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用于羊痘病毒屬病毒鑒定的基因芯片及其檢測方法

文檔序號:400299閱讀:464來源:國知局
專利名稱:用于羊痘病毒屬病毒鑒定的基因芯片及其檢測方法
技術領域
本發(fā)明屬于生物芯片領域。具體而言,本發(fā)明涉及一種羊痘病毒屬病毒(包括山羊痘病毒、綿羊痘病毒及牛疙瘩皮膚病病毒)的芯片檢測裝置。
背景技術
羊痘病毒屬病毒能引起山羊、綿羊和牛的皮膚、器官表面廣泛性結節(jié)和水腫,病畜產乳量急劇減少,皮毛品質極大下降,造成巨大經濟損失。山羊痘、綿羊痘病毒引起的羊痘又名羊“天花”,是羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病。綿羊痘和山羊痘,被我國列為一類傳染病,對畜牧業(yè)養(yǎng)殖影響重大。據不同毒株的毒力差異,易感羊群的致死率可達10% 58% 或75% 100%不等。羔羊致死率可達100%,妊娠母羊極易流產。同時,因自由貿易受到限制造成了國家稅收的下降,致使此病也成為了重要的經濟疾病。該病呈世界性分布,我國近年來在如廣西、貴州、黑龍江、甘肅等地也有發(fā)生。牛疙瘩皮膚病病毒引起牛的疙瘩皮膚病, 又稱牛結節(jié)性皮炎或塊狀皮膚病,是以患牛發(fā)熱、皮膚、黏膜、器官表面廣泛性結節(jié),淋巴結腫大,皮膚水腫為特征的傳染病,能引起感染動物消瘦,產乳量大幅度降低,嚴重時導致死亡。被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報的動物疫病,感染率為5% 85%,病死率為 10%。此外,本病在公共衛(wèi)生方面也有一定的意義,印度和斯堪的納維亞都有人類感染羊痘病毒的報道。在印度,管理患病動物的人有的手和腿上發(fā)生紅色丘疹,繼而出現水皰并結痂,但未見有全身性的擴散。張瑞陽等(2003)首次報道了我國人感染羊痘的病例,病人手指、口唇、面頰等部位出現丘疹。山羊痘、綿羊痘和牛疙瘩皮膚病病毒很強的宿主特異性,自然條件下,不會發(fā)生交叉感染。本病毒對上皮細胞有特殊親和力,因此無論通過哪種途徑進入機體的病毒,最終都經血液達到皮膚和粘膜,在上皮細胞內增殖,引起一系列的炎癥過程而發(fā)生特異性的痘疹。 山羊和綿羊均為易感動物。本病多有病羊和含有羊痘病毒的皮屑隨風和灰塵吸入呼吸道而感染,也可以通過損傷的皮膚及消化道傳染。丘疹中含大量病毒,黏膜上的丘疹破潰后可從鼻、口分泌物和淚液排泄病毒。病毒進入乳汁、尿液和精液也可成為病毒傳播的重要來源。 被病羊污染的用具、飼料、墊草,病羊的糞便、分泌物、皮毛和體外寄生蟲(如羊虱)都可以成為傳播媒介。該病以春秋兩季多發(fā),主要在冬季春初流行,常呈地方性或廣泛流行。氣候嚴寒、雨雪、霜凍、枯草和飼養(yǎng)管理不良等因素都有助于本病的發(fā)生和加重病情。目前控制該病最有效的方法還是使用高效疫苗對易感動物進行免疫接種。綜上所述該病毒的檢測對動物飼養(yǎng)和人類健康有重要的意義。利用基因芯片檢測羊痘病毒屬病毒具有快速、敏感、特異、高通量和自動化的優(yōu)點。在對食品安全和出入境的快速檢測中起著重要作用,同時還可以減少該病毒的傳播。牛疙瘩皮膚病病毒是引起牛疙瘩皮膚病的一種病毒。只要是病毒都可能存在變異的,牛疙瘩皮膚病病毒野毒株是指從自然發(fā)病的動物上分離的牛疙瘩皮膚病病毒,與標準毒株之間可能存在個別堿基的突變。牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株是目前非洲地區(qū)以及其它地區(qū),需要給牛注射疫苗,而選用的牛疙瘩皮膚病病毒經典毒株制備疫苗,通常稱該毒株為疫苗株。