專利名稱：仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置及其切應(yīng)力加載方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置及其切應(yīng)力加載方法，用于研究各種細(xì)胞在三維培養(yǎng)狀態(tài)下，對可控的流體切應(yīng)力的反應(yīng)，屬于生物力學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由無機(jī)和有機(jī)成分組成的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成了復(fù)雜的、高度有機(jī)化的骨組織，適宜的機(jī)械力加載對骨起著重要影響，它可以促進(jìn)骨形成并減少骨吸收，反之缺乏適宜的刺激會影響骨基質(zhì)蛋白和礦化物質(zhì)的產(chǎn)生、減少骨形成、增加骨吸收。因此，許多體外實驗開始研究骨細(xì)胞對不同機(jī)械刺激(包括流體切應(yīng)力、流體靜壓力和牽張力等)的反應(yīng)性變化。 組織學(xué)的研究表明松質(zhì)骨骨髓腔內(nèi)的陷窩、骨小管和骨小梁形成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中充滿了組織液，約占骨量的23%，正常活動對骨施加的機(jī)械負(fù)荷將引起這些空隙體積的變化，形成液壓促進(jìn)組織液流動，進(jìn)而激活腔隙_小管中骨源細(xì)胞的成骨相分化。Knothe (Bone, 1998， 22(2) 107-17)通過分子標(biāo)記證實了骨礦化基質(zhì)中流體流動的存在。Klei-Nulend(FASEB JOURNAL, 1995,9(5) :441_445)等采用流體流動刺激骨細(xì)胞，認(rèn)為在整骨中，骨細(xì)胞受到腔隙_小管中流體流動的作用而被激活。假說和實驗證據(jù)提示，骨應(yīng)力適應(yīng)的主要運動者是通過小管間隙的流體，并沿骨細(xì)胞軸突產(chǎn)生的應(yīng)變導(dǎo)致的流動。當(dāng)骨被加載時，細(xì)胞周圍的未礦化基質(zhì)產(chǎn)生擠壓，從而在骨細(xì)胞的細(xì)胞膜面上產(chǎn)生流動剪切力。此外Johnson(Am J. Physiol. 271 :E205_E208，1996)等許多實驗表明流體切應(yīng)力比流體靜壓力和牽張力等更能有效地影響骨細(xì)胞應(yīng)力刺激的反應(yīng)。目前常用的流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)多作用于二維培養(yǎng)的細(xì)胞，然而骨是一種非均質(zhì)性組織，它是在三維環(huán)境中對機(jī)械力刺激做出反應(yīng)并改變其形態(tài)。三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)就是將細(xì)胞接種在能夠允許流體流經(jīng)并允許細(xì)胞在其上進(jìn)行三維生長和增殖的支架材料上。三維培養(yǎng)是利用各種方法及材料，使細(xì)胞呈空間立體方式生長，更接近于體內(nèi)生長模式，形成類似體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)，發(fā)揮其功能。細(xì)胞三維培養(yǎng)一方面能夠為體外培養(yǎng)細(xì)胞提供與其來源相似甚至相同的細(xì)胞生長微環(huán)境和細(xì)胞聯(lián)系，從而既有利于各類細(xì)胞的分化定向誘導(dǎo)，又有利于細(xì)胞分化表型的維持和增殖；另一方面，可望在體外構(gòu)建與各類組織、器官相應(yīng)的細(xì)胞三維生長類似物或等同物。而根據(jù)不同培養(yǎng)方式可將細(xì)胞三維培養(yǎng)分為靜止三維培養(yǎng)和動力性三維培養(yǎng)。