專利名稱：一株具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株高溫菌。
背景技術：
目前，高溫好氧堆肥化處理是解決農(nóng)村固體廢物問題的一個重要途徑，具有保護環(huán)境，節(jié)約原材料和能源、投資少、運行費用低等優(yōu)點。但是，農(nóng)業(yè)固體廢物，尤其是牛等食草動物的糞便中含有大量的木質纖維素，其成分復雜，難以被充分利用或被大多數(shù)微生物直接作為碳源物質而轉化利用。因此，它們的生物降解成為生物技術處理有機固體廢物的關鍵，也是近年來研究的重點。然而，在堆肥過程中木質素、纖維素和半纖維素等分子產(chǎn)生破壞，斷裂和分解的主要階段是在堆肥高溫階段，由于溫度的影響，微生物種群受到很大的抑制，表現(xiàn)為種類單一，數(shù)量減少，比中溫階段要少1-2個數(shù)量級，這無疑限制了大分子難降解的木質纖維素物質的快速降解。已有的研究表明，在堆肥高溫階段，堆肥中絕大部分的寄生蟲、蟲卵、孢子和病原菌等被殺死，是保證堆肥無害化的最重要階段。大量的研究表明， 堆體溫度應控制在45°C-65°C之間，尤其是在55°C-60°C時比較好，此時也是木質纖維素等大分子物質降解的最適溫度。研究該溫度范圍內的微生物及其活動特性對堆肥技術的提高具有重要意義。從已有的文獻中可以看出，現(xiàn)今關于牛糞堆肥的而研究是非常活躍的，相關的文獻也較多，但關于分離于牛糞堆肥的同時具有纖維素酶活與蛋白酶活的高溫地衣芽孢桿菌的研究還極少，目前關于地衣芽孢桿菌的研究主要集中于其淀粉酶活與產(chǎn)抗生素的研究方面。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一株具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌。具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌，它為地衣芽孢桿菌(Bacillus lichenifOrmis)NF705，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCCN0 4489，保藏日期為2010年12月17日；它為桿菌，長為1. 5 μ m 3. 5 μ m，寬為0. 6 μ m 0.8 μ m，無莢膜，中生橢圓狀芽孢，孢囊稍膨大。本發(fā)明中具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌，它為地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)NF705，它的培養(yǎng)特征如下瓊脂斜面生長旺盛，粗糙，不透明，粘著，擴展，有毛狀枝條。葡萄糖瓊脂斜面生長豐厚，有皺紋，表面有似擠出的小滴或粘液狀囊，沿接種線有毛狀枝條。酪氨酸瓊脂斜面生長旺盛，粗糙，不透明，粘著，擴展，有毛狀枝條。肉汁瓊脂平板菌落大，擴展，表面粗糙或具皺紋，有毛狀枝條，暗白色，培養(yǎng)物顏色加深，呈微黃褐色。本發(fā)明中具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌，它為地衣芽孢桿菌(Bacillus lichenifOrmis)NF705，其明膠穿刺快速的呈漏斗狀、淀粉水解呈陽性、乙酰甲基甲醇反應呈陽性、利用檸檬酸鹽、硝酸鹽還原呈陽性、卵磷脂酶試驗呈陰性、利用阿拉伯糖、利用木糖、利用葡萄糖、利用蔗糖、利用甘露醇產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣、固體培養(yǎng)基上最適生長溫度為45 55°C，液體培養(yǎng)基上最適生長溫度為58 62°C，最適生長pH值為4. 5 8. 5。本發(fā)明中具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌，它為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)NF705,其 16S rRNA 序列分析結果顯示與 Bacillus Iicheniformis的16S rRNA序列的相似性最高，達到99% ；并結合細菌形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結果，確定地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)NF705為芽孢桿菌屬的一個新菌種。本發(fā)明中具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌，它為地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)NF705，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC No :4489，保藏日期為2010年12月17日。本發(fā)明以自然堆積的牛糞為分離源，采用高溫培養(yǎng)馴化的手段分離篩選出一株具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌，它具有較高纖維素酶活與蛋白酶活，羧甲基纖維素相對酶活性，1. 56士0. 11cm. d—1，蛋白酶相對活性1.沘士0. 2cm. cf1。本發(fā)明具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌，對堆肥技術的提高具有重要意義。


圖1為具體實施方式
一中地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)NF705 含芽孢G+菌體的顯微鏡觀察圖；圖2為具體實施方式
一中地衣芽孢桿菌(Bacillus lichenifOrmis)NF705對數(shù)生長期菌體的顯微鏡觀察圖；圖3為具體實施方式
