專利名稱：一種同時檢測tnf、il-10和ctla-4基因多態(tài)性的芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種人類免疫相關(guān)基因(TNF、IL-10和CTLA-4基因)多態(tài)性的芯片，尤其涉及一種能同時檢測TNF-α -308，IL_10_1082，IL-10-592, CTLA-4-49位點基因多態(tài)性的玻璃基因芯片，屬生物芯片診斷技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體免疫系統(tǒng)是由免疫器官、免疫細胞、免疫因子等組成的龐大的系統(tǒng)，負責抵御外來多種類型病原菌的侵害，清除體內(nèi)衰老、死亡或損傷的自身細胞以及識別和消滅體內(nèi)產(chǎn)生的突變細胞。免疫調(diào)節(jié)細胞的功能異常或失衡，對多種自身免疫性疾病以及惡性腫瘤的產(chǎn)生具有重要影響。免疫調(diào)節(jié)細胞可以產(chǎn)生多種不同的細胞因子，作為細胞間信號傳遞分子，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與免疫細胞的分化、發(fā)育和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等作用。這些細胞因子的合成及合成量為遺傳基因所控制，差別的主要原因為基因序列上存在許多極小的遺傳差異即單核苷酸多態(tài)性。TNF(腫瘤壞死因子)是體內(nèi)具有多種生物活性的重要細胞因子，具有抗腫瘤，抗病毒感染及免疫調(diào)節(jié)作用。多項研究提示腫瘤患者體內(nèi)TNF呈現(xiàn)過度表達。TNF-a-308 位點位于TNF-α基因啟動子區(qū)，這一位點的基因多態(tài)性可能影響體內(nèi)TNF的表達，進而影響機體免疫功能的改變。IL-10 (白細胞介素-10)是一種具有廣泛免疫活性的免疫調(diào)節(jié)細胞因子，其作用包括誘導(dǎo)B細胞增殖和分化，抑制T細胞的增殖和細胞毒作用。近年來發(fā)現(xiàn)，某些腫瘤往往伴有血清IL-10水平增高及受體表達異常。提示IL-10失調(diào)會影響機體整個內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，進而導(dǎo)致免疫功能的紊亂，直至誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。IL-10啟動子區(qū)-1082位點和-592位點基因多態(tài)性可能影響著體內(nèi)IL-10的表達，進而影響相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展。CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞抗原-4)是一種T細胞活性的負性調(diào)節(jié)因子，其高表達可導(dǎo)致細胞周期阻滯和細胞因子產(chǎn)量抑制，直接導(dǎo)致T細胞增殖期的消除。CTLA-4 49位點基因多態(tài)性可能影響T細胞活性，進而對免疫相關(guān)性疾病及腫瘤的發(fā)生產(chǎn)生影響。 綜上所述，上述幾個基因均為參與人體免疫調(diào)節(jié)的重要組成因素，明確這些基因序列上的基因類型可以了解人體先天性免疫功能以及了解人體罹患自身免疫性疾病及惡性腫瘤的風險?；蛐酒夹g(shù)是一種微型化、快速、高效進行基因檢測的技術(shù)方法，迄今為止，在基因表達檢測，基因突變檢測，單核苷酸多態(tài)性和DNA序列測定等方面具有廣泛的研究應(yīng)用。然而，檢索發(fā)現(xiàn)人類免疫相關(guān)基因(TNF，IL-10和CTLA-4基因)多態(tài)性檢測的玻璃基因芯片，至今未見報道。
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本實用新型提供了一種同時檢測TNF-α -308，IL_10_1082， IL-10-592, CTLA-4-49位點多態(tài)性的玻璃基因芯片。該芯片能夠克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不能一次檢測多個基因多態(tài)性的缺陷，滿足疾病預(yù)防控制和臨床醫(yī)療領(lǐng)域的需要。[0006]本實用新型所述同時檢測TNF、IL-10和CTLA-4基因多態(tài)性的玻璃基因芯片，由 玻璃基片和陣列式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探針與對照及空白的點涂層組成；其特征 在于所述的玻璃基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片；所述點涂層的形狀為圓形，涂層 區(qū)設(shè)1 2個，每涂層區(qū)設(shè)有8條不同位點的基因特異性檢測探針、1條陽性對照探針和4 條陰性對照探針、以及一個由點樣液做的空白，其中所述8條檢測探針中的每種探針與對 照及空白分別以2X 2方式在玻璃基片表面陣列排布4個平行的點涂層，每個點涂層的直徑 為0. 15mm,同組探針或?qū)φ栈蚩瞻c涂層間距為0. 4mm，不同組探針或?qū)φ拯c涂層間距為 0. 5mm。其中所述的玻璃基片是長方形，面積是73mm 77mmX25mm 27mm ；厚度為0. 6mm 2. Omm0所述的涂層區(qū)面積優(yōu)選5mmX 5mm。