專利名稱：rDNA ITS-D3區(qū)核苷酸序列在建立藥用植物DNA條形碼鑒別系統(tǒng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及包含核酸的檢測和應(yīng)用方法，具體涉及利用核苷酸序列鑒別藥用植物的方法。
背景技術(shù)：
藥用植物是中藥材的原植物，是一些具有保健和藥用價值的植物物種。據(jù)統(tǒng)計，我國有11146種藥用植物(占全部中藥資源的87%)，分屬383科，2309屬。對這一萬多種藥用植物進行快速、準確鑒定是擺在我國中醫(yī)藥工作者面前的一項緊迫而艱巨的任務(wù)。藥用植物現(xiàn)有的鑒別方法主要根據(jù)形態(tài)特征來鑒別，通過采集待鑒定樣品各器官(如花、果實、 種子、根、莖、葉)或組織的形態(tài)特征，查閱藥用植物文獻資料、圖片及標本，對照比較后得出鑒定結(jié)果。這一方法易受植物生長發(fā)育階段、環(huán)境條件及鑒定人員的經(jīng)驗影響，鑒定效率較低，而且對一些形態(tài)相似的藥用植物容易判斷錯誤。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)特別是DNA測序技術(shù)的迅速發(fā)展，國際上開始發(fā)展DNA條形碼技術(shù)(DNA barcoding)來鑒別物種。DNA條形碼技術(shù)是以物種細胞中的一段短的標準的 DNA區(qū)域作為條形碼標記，對生物物種進行準確、快速、自動鑒定的技術(shù)。該技術(shù)直接分析植物的基因型而非表現(xiàn)型，鑒別結(jié)果不受環(huán)境因素、樣品形態(tài)和材料來源的影響，可以確保藥材的基原真實。目前國際上已采用CBOL植物條形碼工作組(CBOL Plant Working Group.，A DNA barcodefor land plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009，106 :12794-12797.)提出的以質(zhì)體基因matK+rbcL組成的雙位點植物DNA條形碼方案。使用時，用戶采用通用引物PCR 擴增matK和rbcL兩個位點并測序，將獲得的matK和rbcL序列提交到生物條形碼數(shù)據(jù)庫 BOLD (http://www. boldsystems, org)進行查詢，即可獲得樣品的生物分類信息。但是這一標準方案在鑒別植物物種時尚存在以下缺點1.需要測試matK和rbcL兩個位點，工作量大，成本較高；2. rbcL雖然有通用引物，但序列在物種中進化速率較慢，而matK雖然序列進化速率較快，但缺乏通用引物，這些缺點使matK+rbcL只能區(qū)別約70%的植物物種，鑒別能力不理想。植物核糖體DNA(rDNA)通常呈18S-5. 8S-26S順反子排列于染色體上，在基因組中高度重復(fù)(幾百至幾千次)。位于18S與5. 8S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)I(ITSl)以及位于 5.8S與26S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)因具有較高的序列變異速率，已被廣泛用于植物系統(tǒng)發(fā)生、遺傳多樣性等研究(Alvarez，I.，Wendel，J. F.，2003. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. Mol. Phylogenet. Evo 1. 29 :417-434.)。最近，一些學(xué)者認為ITS2適合作為植物DNA條形碼位點，用來區(qū)別不同植物物種(Shilin Chen, Hui Yao, Jianping Han, Chang Liu, Jingyuan Song, Linchun Shi, Yingjie Zhu, Xinye Ma, Ting Gao,Xiaohui Pang,Kun Luo,Ying Li, Xiaocheng Jia, Yulin Lin, Christine Leon. Validation of the ITS2Region as a Novel DNA Barcode for Identifying MedicinalPlant Species. PL0S0NE. 2010,15 (1) :e8613)。但是單獨采用 ITS2 作為植物 DNA 條形碼存在以下缺點1. ITS2序列在許多物種中存在多個不同的拷貝，需對PCR產(chǎn)物進行克隆并挑取多個陽性克隆測序；2.由于缺少保守區(qū)，ITS2序列在分類廣泛的物種中難以準確比對。Kuzoff P K等研究發(fā)現(xiàn)植物核糖體大亞基DNAQ6S rDNA)上存在12個擴展區(qū)(D1-D12)，這些擴展區(qū)的序列變異速率比位于擴展區(qū)之間的保守區(qū)快6. 4到10. 2倍 (Kuzoff P K, SweereJ A, Soltis D E, Soltis P S. , Zimmer E A. , The phylogenetic potential of entire 26SrDNA sequences in plants. Molecular Biology and Evolution, 1998，15 :251-263.)。