一中地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)NF705和相近菌株的16S rRNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹譜圖；圖4為具體實施方式
一中地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)NF705的生長曲線圖，其中 表示OD值。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌，它為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) NF705，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No :4489，保藏日期為 2010年12月17日；它為桿菌，長為1. 5 μ m 3. 5 μ m，寬為0. 6 μ m 0. 8 μ m，無莢膜，中生橢圓狀芽孢，孢囊稍膨大。本實施方式中地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) NF705 (見圖1和2)，其進行常規(guī)生理生化鑒定，實驗結果為明膠穿刺快速的呈漏斗狀、淀粉水解呈陽性、乙酰甲基甲醇反應呈陽性、利用檸檬酸鹽、硝酸鹽還原呈陽性、卵磷脂酶試驗呈陰性、利用阿拉伯糖、 利用木糖、利用葡萄糖、利用蔗糖、利用甘露醇產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣。本實施方式中地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)NF705，它的培養(yǎng)特征如下
瓊脂斜面生長旺盛，粗糙，不透明，粘著，擴展，有毛狀枝條。葡萄糖瓊脂斜面生長豐厚，有皺紋，表面有似擠出的小滴或粘液狀囊，沿接種線有毛狀枝條。酪氨酸瓊脂斜面生長旺盛，粗糙，不透明，粘著，擴展，有毛狀枝條。肉汁瓊脂平板菌落大，擴展，表面粗糙或具皺紋，有毛狀枝條，暗白色，培養(yǎng)物顏色加深，呈微黃褐色。本實施方式具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌，它為地衣芽孢桿菌 (Bacillus lichenifOrmis)NF705，該菌株分離自哈爾濱市機場路八里堡農(nóng)戶傳統(tǒng)堆置牛糞堆肥固體樣品；它按以下步驟進行分離培養(yǎng)a、哈爾濱市機場路八里堡農(nóng)戶傳統(tǒng)堆置牛糞堆肥固體樣品經(jīng)風干晾曬，分篩，除去雜物及水分(晾曬時注意遮蔽陽光暴曬及雨淋，適當?shù)姆瓌?后裝于玻璃容器中待用，放于4°C冰箱中保存，備用；b、將處理后的牛糞堆肥樣品在75 80°C水浴鍋中水浴IOmin后，冷卻，采用10倍稀釋，平板涂布法，用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行高溫菌的分離培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度60°C 士2°C， 培養(yǎng)時間24h 72h，其間觀察菌落的生長情況并記錄；挑取在此培養(yǎng)條件下，菌落生長迅速，菌落較大的單個的菌落轉接于牛肉膏蛋白斜面培養(yǎng)基中；將分離到的斜面培養(yǎng)物在牛肉膏蛋白胨平板中采用多次劃線分離60°C 士2°C高溫培養(yǎng)的方法，最終獲得純培養(yǎng)物，將獲得的純培養(yǎng)物轉接于牛肉膏蛋白斜面培養(yǎng)基，放于4°C冰箱保存?zhèn)溆?；共分離細菌菌株 25株；C、將初步分離得到的斜面菌株加入少量的無菌水，制備成菌懸液，采用鋼圈滴注的方法，滴1滴加到酪素培養(yǎng)基平板中，重復3次，置于60°C 士2°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 72h，每隔4小時觀察透明圈產(chǎn)生情況，挑取產(chǎn)生透明圈的菌落，轉接于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中，備用；共分離菌株16株；d、再將上述斜面培養(yǎng)物加入少量的無菌水，制備成菌懸液，采用鋼圈滴注的方法， 滴1滴加到纖維素剛果紅培養(yǎng)基平板中，重復3次，置于60°C 士2°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 72h，每隔4小時觀察透明圈產(chǎn)生情況，挑取產(chǎn)生透明圈的菌落，轉接于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中，備用；共分離菌株11株；此11株菌可以確定均為高溫菌，并同時具有耐高溫纖維素酶與蛋白酶活；經(jīng)過初次分篩獲得的高溫菌株中，以編號為705，保藏編號CGMCC No. 4489的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的水解透明圈的直徑最大；其中牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基由3. Og的牛肉膏、10. Og的蛋白胨、5. Og的NaCl、15. Og 的瓊脂和IOOOml的H2O組成，pH值為7. 0，121°C下蒸汽滅菌30min ；酪素培養(yǎng)基由IOg的蛋白胨、1. Og的葡萄糖、5. Og的NaCUO. Ig的CaCUO. Ig的 L-Tyr,5. Og的酪素、18g的瓊脂和IOOOml的H2O組成，pH值為7. 2 7. 4，121°C下蒸汽滅菌 30min ；纖維素剛果紅培養(yǎng)基由0. 5g的ΚΗ2Ρ04、0· 25g的MgS047H20、1. 88g的微晶纖維素、 2g的明膠、0. 