本發(fā)明涉及的毒株均為已知,例如牛疙瘩性皮膚病疫苗株Neethling vaccine Lff 1959株購自南非(Bio Onderst印oort,批號8545),牛疙瘩性皮膚病野毒株Neethling M90株基因組DNA已由法國某生物實驗室公布,由病毒基因組0RF132基因的克隆測序結果可知,兩者的同源性為97. 93%。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是建立一種靈敏度高、特異性強、節(jié)時省力并且易于觀察結果的微陣列芯片檢測羊痘病毒屬三種病毒的基因芯片。為了實現上述目的本發(fā)明采用如下技術方案用于羊痘病毒屬病毒鑒定的基因芯片檢測裝置,包括PCR反應混合液管、Taq聚合酶、PCR陽性對照、PCR陰性對照、ddH20、檢測芯片、芯片探針的點樣分布、山羊痘病毒兩條檢測探針的核苷酸序列、綿羊痘病毒兩條檢測探針的核苷酸序列、疙瘩皮膚病病毒疫苗株兩條檢測探針的核苷酸序列、疙瘩皮膚病病毒野毒株兩條檢測探針的核苷酸序列、芯片蓋片、雜交液、雜交陽性對照、雜交盒。采用基因芯片微量點樣技術,將待測樣品探針與各種質控探針固定在經過化學修飾的基片上,形成的微陣列。微陣列包括質控探針區(qū)和待測樣品探針區(qū),其中所述質控探針區(qū)內設置下述分區(qū)
點樣位置質控分區(qū)P1,包含至少一個點樣位置質控探針SEQ ID N09; 雜交陽性質控分區(qū)P2,包含至少一個雜交陽性質控探針SEQ ID NOlO ; 雜交陰性質控分區(qū)N,包含點樣緩沖液;
所述待測樣品探針區(qū)內設置下述包括至少一個待測樣品探針的分區(qū)
山羊痘病毒1號探針分區(qū)1,
山羊痘病毒2號探針分區(qū)2,
綿羊痘病毒1號探針分區(qū)3,
綿羊痘病毒2號探針分區(qū)4,
牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株1號探針分區(qū)5,
牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株2號探針分區(qū)6,
牛疙瘩皮膚病病毒野毒株1號探針分區(qū)7,
牛疙瘩皮膚病病毒野毒株2號探針分區(qū)8。各個探針序列如下
山羊痘病毒1號探針SEQ ID NOl ; 山羊痘病毒2號探針SEQ ID N02 ; 綿羊痘病毒1號探針SEQ ID N03 ; 綿羊痘病毒2號探針,SEQ ID N04 ; 牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株1號探針,SEQ ID N05 ; 牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株2號探針,SEQ ID N06 ; 牛疙瘩皮膚病病毒野毒株1號探針,SEQ ID N07 ; 牛疙瘩皮膚病病毒野毒株2號探針SEQ ID N08o利用上述基因芯片檢測山羊痘病毒、綿羊痘病毒、牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株和牛疙瘩皮膚病病毒野毒株的檢測方法,包括如下步驟
(1)待測樣品制備按照商品化DNA提取試劑盒使用說明書提取患病動物的組織或病毒的細胞增殖液的全基因組DNA,制備待測樣品DNA。(2)PCR 擴增25 μ L PCR 反應液包含PCR Mix 12. 5 μ L,5U/y L PCR Taq 酶 0.4 μ L、待測樣品DNA 5 μ L、無核酸酶滅菌水7. 1 μ L ;
其中,所述 PCR Mix 含有 10XPCR Buffer 2.5 μ L, 2. 5 mmol/L dNTP Mix 2 μ L, 25 mmol/L 氯化鎂 2 μ L,
10 μ mol/L山羊痘病毒上游引物SEQ ID NOll 0.5 μ L, 10μmol/L綿羊痘上游引物SEQIDN012 0.5 μ L, 10 μ mol/L PCR 通用下游引物 SEQ ID N013 5 yL;