由于重力作用，靜止培養(yǎng)時細(xì)胞多聚集到載體的底部和載體之外，載體內(nèi)部粘附生長的細(xì)胞數(shù)量很少；而動力性三維培養(yǎng)有許多靜止細(xì)胞培養(yǎng)所不具備的優(yōu)點①三維載體中，能夠產(chǎn)生有效的、均勻的細(xì)胞種植，允許移植最大數(shù)量的細(xì)胞；②能夠促進(jìn)載體中粘附生長細(xì)胞的增殖，分泌更多細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)組織再生；③能夠促進(jìn)氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)向載體內(nèi)部輸送，保持載體內(nèi)部細(xì)胞的活性和功能的發(fā)揮；④細(xì)胞能夠沿著三維載體的孔隙生長，產(chǎn)生具有一定幾何形狀的組織；⑤能夠排出更多的C02，維持生理性PH值，為細(xì)胞代謝和功能發(fā)揮提供更游離的微環(huán)境；⑥培養(yǎng)液流動能夠?qū)?xì)胞產(chǎn)生機(jī)械應(yīng)力刺激，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的發(fā)揮。動力性三維細(xì)胞培養(yǎng)不僅為細(xì)胞生長提供了適宜的生物性微環(huán)境和力學(xué)刺激，而且能更好地促進(jìn)細(xì)胞功能的發(fā)揮。
但現(xiàn)在所使用的為數(shù)較少的自制的三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)存在著組裝復(fù)雜、產(chǎn)生非灌注流徑旁路、可觀察性差等缺點。例如徐尚龍等(生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2006,33(9) 895-901)設(shè)計的培養(yǎng)系統(tǒng)是直接將支架材料浸沒在培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基流過培養(yǎng)瓶時產(chǎn)生了大量的非灌注路徑，無法保證流體垂直流經(jīng)整個支架內(nèi)部，支架表面和內(nèi)部的細(xì)胞無法受到均勻的力學(xué)刺激。李祥等(生物工程學(xué)報，2005，21 (4) 579-583)設(shè)計的培養(yǎng)系統(tǒng)中，支架材料鑲嵌在硅橡膠密封圈內(nèi)，組裝不易且容易造成污染。吳丹等(臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2007，23 (4) 197-199)設(shè)計的培養(yǎng)系統(tǒng)只采用了一個灌注小室，若欲增加樣本量需多次重復(fù)實驗，增加了操作的次數(shù)，大多數(shù)設(shè)計灌注小室不透明，不能觀察到小室內(nèi)液體流動和細(xì)胞培養(yǎng)的情況，給實驗帶來不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置及其切應(yīng)力加載方法，其特點是對成品玻璃注射器進(jìn)行適當(dāng)改造，將注射器的針筒作為灌注小室，并將注射器的活塞中部徑向截斷，置于灌注小室內(nèi)支撐固定支架，利用了注射器的活塞與針筒之間具有的緊密接觸，將培養(yǎng)基流經(jīng)細(xì)胞支架發(fā)生旁路漏液的可能性降到最低；實驗開始前，調(diào)整流速為一固定值，蠕動泵運行Ih后，用量筒分別精確測量每個泵頭水流出量的體積(最大值為67. 1ml，最小值為66. 4ml，誤差率為1. 05% )，獨立性的泵頭能夠減少誤差及灌注小室相互間的影響。本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施實現(xiàn)仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置由蠕動泵、灌注小室、1轉(zhuǎn)8的轉(zhuǎn)接口、空氣濾膜、廢液瓶、直通閥、培養(yǎng)基、儲液瓶和處理硅膠管組成，灌注小室的一端與蠕動泵連接，灌注小室的另一端通過1轉(zhuǎn)8的轉(zhuǎn)接口與廢液瓶連接；廢液瓶通過直通閥與儲液瓶連接；儲液瓶通過1轉(zhuǎn)8的轉(zhuǎn)接口與蠕動泵連接。灌注小室由玻璃注射器制成，可以觀察到灌注小室內(nèi)培養(yǎng)基、細(xì)胞支架及流體內(nèi)的氣泡的情況，細(xì)胞支架置于經(jīng)機(jī)械徑向切割兩段的注射器活塞之間，能夠基本保證流體完全通過細(xì)胞支架，使非灌流旁路減少到最少，活塞與注射器內(nèi)壁間的緊密接觸滿足GB/ T1962. 