專利名稱：一種肝癌肝移植術(shù)后復發(fā)預測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝癌肝移植術(shù)后復發(fā)預測試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細胞肝癌(以下簡稱肝癌)是全球最常見的惡性腫瘤之一，由于我國乙 型肝炎病毒Ofepatitis B Virus, HBV)感染率較高，因此肝癌的發(fā)病率居高不下。肝移植 能徹底切除腫瘤并修復肝功能，已成為肝癌的根治性治療手段之一。但移植術(shù)后腫瘤的復 發(fā)轉(zhuǎn)移仍是影響肝移植療效的最主要因素。對移植術(shù)后腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的準確預測將有助于 積極的個體化防治措施的開展。同時由于供肝的短缺，預后的準確預測對于合理分配有限 的供肝具有重要現(xiàn)實意義。影響肝癌肝移植預后因素的研究，目前主要集中于腫瘤大小、數(shù)目、腫瘤分化、血 管侵犯、甲胎蛋白(AFP)水平等方面，但上述臨床病理指標仍難以準確預測肝癌肝移植術(shù) 后的復發(fā)轉(zhuǎn)移。最近，少量相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)了可用于肝癌肝移植術(shù)后復發(fā)預測的分子標記。 但這些研究多采用腫瘤組織作為研究材料，而組織學腫瘤標志物存在標本采集、無法連續(xù) 檢測和隨訪追蹤等諸多限制，不利于實際臨床應(yīng)用。本發(fā)明前期研究發(fā)現(xiàn)在肝癌病人的血 漿循環(huán)DNA可檢測到與復發(fā)密切相關(guān)的雜合性缺失(loss of heterOZygOSity，L0H)?；?芯片的高通量SNP(單核苷酸多態(tài)性)分析使全基因組范圍的遺傳分析成為可能。本發(fā)明 在我院前期研究的基礎(chǔ)上，利用高通量SNP芯片、時間飛行質(zhì)譜的方法，尋找血漿循環(huán)DNA 分子遺傳學變異(主要是SNP)在肝癌肝移植患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復發(fā)預測中的價值，并制成檢測 試劑盒，為現(xiàn)有肝癌肝移植適應(yīng)證的進一步完善提供簡便、有效的檢測指標。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種能夠方便運用于臨床、快速有效地在術(shù)前預測肝癌肝移 植患者術(shù)后復發(fā)潛能的試劑盒。為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種肝癌肝移植術(shù)后復發(fā)預測試劑盒，其特征 在于，用PCR擴增和熒光探針檢測rs894151和rsl2438080兩個SNP位點的基因型，用這兩 個位點的基因型結(jié)合腫瘤大小、數(shù)目來預測肝癌肝移植術(shù)后復發(fā)的風險，包括PCR擴增引 物以及用于基因分型的熒光檢測探針；其中，PGR擴增引物為rs894151 位點上游序列5，AGAAACACTGAGTCTGCAGG3，；下游序列5，GCCTCTTTCCTTCATCTGTC3’ ；rs 12438080 位點上游序列5，GATGACTCATAGCTTCCCTG3，；下游序列5，CTTGCCGAGAGTTTAACAGG3，；用于基因分型的熒光檢測探針為
rs894151-TA :AACTGTGAATAATAAATGCCACGCA ；rs894151-TG TTTAACTGTGAATAATAAATGCCACGCG ；rs894151-TR -P-CAAAGCTCTTCACTGTGTTAAGTAA-FAM-；rsl2438080-TA TTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAA ；rsl2438080-TC :TTTTTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAC ；rsl2438080-TR -P-CAGTAAGTATGGTAAAAATAAAAATAAT-FAM-。