按如下步驟進行擴增95°C 5 min ;95°C 30 sec,50°C 30 sec,72°C 1 min循環(huán)45次; 72°C 8 min。(3)雜交首先配制雜交液雜交緩沖液7. 5 μ L、PCR擴增產物5 μ L、雜交陽性對照2. 5 μ L,混勻后95°C變性5min,冰上放置5min,然后用15 μ L雜交液進行雜交。(4)結果判讀用微陣列芯片掃描儀掃描分析,去除陰性對照背景,與芯片雜交說明對照,判定結果。本發(fā)明具有如下優(yōu)點
(1)成功地構建了 GTPV&SPPV&LSDV檢測基因芯片本發(fā)明所制備的基因芯片采用的各條篩選探針可與對應病毒目的基因進行特異性結合,雜交信號較強且穩(wěn)定。(2)制備的檢測基因芯片具有良好的方法學特征本發(fā)明建立了一種特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強和節(jié)時省力的基因芯片檢測方法。(3)檢測基因芯片的構建,為混合感染疾病的同步檢測和鑒別診斷提供快速、高效的手段為今后出入境動物檢疫和相應疫病控制提供了技術保障。對滿足進出境動物檢疫工作的需要,控制羊痘病毒屬病毒的傳播,并防止牛疙瘩皮膚病毒由境外向我國擴散,保障我國的畜牧業(yè)安全、健康發(fā)展具有十分重要的意義。


圖1芯片探針分布示意圖; 圖2山羊痘病毒雜交結果示意圖; 圖3綿羊痘病毒雜交結果示意圖4牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株雜交結果示意圖; 圖5牛疙瘩皮膚病病毒野毒株雜交結果示意圖中Ρ1-點樣位置質控分區(qū);Ρ2-雜交陽性質控分區(qū);N-雜交陰性質控分區(qū);1-山羊痘病毒1號探針分區(qū);2-山羊痘病毒2號探針分區(qū);3-綿羊痘病毒檢1號探針分區(qū);4-綿羊痘病毒2號探針分區(qū);5-牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株1號探針分區(qū);6-牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株2號探針分區(qū);7-牛疙瘩皮膚病病毒野毒株1號探針分區(qū);8-牛疙瘩皮膚病病毒野毒株2號探針分區(qū);
雜交說明P1 探針固定陽性對照,監(jiān)控芯片點樣過程,芯片雜交前后都應陽性;P2 雜交陽性對照,監(jiān)控芯片雜交過程,檢測任何樣品都應陽性; N 雜交陰性對照,檢測任何樣品都應陰性;
山羊痘病毒基因組DNA經PCR擴增產物的雜交結果除質控探針符合要求外,1、2號探針亮;
綿羊痘病毒基因組DNA經PCR擴增產物的雜交結果除質控探針符合要求外,3、4號探針亮;
牛疙瘩皮膚病疫苗株病毒基因組DNA經PCR擴增產物的雜交結果除質控探針符合要求外,1、5、6號探針亮;
牛疙瘩皮膚病野毒株病毒基因組DNA經PCR擴增產物的雜交結果除質控探針符合要求外,1、7、8號探針亮。
具體實施例方式面提供具體實施例進一步闡述本發(fā)明的技術方案,但本發(fā)明技術的應用不限于實施例。實施例1,本發(fā)明是基于對羊痘病毒屬山羊痘病毒、綿羊痘病毒及牛疙瘩皮膚病病毒的細胞增殖,提取病毒基因組DNA。對山羊痘病毒、綿羊痘病毒及牛疙瘩皮膚病病毒的 0RF132基因進行克隆、測序分析,根據測序結果設計了 8條寡核苷酸探針,可與相應的病毒基因組DNA的PCR產物進行特異性結合,PCR進行基因組擴增時,下游引物5'端利用Cy3 熒光色素進行標記,探針可與此產物在56°C下進行雜交。根據熒光信號位置、強度判斷雜交結果,以此來鑒定山羊痘病毒、綿羊痘病毒及牛疙瘩皮膚病病毒。根據Genbank網站上公布的山羊痘、綿羊痘及疙瘩皮膚病病毒0RF132基因序列利用I^rimer Premier 5. 