專利名稱：一對大白菜蕪菁花葉病毒病est-ssr標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一對EST-SSR標(biāo)記，尤其是與大白菜蕪菁花葉病毒(TuMV)抗病和感病 基因緊密連鎖的EST-SSR標(biāo)記，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大白菜(Brassica rapa L. ssp. pekinensis)原產(chǎn)于我國，是我國乃至日本、朝鮮、 韓國等國家的重要蔬菜。病毒病是我國大白菜的三大病害之一，平均每年造成5%的產(chǎn)量 損失，有些年份減產(chǎn)10%以上，病害嚴(yán)重的地塊幾乎絕收。該病防治困難，目前，還沒有可 以普遍適用的抗病毒病藥劑或其它行之有效的控制技術(shù)，培育抗病品種仍然是一條最有效 且可持續(xù)的防治措施。但常規(guī)育種程序繁瑣，在抗性選擇時，表型觀測困難，選育時間較長， 另一方面抗性遺傳易受環(huán)境條件的影響，選擇準(zhǔn)確度不高，難以適應(yīng)生產(chǎn)的需要。采用分子 標(biāo)記輔助育種可大大加快育種進(jìn)程。研究表明，我國大白菜病毒病主要是由三種病毒單獨(dú) 或復(fù)合浸染所致，即蕪菁花葉病毒病(Turnip mosaic virus，簡稱TuMV)、黃瓜花葉病毒病 (Cucumber mosaic virus，簡稱 CMV)和煙草花葉病毒病(Tobacco mosaicvirus，簡稱TMV)。 其中，TuMV是主要病原，占病毒分離物的71.9%。因此，篩選與大白菜TuMV抗性有關(guān)的分 子標(biāo)記對指導(dǎo)今后大白菜抗病毒病育種具有重要意義。國內(nèi)外許多學(xué)者報(bào)道過這方面的研究。如閆瑾琦(2000)采用RAPD方法找到2 個與大白菜抗TuMV基因緊密連鎖的標(biāo)記，遺傳距離分別為9. 5cM和15.36cM。韓和平等 (2004)篩選到2個與大白菜TuMV感病基因緊密連鎖的AFLP分子標(biāo)記，其遺傳距離分別為 7. 5和8. 4cM。張俊華等(2006)篩選出2個與大白菜TuMV_C3株系抗病基因緊密連鎖的 EST-PCR-RFLP分子標(biāo)記BS300及BS160，遺傳距離均為6. 5cM。Gao等(2008)以甘藍(lán)為材 料，采用BSA法，篩選到兩個與TuMV抗性基因連鎖的RAPD分子標(biāo)記，連鎖距離分別為7. 7c M和8. 38cM，并將其轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。但相對于實(shí)際應(yīng)用，這些標(biāo)記的連鎖遺傳距離還較 遠(yuǎn)。一般情況下，5cM以下的分子標(biāo)記才有應(yīng)用價(jià)值。張曉偉等(2009)篩選到3個與大白 菜TuMV抗性有關(guān)的QTLs連鎖距離分別為2. 9cM、2. 4cM和0. 5cM的AFLP標(biāo)記，但均為顯性 標(biāo)記，在后代選擇中難以區(qū)分純合體和雜合體。因此，篩選與大白菜TuMV抗性基因連鎖距 離在5cM以下且呈共顯性的EST-SSR分子標(biāo)記具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有分子標(biāo)記在大白菜抗TuMV育種輔助選擇應(yīng)用中的不足，本發(fā)明提 供一對連鎖距離為3. 8cM且呈共顯性的EST-SSR分子標(biāo)記，該對分子標(biāo)記不僅能用于大白 菜抗TuMV育種輔助選擇，而且能在后代選擇中區(qū)分純合體和雜合體，從而有利于抗病材料 的快速篩選和純化。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一對大白菜蕪菁花葉病毒病 EST-SSR標(biāo)記，其特征是，其為一對等位標(biāo)記ATA157和ATA154，與大白菜TuMV抗性位點(diǎn)間 的連鎖距離為3. 8cM，其中，標(biāo)記ATA157的片段長度為157bp，具有序列表SEQ ID No. 1中
