專利名稱：食品中豬肉成分的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定食品中豬肉成分的方法，該方法包括從豬肉樣本中提取脫氧 核糖核酸(DNA)，然后在豬肉ND5線粒體基因的基礎(chǔ)上構(gòu)架一正向引物和反向引物，對該 正向引物和反向引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其中，該正向引物序列為SUS-FWD :5' -AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3'，該反向引物序列為SUS-RVS :5' -ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG-3，。 本發(fā)明特征為 —種鑒定食品中豬肉成分的方法，該方法包括 (a)從豬肉樣本中提取脫氧核糖核酸(DNA); (b)以豬肉ND5線粒體基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)架一正向引物和反向引物； (c)對該正向引物和反向引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其中，該正向引物序列為
SUS-FWD :5， -AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3'，該反向引物序列為SUS-RVS :5， -ATG CGT
TTG AGT GGG TTA GG_3'。其中正向引物和反向引物的濃度為0. 3-0. 9ii m。
其中反應(yīng)溫度為50-70°C。
以及， —種鑒定食品中豬肉成分的方法，該方法包括 (a)以豬肉ND5線粒體基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)架一正向引物和反向引物； (b)對該正向引物和反向引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其中，該正向引物序列為
SUS-FWD :5， -AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC_3，，該反向引物序列為SUS-RVS :5， -ATG CGT
TTG AGT GGG TTA GG_3'。 其中正向引物和反向引物的濃度為0. 3-0. 9ii m。
其中反應(yīng)溫度為50-70°C。


圖1示出了豬肉引物和其他肉類(牛肉和雞肉)特異性實(shí)驗(yàn)比較；
圖2示出了 10倍連續(xù)稀釋的豬肉引物的靈敏度測試；
圖3示出了引物濃度的最優(yōu)化；
圖4示出了引物退火溫度的最優(yōu)化。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明描述了用于清真食品鑒定的豬肉特異性實(shí)時(shí)PCR檢驗(yàn)的發(fā)展和應(yīng)用。引 物構(gòu)架成擴(kuò)增豬肉線粒體基因ND5的一個(gè)89bp擴(kuò)增子(89bpamplicon)，與商業(yè)種類的雞 肉和牛肉進(jìn)行錯(cuò)配。該檢驗(yàn)具有高度靈敏性，可在水中DNA稀釋評估時(shí)，檢測出豬肉模板 DNA(pork template DNA)的0. OOlng的存在。用于清真食品鑒定而發(fā)展出的引物以豬肉線 粒體基因ND5為基礎(chǔ)，該引物序列如下 正向引物(SUS-FWD :5， -AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC_3，)
反向引物(SUS-RVS :5， -ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG_3，) 檢測豬肉DNA的PCR條件是利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(the Mastercycler印) (德國漢堡某公司產(chǎn)品Eppendorf AG， Hamburg, Germany)通過擴(kuò)增完成的。每支反應(yīng) 試管盛裝20ii 1的反應(yīng)混合物，其中包括lOii 1 2x Quantitect SYBRGreen PCR Master Mix (Qiagen，Hilden，Germany) ， 1 ii 1正向引物，1 P 1反向引物，3 ii 1 dH20禾口5ii 1 DNA樣品 (20ng/ul)。三步擴(kuò)增循環(huán)程序(The3-st印amplification cycle program)如下所述 在95t:進(jìn)行15分鐘的最初活化，在94t:進(jìn)行變性15秒，在58t:進(jìn)行退火30秒，在72t:進(jìn) 行延伸30秒。最初活化步驟用以激活HotStarTaq DNA聚合酶在反應(yīng)混合物中出現(xiàn)。該循 環(huán)重復(fù)40次，采用解鏈曲線分析(melting curve analysis)以核實(shí)具體物品和DNA擴(kuò)增
的鑒定。
樣品 豬肉，牛肉和雞肉三個(gè)種類用于該研究。肉樣品從當(dāng)?shù)厥袌?SelangorWholesale Market)購得。在DNA提取前，樣品以-2(TC儲存。
DNA提取 肉樣品中的DNA用DNeasy②血液及組織套件(DNeasy Blood and TissueKit) (Qiagen， Hi lden， Germany)提取。25mg的樣品在1. 5ml微型離心機(jī)試管中稱重。加入180
4成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤緩沖劑(Buffer ATL)和20 蛋白酶K?；旌衔锉恍D(zhuǎn)，在56°C 水浴中培養(yǎng)過夜以溶解。當(dāng)樣品被全部溶解后，加入4iU核糖核酸酶A(RNase A) (lOOmg/ ml)，混合并在室溫下培養(yǎng)2分鐘。將混合物旋轉(zhuǎn)后，加入200 ii 1 AL緩沖劑(Buffer AL)， 然后再次旋轉(zhuǎn)使混合充分。而后，加入200iU乙醇(96-100% )，并通過旋轉(zhuǎn)混合產(chǎn)生一均 一溶液?；旌衔镉孟匆汗軐?dǎo)入Dneasy迷你旋轉(zhuǎn)柱體套件(DNeasy Minispin column set), 在8000rpm下離心1分鐘。滲流以及收集試管丟棄。然后，Dneasy迷你旋轉(zhuǎn)柱體(DNeasy Mini spin column)安裝一新的2ml收集試管。加入500 ii 1 AW2緩沖劑(Buffer AW2)， 在14， OOOrpm下離心3分鐘以保證柱體干燥以及避免乙醇遺留的發(fā)生。而后，Dneasy迷你 旋轉(zhuǎn)柱體安裝一新的1. 5ml微型離心機(jī)試管，加入100 ill AF緩沖劑(Buffer AF)以洗提。 試管在室溫下培養(yǎng)1分鐘，然后在8， OOOrpm下離心1分鐘。包含被提取的DNA的上清液于