目前，26S rDNA已經(jīng)應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)生研究(Douglas Ε.Soltis, Anne Ε.Senters, MichaelJ. Zanis, Sangtae Kim, James D. Thompson, Pamela S.Soltis,Louis P. Ronse De Craene,Peter K. Endress and James S. Farris. Gunnerales are sister to other core eudicots amplications for the evolution of pentamery. American Journal of Botany，2003，90 :461-470.)，但尚未見將 ^S rDNA上存在的擴展區(qū)用于植物(含藥用植物)鑒別的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種藥用植物ITS-D3區(qū)核苷酸序列新用途。本發(fā)明所述的ITS-D3區(qū)核苷酸序列是指核糖體DNA(rDNA)上的一段DNA序列， 由rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(包含ITS1-5. 8S-ITS2)與^S D1-D3構(gòu)成，其全部區(qū)域包含 ITS1-5. 8S-ITS2-D1-D2-D3(圖 1)。ITS-D3 區(qū)核苷酸序列中的 ITS1、ITS2J6S rDNA 的 D1、 26S rDNA的D2和^S rDNA的D3區(qū)域具有序列變異速率快的特點，上述區(qū)域在不同物種的藥用植物之間或者同一種內(nèi)不同類型的藥用植物之間通常存在堿基差異位點，因此不同物種的藥用植物或者同一種內(nèi)不同類型的藥用植物具有不同的ITS-D3序列。并且，ITS-D3 區(qū)核苷酸序列中的18S rDNA 3，端、5. 8S、ITS2與^S Dl連接區(qū)、26S D1-D2連接區(qū)、26S D2-D3連接區(qū)和^S D3-D4連接區(qū)具有序列變異速率較慢的特點，上述區(qū)域在不同物種的藥用植物之間或者同一種內(nèi)不同類型的藥用植物之間變化較少，因此上述區(qū)域既可以用來篩選PCR檢測及測序通用引物，也可以為各種藥用植物的ITS-D3區(qū)序列比對提供穩(wěn)定區(qū)， 使序列比對能夠準確進行。此外，藥用植物ITS-D3區(qū)序列長度約1400bp，利于PCR擴增與測序。ITS-D3區(qū)的核苷酸序列上述特性使其可以作為藥用植物DNA條形碼，用于藥用植物的鑒別。所述的ITS-D3區(qū)的核苷酸序列在鑒別藥用植物中的用途具體為，藥用植物的 ITS-D3區(qū)的核苷酸序列在建立藥用植物DNA條形碼鑒別系統(tǒng)中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的應(yīng)用中，所述的藥用植物的ITS-D3區(qū)的核苷酸序列由以下方法得到(a)提取藥用植物的基因組DNA ；(b)將步驟(a)得到的基因組DNA，先以SEQ ID NO. 1所示的序列為上游引物，SEQ IDN0. 4所示的序列為下游引物進行PCR擴增，再電泳檢測分離出擴增產(chǎn)物；其中所述的PCR 擴增程序為94°C預(yù)變性Imin后進入循環(huán)，94°C變性30S，55°C退火60S，72°C延伸2min，循環(huán)36次，72°C延伸7min，12°C保存；(c)將步驟(b)得到的擴增產(chǎn)物以 SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID Ν0· 3 禾口SEQ IDN0. 4所示的序列為引物進行PCR循環(huán)測序；其中所述的PCR循環(huán)測序的PCR擴增程序為96°C變性15S，50°C退火15S，60°C延伸^iin，25個循環(huán)；(d)將步驟(c)所得到的ABI序列文件用序列拼接軟件進行拼接和人工校正，得到 ITS-D3區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明所述的應(yīng)用中，所述的DNA條形碼鑒別系統(tǒng)包括DNA條形碼數(shù)據(jù)庫、更新 DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的方法和利用DNA條形碼鑒別藥用植物的方法，其中，所述的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫為所述的藥用植物的ITS-D3區(qū)核苷酸序列及其對應(yīng)的植物名稱的文檔；所述的更新DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的方法包括檢測ITS-D3區(qū)核苷酸序列的步驟和將所測得的ITS-D3區(qū)核苷酸序列及其植物名稱添加到所述的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫內(nèi)的步驟；所述的鑒別藥用植物的方法包括以下步驟首先測定待鑒定樣品的ITS-D3區(qū)的核苷酸序列，再將測定得到的核苷酸序列與DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中的ITS-D3區(qū)的核苷酸序列一起構(gòu)建聚類樹，根據(jù)聚類樹確定待鑒定樣品與DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中親緣關(guān)系最近的藥用植物并比較它們的ITS-D3區(qū)核苷酸序列差異，然后以數(shù)據(jù)庫中與待鑒定樣品親緣關(guān)系最近的藥用植物的物種名稱為參考，結(jié)合形態(tài)特征等信息確定待鑒定樣品的物種名稱。