2g的剛果紅、IOOml的土壤浸出液、15g的瓊脂和900ml的H2O組成，pH值為 6. 5，121°C下蒸汽滅菌30min。依據(jù)《伯杰氏細菌學鑒定手冊》對篩選出的具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌進行常規(guī)生理生化鑒定；采用CTAB法進行細菌總DNA的提取，然后對其進行16S rRNA序列分析，結果顯示(見圖3)與Bacillus Iicheniformis的16S rRNA序列的相似性最高，達到99% ；并結合細菌形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結果，確定具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌為芽孢桿菌屬的一個新菌種，命名為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)NF705。本實施方式中篩選出的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) NF705，將其菌株的斜面培養(yǎng)物挑取1環(huán)接種于IOOml牛肉膏蛋白胨發(fā)酵培養(yǎng)基中(由3. Og的牛肉膏、 1. Og的蛋白胨、0. 5g的NaCUniOOml的氏0組成，pH值為7. 0 7. 2，121°C下滅菌30min)， 在60°C 士2°C，180轉/分，培養(yǎng)24h 36h，每隔4小時取樣一次，以不接菌的牛肉膏蛋白胨發(fā)酵培養(yǎng)液為參比調零點，采用分光光度計法在600nm波長下測定其吸光度，進而測定其菌密度(見表1)，并繪制生長曲線，如圖4所示，該菌可以在高溫的條件下良好的生長，4 個小時后即進入生長的對數(shù)期，在16個小時即達到了穩(wěn)定期。表1NF705以牛肉膏蛋白胨為培養(yǎng)基60°C下不同時間的菌密度
時間4812162024283236OD值0. 2240. 9811. 8962. 9092. 8762. 9022. 9902. 8762. 789本實施方式中篩選出的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)NF705，為了驗證該菌的高溫條件的穩(wěn)定性，經(jīng)過超過5次以上傳代后，挑取1環(huán)該菌株的斜面培養(yǎng)物接種于IOOml牛肉膏蛋白胨發(fā)酵培養(yǎng)基中，在60°C 士2°C，180轉/分，培養(yǎng)16h結束發(fā)酵。取該培養(yǎng)物按的接種量接入不同的培養(yǎng)基中，進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，在60°C 士2°C，180轉/ 分，經(jīng)過M小時和36小時培養(yǎng)后，以無菌水為參比，調零點，各發(fā)酵液稀釋10倍后，利用分光光度計法，在600nm波長測定吸光度，測定其菌密度，觀察該菌的生長情況；結果見表2 (不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)溫度條件下菌株生長狀況)，其中處理1為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基由3. Og的牛肉膏、1. Og的蛋白胨、0. 5g的NaCl、和IOOml的H2O組成， PH值為7. 0，121 °C下蒸汽滅菌30min。處理2為CMC培養(yǎng)基由1. 5g的CMC_Na、0. Ig的 NH4N03、0. Ig 的酵母膏、0. 05g 的 MgSO4 · 7H20、0. Ig 的 KH2PO4 和 IOOml 的 H2O 組成，pH 值為 7.0 7.2，1211下蒸汽滅菌301^11。用250ml三角瓶，每個三角瓶裝入IOOml培養(yǎng)基。從結果可以看出，該菌的生長溫度范圍廣，最適的生長范圍是45 65°C，在55°C時，24h菌密度就達到了峰值。表2不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)溫度條件下NF705的生長狀況
權利要求
頁1. 一株具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌，其特征在于它為地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)NF705，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No :4489，保藏日期為2010年12月17曰。
全文摘要
一株具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌，它涉及一株高溫菌。具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌，它為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)NF705，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No4489，保藏日期為2010年12月17日。本發(fā)明以自然堆積的牛糞為分離源，采用高溫培養(yǎng)馴化的手段分離篩選出一株具有雙重酶活用于好氧堆肥發(fā)酵的高溫菌，它具有較高纖維素酶活與蛋白酶活，羧甲基纖維素相對酶活性，1.56±0.11cm.d-1，蛋白酶相對活性1.28±0.2cm.d-1。
文檔編號C12R1/10GK102409005SQ20111007421
公開日2012年4月11日 申請日期2011年3月25日 優(yōu)先權日2011年3月25日
發(fā)明者吳皓瓊, 曹亞彬, 殷博, 牛彥波, 郭立姝 申請人:黑龍江省科學院微生物研究所