專利名稱：一種鑒別羊肉和鴨肉的pcr-rflp方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及到羊肉和鴨肉的鑒別。
背景技術(shù)：
羊肉中含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白和大量的礦物質(zhì)元素等，具有很高的營養(yǎng)價值。寒冬 吃羊肉可益氣補(bǔ)虛，促進(jìn)血液循環(huán)，增強(qiáng)御寒能力。中醫(yī)認(rèn)為，羊肉還有補(bǔ)腎壯陽的作用，故 而羊肉深受人們的青睞。然而近年來，一些不法商販以鴨肉串當(dāng)做羊肉串進(jìn)行銷售來欺騙 消費者的事件屢有發(fā)生，這種以鴨肉替代羊肉進(jìn)行銷售的行為不僅給消費者帶來損失，也 給羊肉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展造成不良影響。為了確保廣大消費者的權(quán)益，為執(zhí)法人員提供技術(shù) 支撐，需要對羊肉和鴨肉進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別。對生鮮肉進(jìn)行感官鑒別時，根據(jù)一些物種肉在顏色、氣味、滋味、纖維粗細(xì)等方面 的特點差異，借助“看、聞、摸”手段，綜合三個要點得出的判斷，對肉類進(jìn)行感官鑒別。這在 實際應(yīng)用中存在如下問題對于經(jīng)過加工的肉制品，由于加入色素、食品添加劑、香料等物 質(zhì)，通過感官手段難以進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。例如制假者將鴨肉串刷上羊油，加上佐料等物質(zhì)，靠 傳統(tǒng)的感官方法難以檢驗。免疫學(xué)檢測是基于可溶性抗原與抗體的免疫反應(yīng)，應(yīng)用種間特異性抗原進(jìn)行設(shè)計 研究的方法。GiovannacciI等2005年對動物物種檢測的ELISA方法進(jìn)行了全面綜述，認(rèn)為 樣品經(jīng)過不同溫度的加熱處理會影響ELISA方法的檢測準(zhǔn)確性。特別是當(dāng)樣品經(jīng)過高溫處 理后，蛋白發(fā)生了變性，改變了特異抗原決定簇，因此很難鑒別和區(qū)分動物物種。目前用于 動物源性檢測的試劑盒靈敏度較低，不適于推廣使用。PCR-RFLP技術(shù)快速、簡便，在肉產(chǎn)品的種屬鑒別方面已有相關(guān)報道，但未見有羊肉 和鴨肉鑒別方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決目前羊肉和鴨肉鑒別方法準(zhǔn)確性低的缺陷，提供一種羊肉和 鴨肉鑒別的PCR-RFLP方法，為打擊鴨肉代替羊肉銷售的不法行為提供技術(shù)支撐?？蓪⒀蛉夂网喨獍匆韵路椒ㄟM(jìn)行鑒別一、將取50mg待檢樣品放入1. 5mL的EP 管(EP管應(yīng)高壓滅菌)中，用小剪刀將其剪碎。二、加入STE抽提液600 μ L、ProK(20mg/ mL) 20 μ L及20%的SDS溶液15 μ L，在震蕩器上充分混勻。三、將EP管置入水浴鍋，55°C消 化電泳圖。三個圖中的“陰，，為陰性對照樣品，M為分子量內(nèi)標(biāo)。
具體實施例方式本實施方式一一、將取50mg待檢樣品放入1. 5mL的EP管(EP管應(yīng)高壓滅菌)中， 用小剪刀將其剪碎。二、加入STE抽提液600 μ L、ProK(20mg/mL) 20 μ L及20%的SDS溶液 15 μ L，在震蕩器上充分混勻。三、將EP管置入水浴鍋，55°C消化過夜(12-16h)，在此期間可 取出顛倒混勻幾次，以便消化徹底。四、將EP管取出，每管加入600 μ L的Tris飽和酚，輕輕搖動混勻15min，然后在12000rpm離心lOmin。五、轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管，加入等體積 的酚氯仿異戊醇混合液(酚氯仿異戊醇體積比為25 24 1)，顛倒混勻lOmin，然后 12000rpm離心lOmin。六、轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管，加入等體積的氯仿異戊醇混合液(氯 仿異戊醇體積比為24 1)，輕輕混勻lOmin，然后在12000rpm離心lOmin。七、轉(zhuǎn)移上清 液至新的EP管，先加入lmL冰乙醇，再加入60 ii L的NaAc (3M)，輕輕水平搖動，可見絮狀、 白色DNA出現(xiàn)。將EP管放入-20°C冰箱冷凍30min，然后在12000rpm離心lOmin，可見DNA 沉于管底。棄無水乙醇，再用75%的乙醇洗滌DNA兩次，然后在12000rpm離心lOmin ；自然 干燥后，加入50PL TE溶液溶解。八、PCR擴(kuò)增及檢測引物用可擴(kuò)增所有脊椎動物Cytb 序列的通用上游引物F :5，-TAC CAT GAG GAC AAA TAT CAT TCT G_3，和通用下游引物R : 5，-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3，。PCR 反應(yīng)總體積為 25 ii L，其中 10 XPCR Buffer 2. 