由于藥用植物的基因組DNA中ITS-D3區(qū)的核苷酸序列既包括序列變異速率快的 ITSUITS2以及^S rDNA上的D1、D2、D3擴展區(qū)，又包含序列進化比較保守的5. 8S及rDNA 上的D1、D2、D3擴展區(qū)兩端的保守區(qū)，因此與ITS2及國際上的matK+rbcL植物DNA條形碼標準方案相比，本發(fā)明所述用途的DNA條形碼鑒別系統(tǒng)具有通用性好、序列比對準確、物種區(qū)別能力強的優(yōu)點。此外，采用本發(fā)明提供的引物和測定方法擴增rDNA ITS-D3區(qū)，只需一次PCR擴增，2-4次測序反應(yīng)，即可獲得長度約1400bp的核苷酸序列，因此既可減少工作量，節(jié)省測定時間，也可降低成本。


圖1為ITS-D3區(qū)的結(jié)構(gòu)及本發(fā)明設(shè)計的引物在rDNA上的位置與擴增方向示意圖。圖2為50種藥用植物的聚類樹。該聚類樹根據(jù)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中50種藥用植物的ITS-D3堿基差異數(shù)據(jù)矩陣采用鄰接法聚類，并用自展值檢驗聚類樹內(nèi)部各分支的支持率。圖3為待鑒定的8份砂仁樣品與DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中的50種藥用植物的聚類樹。 該聚類樹基于樣品間的ITS-D3堿基差異數(shù)據(jù)矩陣采用鄰接法聚類，并采用自展值檢驗聚類樹內(nèi)部各分支的支持率。圖中“▲”表示數(shù)據(jù)庫中與待鑒定的砂仁樣品親緣關(guān)系最近的藥用植物，“Δ”表示待鑒定的砂仁樣品5.砂仁(廣東陽春)6.砂仁(廣東陽春)7.砂仁(廣西)8.砂仁(云南)
具體實施例方式例ISEQ ID No. 1 4所示序列的引物的設(shè)計SEQ ID No. 1 4所示序列的引物的具體設(shè)計方法如下
參考 Soltis 等的文章(Douglas Ε. Soltis, Anne Ε. Senters, Michael J. Zanis, Sangtae Kim, James D. Thompson, Pamela S. Soltis, Louis P. Ronse De Craene, Peter K.Endress and James S.Farris. Gunnerales are sister to other core eudicots implications for the evolution of pentamery. American Journal of Botany,2003, 90 :461-470.)，從核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank和EMBL中下載文章中附加的種子植物206個分類單元的 18S rDNA與 S rDNA 序列，并下載粳稻(Oryza sativa Japonica Group) 第9染色體序列(序列號AP008225)，選取其rDNA全序列(從第^98bp至8680bp，包含 18S-ITS1-5. 8S-ITS2-25S)。將下載的序列采用 clustal X (version 1. 83) (www. clustal. org)進行多重比對，參考粳稻(序列號AP008225)的rDNA全序列來確定18S、ITS1、5.8S、 ITS2、26S的具體位置，根據(jù)比對結(jié)果確定rDNA ITS-D3兩端及內(nèi)部的保守區(qū)。然后，采用 Oligo 6.54(www. oligo. net)禾口 Primer Premier5. O(www. premierbiosoft. com)對 rDNA ITS-D3兩端及內(nèi)部的保守區(qū)進行引物設(shè)計和評價。引物評價指標主要采用序列Tm值、AG 值、引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)、在錯配位點的引發(fā)效率、引物及產(chǎn)物的GC含量等。最終確定 ITS-D3 區(qū)測序引物為序列表中 SEQ IDNo. USEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示的核酸序列，四者之間的位置如圖1所示。上述SEQ ID No. 1 4所示序列的引物均交由hvitrogen (英駿)生物技術(shù)有限公司合成。例2建立基于ITS-D3區(qū)的核苷酸序列的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫本例以50種藥用植物為例說明基于ITS-D3區(qū)的核苷酸序列的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的建立，具體步驟如下1.采集下述來自華南藥用植物種質(zhì)資源庫中的19科50種藥用植物的葉片長果陽春砂Amomum villosum Lour. var. changguo.、高良姜Alpinia officinarum Hance、草豆蔻Alpinia katsumadai Hayata、大高良姜Alpinia galanga(Linn)Wi 1 Id.、姜花Hedychium coronarium Koen.