA片段，經(jīng)測(cè)序其具體序列如SEQ ID NO. I的第124 524位堿基所示，長(zhǎng)度為40Ibp。利用本發(fā)明的核酸分子探針ZMF和ZMR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅致命鵝膏能夠擴(kuò)增獲得該特異性片段，而其他樣品沒(méi)有擴(kuò)增到任何片段(如圖3)，這表明本發(fā)明的核酸分子探針ZMF和ZMR具有極高的專一性，可以用于快速的鑒別致命鵝膏(子實(shí)體和菌絲體)。本發(fā)明采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，材料用量少，僅20mg就足夠，方法簡(jiǎn)單，特異性好，用時(shí)短，半日即可完成。


圖I是本發(fā)明所述的致命鵝膏的特征性核苷酸序列及對(duì)致命鵝膏專一性核酸分子探針ZMF和ZMR的位置圖，左側(cè)為5'端，右側(cè)為3'端，其中黑色部分為專一性核酸分子探針ZMF和ZMR擴(kuò)增的片斷大小及位置；圖2是利用ITSl和ITS4作為引物按照常規(guī)的PCR方法對(duì)不同鵝膏樣品進(jìn)行PCR的產(chǎn)物的電泳圖，其中I、灰花紋鵝膏，2、致命鵝膏，3、黃蓋鵝膏白色變種，4、土紅粉蓋鵝膏，
5、歐式鵝膏，6、大白菇Russula delica (外型與致命鵝膏近似，可食用)，M為2Kb的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖3是利用本發(fā)明的核酸分子探針ZMF和ZMR作為引物按照常規(guī)的PCR方法對(duì)不同鵝膏樣品進(jìn)行PCR的產(chǎn)物的電泳圖，其中I、灰花紋鵝膏，2、致命鵝膏，3、黃蓋鵝膏白色變種，4、土紅粉蓋鵝膏，5、歐式鵝膏，6、大白菇Russula delica (外型與致命鵝膏近似，可食用)，M為2Kb的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :致命鵝膏基因組DNA的提取和ITS rDNA基因的獲得取20mg致命鵝膏樣品置于無(wú)菌的研缽中，將液氮倒入并快速研磨，加入2%(w/v)CTAB抽提緩沖液600 μ 1，其中含有2%的SDS，繼續(xù)研磨幾秒后倒入I. 5ml微量離心管中，65°C水浴保溫lh。冷卻至室溫后，向I. 5ml含有樣品的微量離心管中加入等體積的飽和酚氯仿異戊醇(25:24:1)，顛倒混勻2min，12000rpm離心15min，用200 μ I移液器將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，棄沉淀。上清液中加入與之等體積的氯仿異戊醇(24:1)，顛倒混勻2min，12000rpm離心15min，用200 μ I的微量移液器將含有DNA的上層(水相)小心地移入一只新管中，如果在水相和有機(jī)相交界處有白色沉淀物，則重新抽提有機(jī)相1-2次，合并水相。將最終的上清液用200 μ I的微量移液器小心轉(zhuǎn)入一只新離心管中。往上清液(DNA溶液)中加入1/10體積的3mol/L pH5. 2的乙酸鈉，用手指輕彈離心管壁幾次使之混勻。加入與DNA溶液(含鹽溶液)等體積的異丙醇(-4°C預(yù)冷)輕輕混勻，于-4°C靜置2h。12000rpm離心15min，棄上清液，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇水溶液洗滌沉淀物兩次。室溫下自然晾干。自然干燥后加入20 μ I無(wú)菌的超純水重懸，選用DNA純化試劑盒(東盛生物科技有限公司的基因組純化試劑盒，其貨號(hào)為Ν1091)純化重懸的DNA，而獲得致命鵝膏的基因組DNA。灰花紋鵝膏、黃蓋鵝膏白色變種、土紅粉蓋鵝膏、歐式鵝膏和大白菇Russula delica的基因組DNA參照上述方法提取。取真菌ITS rDNA 通用引物 ITSl 和 ITS4, ITSl :5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ；ITS4 :5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系為 25 μ L 總體積，ddH2012. 8μ L，10 倍緩沖液(Mg2+) 8μ L，dNTP (2. 5mmol/L) 2 μ L，ITSl(10 μ mol/L) O. 5 μ L, ITS4 (10 μ mol/L) O. 5 μ L, HotStart Taq (5u/ μ L) O. 2 μ L,模板DNA (灰花紋鵝膏、致命鵝膏、黃蓋鵝膏白色變種、土紅粉蓋鵝膏、歐式鵝膏或大白菇Russuladelica 的基因組 DNA) I μ L。反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min 預(yù)變性；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s，35個(gè)循環(huán)；72°C 8min。致命鵝膏的PCR產(chǎn)物送北京華大基因測(cè)序，獲得ITS rDNA基因序列，致命鵝膏的ITS rDNA序列如SEQ ID NO. I和圖I所示，電泳圖如圖2所示。由圖2可以看出，利用通用引物ITSl和ITS4可以從灰花紋鵝膏、致命鵝膏、黃蓋鵝膏白色變種、土紅粉蓋鵝膏、歐式鵝膏和大白菇Russula delica的基因組DNA中擴(kuò)增出序列。