5u L, Taq DNA 聚合酶 0. 2 u L (2. 5U/ u L)，dNTPs (2. 5mmol/L) 2 u L, lOpmol/ u L 的上、下游引物各2 yL，模板DNA 250ng，滅菌蒸餾水補(bǔ)足總體積。擴(kuò)增條件為95°C變性 10min，95°C變性45s，53°C退火60s，72°C延伸60s，35個循環(huán)后在72°C繼續(xù)延伸7min。取 4ii L的PCR產(chǎn)物與1 ii L的6Xl0adding buffer混合，采用TAE緩沖系統(tǒng)，2%瓊脂糖凝膠 (加入染色劑Gold view I)在5v/cm恒壓電泳條件下約25min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并 記錄。九、Bsu36I酶切分析對步驟八中的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Bsu36I進(jìn)行PCR-RFLP 分析；Bsu36I只能將鴨的PCR產(chǎn)物切割為95bp和377bp的片段，而不能切割山羊和綿羊 的PCR產(chǎn)物，根據(jù)瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果是否可檢測到95bp和377bp的條帶來判斷是否為鴨 肉。酶切體系為201^，其中0嫩(卩0 產(chǎn)物)11^，10\陬8 buffer 2 u L, 100XBSA0. 2 u L, Bsu36I限制性內(nèi)切酶(10000U/mL)0. 5uL,滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積?；靹虿㈦x心后在37°C 消化16h，然后在65°C處理20min滅活內(nèi)切酶活性，取7iiLPCR產(chǎn)物與1 y L 6Xloadding buffer混合，采用TAE緩沖系統(tǒng)，2%瓊脂糖凝膠(加入Gold view I染色劑)在5v/cm恒 壓電泳條件下約25min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄。十、Spel酶切分析對步驟八中的 PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Spel進(jìn)行PCR-RFLP分析；Spel可將綿羊和山羊的PCR產(chǎn)物切割 為326過夜(12-16h)，在此期間可取出顛倒混勻幾次，以便消化徹底。四、將EP管取出，每 管加入600 ii L的Tris飽和酚，輕輕搖動混勻15min，然后在12000rpm離心lOmin。五、轉(zhuǎn) 移上清液至新的EP管，加入等體積的酚氯仿異戊醇混合液(酚氯仿異戊醇體積比為 25 24 1)，顛倒混勻lOmin，然后12000rpm離心lOmin。六、轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管， 加入等體積的氯仿異戊醇混合液(氯仿異戊醇體積比為24 1)，輕輕混勻lOmin，然后 在12000rpm離心lOmin。七、轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管，先加入lmL冰乙醇，再加入60 y L的 NaAc (3M)，輕輕水平搖動，可見絮狀、白色DNA出現(xiàn)。將EP管放入_20°C冰箱冷凍30min，然 后在12000rpm離心lOmin，可見DNA沉于管底。棄無水乙醇，再用75%的乙醇洗滌DNA兩 次，然后在12000rpm離心lOmin ；自然干燥后，加入50iiL TE溶液溶解。八、PCR擴(kuò)增及檢 測引物用可擴(kuò)增所有脊椎動物Cyt b序列的通用上游引物F:5’ -TAC CAT GAG GAC AAA TAT CATTCT G_3，和通用下游引物 R :5，-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3，。PCR 反應(yīng)總體積為 25 ii L，其中 10 XPCR Buffer 2. 5 u L, Taq DNA 聚合酶 0. 2 ii L (2. 5U/ii L)， dNTPs (2. 5mmol/L) 2 u L, lOpmol/ u L 的上、下游引物各 2 u L,模板 DNA 250ng,滅菌蒸餾水 補(bǔ)足總體積。擴(kuò)增條件為95°C變性10min，95°C變性45s，53°C退火60s，72°C延伸60s，35 個循環(huán)后在72°C繼續(xù)延伸7min。取4 y L的PCR產(chǎn)物與1 y L的6X loadding buffer混合，采用TAE緩沖系統(tǒng)，2%瓊脂糖凝膠(加入染色劑Gold view I)在5v/cm恒壓電泳條件下約 25min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄。九、Bsu36I酶切分析對步驟八中的PCR產(chǎn)物用限 制性內(nèi)切酶Bsu36I進(jìn)行PCR-RFLP分析；Bsu36I只能將鴨的PCR產(chǎn)物切割為95bp和377bp 的片段，而不能切割山羊和綿羊的PCR產(chǎn)物，根據(jù)瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果是否可檢測到95bp 和377bp的條帶來判斷是否為鴨肉。