1-2001，達(dá)到泄漏率不超過0. 005Pa · m3/s。灌注小室上端由鈦板及0型硅膠圈密封，上端鈦板通過鈦支架與下端鈦板連接，灌注小室上、下兩端分別設(shè)有流體流入口和流出蠕動泵頭有8個通道分別和8個灌注小室連接，蠕動泵另一端通過1轉(zhuǎn)8的轉(zhuǎn)接口和鉬處理硅膠管與儲液瓶連接，能使用不同直徑的支架和注射器制成的不同灌注小室， 減少了對實驗設(shè)計的限制。廢液瓶和儲液瓶內(nèi)的鉬處理硅膠管頂端封有空氣濾膜，有利于孵箱中的氧氣和二氧化碳進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)。仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置的切應(yīng)力加載方法包括以下步驟(1)實驗開始之前分別測定蠕動泵每個通道的流速，流 速控制到10-60ml/min ；(2)在無菌條件下，將接種了細(xì)胞的支架固定于灌注小室中，儲液瓶和廢液瓶中加入培養(yǎng)基，連接整個加力裝置；(3)打開蠕動泵，排出整個管道內(nèi)空氣，根據(jù)實驗要求設(shè)定培養(yǎng)基流速10-60ml/min ； (4)將灌注小室、廢液瓶、直通閥、儲液瓶置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)；(5)隔天更換培養(yǎng)基，根據(jù)實驗需要設(shè)定加力時間為1-8天。(6)加力完成后，將接種有細(xì)胞的支架取出，進(jìn)行掃描電鏡觀察細(xì)胞生長情況，免疫組化，RT-PCR分別檢測待測蛋白及基因的表達(dá)。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.本發(fā)明提供一種組裝快捷的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其不僅能將流體比較均勻地作用于細(xì)胞，而且流體全部通過接種了細(xì)胞的支架內(nèi)部，將非灌流路徑減到最小，2..在體外模擬出細(xì)胞生長的三維環(huán)境和力學(xué)環(huán)境，將細(xì)胞接種和長期培養(yǎng)整合于一個系統(tǒng)中；3.精確控制作用于培養(yǎng)細(xì)胞上的流量和切應(yīng)力；4.用于觀察新型支架材料是否有利于細(xì)胞生長繁殖；5.增加組織培養(yǎng)的數(shù)量，確保同一實驗組內(nèi)和組間可比性。6.灌注小室采用的成品玻璃注射器對細(xì)胞無毒無害，便于觀察和消毒，灌注小室支架采用不銹鋼金屬，避免了生銹或金屬污染對細(xì)胞造成損害等問題的發(fā)生。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明圖1為本發(fā)明的縱剖面圖1.蠕動泵，2.灌注小室，3. 1轉(zhuǎn)8轉(zhuǎn)接口，4.空氣濾膜，5.廢液瓶，6.直通閥，7.培養(yǎng)基，8.儲液瓶，9.鉬處理硅膠管。圖2為灌注小室的縱剖面圖10.6% (魯爾)標(biāo)準(zhǔn)圓錐接頭(培養(yǎng)基流入口)，11.0型墊圈，12.螺帽，13.鈦板， 14.注射器針筒，15.鈦支架，16.細(xì)胞支架，17.注射器活塞。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容，對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。實施例1仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置由蠕動泵1、灌注小室2、1轉(zhuǎn)8的轉(zhuǎn)接口 3、空氣濾膜4、廢液瓶5、直通閥6、培養(yǎng)基7、儲液瓶8和處理硅膠管9組成，灌注小室2的一端與蠕動泵1連接，灌注小室2的另一端通過1轉(zhuǎn)8的轉(zhuǎn)接口 3與廢液瓶5連接；廢液瓶通過直通閥6與儲液瓶8連接；儲液瓶8通過1轉(zhuǎn)8的轉(zhuǎn)接口 3與蠕動泵1連接。灌注小室2由玻璃注射器制成，可以觀察到灌注小室2內(nèi)培養(yǎng)基7、細(xì)胞支架16及流體內(nèi)的氣泡的情況，細(xì)胞支架16置于經(jīng)機(jī)械徑向切割兩段的注射器活塞17之間，能夠基本保證流體完全通過細(xì)胞支架，使非灌流旁路減少到最少，活塞與注射器內(nèi)壁間的緊密接觸滿足GB/T 1962. 