本發(fā)明的原理如下如圖1所示，為獲得rs894151和rsl2438080兩個SNP位點的 分析流程圖。通過SNP芯片在30例FFPE腫瘤組織中篩查復發(fā)相關(guān)位點，然后用飛行質(zhì)譜 法在這些芯片病例的循環(huán)DNA中對篩選出的復發(fā)相關(guān)位點進行SNP分型，找出同時在血漿 循環(huán)DNA中出現(xiàn)的復發(fā)位點。在另兩組獨立的病例血漿循環(huán)DNA中進行驗證。首先本發(fā)明使用Affimetrix公司的最新的SNP6. 0芯片篩查肝癌肝移植患者腫 瘤組織(復發(fā)組及未復發(fā)組各15例)間的遺傳學差異，發(fā)現(xiàn)了 1272個差異SNP位點(P < 0. 001)。其中30個差異最顯著的SNP位點P值小于0. 001。聚類分析發(fā)現(xiàn)30個差異最 顯著的SNP位點能清楚地將患者分為兩群，兩群的無復發(fā)生存率及總體生存率均有顯著差 異。如圖2和圖3所示，用30個P值最小的差異位點可清楚地將所有的患者分為兩群(高 危復發(fā)組及低危復發(fā)組)。生存分析發(fā)現(xiàn)兩群的總體生存時間(圖2)及無復發(fā)生存時間 (圖3)存在顯著差異(P<0. 001)。在以上病人的術(shù)前循環(huán)DNA中用飛行質(zhì)譜法檢測這30 個SNP位點，共成功檢測到28個位點，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織DNA和循環(huán)DNA中的符合率大于98 %。 本發(fā)明在另外102例獨立病例(測試集)的循環(huán)DNA中進一步驗證這28個SNP位點與復 發(fā)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)rs894151和rsl2438080兩個位點與復發(fā)顯著相關(guān)。其中rs894151位點的 G等位基因和rsl2438080的C等位基因與復發(fā)呈正相關(guān)。本發(fā)明將等位基因G和C定義 為危險等位基因。兩個SNP位點共四個基因座。rs894151位點可能的基因型為AA、AG和 GG, rsl2438080位點可能的基因型為AA、AC和CC。本發(fā)明將兩個位點均為AA基因型的患 者定義為復發(fā)低危組；其余患者(即兩個位點任一基因座出現(xiàn)危險等位基因的患者)分為 復發(fā)高危組。生存分析發(fā)現(xiàn)這兩個位點的聯(lián)合指標是肝癌肝移植術(shù)后復發(fā)的獨立預后指標 (P = 0. 030)，如表1所示表1 多因素分析臨床病理因素與OS和RFS的關(guān)系(102例測試集病例) 該結(jié)果得到第三組獨立病例(47例驗證集)的驗證。如表2所示表2 多因素分析臨床病理因素與RFS的關(guān)系(驗證組47例病例) 符合米蘭標準的患者均為早期肝癌，而我國大多數(shù)患者就診時已進入晚期從而失 去移植機會。本發(fā)明在超過米蘭標準的患者中檢測血漿循環(huán)DNA SNP聯(lián)合指標，發(fā)現(xiàn)超出 米蘭標準的患者若rs894151和rsl2438080位點基因型均為AA其術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移的概率僅 為30% (6/20)。圖4為米蘭標準分層后SNP聯(lián)合指標的預測結(jié)果圖，兩個SNP位點的聯(lián)合 指標在超出米蘭標準病例中的預測價值。本發(fā)明進一步用循環(huán)DNA中兩個SNP(rs894151和rsl2438080)的聯(lián)合指標以及 米蘭標準中采用的腫瘤大小、個數(shù)共三個因子建立肝癌肝移植的預后模型。微血管侵犯雖 然也是復發(fā)的獨立預后因素，但該指標在術(shù)前無法獲得，因此不納入預后模型中。將SNP聯(lián) 合指標、腫瘤大小和腫瘤個數(shù)分別置入COX風險比例模型中，計算每個因子與復發(fā)關(guān)聯(lián)，每 個因子產(chǎn)生一個系數(shù)?