十、Spel酶切分析對步驟八中的PCR產(chǎn)物用限制性 內(nèi)切酶Spel進(jìn)行PCR-RFLP分析；Spel可將綿羊和山羊的PCR產(chǎn)物切割為326bp和146bp， 但不能切割鴨的PCR產(chǎn)物，根據(jù)瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果是否可檢測到326bp和146bp的條帶 來判斷是否為羊肉。本發(fā)明在鑒別過程中采用PCR-RFLP方法，具有簡便、快捷、廉價和準(zhǔn)確性高的特
點o


圖1是具體實施方式
一中步驟八得到的綿羊(S)、山羊(G)和鴨(D)PCR產(chǎn)物檢測 的凝膠電泳圖；圖2是具體實施方式
一中步驟九用Bsu361限制內(nèi)切酶酶切對具體實施方式
一中步驟八得到的綿羊(S)、山羊(G)和鴨⑶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR-RFLP分析后檢測的凝膠 電泳圖；圖3是具體實施方式
一中步驟十用Spel限制性內(nèi)切酶酶切對具體實施方式
一中步 驟八得到的綿羊(S)、山羊(G)和鴨(D)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR-RFLP分析后檢測的凝膠bp和 146bp，但不能切割鴨的PCR產(chǎn)物，根據(jù)瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果是否可檢測到326bp和146bp 的條帶來判斷是否為羊肉。酶切體系為20 iiL，其中0嫩( 0 產(chǎn)物)11^，10\服813吐作『 2uL, 100XBSA 0. 2ii L，SpeI限制性內(nèi)切酶(10000U/mL) 0. 5 y L，滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積?；?勻并離心后在37°C消化16h，然后在65°C處理20min滅活內(nèi)切酶活性，取7 y L PCR產(chǎn)物與 luL 6Xloadding buffer混合，采用TAE緩沖系統(tǒng)，2%瓊脂糖凝膠(加入Gold view I染 色劑)在5v/cm恒壓電泳條件下約25min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄。附鑒別綿羊、山羊和鴨肉所用限制性內(nèi)切酶的酶切位點限制性內(nèi)切酶Bsu36I(CC丨TNAGG)限制性內(nèi)切酶Spel (A丨CTAGT)附溶液配制表STE 抽提液10mL Tris-HCl (1M ;pH 8. 0), 2mL EDTA(0. 5M ；pH 8. 0)，lOOmL NaAc (1M)，888mL 水，高壓滅菌。20% SDS :200g SDS溶于900mL水中，用鹽酸調(diào)pH值至7. 2，加水定容至1000mL。1M Tris-HCl :121.4g Tris溶于800mL雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至8. 0，定容至 lOOOmL，高壓滅菌。TE 緩沖液(pH 8. 0) :lmL Tris-HCl (1M ；pH 8. 0) ,0. lmL EDTA (0. 5M ；pH 8. 0)，加 雙蒸水定容至50mL，高壓滅菌。20mg/mL ProK :100mg蛋白酶K溶于5mL滅菌雙蒸水，_20°C分裝保存。TE 緩沖液(pH 8. 0) :lmL Tris-HCl (1M ；pH 8. 0) ,0. lmL EDTA (0. 5M ；pH 8. 0)，加 雙蒸水定容至50mL，高壓滅菌。
權(quán)利要求
一種鑒別羊肉和鴨肉的PCR-RFLP方法，其特征在于可將羊肉和鴨肉按以下方法加以鑒別一、將取50mg待檢樣品放入1.5mL的EP管(EP管應(yīng)高壓滅菌)中，用小剪刀將其剪碎。二、加入STE抽提液600μL、ProK(20mg/mL)20μL及20％的SDS溶液15μL，在震蕩器上充分混勻。三、將EP管置入水浴鍋，55℃消化過夜(12-16h)，在此期間可取出顛倒混勻幾次，以便消化徹底。四、將EP管取出，每管加入600μL的Tris飽和酚，輕輕搖動混勻15min，然后在12000rpm離心10min。五、轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管，加入等體積的酚氯仿異戊醇混合液(酚∶氯仿∶異戊醇體積比為25∶24∶1)，顛倒混勻10min，然后12000rpm離心10min。六、轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管，加入等體積的氯仿異戊醇混合液(氯仿∶異戊醇體積比為24∶1)，輕輕混勻10min，然后在12000rpm離心10min。七、轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管，先加入1mL冰乙醇，再加入60μL的NaAc(3M)，輕輕水平搖動，可見絮狀、白色DNA出現(xiàn)。