專利名稱：一種獲得去核卵母細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲得去核卵母細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
在進(jìn)行體細(xì)胞克隆時(shí)，獲得去核卵母細(xì)胞之前針對卵母細(xì)胞的常規(guī)處理是將卵巢抽得的卵丘卵母細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation, IVM)培養(yǎng)18_20hr (牛、羊等)、 40-44hr(豬)后脫除卵丘細(xì)胞。此時(shí)，絕大多數(shù)的卵母細(xì)胞已經(jīng)排出第一極體(the first polar body，PB1)，處于第二次減數(shù)分裂的中期(metaphase II，Mil)。然后挑選具有PBl 的卵母細(xì)胞作為受體胞質(zhì)。該常規(guī)的處理，容易使PBl偏離于卵的染色體(質(zhì))，在以PBl 為標(biāo)志的盲吸去核過程中，去核率降低。而使用熒光染料并輔以紫外線照射法，易造成對卵的傷害，影響胚胎質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種待去核的卵母細(xì)胞的獲得方法。本發(fā)明提供的待去核的卵母細(xì)胞的獲得方法包括如下步驟1)在離體的卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體體外成熟培養(yǎng)12-18小時(shí)時(shí)，去除卵丘細(xì)胞， 得到去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞；2)將步驟1)得到的去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞繼續(xù)體外成熟培養(yǎng)，得到帶有第一極體的待去核的卵母細(xì)胞。步驟2)中，所述繼續(xù)體外成熟培養(yǎng)的時(shí)間為4-8小時(shí)。本發(fā)明的發(fā)明點(diǎn)在于上述兩步法處理卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體，而具體的體外成熟培養(yǎng)所用的培養(yǎng)液可以是本領(lǐng)域公知的培養(yǎng)液。優(yōu)選的是，步驟1)和步驟幻中，所述體外成熟培養(yǎng)是在M199培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的成熟液中培養(yǎng)的胎牛血清、丙酮酸鈉、卵泡刺激素、促黃體激素、雌二醇、青霉素和鏈霉素；其中，添加的物質(zhì)在所述成熟液中的終濃度分別為胎牛血清10% (體積百分比)、 丙酮酸鈉0. 38mM/L、卵泡刺激素0. 01U/mL、促黃體激素0. 01U/mL和雌二醇1 μ g/mL、青霉素 50 μ g/mL 和鏈霉素 100 μ g/mL。上述體外成熟培養(yǎng)的條件是38. 5°C,5% CO2和飽和濕度條件。其中，M199培養(yǎng)液購自Geibco或HyClone公司。本發(fā)明的另一目的在于提供一種獲得去核卵母細(xì)胞的方法。本發(fā)明提供的獲得去核卵母細(xì)胞的方法包括如下步驟a)利用上述待去核的卵母細(xì)胞的獲得方法，得到所述帶有第一極體的待去核的卵母細(xì)胞；b)對所述帶有第一極體的待去核的卵母細(xì)胞進(jìn)行去核處理，得到去核卵母細(xì)胞。步驟b)中，所述去核處理的方法為盲吸法、點(diǎn)擊法或負(fù)壓-點(diǎn)壓法。上述去核處理的方法優(yōu)選為盲吸法。
上述的待去核的卵母細(xì)胞的獲得方法或上述獲得去核卵母細(xì)胞的方法在培育克隆動(dòng)物胚胎和轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物胚胎中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述的待去核的卵母細(xì)胞的獲得方法或上述的獲得去核卵母細(xì)胞的方法在培育克隆動(dòng)物與轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述動(dòng)物可以為牛、羊、豬或鼠。實(shí)驗(yàn)證明獲得去核卵母細(xì)胞步驟中，采用本發(fā)明提供的兩步法可獲得95%的去核率(表1)；最大程度的保持了卵母細(xì)胞胞質(zhì)的完整性。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例中所用的原料若無特別說明均能夠從商業(yè)途徑獲得。