3的序列；標(biāo)記ATA154的片段長度為154bp，具有序列表SEQ ID No. 2中的序列。標(biāo)記ATA157基因序列GCAAAACGGAGTACCCTAACGCCTTCATCAGGATCATCGGATTCGACAACAACCGTCAAGTCCAGTGC ATCAGTTTCATCGCCTACAAGCCACCAAGCTTCACCGGTGCTTAATTCGCTTTCATATAATAATAATATCTTCTCA TTTCATTTCCAAA(SEQ ID No. 1)標(biāo)記ATA154基因序列TTGGAAATGAAATGAGAAGATATTATTATATGAAAGCGAATTAAGCACCGGTGAAGCTTGGTGGCTTG TAGGCGATGAAACTGATGCACTGGACTTGACGGTTGTTGTCGAATCCGATGATCCTGATGAAGGCGTTAGGGTACT CCGTTTTGCA(SEQ ID No. 2)本發(fā)明大白菜蕪菁花葉病毒病EST-SSR標(biāo)記的制備方法(1)采用改良CTAB法提取待測驗(yàn)單株的基因組DNA取幼葉0. lg，在液氮中研成粉末，裝入1.5mL離心管中；加入700iiL 65°C預(yù)熱 的 CTAB 提取緩沖液(2. 0 % CTAB(g/ml) ；1. 4mol/L NaCl ； lmol/LTris-HCl, pH = 8. 0 ； 0. 5mol/L EDTA ； 1. 0% 3 -巰基乙醇(V/V))，混勻，65°C 水浴 45min_lh，其間每 5_10min 搖一次；冷卻至室溫，離心取上清，用與所取上清液等體積的Tris飽和酚氯仿異戊醇 (25 24 1(V/V))抽提，搖勻后冰浴至分層；12000r/min離心lOmin，取上清液，用酚/氯 仿/異戊醇再抽提一次，取上清液加入熱處理的Rnase至終濃度100 y g/mL，混勻后，37°C 水浴45min ；之后再次用酚/氯仿/異戊醇抽提，取上清，加入預(yù)冷的無水乙醇，_20°C保存 30min，離心，倒掉上清，用70%的酒精清洗，室溫吹干；加入TE溶解DNA，-20°C保存?zhèn)溆茫?用0. 8%的瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量完整性。(2)利用本發(fā)明EST-SSR標(biāo)記引物HCC259的上游引物和下游引物對上述基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增HCC259 的上游引物為GCAAAACGGAGTACCCTA (SEQ ID No. 3)HCC259 的下游引物為TTGGAAATGAAATGAGAAGA(SEQ ID No. 4)擴(kuò)增采用20 u L 反應(yīng)體系，其中，引物濃度 0. 75iimol I71，dNTPs 0. 2mmol I71， Taq 酶 1. 5U，模板 DNA 75ng，含 Mg2+的 10 X Buffer 2. 0 u L ；反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 4min， 94°C變性lmin，48. 5°C退火45s，72°C延伸45s，共35個循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存；擴(kuò) 增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上檢測，每孔點(diǎn)樣6 u L。(3)根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，對照標(biāo)準(zhǔn)條帶或通過測序，判斷待測單株的抗、感特性，并推測 其基因型，以此達(dá)到輔助選育和純化抗病材料的目的。本發(fā)明的有益效果是通過利用該引物，以待測單株的基因組DNA為模板，對本文 中所述的標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增，可實(shí)現(xiàn)對大白菜TuMV抗性的高效選擇，加快大白菜抗TuMV新品系 的選育，建立新型的大白菜雜交種親本選配體系；選育有自主知識產(chǎn)權(quán)的雜交一代品種，解 決我國目前生產(chǎn)上以常規(guī)種為主和花費(fèi)大量外匯購買國外雜交種的難題。本發(fā)明可以不用 通過繁瑣的病毒接種鑒定程序，在子葉期通過提取基因組DNA和PCR擴(kuò)增，即可達(dá)到單株選 擇的目的，選擇的準(zhǔn)確率高達(dá)96. 4%以上。


圖1是標(biāo)記ATA157和ATA154的篩選結(jié)果。
