專利名稱：雞脂肪候選基因lpin1基因及功能突變檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測動物脂肪性狀技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞脂肪候選基 因Ipinl基因及功能突變檢測方法。
背景技術(shù)：
動物每天從食物中攝取能量，并主要在肝臟和脂肪組織中把多余的能量轉(zhuǎn)變成脂 肪儲存起來。動物脂肪沉積所需要的脂肪酸大多來自于脂肪酸的全程合成。動物脂肪的過 度沉積是影響胴體品質(zhì)和人類健康的重要問題之一。近年來，減少動物脂肪的過度沉積，闡 明其調(diào)控的分子機(jī)制及建立相應(yīng)的調(diào)控技術(shù)，已成為動物營養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)，并已取得許 多重要的研究成果。人Lipinl基因與酵母的PAHl基因為同源基因，PAHl基因編碼酵母細(xì)胞的Mg2+依 賴性的磷脂酸(PA)磷酸化酶，該酶活力與細(xì)胞膜和細(xì)胞液有關(guān)，酶的膜結(jié)合形式是鹽溶性 的，脂分析顯示缺乏PAHl的突變導(dǎo)致磷脂酸的聚集，減少了甘油二酯和甘油三酯的量，缺 少這種酶的酵母細(xì)胞，其酵母的脂肪細(xì)胞減少90 %。人Lipinl基因在大腸桿菌的雜合表達(dá) 表明該基因也是一種編碼Mg2+依賴性的磷脂酸磷酸化酶(PAP酶)的基因。在對患有脂肪 肝營養(yǎng)不良癥小鼠的研究結(jié)果顯示，Lipinl基因在脂肪組織和骨骼肌組織中可以發(fā)揮磷脂 酸磷酸化酶(PAP酶)的所有功能。目前研究發(fā)現(xiàn)，由Lipinl基因編碼的哺乳動物L(fēng)ipin-I蛋白家族不僅具有胞質(zhì)定 位信號區(qū)，而且還擁有核定位信號區(qū)。已經(jīng)得到證實(shí)，由Lipinl基因編碼的Lipin-I蛋白 由于能夠定位在脂肪細(xì)胞和肝臟細(xì)胞的細(xì)胞核中，F(xiàn)inck和他的同事們在鼠中研究發(fā)現(xiàn)，在 空腹?fàn)顟B(tài)下，Lipin-I蛋白是激活肝臟內(nèi)脂肪酸氧化相關(guān)基因并發(fā)揮作用所必須的因素。在以前的研究中，Lipin-I蛋白具有重要的生理學(xué)功能，即自身代謝平衡的獨(dú)特生 理學(xué)功能，然而Lipin-I蛋白所具有的兩種不同的細(xì)胞功能最近才被發(fā)現(xiàn)。首先，Lipin-I 蛋白作為一種酶，參與甘油三酯和磷脂合成；其次，Lipin-I蛋白作為一個轉(zhuǎn)錄輔激活因 子，直接與細(xì)胞核受體過氧化物酶體增生物激活受體α (PPARa)和PPARa共活化物 PGC-I α直接相互作用并形成復(fù)合物，以調(diào)節(jié)脂肪酸利用及脂類合成相關(guān)基因的表達(dá)。另 外，Lipin-I蛋白還具有在脂肪、骨骼肌、肝臟等組織和外周神經(jīng)中調(diào)節(jié)脂類自身代謝平衡 的獨(dú)特生理學(xué)功能。Lindegaard在對兩組均感染艾滋病病毒的男性(其中一組同時患有脂肪營養(yǎng)不 良癥)研究結(jié)果顯示，在患有脂肪營養(yǎng)不良癥的男性血清中總膽固醇含量顯著高于沒有患 脂肪營養(yǎng)不良癥的男性(p<0.(^)；血清中甘油三酯含量極其顯著高于沒有患脂肪營養(yǎng)不 良癥的男性(P<0. 001)。在患有脂肪營養(yǎng)不良癥的男性脂肪組織中Lipinl基因表達(dá)水平 顯著高于沒有患脂肪營養(yǎng)不良癥的男性(ρ <0.05)。在健康青年男性中，脂肪細(xì)胞當(dāng)達(dá)到 正常成熟脂肪細(xì)胞大小的時候，脂肪細(xì)胞中Lipinl基因表達(dá)水平會被削弱，但是此時，脂 肪組織中甘油三酯的貯存能力達(dá)到最大，即甘油三酯含量最高。研究結(jié)果顯示，Lipinl基 因表達(dá)水平與血清中甘油三酯含量呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(R2 = -0. 10 ；ρ < 0. 05)。