0生物軟件設計PCR引物SEQ ID NOlUSEQ ID N012和SEQ ID N013。同時,克隆基因序列,并進行測序、比對分析,選取差異性序列在利用fastPCR生物軟件設計所述8條特異性寡核苷酸探針,SEQ ID NOl、SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ ID N06、SEQ ID N07、SEQ ID N08o通過這3條PCR引物和8條特異性的探針,可以特異的、敏感的快速鑒定區(qū)別4種病毒。根據國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局文件(2009. 178號)《關于進一步加強進出境豬甲型Hmi流感檢驗檢疫工作的通知——A型流感分型基因芯片檢測方法》提供的質控序列合成本發(fā)明用質控序列SEQ ID N09、SEQ ID N010。每條探針的5'端均通過15個胸腺嘧啶核苷酸連接有一個氨基,具體核苷酸序列如下
SEQ ID NOl 為
5’ -nh2-t15-atgcaataataacgatagttattggtttgttaatattttagaa ;
SEQ ID N02 為
5’ -nh2-t15-atggaatatgtaataatgttcctatatgtattgatggataatt ;
SEQ ID N03 為
5’ -nh2-t15-agaatatgtaacaatgttcatcatgtattgatggagaagttaa ;
SEQ ID N04 為
5’ -nh2-t15-tttactctctctcaacaattcttataatggtctatttt ;
SEQ ID N05 為5’ -nh2-t15-tgattgtgtaagctttaactctacaacataatacaactgtt ;
SEQ ID N06 為
5’ -nh2-t15-acaatgatgatgttaaaactgaactcgttacattatgtgatgt ;
SEQ ID N07 為
5’ -nh2-t15-cagatgattgcgtaagctttaactctacatataatacaactgt ;
SEQ ID N08 為
5’ -nh2-t15-aaactgaacttgttacgttgtgtgatgtatctaaagaagtaca ;
SEQ ID N09 為5,-NH2-T15-GCTGCCTCGGCAAGGAGT_TAMRA ; SEQ ID NOlO 為5,-NH2-T15-ATCACTTGCTTCCGTTGAGG。實施例2,參見圖1,用于羊痘病毒屬病毒鑒定的基因芯片,采用基因芯片微量點樣技術,將待測樣品探針與各種質控探針固定在經過化學修飾的基片上,形成8行X 6列的微陣列。微陣列上探針分布從上到下依次為點樣位置質控分區(qū)Pl 1行X6點,雜交陽性質控分區(qū)P2 :1行X6點,雜交陰性質控分區(qū)N :1行X6點,山羊痘病毒檢測探針分區(qū)1 :1 行X 3點,山羊痘病毒檢測探針分區(qū)2 1行X 3點,綿羊痘病毒檢測探針分區(qū)3 1行X 3點, 綿羊痘病毒檢測探針區(qū)分4 :1行X3點,牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株檢測探針分區(qū)5 :1行X3 點,牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株檢測探針分區(qū)6 1行X 3點,牛疙瘩皮膚病病毒野毒株檢測探針分區(qū)7 :1行X 3點,牛疙瘩皮膚病病毒野毒株檢測探針分區(qū)8 :1行X 3點,點樣位置質控分區(qū)Pl 1行X6點。每張芯片上有至少一個上述微陣列,每個微陣列可以檢測一份樣品。雜交陰性質控分區(qū)N,包含點樣緩沖液,點樣緩沖液為市售產品,例如博奧生有限公司生產的。其余各分區(qū)包括對應的檢測探針和質控探針。圖2 5為本發(fā)明的具體實施方式