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、體細(xì)胞克隆一、體細(xì)胞培養(yǎng)與處理1、牛成年成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)取離體的來自呼市屠宰場的成年牛(中國赫斯坦牛)的耳尖組織。耳皮膚局部先用手術(shù)刀片刮毛，再用70% -75%的酒精消毒，用組織剪迅速剪取耳尖約Icm3大小的組織， 立即在70% -75%的酒精中浸泡60s，在含250U/mL青霉素和250 μ g/mL鏈霉素的滅菌PBS 中清洗2-3遍，放入相同溶液中，4°C帶回實(shí)驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，耳組織于60mm培養(yǎng)皿中用PBS漂洗2遍后，放入青霉素瓶內(nèi)，不加任何溶液，用眼科剪反復(fù)剪切組織塊至約Imm3 大小。用PBS和含20% FBS的DMEM(DMEM+20% FBS)各清洗3遍后，挑取組織塊，接種于 2-3個(gè)60mm培養(yǎng)皿中，每皿約接種20-30個(gè)組織塊，放入(X)2培養(yǎng)箱，在37°C，5 % CO2飽和濕度條件下，進(jìn)行干涸培養(yǎng)池！·，然后加入5mL含DMEM+20% FBS進(jìn)行原代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到90%匯合時(shí)，吸出培養(yǎng)液，用滅菌PBS清洗3遍，加入ImL 0. 25%胰蛋白酶+0. 02% EDTA的消化液，37°C消化2-aiiin，立即加入2mL DMEM+10% FBS終止消化。然后按照1 4 傳代。2、胎兒成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)采取活體手術(shù)法，自子宮中剝?nèi)∪焉?0至60天的胎兒，在4°C帶回實(shí)驗(yàn)室。將胎兒的頭、蹄及內(nèi)臟等器官去掉。按照步驟1的操作把胎兒剪碎，進(jìn)行培養(yǎng)。3、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇及培養(yǎng)在步驟1、2中的細(xì)胞長至超過80%匯合時(shí)，用4_5mL PBS清洗3次，用0. 25%胰蛋白酶，在37°C條件下，消化3min，吹打使之懸浮，然后收集細(xì)胞，1500rpm/min離心5min， 棄去上清液，重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)，在每個(gè)冷凍管中放入1 X IO6個(gè)/mL細(xì)胞，并加入DMEM培養(yǎng)液、 20% FBSUO% DMS0。先將凍存管放于4°C條件下平衡半小時(shí)，_20°C過夜，_80°C存放Mhr 后投入液氮冷凍。細(xì)胞的復(fù)蘇從液氮中取出凍存管，立即投入37°C水浴，待冰塊剛剛?cè)诨?，用酒精消毒凍存管外壁后，立即置于超凈臺(tái)中。將凍存管中細(xì)胞懸液移入IOmL離心管內(nèi)，用培養(yǎng)液清洗兩次凍存管，清洗液移至離心管中，室溫離心(1500rpm/min，5min)，棄上清。加入含 10% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞接種于60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37°C，5% CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至約70-80%匯合時(shí)，傳代或用于核移植。核移植所有細(xì)胞為3-12代。二、卵母細(xì)胞的處理與核移植操作1、卵母細(xì)胞的處理按如下兩種方法進(jìn)行1)常規(guī)方法卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)將離體的來自成年當(dāng)?shù)攸S牛的卵巢(取自呼市屠宰場)用 37°C的PBS液清洗三遍后，用直徑為0. 7mm的針頭抽取直徑為2_8mm的卵泡，回收形態(tài)均勻、結(jié)構(gòu)致密的卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體(COCs)，將其用成熟液(在M199培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的成熟液胎牛血清、丙酮酸鈉、卵泡刺激素，促黃體激素、雌二醇、青霉素和鏈霉素；其中，添加的物質(zhì)在所述成熟液中的終濃度分別為胎牛血清10% (體積百分比)、丙酮酸鈉0. 38mM/L、卵泡刺激素(bFSH)O. 01U/mL、促黃體激素(bLH)O. 01U/mL和雌二醇1 μ g/ mL、青霉素50 μ g/mL和鏈霉素100 μ g/mL，其中M199培養(yǎng)液購自Geibco或HyClone公司) 洗滌兩遍，然后將卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體按40-50枚/孔放入含成熟液的四孔板，置于 38. 