上述8條不同位點的基因特異性檢測探針的基因序列分別是(TNF-a -308)-w :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-GAGGGGCATGAGGACGGGGTT ；(TNF-a -308)-m :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-GAGGGGCATGGGGACGGGGTT ；(IL-10-1082)-w :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-TTCTTTGGGAAGGGGAAGTAG ；(IL-10-1082)-m :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-TTCTTTGGGAGGGGGAAGTAG ；(IL-10-592)-w :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-CCCCGCCTGTCCTGTAGGAAG ；(IL-10-592)-m :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-CCCCGCCTGTACTGTAGGAAG ；(CTLA-4-49)_w :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-GAACCTGGCTACCAGGACCTG ；(CTLA-4-49)-m :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-GAACCTGGCTGCCAGGACCTG ；上述1條陽性對照探針的基因序列是日-actin :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-TACTCTAACCGTACCGA ；上述4條陰性對照探針的基因序列分別是(TNF-a -30 -CK 5，-(NH2)-(CH2)6_Po1(dT)15-GAGGGGCATGCGGACGGGGTT ；(IL-10-1082)-CK :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-TTCTTTGGGACGGGGAAGTAG ；(IL-10-592)-CK :5，-(NH2)-(CH2)6-Pol(dT)15-CCCCGCCTGTGCTGTAGGAAG ；(CTLA-4-49)-CK 5，-(NH2)-(CH2)6-Po1(dT)15-GAACCTGGCTCCCAGGACCTG上述檢測探針與對照探針均以poly (dT) 15作為連接臂，并在探針的5’端加入帶 氨基的六碳基團。上述表面有醛基化修飾層的玻璃片的制備方法是將未經(jīng)任何化學(xué)修飾的載玻片 裸片，以體積百分比濃度為5%戊ニ醛水溶液浸泡，然后晾干制得。本實用新型所述的人類免疫相關(guān)基因(TNF，IL-10和CTLA-4基因)多態(tài)性檢測玻 璃基因芯片實現(xiàn)了高通量檢測的目的，具有如下優(yōu)點和效果(1)采用的 TNF-a -308，IL-10-1082, IL-10-592, CTLA-4-49 多態(tài)性位點特異性引 物和檢測探針，能夠?qū)崿F(xiàn)對TNF，IL-10和CTLA-4基因進行有效擴增和精確鑒定。(2)采用的將TNF，IL-10和CTLA-4基因多態(tài)性特異性探針點制在同一個檢測微 陣列上，能夠?qū)崿F(xiàn)對多個基因位點的同時檢測?？傊緦嵱眯滦蜕婕暗男酒瑫r用于TNF-a-308，IL-10-1082, IL-10-592,CTLA-4-49位點基因多態(tài)性檢測，確定人體免疫相關(guān)基因的基因型，提供人體免疫相關(guān)基因相關(guān)的遺傳信息咨詢，有望滿足疾病預(yù)防控制和臨床醫(yī)療領(lǐng)域的需要。

圖1 本實用新型所述同時檢測TNF、IL-10和CTLA-4基因多態(tài)性的玻璃基因芯片的探針排布圖。其中，所述檢測人類免疫相關(guān)(TNF，IL-10和CTLA-4基因)多態(tài)性芯片的探針排布如下表所示
權(quán)利要求1.一種同時檢測TNF、IL-IO和CTLA-4基因多態(tài)性的玻璃基因芯片，由玻璃基片和陣列式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探針與對照及空白的點涂層組成；其特征在于所述的玻璃基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片；所述點涂層的形狀為圓形，涂層區(qū)設(shè)1 2個， 每涂層區(qū)設(shè)有8條不同位點的基因特異性檢測探針、1條陽性對照探針和4條陰性對照探針、以及一個由點樣液做的空白，其中所述8條檢測探針中的每種探針與對照及空白分別以2X2方式在玻璃基片表面陣列排布4個平行的點涂層，每個點涂層的直徑為0. 15mm,同組探針或?qū)φ栈蚩瞻c涂層間距為0. 4mm，不同組探針或?qū)φ拯c涂層間距為0. 5mm。
2.如權(quán)利要求1所述同時檢測TNF、IL-10和CTLA-4基因多態(tài)性的玻璃基因芯片，其特征在于，所述的玻璃基片是長方形，面積是73mm 77mmX 25mm 27mm ；厚度為0. 6mm 2. Omm0
3.如權(quán)利要求1所述同時檢測TNF、IL-10和CTLA-4基因多態(tài)性的玻璃基因芯片，其特征在于，所述涂層區(qū)的面積為5. OmmX5. 0mm。
專利摘要本實用新型公開了一種同時檢測TNF、IL-10和CTLA-4基因多態(tài)性的玻璃基因芯片，由玻璃基片和陣列式分布于玻璃基片上的寡核苷酸探針與對照及空白的點涂層組成；其中所述的玻璃基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片；所述點涂層的形狀為圓形，涂層區(qū)設(shè)1～2個，每涂層區(qū)設(shè)有8條不同位點的基因特異性檢測探針、1條陽性對照探針和4條陰性對照探針、以及一個由點樣液做的空白。本實用新型的芯片可快速、高效對人類免疫相關(guān)基因TNF-α-308，IL-10-1082，IL-10-592，CTLA-4-49位點單核苷酸多態(tài)性進行同步檢測，了解機體先天性免疫機能，對判斷個體罹患自身免疫性疾病及惡性腫瘤的風險具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK202164307SQ2010205901
公開日2012年3月14日 申請日期2010年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月4日
發(fā)明者劉杰, 呂麗燕, 宋衛(wèi)國, 宋寶, 王興武, 胡德蓉 申請人:山東省腫瘤醫(yī)院