Lipinl/LIPINl是通過對fid小鼠突變體進(jìn)行候選位置克隆獲得的。fid突變小 鼠患有脂肪營養(yǎng)不良癥(lipodystrophy，fid)，表現(xiàn)為脂肪組織數(shù)量的嚴(yán)重缺乏(80%)、 胰島素抗性及進(jìn)程性的外周神經(jīng)病。比較fid小鼠和野生型小鼠的基因組，發(fā)現(xiàn)fid小鼠 的Lipinl的基因組序列出現(xiàn)了缺失、反轉(zhuǎn)和復(fù)制現(xiàn)象，為一種無效突變。在fid小鼠體內(nèi) 既不表達(dá)Lipinl- α，也不表達(dá)Lipinl- β。不表達(dá)Lipinl的fld/fld小鼠與野生型小鼠 相比，其脂肪組織、骨骼組織僅有很少的PAP酶活力。Cao從脂肪營養(yǎng)不良患者和正常人群中未檢測到Lipinl基因的特異變異，僅從外 顯子、外顯子-內(nèi)含子邊界檢測到5個變異位點(diǎn)。SUViOlahtU20(^)從瘦型對照人群及 dyslipidemic Finnish家系和肥胖群體中，發(fā)現(xiàn)Lipinl基因內(nèi)SNP及相應(yīng)的等位基因單倍 型與血清胰島素水平和體重指數(shù)的關(guān)聯(lián)，顯示這個基因的等位基因變異體在人類代謝性狀 中有重要的作用。Eun Seok Kang在人上研究表明，Lipinl基因的遺傳變異能夠影響降血糖藥物匹 格列酮(pioglitazone)對II型糖尿病的治療作用，匹格列酮能夠增強(qiáng)Lipinl基因在人脂 肪細(xì)胞中中的表達(dá)量。Lipinl基因的變異能夠引起兒童橫紋肌溶解癥復(fù)發(fā)，并成為引起與 肌肉相關(guān)疾病誘因的攜帶者。Phan等發(fā)現(xiàn)具有Lipinl缺陷的fid小鼠采食量正常，但飼料轉(zhuǎn)化率降低，同樣， 在脂肪組織和骨骼肌組織過量表達(dá)Lipinl基因小鼠的采食量也正常，但小鼠的體重顯著 高于Lipinl正常表達(dá)的小鼠，其中骨骼肌過量表達(dá)小鼠的體重與正常小鼠體重差異最大， 飼料轉(zhuǎn)化率顯著提高，尤其在高脂日糧的效應(yīng)最顯著，此外，骨骼肌和脂肪組織過量表達(dá) Lipinl的小鼠脂肪含量分別極顯著和顯著大于正常表達(dá)小鼠，表明LIPim水平應(yīng)具有調(diào) 控能量消耗的作用，LIPim缺陷阻止了日糧誘發(fā)肥胖和遺傳性肥胖，并且需要上游的正常 脂肪細(xì)胞分化基因PPARy的協(xié)同作用。是否雞的不同品種或不同個體中存在雞Lipinl基 因表達(dá)量的差異，表達(dá)量的差異與雞只的采食量，飼料轉(zhuǎn)化率，脂肪沉積是否有關(guān)？能否依 據(jù)該基因的DNA變異或表達(dá)差異選擇低脂系或高飼料轉(zhuǎn)化率的雞品系。這些都值得研究。目前的研究表明，Lipinl基因表達(dá)具有強(qiáng)烈的影響脂肪沉積的效應(yīng)，Lipinl的不 表達(dá)、正常表達(dá)、過量表達(dá)均能引起脂肪沉積的劇烈變化，引起脂肪組織量增加，即從正常 情況的10%到3倍的增加。在極端狀態(tài)下，人和鼠Lipinl的無效突變會導(dǎo)致脂肪營養(yǎng)不良 癥。Lipinl對脂肪沉積的效應(yīng)在轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)小鼠研究和自然人群的研究卻有相反的結(jié) 論。在人和鼠的研究表明Lipinl基因能引起脂肪沉積的劇烈變化，Lipinl對脂沉積 的效應(yīng)在轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)研究和自然群體的研究卻得到相反的結(jié)論，有必要以其它模式動 物為對象進(jìn)行該基因在自然群體中對脂肪沉積效應(yīng)的進(jìn)一步研究。