、花葉山姜Aplinia pumila Hook. f.、文殊蘭Crinum asiaticum Lvar. sinicum(Roxb. ex Herb.)、朱丁頁紅 Hippeastrum vittatum(Ait.) Herb.、天門冬 Asparagus cochinchinensis (Lour.)Merr.、中華戸菩 Aloe vera L var. chinesis (Haw.)BergerΛ 日本戸菩 Aloe arboresesens. Mill.、細辛 Asarum sieboldii Miq.、藤三七 Boussingaultia gracilis Miers. var. baselloides Bail.、 7^ 1 Cajanus cajan(L. )Millsp. Λ ^lJ ^f Schizonepeta tenuifolia(Benth. )Briq.、紫花杜_! Rhododendri mariae Hance、紫背千里光 Senecio nudicaulis Buch. -Ham. ex D. Don、野菊 Chrysanthemum indicum L、 絡(luò)石 Trachelospermum jasminoides、牛白藤 Hedyotis hedyotidea(DC.)Merr.、巴卓戈天 Morinda officinalis How、馬藍 Baphicacanthus cusia(Nees)Bremek.、丹參 Salvia miltiorrhiza BungeΛ 溪黃草 Isodon lophanthoides(Buch. Ham. ex D. Don)Hara var. gerardiana(Benth· )Hara、廣藿香 Pogostemon cablin(Blanco)Benth、紫蘇 Perilla frutescens (L. )Britt、薄荷 Mentha longifolia (Linn.) HudsonΛ 紫竹豐艮 Phyllostachys nigra(Lodd. ex Lindl·)Munro、大馬艾骨丹 Adhatoda vasica(wall. )Nees、忍冬 Lonicera japonica Thunb.、黃葛樹 Ficus virens Ait. var. sublanceolata (Miq).、琴葉格 Ficus pandurata Hance.、小葉格 Ficus microcarpa L、對葉格 Ficus hispida L f.、桑樹 Morus alba L、漂桑Morus nigra L、朱樓Hibiscus rosa-sinensis L、白木香Aquilariasinensis (Lour. )Gilg、佛手 Citrus medica L var. sareodactylis (Noot.) swingle、化橘紅Citrus grandis (L) Osbeck. var. tomentosa Hort、兩面針Zanthoxylum nitidum(Roxb.) DC.、酒餅簕 Atalantia buxifolia(Poir. )oliv、黃皮 Clauseina lansium(Lour.) skeels、 I由皮 Citrus grandis (L.) Osbeck、^L M ^ Murraya exotica (L.) Jack.、陳& Citrus reticulate Blanco、山小桔 Glycosmis panifIora(sims)Little、山小橘 Glycosmis citrifolia(Willd. )Lindl.、三、廣苦Evodia lepta(Spreng. )Merr.、；Μ草尺uta graveolens2.分別測定上述50種藥用植物的ITS-D3區(qū)的核苷酸序列，具體檢測方法如下所述。(1)取0. Ig所采集的植物葉片，用滅菌純水把葉片沖洗干凈，吸水紙吸去表面水分。加 800 μ 1 提取液[L4mol/L NaCl, 100mmol/L Tris-HCl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA,3% (w/v)CTAB,l% (w/v)PVP，研磨前加入0. 2% (ν/ν) β -巰基乙醇]，石英砂適量。冰浴快速研磨lmin，轉(zhuǎn)入2. Oml離心管，65°C溫育20-40min，間或輕搖離心管。將離心管取出，冷卻至室溫，加入等體積(約800 μ 1)酚-氯仿-異戊醇05 24 1)。將離心管上下顛倒幾次，充分混勻，裝入離心機中，lOOOOrpm，離心15min。吸取上清液400 μ 1，轉(zhuǎn)管，加入等體積 (400 μ 1)酚-氯仿-異戊醇重復(fù)抽提一次，離心。取上清液300 μ 1，加0. 7體積冰凍異丙醇 OlO μ 1)，緩緩平轉(zhuǎn)離心管，可見白色的DNA絮狀物，4°C冰箱放置20min至2h。lOOOOrpm， 離心15min，棄上清液。沉淀為DNA，用ΙΟΟΟμ 1 70%乙醇清洗2次。lOOOOrpm，離心5min， 倒出乙醇。待DNA在室溫中干燥后，加150 μ 1滅菌純水溶解，_20°C保存。將提取的DNA溶 'MMM 100 M GeneQuant pro DNA/RNA calculator (Amersham Pharmacia Biotech) IlJ 定A260^A280值。根據(jù)A260A280值判斷DNA的純度，以A260A280的值在1.7-1.9之間為合格。 根據(jù)公式DNA濃度(ng/ μ 1) = 50 X (OD260) X稀釋倍數(shù)，計算DNA濃度，使DNA模板濃度稀釋為50 500ng/l·! 