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圖2是標(biāo)記ATA157和ATA154在10個F2代分離群體單株中的擴(kuò)增結(jié)果。圖3是標(biāo)記ATA157和ATA154在7個由抗病親本材料“73”轉(zhuǎn)育而來的抗病材料 中的擴(kuò)增結(jié)果。圖4是標(biāo)記ATA157和ATA154在7個其它抗病材料中的擴(kuò)增結(jié)果。圖5是標(biāo)記ATA157和ATA154在7個其它感病材料中的擴(kuò)增結(jié)果。圖中S1.感病親本“71-36-2”，S2.感病對照材料“冠291 ”，R1.抗病親本“73”， R2.抗病對照材料“8407”，A J.測驗(yàn)單株編號，1 7.測驗(yàn)材料編號。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。實(shí)施例1(1)采用改良CTAB法提取待測驗(yàn)單株的基因組DNA本實(shí)例中分別選用高抗TuMV的大白菜自交系材料“73”和高感TuMV的自交系材 料“71-36-2”為親本材料，選用TuMV的大白菜國家級抗源“8407”和感TuMV的核心種質(zhì)材 料“冠291”為對照材料。分別取0. 1克上述材料的幼葉在液氮中研成粉末，裝入1. 5mL離 心管中。加入 700iiL 65°C預(yù)熱的 CTAB 提取緩沖液(2.0% CTAB(g/ml) ； 1. 4mol/L NaCl ； lmol/L Tris-HCl, pH = 8. 0 ；0. 5mol/L EDTA ；1. 0% 3 _ 巰基乙醇(V/V)),混勻，65°C水浴 45min-lh，其間每5-lOmin搖一次。冷卻至室溫，離心取上清，與所取上清液等體積的Tris 飽和酚氯仿異戊醇(25 24 1(V/V))抽提，搖勻后冰浴至分層。12000r/min離心 lOmin,取上清液，用酚/氯仿/異戊醇再抽提一次，取上清液加入熱處理的Rnase至終濃度 100 u g/mL,混勻后，37°C水浴45min。之后再次用酚/氯仿/異戊醇抽提，取上清，加入預(yù)冷 的無水乙醇，-20°C保存30min，離心，倒掉上清，用70%的酒精清洗，室溫吹干。加入TE溶 解DNA，-20°C保存?zhèn)溆谩Ｓ?. 8%的瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量完整性。(2)利用本發(fā)明EST-SSR標(biāo)記引物HCC259的上游引物和下游引物對上述基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增HCC259 的上游引物為GCAAAACGGAGTACCCTA (SEQ ID No. 3)HCC259 的上游引物為TTGGAAATGAAATGAGAAGA(SEQ ID No. 4)擴(kuò)增采用20 u L 反應(yīng)體系，其中，引物濃度 0. 75 ii mol I71，dNTPs 0. 2mmol I71， Taq 酶 1. 5U，模板DNA 75ng，含Mg2+的 10 XBufffer 2. Oy L。反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 4min， 94°C變性lmin，48. 5°C退火45s，72°C延伸45s，共35個循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。擴(kuò) 增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上檢測，每孔點(diǎn)樣6 u L。(3)根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，對照標(biāo)準(zhǔn)條帶或通過測序，判斷待測單株的抗、感特性，并推測 其基因型，以此達(dá)到輔助選育和純化抗病材料的目的。實(shí)施例2如圖1所示，利用引物HCC259，在抗病親本材料“73”和抗病對照材料“8407”中分 別擴(kuò)增出一條157bp的條帶，命名為ATA157，在感病親本材料“71-36-2”和感病對照材料 “冠291”中，分別擴(kuò)增出一條154bp的條帶，命名為ATA154。實(shí)施例3如圖2所示，利用引物HCC259對10個F2代分離群體單株(A-J)進(jìn)行檢測，其中，