1-2001，同于IS0594-1 1986 <《注射器、注射針和其他醫(yī)療器械的6% (魯爾)圓錐接頭——第一部分通用要求》，達(dá)到泄漏率不超過0.005Pa*m3/S。灌注小室2上端由鈦板13及O型硅膠圈11密封，上端鈦板13通過鈦支架15與下端鈦板13連接，灌注小室上、下兩端分別設(shè)有流體流入口 10和流出口。蠕動泵1頭有8個通道分別和8個灌注小室2連接，蠕動泵1另一端通過1轉(zhuǎn)8 的轉(zhuǎn)接口 3和鉬處理硅膠管9與儲液瓶8連接，能使用不同直徑的支架和注射器制成的不同灌注小室，減少了對實驗設(shè)計的限制。
廢液瓶5和儲液瓶8內(nèi)的鉬處理硅膠管9頂端封有空氣濾膜4，有利于孵箱中的氧氣和二氧化碳進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)。仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置的切應(yīng)力加載方法包括以下步驟(1)實驗開始之前分別測定蠕動泵1每個通道的流速，流速控制到60ml/min ；(2)在無菌條件下，將接種了細(xì)胞的支架16固定于灌注小室2中，儲液瓶8和廢液瓶5中加入培養(yǎng)基7，連接整個加力裝置；(3)打開蠕動泵1，排出整個管道內(nèi)空氣，根據(jù)實驗要求設(shè)定培養(yǎng)基7流速60ml/ min ；(4)將灌注小室2、廢液瓶5、直通閥6、儲液瓶8置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)；(5)根據(jù)實驗需要設(shè)定加力時間為1天。(6)加力完成后，將接種有細(xì)胞的支架16取出，進(jìn)行掃描電鏡觀察細(xì)胞生長情況， 免疫組化，RT-PCR分別檢測待測蛋白及基因的表達(dá)。實施例2按照實施例1仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置的切應(yīng)力加載方法包括以下步驟(1)實驗開始之前分別測定蠕動泵1每個通道的流速，流速控制到30ml/min ；(2)在無菌條件下，將接種了細(xì)胞的支架16固定于灌注小室2中，儲液瓶8和廢液瓶5中加入培養(yǎng)基7，連接整個加力裝置；(3)打開蠕動泵1，排出整個管道內(nèi)空氣，根據(jù)實驗要求設(shè)定培養(yǎng)基7流速30ml/ min ；(4)將灌注小室2、廢液瓶5、直通閥6、儲液瓶8置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)；(5)隔天更換培養(yǎng)基7，根據(jù)實驗需要設(shè)定加力時間為4天。(6)加力完成后，將接種有細(xì)胞的支架16取出，進(jìn)行掃描電鏡觀察細(xì)胞生長情況， 免疫組化，RT-PCR分別檢測待測蛋白及基因的表達(dá)。實施例3按照實施例1仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置的切應(yīng)力加載方法包括以下步驟(1)實驗開始之前分別測定蠕動泵1每個通道的流速，流速控制到lOml/min ；(2)在無菌條件下，將接種了細(xì)胞的支架16固定于灌注小室2中，儲液瓶8和廢液瓶5中加入培養(yǎng)基7，連接整個加力裝置；(3)打開蠕動泵1，排出整個管道內(nèi)空氣，根據(jù)實驗要求設(shè)定培養(yǎng)基7流速IOml/ min ；(4)將灌注小室2、廢液瓶5、直通閥6、儲液瓶8置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)；(5)隔天更換培養(yǎng)基7，根據(jù)實驗需要設(shè)定加力時間為8天。
( 6)加力完成后，將接種有細(xì)胞的支架16取出，進(jìn)行掃描電鏡觀察細(xì)胞生長情況， 免疫組化，RT-PCR分別檢測待測蛋白及基因的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于該裝置由蠕動泵(1)、灌注小室 (2)、1轉(zhuǎn)8的轉(zhuǎn)接口 (3)、空氣濾膜(4)、廢液瓶(5)、直通閥(6)、培養(yǎng)基(7)、儲液瓶(8)和處理硅膠管(9)組成，灌注小室(2)的一端與蠕動泵(1)連接，灌注小室(2)的另一端通過 1轉(zhuǎn)8的轉(zhuǎn)接口(3)與廢液瓶(5)連接；廢液瓶通過直通閥(6)與儲液瓶(8)連接；儲液瓶 (8)通過1轉(zhuǎn)8的轉(zhuǎn)接口(3)與蠕動泵⑴連接。