實(shí)施例2 :致命鵝膏特異性引物的PCR擴(kuò)增根據(jù)致命鵝膏ITS rDNA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物ZMF和ZMR，ZMF 5'-GAAGTTGAAATCTGGGTG-3' 和 ZMR :5'-TAACTAGCATTGCTCCTG-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以基因組DNA為模板，反應(yīng)體系為25 μ L總體積ddH2012. 8 μ L，10倍緩沖液(Mg2+)8y L，dNTP (2. 5mmol/L)2 μ L，ZMF (10 μ mol/L)0. 5 μ L, ZMR (10 μ mol/L)0. 5 μ L,HotStart Taq (5u/μ L)0. 2 μ L，模板DNA (灰花紋鵝膏、致命鵝膏、黃蓋鵝膏白色變種、土紅粉蓋鵝膏、歐式鵝膏或大白菇Russula delica的基因組DNA)1 μ L。反應(yīng)程序?yàn)?4°C 5min預(yù)變性;94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 60s，35個(gè)循環(huán)；72°C 8min。電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，電泳圖如圖3所示，從圖3可以看出，僅致命鵝膏能夠擴(kuò)增出特異性片段，而灰花紋鵝膏、黃蓋鵝膏白色變種、土紅粉蓋鵝膏、歐式鵝膏和大白菇Russula delica沒(méi)有擴(kuò)增出任何片段，這表明本發(fā)明的核酸分子探針具有極高的專一性，特異性好，因此可以用于快速的鑒別致命鵝膏。將致命鵝膏的特異性片段送去測(cè)序，其序列如SEQ ID NO. I的第12Γ524位堿基所示，其長(zhǎng)度為 401bp。權(quán)利要求
1.一種用于鑒別致命鵝膏(Amanita exitialis)的特征性核苷酸序列,其特征在于,該特征性核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一種用于鑒別致命鵝膏的核酸分子探針，其特征在于，該核酸分子探針為ZMF 5'-GAAGTTGAAATCTGGGTG-3' ；ZMR 5'-TAACTAGCATTGCTCCTG-3'。
3.—種致命鵝膏快速鑒定試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求2所述的核酸分子探針序列ZMF和ZMR，以及常規(guī)的DNA提取試劑和常規(guī)的PCR反應(yīng)試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的致命鵝膏快速鑒定試劑盒，其特征在于，還包括真菌核糖體rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITSl 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ；ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。
5.一種鑒別致命鵝膏的方法，其特征在于，是采用權(quán)利要求2所述的核酸分子探針ZMF和ZMR作為PCR引物，利用PCR方法鑒定致命鵝膏，具體步驟按常規(guī)PCR方法進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鑒別致命鵝膏的方法，其特征在于，還利用ITSl5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ；ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 作為 PCR 引物，以致命鵝膏的基因組DNA作為模板進(jìn)行常規(guī)的PCR，以作為陽(yáng)性對(duì)照。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別致命鵝膏的特征性核苷酸序列、核酸分子探針和方法。該特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。該核酸分子探針為ZMF5`-GAAGTTGAAATCTGGGTG-3`和ZMR5`-TAACTAGCATTGCTCCTG-3`。其方法為是采用上述核酸分子探針ZMF和ZMR作為PCR引物，利用PCR方法鑒定致命鵝膏，具體步驟按常規(guī)PCR方法進(jìn)行。本發(fā)明以ZMF和ZMR作為引物，以致命鵝膏的基因組DNA為模板，按照常規(guī)PCR方法進(jìn)行PCR，擴(kuò)增到特異性片段。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，僅致命鵝膏能夠擴(kuò)增到特異性片段，而其他鵝膏樣品，如灰花紋鵝膏、黃蓋鵝膏白色變種、土紅粉蓋鵝膏、歐式鵝膏和大白菇Russula delica都沒(méi)有擴(kuò)增到任何片段，這表明本發(fā)明的核酸分子探針ZMF和ZMR具有極高的專一性，可以用于快速的鑒別致命鵝膏。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102719544SQ20121021613
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月27日
發(fā)明者宋斌, 李挺, 李泰輝, 鄧旺秋 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所