將EP管放入-20℃冰箱冷凍30min，然后在12000rpm離心10min，可見DNA沉于管底。棄無水乙醇，再用75％的乙醇洗滌DNA兩次，然后在12000rpm離心10min；自然干燥后，加入50μL TE溶液溶解。八、PCR擴(kuò)增及檢測引物用可擴(kuò)增所有脊椎動物Cyt b序列的通用上游引物F5’-TAC CAT GAG GAC AAA TAT CAT TCT G-3’和通用下游引物R5’-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3’。PCR反應(yīng)總體積為25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL(2.5U/μL)，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，10pmol/μL的上、下游引物各2μL，模板DNA 250ng，滅菌蒸餾水補(bǔ)足總體積。擴(kuò)增條件為95℃變性10min，95℃變性45s，53℃退火60s，72℃延伸60s，35個循環(huán)后在72℃繼續(xù)延伸7min。取4μL的PCR產(chǎn)物與1μL的6×loadding buffer混合，采用TAE緩沖系統(tǒng)，2％瓊脂糖凝膠(加入染色劑Gold view I)在5v/cm恒壓電泳條件下約25min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄。九、Bsu36I酶切分析對步驟八中的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Bsu36I進(jìn)行PCR-RFLP分析；Bsu36I只能將鴨的PCR產(chǎn)物切割為95bp和377bp的片段，而不能切割山羊和綿羊的PCR產(chǎn)物，根據(jù)瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果是否可檢測到95bp和377bp的條帶來判斷是否為鴨肉。十、SpeI酶切分析對步驟八中的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶SpeI進(jìn)行PCR-RFLP分析；SpeI可將綿羊和山羊的PCR產(chǎn)物切割為326bp和146bp，但不能切割鴨的PCR產(chǎn)物，根據(jù)瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果是否可檢測到326bp和146bp的條帶來判斷是否為羊肉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別羊肉和鴨肉的PCR-RFLP方法，其特征在于步驟二用 STE抽提液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別羊肉和鴨肉的PCR-RFLP方法，其特征在于步驟八中 擴(kuò)增引物為用通用上游引物F :5’ -TAC CAT GAG GAC AAA TAT CAT TCT G_3，和通用下游 引物 R:5，-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3，。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別羊肉和鴨肉的PCR-RFLP方法，其特征在于步驟九用 限制性內(nèi)切酶Bsu36I進(jìn)行PCR-RFLP分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒別羊肉和鴨肉的PCR-RFLP方法，其特征在于步驟十用 限制內(nèi)切酶SpesI進(jìn)行PCR-RFLP分析。
全文摘要
羊肉和鴨肉鑒別的PCR-RFLP方法屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域。它設(shè)計了一種羊肉制品肉種來源鑒別的方法，解決了目前羊肉和鴨肉鑒別方法準(zhǔn)確性低的缺陷，提供了鑒別羊肉和鴨肉的PCR-RFLP檢測技術(shù)?？蓪⒀蛉夂网喨獍匆韵路椒右澡b別提取樣品DNA，采用通用引物擴(kuò)增和凝膠電泳檢測，然后分別用Bsu36I和SpeI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行PCR-RFLP分析，即可區(qū)分羊肉和鴨肉。本發(fā)明采用PCR-RFLP方法，具有簡單、快捷、廉價和準(zhǔn)確性高的特點。
文檔編號C12Q1/68GK101875975SQ20101022668
公開日2010年11月3日 申請日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日 公開號201010226683.發(fā)明者何建文, 馮海永, 安添午, 張 浩, 王繼卿, 羅玉柱, 趙會靜, 韓建林 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所;甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)