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一部分單株(如C、E、I號單株)擴(kuò)出抗病標(biāo)記條帶ATA157，另一部分(F、J號單株)則擴(kuò) 出感病條帶ATA154，還有一部分仏、8、0、6、11號單株)擴(kuò)出雜合條帶。實(shí)施例4如圖3所示，利用引物HCC259對7個由抗病親本材料“73”轉(zhuǎn)育而來的抗病親本 材料(1-7號)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，7個抗病材料均擴(kuò)出抗病標(biāo)記ATA157，說明該標(biāo)記可用 于以“73”及其轉(zhuǎn)育材料為親本所構(gòu)建群體的TuMV抗性篩選。實(shí)施例5如圖4所示，利用引物HCC259對7個其它抗病材料進(jìn)行檢測，其中，第2、4、5號抗 病材料均擴(kuò)出抗病標(biāo)記ATA157，表明利用該標(biāo)記有望用于以這三個材料為親本構(gòu)建的群體 的TuMV抗性篩選；第1、3、6、7號抗病材料未擴(kuò)出抗病標(biāo)記ATA157，表明該標(biāo)記不適用于以 此材料為親本構(gòu)建群體的TuMV抗性篩選。同時也表明抗病標(biāo)記ATA157并不是一個通用標(biāo) 記，目前僅適用于以抗病親本“73”及其轉(zhuǎn)育而來的抗病材料為親本構(gòu)建群體的TuMV抗性 篩選。有望用于本實(shí)例中第2、4、5號抗病材料后代的TuMV抗性選擇，但還有待于進(jìn)一步驗(yàn) 證。同樣，對于抗病對照材料“8407”后代的TuMV抗性選擇，也有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。實(shí)施例6如圖5所示，利用引物HCC259對7個其它感病材料進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，除第4個 材料外，其余六個均擴(kuò)出感病標(biāo)記ATA154，說明該標(biāo)記有望間接用于以這六個材料為親本 構(gòu)建群體的TuMV抗性選擇。同時也說明標(biāo)記ATA154也不是一個通用標(biāo)記，目前僅適用于感 病親本“71-36-2”，同時有望用于實(shí)例中第1、2、3、5、6、7號材料，但還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。 同樣，對于感病對照材料冠291的實(shí)用性也有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。標(biāo)記ATA154不適用于本實(shí) 例中第4號材料。另外，由于本專利中所涉及到的標(biāo)記是一對等位標(biāo)記，從圖4可以看出，雖然利 用引物HCC259，在第1、3、6、7號抗病材料中未擴(kuò)出抗病標(biāo)記ATA157，但擴(kuò)出了感病標(biāo)記 ATA154。同樣，由圖5可以看出，盡管利用引物HCC259，在第4號感病材料中未擴(kuò)出感病標(biāo) 記ATA154，但擴(kuò)出了抗病標(biāo)記ATA157。因此，標(biāo)記ATA157仍然有望適用于第4號感病材料， 同樣，標(biāo)記ATA154有望適用于第1、3、6、7號抗病材料后代的TuMV抗性選擇。通過以上的標(biāo)記篩選及適用性檢驗(yàn)，可以得出以下結(jié)論由引物HCC259在大白菜 抗、感TuMV材料中擴(kuò)增得到的標(biāo)記ATA157和ATA154是一對等位標(biāo)記，其中，標(biāo)記ATA157 適用于大白菜自交系材料“73”的后代TuMV抗性選擇，有望用于本文中第2、4、5號抗病材 料和第4號感病材料以及抗病對照材料“8407”后代的TuMV抗性篩選；標(biāo)記ATA154適用于 大白菜自交系材料“71-36-2”后代的TuMV抗性篩查，有望用于本文中第1、2、3、5、6、7號感 病材料和第1、3、6、7號抗病材料以及感TuMV的大白菜核心種質(zhì)材料“冠291”后代的TuMV 抗性篩查。
權(quán)利要求
一對大白菜蕪菁花葉病毒病EST-SSR標(biāo)記，其特征是，其為一對等位標(biāo)記ATA157和ATA154，與大白菜TuMV抗性位點(diǎn)間的連鎖距離為3.8cM，其中，標(biāo)記ATA157的片段長度為157bp，具有序列表SEQ ID No.1中的序列；標(biāo)記ATA154的片段長度為154bp，具有序列表SEQ ID No.2中的序列。
2.用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的一對大白菜蕪菁花葉病毒病EST-SSR標(biāo)記的 引物序列HCC259，其特征是，其上游引物為GCAAAACGGAGTACCCTA ；下游引物為 TTGGAAATGAAATGAGAAGA。
3.權(quán)利要求1所述的一對大白菜蕪菁花葉病毒病EST-SSR標(biāo)記的制備方法，其特征是 (1)采用改良CTAB法提取待測驗(yàn)單株的基因組DNA ； (2)利用權(quán)利要求2所述的引物HCC259 的上游引物和下游引物對步驟⑴獲得的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，對 照標(biāo)準(zhǔn)條帶或通過測序，判斷待測單株的抗、感特性，并推測其基因型。