；颊叩膹桶l(fā)風險為三個指標分別與其系數(shù)相乘后的累加。即患者 復發(fā)風險=2. 008XSNP聯(lián)合指標+1.381 X腫瘤大小+0.859X腫瘤數(shù)目。當患者兩個位 點基因型均為AA時“SNP聯(lián)合指標” =0 ；否則“SNP聯(lián)合指標” =1 ；當患者腫瘤直徑彡5cm 時“腫瘤大小” =0 ；大于5cm時“腫瘤大小” =1 ；，當患者腫瘤僅一枚時“腫瘤數(shù)目” =0 ； 多枚時“腫瘤數(shù)目” =1。用模型計算每個患者的復發(fā)風險并用不含SNP指標的模型作為 參照，ROC曲線分析兩種模型復發(fā)風險的預后價值發(fā)現(xiàn)，用含有SNP指標的模型AUC面積為 0. 810，而用傳統(tǒng)的腫瘤大小、數(shù)目的模型AUC面積僅為0. 705，如圖5所示，為復發(fā)風險的 ROC曲線分析圖，兩者具有顯著差異(P<0.001)。含有SNP指標的模型可達到較高預測效 能。為簡化模型，本發(fā)明進一步用復發(fā)風險值的中位數(shù)2. 240作為復發(fā)的預測閾值 將所有患者分為兩群復發(fā)風險> 2. 240為高危組，該組患者兩年內(nèi)復發(fā)的概率為70. 4% (50/71)；復發(fā)風險< 2. 240為低危組，該組患者兩年內(nèi)復發(fā)的概率為17. 9% (14/78)。同 樣用ROC曲線分析其預測效能。如圖6所示，為用復發(fā)風險中位數(shù)分組后的ROC曲線分析 圖，用復發(fā)風險的中位數(shù)2. 240作為復發(fā)的預測閾值進行ROC分析。其預測復發(fā)的AUC面 積為0. 767，敏感度為78. 1%，特異度為75. 3%。本發(fā)明的優(yōu)點是
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1、能夠方便運用于臨床、快速有效地在術(shù)前預測肝癌肝移植患者術(shù)后復發(fā)潛能。2、檢測外周血分子指標為非侵入性檢查，創(chuàng)傷小，患者更易接受。3、遺傳學變異反映了腫瘤的生物學行為，結(jié)合腫瘤大小、數(shù)目等臨床病理指標能 更好的預測腫瘤術(shù)后復發(fā)，而目前國際上所有的肝癌肝移植標準均未含術(shù)前肝癌生物學特 性指標。4、血漿循環(huán)DNA可在術(shù)前獲取樣本，術(shù)前即能完成患者復發(fā)潛能評估，有利于移 植病人的選擇、供肝的合理分配。5、外周血獲取方便，可在術(shù)前術(shù)后對患者進行連續(xù)動態(tài)監(jiān)測。有利于高復發(fā)風險 的移植患者選擇合理有效的干預治療，延長總體生存時間。6、腫瘤具有異質(zhì)性，同一個腫瘤不同的取材點可能得到不同亞群的腫瘤細胞。循 環(huán)DNA可以起源于腫瘤內(nèi)部任何一個亞克隆的群體，因此能比組織學取材的腫瘤更全面地 反映腫瘤細胞的遺傳學改變。


圖1為獲得rs894151和rsl2438080兩個SNP位點的分析流程圖；圖2為總體生存曲線圖；圖3為無復發(fā)生存曲線圖；圖4為米蘭標準分層后SNP聯(lián)合指標的預測結(jié)果圖；圖5為復發(fā)風險的ROC曲線分析圖；圖6為用復發(fā)風險中位數(shù)分組后的ROC曲線分析圖。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例一種肝癌肝移植術(shù)后復發(fā)預測試劑盒，以血漿循環(huán)DNA中兩個SNP rs894151和 rsl2438080為檢測位點，包括PCR擴增引物以及用于基因分型的熒光檢測探針；其中，PCR擴增引物為rs894151 位點上游序列5，AGAAACACTGAGTCTGCAGG3，；下游序列5，GCCTCTTTCCTTCATCTGTC3，；rs 12438080 位點上游序列5，GATGACTCATAGCTTCCCTG3，；下游序列5，CTTGCCGAGAGTTTAACAGG3，；用于基因分型的熒光檢測探針為rs894151-TA :AACTGTGAATAATAAATGCCACGCA ；rs894151-TG TTTAACTGTGAATAATAAATGCCACGCG ；rs894151-TR -P-CAAAGCTCTTCACTGTGTTAAGTAA-FAM-；rsl2438080-TA TTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAA ；rsl2438080-TC :TTTTTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAC ；