5°C、5% CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)20h后，將成熟的卵母細(xì)胞放入含0. 1 %透明質(zhì)酸酶的管內(nèi)振蕩2-aiiin，使卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞完全脫離。然后，選擇形態(tài)完整，細(xì)胞質(zhì)均勻并排出第一極體的卵母細(xì)胞為胞質(zhì)受體，也即獲得了待去核的卵母細(xì)胞。2)本發(fā)明提供的兩步法a、第一步與常規(guī)方法基本相同。自離體的卵巢表面2_8mm的卵泡中抽取COCs。 將COCs在上述成熟液中洗3-4遍后，以40-50個(gè)COCs為一組放入含0. 5mL成熟液的4孔板中，在38. 5°C>5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)。在COCs體外成熟15_lMir時(shí)，用0. 透明質(zhì)酸酶液振蕩COCs 2-aiiin去除卵丘細(xì)胞。在實(shí)體鏡下去除形態(tài)異?；蛲嘶劳龅穆涯讣?xì)胞。其他的卵母細(xì)胞進(jìn)入下一步處理。b、第二步將第一步培養(yǎng)得到的無卵丘的卵母細(xì)胞，再放入預(yù)先在培養(yǎng)箱中平衡的成熟液中，每孔放50-60枚卵母細(xì)胞。繼續(xù)在在38. 5°C,5% C02和飽和濕度條件下培養(yǎng) Mir，此時(shí)獲得帶有第一極體的卵母細(xì)胞為待去核的卵母細(xì)胞。2、核移植操作將步驟1獲得的帶有第一極體的卵母細(xì)胞移入操作液(在M199的基礎(chǔ)上添加了 10% FBS和5. 0 μ g/mL細(xì)胞松馳素B)中，在200倍顯微鏡下用固定管吸住卵母細(xì)胞，調(diào)整卵的位置，使其第一極體位于時(shí)鐘的12點(diǎn)到1點(diǎn)的位置。再用內(nèi)徑為20 μ m的注射管自約 2點(diǎn)的位置處穿過透明帶，將第一極體及其下方的卵母細(xì)胞內(nèi)的染色體一并吸除。然后，選取步驟一中得到的形態(tài)良好、細(xì)胞質(zhì)均一、直徑約12 μ m的體細(xì)胞作為供核細(xì)胞，用注射管沿去核時(shí)留下的孔將細(xì)胞嵌到卵質(zhì)膜與透明帶之間，得到待融合的重構(gòu)卵。去核結(jié)果如表1所示，本發(fā)明提供的兩步法的去核率明顯高于常規(guī)方法。表1.卵母細(xì)胞一步法與兩步法培養(yǎng)的盲吸法去核效率
處理操作卵數(shù)去核卵數(shù)去核率(% )常規(guī)方法785874. 3°本發(fā)明提供的兩步法817795. Ib
a，b:P<0.01。3、細(xì)胞融合將步驟2獲得的待融合的重構(gòu)卵轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)液滴(CRlaa培養(yǎng)液) 中，放入培養(yǎng)箱中恢復(fù)約0』hr。然后，將重構(gòu)卵置于預(yù)熱的融合液(0.27M甘露醇 +0. ImMCaCl2 · 2H20+0. ImM MgS04 · 7H20+0. 05% BSA)中，室溫平衡 5min，然后轉(zhuǎn)入極間距為Imm并加有融合液的融合槽內(nèi)。調(diào)整重構(gòu)卵的方向，使卵母細(xì)胞和供體細(xì)胞的接觸面與兩極平行，施以2次120V/mm，25 μ s,間隔100毫秒的方波電脈沖(融合儀為BTX公司的 ECM-2001)，每組15個(gè)完成后放入胚胎培養(yǎng)液中，置培養(yǎng)箱中恢復(fù)30min后檢查融合情況。4、融合胚激活與胚胎培養(yǎng)將步驟3獲得的融合胚經(jīng)含5 μ M離子霉素(Sigma，10634)的培養(yǎng)液 (CRlaa+0. 4g/100ml BSA)處理 5min，然后在含 10yg/mL 放線菌酮(cycloheximide，CHX) (Sigma,C7698)的培養(yǎng)液(CRlaa+0. 4g/100ml BSA)中，在 38. 5°C、5% CO2 和飽和濕度條件下培養(yǎng)證！·，完成激活處理。把經(jīng)過激活的重構(gòu)胚，用培養(yǎng)液(CRlaa)洗三次，把胚胎放入由石蠟油覆蓋的 30 μ L培養(yǎng)滴(CRlaa+0. 4g/100ml BSA)中，38. 5°C，飽和濕度條件下培養(yǎng)48h ；再將胚胎轉(zhuǎn)移入鋪有單層卵丘細(xì)胞的培養(yǎng)液為CRlaa+4% (V/V)FCS液滴中培養(yǎng)到7天。其間，每48hr 換液一次。分別在培養(yǎng)后的第48hr統(tǒng)計(jì)卵裂率和168hr統(tǒng)計(jì)囊胚率(以激活后的胚胎進(jìn)入CRlaa+0. 4g/100mlBSA培養(yǎng)滴為0小時(shí))，結(jié)果如表2所示。表2、兩步法培養(yǎng)牛卵母細(xì)胞的克隆胚胎