4.如權(quán)利要求3所述的一對大白菜蕪菁花葉病毒病EST-SSR標(biāo)記的制備方法，其特 征是，所述步驟(1)采用改良CTAB法提取待測驗(yàn)單株的基因組DNA的具體步驟為取幼 葉0. lg，在液氮中研成粉末，裝入1.5mL離心管中；加入700 μ L 65°C預(yù)熱的CTAB提取緩 沖液，混勻，65°C水浴45min-lh，其間每5-lOmin搖一次；冷卻至室溫，離心取上清，用與 所取上清液等體積的Tris飽和酚/氯仿/異戊醇抽提，所述酚氯仿異戊醇的體積比為 25 24 1 ；搖勻后冰浴至分層；12000r/min離心lOmin，取上清液，用酚/氯仿/異戊醇再 抽提一次，取上清液加入熱處理的Rnase至終濃度100 μ g/mL,混勻后，37°C水浴45min ；之 后再次用酚/氯仿/異戊醇抽提，取上清，加入預(yù)冷的無水乙醇，-20°C保存30min，離心，倒 掉上清，用70%的酒精清洗，室溫吹干；加入TE溶解DNA，_20°C保存?zhèn)溆茫挥?.8%的瓊脂 糖電泳檢測DNA質(zhì)量完整性；所述CTAB提取緩沖液為質(zhì)量體積比為2. 0%的CTAB ；1. 4mol/ L NaCl ；lmol/L Tris-HCl, pH = 8. 0 ；0. 5mol/L EDTA ；體積比為 1. 0%的 β -巰基乙醇。
5.如權(quán)利要求3或4所述的一對大白菜蕪菁花葉病毒病EST-SSR標(biāo)記的制備方 法，其特征是，所述步驟(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增為擴(kuò)增采用20 μ L反應(yīng)體系，其中，引物濃度 0. 75 μ mol · ΙΛ dNTPs 0. 2mmol · Λ Taq 酶 1. 5U,模板 DNA 75ng,含 Mg2+ 的 IOXBuffer 2. OyL ；反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min，94°C變性Imin, 48. 5°C退火45s，72°C延伸45s，共 35個循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存；擴(kuò)增產(chǎn)物在8 %聚丙烯酰胺凝膠上檢測，每孔點(diǎn)樣 6 μ L0
6.權(quán)利要求1所述的一對大白菜蕪菁花葉病毒病EST-SSR標(biāo)記在大白菜抗TuMV育種 輔助選擇方面的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的一對大白菜蕪菁花葉病毒病EST-SSR標(biāo)記在后代選擇中區(qū)分純合 體和雜合體方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一對與大白菜蕪菁花葉病毒抗病和感病基因緊密連鎖的EST-SSR標(biāo)記ATA157和ATA154，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該標(biāo)記是一對等位標(biāo)記，與大白菜TuMV抗性位點(diǎn)間的連鎖距離為3.8cM。其中，標(biāo)記ATA157的片段長度為157bp；標(biāo)記ATA154的片段長度為154bp。本發(fā)明還公開了一對EST-SSR標(biāo)記引物HCC259，具有序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4中的序列。通過利用該引物，以待測單株的基因組DNA為模板，對本文中所述的標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增，可實(shí)現(xiàn)對大白菜TuMV抗性的高效選擇，加快大白菜抗TuMV新品系的選育，建立新型的大白菜雜交種親本選配體系。
文檔編號C12N15/11GK101838645SQ20101018002
公開日2010年9月22日 申請日期2010年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日
發(fā)明者佟海申, 劉栓桃, 宋希云, 張志剛, 李巧云, 趙智中 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所;青島農(nóng)業(yè)大學(xué)