比較基因組學(xué)的分析表 明Lipinl也是影響雞脂肪沉積的潛在候選基因，這已經(jīng)為后繼的研究工作打下堅實(shí)的基 石出。Lipinl轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)增加了小鼠的肥胖程度。骨骼肌與脂肪組織過量表達(dá) Lipinl的轉(zhuǎn)基因小鼠的脂肪墊分別極顯著和顯著大于Lipinl正常表達(dá)小鼠。在Lipinl過 量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠研究表明，Lipinl表達(dá)水平的變異自身就已經(jīng)足夠引起肥胖的極端狀 態(tài)。但發(fā)現(xiàn)Lipinl基因在脂肪組織和骨骼肌組織中是通過不同的機(jī)制完成的，脂肪細(xì)胞的 Lipinl基因影響脂肪細(xì)胞的脂肪儲存能力，而骨骼肌中的Lipinl水平則是全身能量消耗和脂肪利用的決定因子。表明人類Lipinl基因不僅是脂肪沉積減少而且是脂肪沉積增加 失調(diào)的候選基因。與其它脂肪相關(guān)組織不一樣的是，Lipinl基因在外周組織優(yōu)勢表達(dá)并發(fā) 揮作用，應(yīng)是一個新的治療肥胖和脂肪營養(yǎng)不良癥的一個新的靶點(diǎn)。自然體形人群中Lipinl基因表達(dá)與肥胖有呈負(fù)相關(guān)的報道。Lipinl基因的表 達(dá)水平和肥胖的關(guān)系似乎比較復(fù)雜，盡管轉(zhuǎn)基因小鼠的脂肪組織的過度表達(dá)促進(jìn)了脂肪合 成基因的表達(dá)并引起肥胖，但在遺傳異質(zhì)的人群中，Lipinl基因表達(dá)量與脂肪沉積的關(guān)系 似乎并不是這樣，這是否是因為大量的環(huán)境和遺傳因子互作影響的效應(yīng)還值得研究。在人 和鼠脂肪組織中，Lipinl基因的表達(dá)水平與肥胖呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，而以前在aP2-Lipinl 轉(zhuǎn)基因小鼠研究中，研究結(jié)果是Lipinl基因的表達(dá)水平與肥胖呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。產(chǎn)生這 種差異的基礎(chǔ)，我們不太清楚，但是在aP2-Lipinl轉(zhuǎn)基因小鼠中，由于增加了 Lipinl基因 的表達(dá)，通過異源調(diào)控元件的介入引起基因表達(dá)上調(diào)，沒有對正常調(diào)節(jié)Lipinl基因表達(dá)水 平所產(chǎn)生的分子的和生理學(xué)的信號作出反應(yīng)，可能與這種情況有關(guān)。所以，在脂肪組織中 Lipinl基因是PAPl酶合成甘油三酯所必須的，在轉(zhuǎn)基因小鼠脂肪組織中由于外界強(qiáng)制作 用使Lipinl基因表達(dá)量增強(qiáng)，結(jié)果就會增強(qiáng)甘油三酯的蓄積，然而在正常受試人群中，脂 肪細(xì)胞當(dāng)達(dá)到正常成熟脂肪細(xì)胞大小的時候，脂肪細(xì)胞中Lipinl基因表達(dá)水平會被削弱。 有以下研究可以證實(shí)上述可能性如果在人脂肪組織中沒有達(dá)到正常甘油三酯的貯存能力 的話，如患有脂肪營養(yǎng)不良的人群，那么，Lipinl基因表達(dá)水平與脂肪重呈正相關(guān)關(guān)系。Yao-Borengasser和van Harmelen觀察到人脂肪組織Lipinl基因的表達(dá)水平與 脂肪沉積量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，肥胖者Lipinl基因的表達(dá)水平低于瘦者，而且在肥胖人群中隨 著肥胖程度的增加，脂肪組織Lipinl基因表達(dá)量呈下降趨勢；vanHarmelenQOOe)認(rèn)為脂 肪沉積應(yīng)是脂肪組織Lipinl基因表達(dá)量的一個主要調(diào)控因素。