rsl2438080-TR -P-CAGTAAGTATGGTAAAAATAAAAATAAT-FAM-。使用試劑盒進行肝癌肝移植術(shù)后復發(fā)預測的具體步驟如下1、血漿獲取肝癌患者肝移植術(shù)前，清晨空腹取靜脈血5ml置于EDTA抗凝管中，以 820g離心10分鐘后將上清血漿部分吸至潔凈離心管，再用16000g離心10分鐘完全去除血 細胞成分后置于干燥潔凈凍存管中。2、循環(huán)DNA抽提血漿循環(huán)DNA的抽提采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen公司，德國，cat 51106)試劑盒的操作步驟進行。具體操作步驟如下(1)將試劑盒中所有試劑和buffers升溫至室溫。(2)將水浴箱調(diào)至56°C。(3)如果Buffer AL或Buffer ATL含有沉淀，將其置于70°C水域中。(4)加 20μ 1 蛋白酶 K 至 1. 5mlEP 管底。(5)加入200 μ 1血漿至EP管內(nèi)混勻。(6)加入200 μ IAL至EP管內(nèi)，渦旋混勻15秒。(7)置入水域箱中56°C孵化10分鐘。(8)短暫離心，去除管蓋內(nèi)和管壁內(nèi)側(cè)的液珠。(9)打開管蓋，加入200 μ 1無水乙醇，渦旋混勻。(10)將EP管置于90°C水浴箱中放置1小時。(11)短暫離心，去除管蓋內(nèi)和管壁內(nèi)側(cè)的液珠。(12)將所有液體轉(zhuǎn)移至QIAamp MinElute column, 6000g離心1分鐘，棄收集管。 將QIAamp MinElute column置入另一潔凈收集管中。(13)在 QIAamp MinElute column 中加入 500 μ 1 AWl，6000g 離心 1 分鐘，棄收集 管。將QIAamp MinElute column置入另一潔凈收集管中。(14)在 QIAamp MinElute column 中加入 500 μ lAW2,6000g 離心 1 分鐘，棄收集 管。將QIAamp MinElute column置入另一潔凈收集管中。(15)將QIAamp MinElute column空柱最高轉(zhuǎn)速離心3分鐘。(16)將 QIAamp MinElute column 置入一潔凈 1. 5mlEP 管中。加入 100 μ 1 Buffer AE至膜中央。室溫孵育1分鐘。(17)將QIAamp MinElute column全速離心1分鐘收集EP管中的DNA溶解。(18)抽提好的DNA用Nanodrop測濃度后凝膠電泳進行質(zhì)量鑒定。3、rs894151 和 rsl2438080 位點基因分型SNP分型服務(wù)采用連接酶特異檢測技術(shù)，對需檢測SNP位點設(shè)計特異性探針，在 連接酶的作用下，當特異性的寡核苷酸探針與互補靶序列DNA完全配對時連接反應(yīng)順利進 行，若寡核苷酸探針與其不完全配對，則連接反應(yīng)不能進行。最后通過測序儀檢測，得到分 型結(jié)果。步驟如下(1)、PCR 擴增:PCR 儀為 ABI 9600 ；擴增體系上一步抽提的DNA Iul (調(diào)整濃度至20ng/ul)，10 * buffer (Tris-Cl 10mmol/L, PH 8· 3 8· 8) 1. 5ul, MgCl2 溶液(1. 5mmol/L) 1. 5ul,四種 dNTP (總量為1 OmM) 0. 3u 1，本發(fā)明試劑盒中的四種PCR擴增引物，每種1 Opmo 1 /u 1，0. 25u 1，Taq酶(5u/ul) 0. 