4t:儲存，以備后用。 引物構(gòu)架 弓|物3軟件(The Primer3 software) (http: 〃frodo. wi. mit. edu/cgi_bin/ primer3/primer3_www. cgi)被用于構(gòu)架在實(shí)時(shí)PCR中應(yīng)用的引物。獲得自NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(hhtp:〃www. ncbi. nlm. nih. gov)的豬肉(NC_000845)牛肉(NC—006853)和雞肉 (NC_001323)中的ND5基因序歹l」，被排列并被比較。 一個(gè)引物對(SUS-FWD :5'-AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3'和SUS-RVS :5' -ATG CGT TTG AGT GGG TTAGG-3')被合成以特定地?cái)U(kuò) 增豬肉中ND5基因的89bp段。
實(shí)時(shí)PCR分析 檢測豬肉DNA是利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(the Mastercycler印)(Eppendorf AG， Hamburg, Germany)通過擴(kuò)增完成的。每支反應(yīng)食管盛裝20 的反應(yīng)混合物，其包括 10 li 1 2x Quantitect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen，Hilden，Germany) ， 1 u 1正向 引物，1 Pi反向引物，3iU dH20 and 5iUDNA樣品(20ng/iU)。三步擴(kuò)增循環(huán)程序如下所 述在95t:進(jìn)行15分鐘的最初活化，在94t:進(jìn)行變性15秒，在58t:進(jìn)行退火30秒，在72°C 進(jìn)行延伸30秒。最初活化步驟用以激活HotStarTaq DNA聚合酶在反應(yīng)混合物中出現(xiàn)。該 循環(huán)重復(fù)40次，解鏈曲線分析實(shí)施用以核實(shí)物種和DNA擴(kuò)增的鑒定。另有說明者除外，所 有反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行了三次。
權(quán)利要求
一種鑒定食品中豬肉成分的方法，該方法包括(a)從豬肉樣本中提取脫氧核糖核酸(DNA)；(b)以豬肉ND5線粒體基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)架一正向引物和反向引物；(c)對該正向引物和反向引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其中，該正向引物序列為SUS-FWD5’-AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3’，該反向引物序列為SUS-RVS5’-ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG-3’。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中正向引物和反向引物的濃度為0. 3-0. 9ii m。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中反應(yīng)溫度為50-70°C。
4. 一種鑒定食品中豬肉成分的方法，該方法包括(a) 以豬肉ND5線粒體基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)架一正向引物和反向引物；(b) 對該正向引物和反向引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其中，該正向引物序列為 SUS-FWD :5' _AGC TGC ACT ACA AGC AAT CC-3'，該反向引物序列為SUS-RVS :5' _ATG CGT TTG AGT GGG TTA GG_3'。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中正向引物和反向引物的濃度為0. 3-0. 9 m。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中反應(yīng)溫度為50-70°C。
全文摘要
在此研究中，豬肉特異性實(shí)時(shí)PCR檢驗(yàn)發(fā)展用以清真食品認(rèn)證。三種肉類樣品被采用，即豬肉，牛肉和雞肉。這三種家畜的肉是馬來西亞經(jīng)常消費(fèi)的肉，而且在市場上很容易買到。每種粗制肉樣品的DNA利用Blood&Tissue Kit(Qiagen，Hilden，Germany)成功提取。在實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)前，DNA的濃度采用光度適應(yīng)計(jì)(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)利用UV吸收分光光度測量法獲得。引物的退火溫度為58℃。為了檢驗(yàn)所構(gòu)架的引物的特異性，反應(yīng)測試了引物與其他兩種肉類樣品的反應(yīng)以監(jiān)測可能的交叉反應(yīng)。該反應(yīng)僅在Ct±22.83時(shí)擴(kuò)增豬肉DNA。本發(fā)明描述的實(shí)時(shí)PCR檢測被證實(shí)在樣品測試中，對低監(jiān)測限度非常敏感。檢測通過自100ngDNA開始制備10倍稀釋系列，測定反應(yīng)的靈敏度。靈敏度起始值最高為0.001ng豬肉DNA。已有報(bào)道稱利用傳統(tǒng)PCR檢測的檢出限為0.1ng豬肉DNA。在這種情況下，本方法對于檢測食品中的豬肉DNA是有益處的。
文檔編號C12N15/06GK101715488SQ200980000315
公開日2010年5月26日 申請日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日
發(fā)明者拉哈·阿布杜歐·拉希姆, 法里漢·里亞納·卡立德, 舒海米·穆斯塔法, 艾達(dá)·阿茲里納·阿茲米, 阿維斯·昆尼·薩茲立, 雅各布·B·徹·曼 申請人:馬來西亞博特拉大學(xué)