,分別為山羊痘病毒基因組DNA經PCR擴增產物的雜交結果綿羊痘病毒基因組DNA經PCR擴增產物的雜交結果牛疙瘩皮膚病疫苗株病毒基因組DNA經PCR擴增產物的雜交結果牛疙瘩皮膚病野毒株病毒基因組DNA經PCR 擴增產物的雜交結果。實施例3、試劑準備 1)芯片洗液
根據需要及實際情況,按如下比例配制洗滌液I和洗滌液II。洗液I :SSC終濃度為2X,SDS終濃度為0. 2 %。如500 mL洗液I =440 mL蒸餾水+50mL 20XSSC+10mL 10%SDS,或根據需要按比例配制。洗液II =SSC 終濃度為 0. 2 X。如 500 mL 洗液 II =495 mL 蒸餾水 +5 mL 20 X SSC,
或根據需要按比例配制。若10% SDS產生白色絮狀沉淀,請置于42°C水浴中溶解混勻后配制洗液。2)無水乙醇。3)冰水混合物。實施例4、病毒基因組DNA提取
按照相應商品化DNA提取試劑盒使用說明書提取患病動物的組織或病毒的細胞增殖液的全基因組DNA,制備樣品。實施例5、PCR擴增病毒基因組DNA
1、PCR反應體系在PCR配液區(qū)內,在冰上融化PCR Mix及基因組DNA,按如下體系配制反應液。25 μ L PCR 反應液包含PCR Mix 12.5 μ L,5U/y L PCR Taq 酶 0.4 μ L、待測樣品DNA 5 μ L、無核酸酶滅菌水7. 1 μ L ;
其中,所述 PCR Mix 含有 10XPCR Buffer 2.5 μ L, 2. 5 mmol/L dNTP Mix 2 μ L, 25 mmol/L 氯化鎂 2 μ L,
10 μ mol/L山羊痘病毒上游引物SEQ ID NOll 0.5 μ L, 10μmol/L綿羊痘病毒上游引物SEQIDN012 0.5 μ L, 10 μ mol/L PCR 通用下游引物 SEQ ID N013 5 μ L ;
山羊痘病毒上游引物 SEQ ID NOll :5' -ACAAACACTTCCCTCCTTAAGCTACT-3‘; 綿羊痘上游引物 SEQ ID N012 :5' -GACGAACATTTTTCCCTCTAAGCTAC-3‘; PCR 通用下游引物 SEQ ID N013: 5' -Cy3-ATCTCCATGNGAAACTTTACAAA-3‘。2、擴增將配置好的反應液置于PCR擴增儀中,按照表1的PCR反應循環(huán)程序進行 PCR反應。表1 PCR反應程序
權利要求
1.用于羊痘病毒屬病毒鑒定的基因芯片,包括PCR反應混合液管、Taq聚合酶、PCR陽性對照、PCR陰性對照、ddH20、檢測芯片、芯片探針的點樣分布、芯片蓋片、雜交液、雜交陽性對照、雜交盒,采用基因芯片微量點樣技術,將待測樣品探針與各種質控探針固定在經過化學修飾的基片上,形成的微陣列,其特征是所述微陣列包括質控探針區(qū)和待測樣品探針區(qū),其中所述質控探針區(qū)內設置下述分區(qū)點樣位置質控分區(qū)(P1),包含至少一個點樣位置質控探針SEQ ID N09; 雜交陽性質控分區(qū)(P2),包含至少一個雜交陽性質控探針SEQ ID NOlO ; 雜交陰性質控分區(qū)(N),包含點樣緩沖液;所述待測樣品探針區(qū)內設置下述包括至少一個待測樣品探針的分區(qū)山羊痘病毒1號探針分區(qū)(1),山羊痘病毒2號探針分區(qū)(2),綿羊痘病毒1號探針分區(qū)(3),綿羊痘病毒2號探針分區(qū)(4),疙瘩皮膚病病毒疫苗株1號探針分區(qū)(5),疙瘩皮膚病病毒疫苗株2號探針分區(qū)(6),疙瘩皮膚病病毒野毒株1號探針分區(qū)(7),疙瘩皮膚病病毒野毒株2號探針分區(qū)(8);各個探針序列如下山羊痘病毒1號探針SEQ ID NOl ;山羊痘病毒2號探針SEQ ID N02 ;綿羊痘病毒1號探針SEQ ID N03 ;綿羊痘病毒2號探針SEQ ID N04 ;牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株1號探針SEQ ID N05 ;牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株2號探針SEQ ID N06 ;牛疙瘩皮膚病病毒野毒株1號探針SEQ ID N07 ;牛疙瘩皮膚病病毒野毒株2號探針SEQ ID N08o