2.如權(quán)利要求1所述仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于灌注小室(2)由玻璃注射器制成，可以觀察到灌注小室(2)內(nèi)培養(yǎng)基(7)、細(xì)胞支架(16)及流體內(nèi)的氣泡的情況，細(xì)胞支架(16)置于經(jīng)機(jī)械徑向切割兩段的注射器活塞(17)之間，能夠基本保證流體完全通過細(xì)胞支架(16)，使非灌流旁路減少到最少，活塞與注射器內(nèi)壁間的緊密接觸滿足 GB/T 1962. 1-2001，達(dá)到泄漏率不超過0.005Pa*m3/s，灌注小室(2)上端由鈦板(13)及O 型硅膠圈(11)密封，上端鈦板通(13)過鈦支架(15)與下端鈦板(13)連接，灌注小室上、 下兩端分別設(shè)有流體流入口(10)和流出口。
3.如權(quán)利要求1所述仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于蠕動泵(1)頭有 8個通道分別和8個灌注小室⑵連接，蠕動泵⑴另一端通過1轉(zhuǎn)8的轉(zhuǎn)接口(3)和鉬處理硅膠管(9)與儲液瓶(8)連接，能使用不同直徑的支架和注射器制成的不同灌注小室，減少了對實驗設(shè)計的限制。
4.如權(quán)利要求1所述仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其特征在于廢液瓶(5)和儲液瓶(8)內(nèi)的鉬處理硅膠管(9)頂端封有空氣濾膜(4)，有利于孵箱中的氧氣和二氧化碳進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)。
5.如權(quán)利要求1-4之一所述仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置的切應(yīng)力加載方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)實驗開始之前分別測定蠕動泵⑴每個通道的流速，流速控制到10-60ml/min；(2)在無菌條件下，將接種了細(xì)胞的支架(16)固定于灌注小室(2)中，儲液瓶(8)和廢液瓶(5)中加入培養(yǎng)基(7)，連接整個加力裝置；(3)打開蠕動泵(1)，排出整個管道內(nèi)空氣，根據(jù)實驗要求設(shè)定培養(yǎng)基(7)流速 10-60ml/min ；(4)將灌注小室(2)、廢液瓶(5)、直通閥(6)、儲液瓶(8)置于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)；(5)隔天更換培養(yǎng)基(7)，根據(jù)實驗需要設(shè)定加力時間為1-8天。(6)加力完成后，將接種有細(xì)胞的支架(16)取出，進(jìn)行掃描電鏡觀察細(xì)胞生長情況，免疫組化，RT-PCR分別檢測待測蛋白及基因的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了仿生三維流體切應(yīng)力細(xì)胞培養(yǎng)裝置及其切應(yīng)力加載方法，其特點是該裝置由蠕動泵(1)、灌注小室(2)1轉(zhuǎn)8的轉(zhuǎn)接口(3)、空氣濾膜(4)、廢液瓶(5)、直通閥(6)、培養(yǎng)基(7)、儲液瓶(8)，處理硅膠管(9)組成，灌注小室的一端與蠕動泵(1)連接，灌注小室的另一端通過1轉(zhuǎn)8的轉(zhuǎn)接口(3)與廢液瓶(5)連接；廢液瓶通過直通閥(6)與儲液瓶(8)連接；儲液瓶(8)通過1轉(zhuǎn)8的轉(zhuǎn)接口(3)與蠕動泵(1)連接。
文檔編號C12M3/00GK102174397SQ20111005370
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月7日
發(fā)明者伍穎穎, 劉曉光, 宮蘋, 李鳳, 班宇, 耿寧 申請人:四川大學(xué)