權(quán)利要求
1.待去核的卵母細(xì)胞的獲得方法，包括如下步驟1)在離體的卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體體外成熟培養(yǎng)12-18小時(shí)時(shí)，去除卵丘細(xì)胞，得到去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞；2)將步驟1)得到的去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞繼續(xù)體外成熟培養(yǎng)，得到帶有第一極體的待去核的卵母細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟幻中，所述繼續(xù)體外成熟培養(yǎng)的時(shí)間為4-8小時(shí)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟1)和步驟2)中，所述體外成熟培養(yǎng)是在在M199培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的成熟液中培養(yǎng)的胎牛血清、丙酮酸鈉、卵泡刺激素，促黃體激素、雌二醇、青霉素和鏈霉素； 其中，添加的物質(zhì)在所述成熟液中的終濃度分別為胎牛血清10% (體積百分比)、丙酮酸鈉0. 38mM/L、卵泡刺激素0. 01U/mL、促黃體激素0. 01U/mL和雌二醇1 μ g/mL、青霉素 50 μ g/mL 和鏈霉素 100 μ g/mL。
4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述體外成熟培養(yǎng)的條件是 38. 5°C>5% CO2和飽和濕度條件。
5.一種獲得去核卵母細(xì)胞的方法，包括如下步驟a)利用權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，得到所述帶有第一極體的待去核的卵母細(xì)胞；b)對所述帶有第一極體的待去核的卵母細(xì)胞進(jìn)行去核處理，得到去核卵母細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟b)中，所述去核處理的方法為盲吸法、 點(diǎn)擊法或負(fù)壓-點(diǎn)壓法。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述去核處理的方法為盲吸法。
8.權(quán)利要求1-4中任一所述的待去核的卵母細(xì)胞的獲得方法或權(quán)利要求5-7中任一所述的獲得去核卵母細(xì)胞的方法在培育克隆動(dòng)物胚胎或轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物胚胎中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1-4中任一所述的待去核的卵母細(xì)胞的獲得方法或權(quán)利要求5-7中任一所述的獲得去核卵母細(xì)胞的方法在培育克隆動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于所述動(dòng)物為牛、羊、豬或鼠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲得去核卵母細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供了待去核的卵母細(xì)胞的獲得方法，其包括如下步驟1)在離體的卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體體外成熟培養(yǎng)12-18小時(shí)時(shí)，去除卵丘細(xì)胞，得到去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞；2)將步驟1)得到的去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞繼續(xù)體外成熟培養(yǎng)，得到帶有第一極體的待去核的卵母細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明獲得去核卵母細(xì)胞步驟中，采用本發(fā)明提供的兩步法可獲得95％的去核率；最大程度的保持了卵母細(xì)胞胞質(zhì)的完整性。
文檔編號(hào)C12N5/075GK102344908SQ20101024115
公開日2012年2月8日 申請日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者李光鵬 申請人:內(nèi)蒙古大學(xué)