2.根據權利要求1所述用于羊痘病毒屬病毒鑒定的基因芯片,其特征是每張所述檢測芯片上包括至少一個權利要求1所述的微陣列,每個微陣列可以檢測一份樣品。
3.根據權利要求1所述用于羊痘病毒屬病毒鑒定的基因芯片,其特征是所述每條質控探針和待測樣品探針的5'端均通過15個胸腺嘧啶核苷酸連接有一個氨基。
4.利用權利要求1所述基因芯片檢測山羊痘病毒、綿羊痘病毒、牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株和牛疙瘩皮膚病病毒野毒株的檢測方法,包括如下步驟(1)待測樣品制備按照商品化DNA提取試劑盒使用說明書提取患病動物的組織或病毒的細胞增殖液的全基因組DNA,制備待測樣品DNA ;(2)PCR 擴增25 μ L PCR 反應液包含PCR Mix 12.5 μ L,5U/y L PCR Taq 酶 0. 4 μ L、待測樣品DNA 5 μ L、無核酸酶滅菌水7. 1 μ L ;其中,所述 PCR Mix 含有 10XPCR Buffer 2.5 μ L, 2. 5 mmol/L dNTP Mix 2 μ L, 25 mmol/L 氯化鎂 2 μ L,、10 μ mol/L山羊痘病毒上游引物SEQ ID NOll 0.5 μ L, 10ymol/L 綿羊痘上游引物 SEQ ID N012 0.5 μ L, 10 μ mol/L PCR 通用下游引物 SEQ ID N013 5 μ L ;按如下步驟進行擴增95°C 5 min ;95°C 30 sec,50°C 30 sec,72°C 1 min循環(huán)45次; 72 0C 8 min ;(3)雜交首先配制雜交液雜交緩沖液7.5 μ L、PCR擴增產物5 μ L、雜交陽性對照 2. 5 μ L,混勻后95°C變性5min,冰上放置5min,然后采用、15 μ L雜交液進行雜交;(4)結果判讀用微陣列芯片掃描儀掃描分析,去除陰性對照背景,與芯片雜交說明對照,判定結果。
5.根據權利要求4所述檢測方法,其特征是所述雜交緩沖液每1020 μ L包括甲酰胺 500 μ L, 20 X SSC 500yL及 10% SDS 20 μ L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羊痘病毒屬病毒,包括山羊痘病毒、綿羊痘病毒及牛疙瘩皮膚病病毒的芯片檢測裝置。通過標準毒株基因組序列分析設計PCR引物,對目的基因克隆及測序分析,然后設計特異性探針,可對羊痘病毒屬的山羊痘病毒、綿羊痘病毒及牛疙瘩皮膚病病毒進行同時鑒定。本發(fā)明旨在建立一種靈敏度高、特異性強、節(jié)時省力并且易于觀察結果的微陣列芯片檢測羊痘病毒屬山羊痘病毒、綿羊痘病毒及牛疙瘩皮膚病病毒的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102373303SQ20111038694
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月29日 優(yōu)先權日2011年11月29日
發(fā)明者丁森, 李應國, 楊俊 , 王國民, 王昱, 聶福平, 肖進文 申請人:重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
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