1，得到基因組DNA，-20°C保存。(2)將步驟(1)得到的基因組DNA與SEQ ID NO. 1所示序列的上游引物、SEQ ID N0. 4所示序列的下游引物、DNA聚合酶、PCR反應(yīng)液和DMSO混合后按以下程序進行PCR擴增94°C預(yù)變性Imin后進入循環(huán)，94°C變性30S，55°C退火60S，72°C延伸2min，循環(huán)36次， 72°C延伸7min，12°C保存；其中，所述的PCR擴增反應(yīng)體系如表1所示表IPCR擴增的反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.rDNA ITS-D3區(qū)核苷酸序列在建立藥用植物DNA條形碼鑒別系統(tǒng)中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥用植物的ITS-D3區(qū)的核苷酸序列由以下方法得到(a)提取藥用植物的基因組DNA；(b)將步驟(a)得到的基因組DNA，先以SEQID NO. 1所示的序列為上游引物，SEQ IDN0. 4所示的序列為下游引物進行PCR擴增，再電泳檢測分離出擴增產(chǎn)物；其中所述的PCR 擴增程序為94°C預(yù)變性Imin后進入循環(huán)，94°C變性30S，55°C退火60S，72°C延伸2min，循環(huán)36次，72°C延伸7min，12°C保存；(c)將步驟(b)得到的擴增產(chǎn)物以SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ IDNO. 4所示的序列為引物進行PCR循環(huán)測序；其中所述的PCR循環(huán)測序的PCR擴增程序為 96°C變性 15S，50°C退火 15S，60°C延伸 4min，25 個循環(huán)；(d)將步驟(c)所得到的ABI序列文件用序列拼接軟件進行拼接和人工校正，得到 ITS-D3區(qū)的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的DNA條形碼鑒別系統(tǒng)包括DNA條形碼數(shù)據(jù)庫、更新DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的方法和鑒別藥用植物的方法，其中，所述的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫為所述的藥用植物的ITS-D3區(qū)核苷酸序列及其對應(yīng)的藥用植物名稱的文檔；所述的更新DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的方法包括檢測ITS-D3區(qū)核苷酸序列的步驟和將所測得的ITS-D3區(qū)核苷酸序列及其藥用植物名稱添加到所述的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫內(nèi)的步驟；所述的鑒別藥用植物的方法包括以下步驟首先測定待鑒定樣品的ITS-D3區(qū)的核苷酸序列，再將測定得到的核苷酸序列與DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中的ITS-D3區(qū)的核苷酸序列一起構(gòu)建聚類樹，根據(jù)聚類樹確定待鑒定樣品與DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中親緣關(guān)系最近的藥用植物并比較它們的ITS-D3區(qū)核苷酸序列差異，然后以數(shù)據(jù)庫中與待鑒定樣品親緣關(guān)系最近的藥用植物的物種名稱為參考，結(jié)合形態(tài)特征等信息確定待鑒定樣品的物種名稱。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用核苷酸序列鑒別藥用植物的方法，具體涉及藥用植物的rDNA ITS-D3區(qū)的核苷酸序列在建立藥用植物DNA條形碼鑒別系統(tǒng)中的應(yīng)用。該應(yīng)用包括以下步驟首先檢測藥用植物的ITS-D3區(qū)的核苷酸序列，建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，然后檢測待鑒定樣品的ITS-D3區(qū)的核苷酸序列，再將測定得到的核苷酸序列與DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中的ITS-D3區(qū)的核苷酸序列一起構(gòu)建聚類樹，根據(jù)聚類樹確定待鑒定樣品與DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中親緣關(guān)系最近的藥用植物并比較它們的ITS-D3區(qū)核苷酸序列差異，然后以數(shù)據(jù)庫中與待鑒定樣品親緣關(guān)系最近的藥用植物的物種名稱為參考，結(jié)合形態(tài)特征等信息確定待鑒定樣品的物種名稱。本發(fā)明所述的DNA條形碼具有引物通用性好、序列比對準確、物種區(qū)別能力強的特點。
文檔編號C12Q1/68GK102191318SQ201110053038
公開日2011年9月21日 申請日期2011年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月4日
發(fā)明者何瑞, 徐暉, 楊錦芬, 段中崗, 詹若挺, 陳蔚文 申請人:廣州中醫(yī)藥大學(xué), 惠州學(xué)院