25ul，加H2O補至15ul。其中，引物由上海生工合成，taq酶(貨號201223)， dNTP都由凱捷公司提供。擴增條件 (2)、連接反應(yīng)反應(yīng)體系PCR擴增產(chǎn)物 3ul、10*Taq DNA ligase buffer (20mM Tris-HCl (pH7. 6) Iul、Taq DNAligase (40U/ul) 0. 125ul、本發(fā)明試劑盒中的 6 種探針，每種 10pmol/ul，0. OlulJnH2O補至10ul。探針由上海捷瑞合成，Taq DNAligase由NEB公司提 供(貨號測0208S)。 連接條件 (3)、在ABI 377型測序儀上進行電泳檢測取Iul連接產(chǎn)物，加2ul上樣，95C變 性3min，立即冰水浴。4、肝癌肝移植患者的復發(fā)風險預測值計算采用如下公式患者復發(fā)風險= 2. 008XSNP聯(lián)合指標+1.381 X腫瘤大小+0.859X腫瘤數(shù)目。當患者兩個位點基因型均 為AA時"SNP聯(lián)合指標” =O ；否則"SNP聯(lián)合指標” =1 ；當患者腫瘤直徑彡5cm時“腫瘤 大小” =O ；大于5cm時“腫瘤大小” =1 ；，當患者腫瘤僅一枚時“腫瘤數(shù)目” =O ；多枚時 “腫瘤數(shù)目” =1。腫瘤大小及數(shù)目資料來源于患者術(shù)前CT或MRI或彩超，由兩種及兩種以 上影像學確認。風險大于2. 240為高復發(fā)風險，不適宜行肝移植術(shù)，小于等于2. 240則為低 復發(fā)風險，適合行肝移植術(shù)。
權(quán)利要求
一種肝癌肝移植術(shù)后復發(fā)預測試劑盒，其特征在于，以血漿循環(huán)DNA兩個SNP rs894151和rs12438080為檢測位點，包括PCR擴增引物以及用于基因分型的熒光檢測探針；其中，PCR擴增引物為rs894151位點上游序列5’AGAAACACTGAGTCTGCAGG3’；下游序列5’GCCTCTTTCCTTCATCTGTC3’；rs12438080位點上游序列5’GATGACTCATAGCTTCCCTG3’；下游序列5’CTTGCCGAGAGTTTAACAGG3’；用于基因分型的熒光檢測探針為rs894151-TAAACTGTGAATAATAAATGCCACGCA；rs894151-TGTTTAACTGTGAATAATAAATGCCACGCG；rs894151-TR-P-CAAAGCTCTTCACTGTGTTAAGTAA-FAM-；rs12438080-TATTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAA；rs12438080-TCTTTTTTTGCTCTCATCAAAGCAGTTATCACAC；rs12438080-TR-P-CAGTAAGTATGGTAAAAATAAAAATAAT-FAM-。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種肝癌肝移植術(shù)后復發(fā)預測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒以血漿循環(huán)DNA中兩個SNP rs894151和rs12438080為檢測位點，以rs894151和rs12438080上游序列和下游序列作為擴增引物，用熒光探針作為基因分型探針。本發(fā)明可在術(shù)前評估肝癌患者行肝移植術(shù)后的復發(fā)風險。并且本發(fā)明以外周血為檢測樣本具有快捷、準確、簡單、易于推廣應(yīng)用等特點?？捎糜谂R床肝癌肝移植患者的篩選，指導肝癌肝移植術(shù)后的輔助治療，降低高危患者術(shù)后復發(fā)率，從而改善肝癌肝移植的預后，有效利用有限的供肝。該試劑盒對于超出米蘭標準患者預后的判斷具有重要的臨床意義。
文檔編號C12Q1/68GK101880715SQ20101020493
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者代智, 周儉, 樊嘉, 王征, 肖永勝, 胡捷 申請人:復旦大學附屬中山醫(yī)院