Yao-Borengasser (2006)發(fā) 現(xiàn)Lipinl總表達(dá)量、Lipinl-α ,Lipinl-β表達(dá)量都呈隨著肥胖程度的增加顯著下降的特 點(diǎn)，并隨著胰島素敏感性的增加而增加，脂肪組織Lipinl表達(dá)量與體型指數(shù)(BMI)、體脂比 例、肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)(IMCLs)呈顯著負(fù)相關(guān)。但私0-80儀叫狀紹1·沒有發(fā)現(xiàn)肌肉中Lipinl基 因表達(dá)的變化與肥胖或胰島素抗性的相關(guān)，包括從瘦子到胖子、從正常到葡萄糖耐性受損 人群。肉雞脂肪相關(guān)性狀已被定位在多個染色體區(qū)域，Jermen和Ueobi都檢測到3號染 色體上有影響脂肪重和脂肪率的一個QTL位點(diǎn)，Jennen進(jìn)一步確證了 3號染色體的0_2cM 處MCW0116-MCW0148區(qū)間有一個影響脂肪重，脂肪率和體重的QTL位點(diǎn)。而該區(qū)域與人的 2P區(qū)域和鼠的12A區(qū)域為同源區(qū)間，人和鼠Lipinl基因正好位于這個區(qū)間?；蚨ㄎ缓捅?較基因組研究表明，Lipinl基因應(yīng)是雞脂肪性狀的重要候選基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于是克隆出雞脂肪性狀的功能候選基因Ipinl基因，并提供一種 雞脂肪候選基因功能突變檢測方法，即單核苷酸多態(tài)性(SNPs)來檢測雞脂肪性狀的方法。 并根據(jù)基因型進(jìn)行相關(guān)性狀的標(biāo)記輔助選擇。本發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明采用電子克隆和RT-PCR方法克隆出雞脂肪侯選基因LPinl的編碼序列，并 用該序列進(jìn)一步搜索雞基因組得到該基因5’-UTR，設(shè)計引物檢測5’-UTR的變異，分析檢測5到的變異位點(diǎn)及其周圍信息后，采用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP法檢測雞脂肪性狀侯選基因 功能突變。本發(fā)明的雞脂肪候選基因Ipinl基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。雞脂肪候選基因Ipinl基因，該基因的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。雞脂肪候選基因Ipinl功能突變檢測方法，采用上述雞脂肪候選基因Ipinl基 因序列，與雞基因組序列比對，獲得雞的5’ -非翻譯區(qū)，針對存在的變異，設(shè)計引物檢測 5’-UTR的變異，分析檢測到的變異位點(diǎn)及其周圍信息后，采用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP法檢 測雞脂肪性狀侯選基因功能突變。通過引入酶切位點(diǎn)，采用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP法，用下述引物對雞的總DNA進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，正向引物5，-AGCTCTGATGTGCCAAACCATAATA-3，；反向引物5，-TCAGACTTTCAGATTGCAGCTCCTA-3，。采用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP檢測5，_UTR的多態(tài)，檢測到5，_UTR存在一個C/T變 異，包含創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP引物的一段5，-UTR序列如SEQ ID No. 3所示，其中第290 個核苷酸是變異位點(diǎn)處，引物序列區(qū)域為第23-47個核苷酸，()內(nèi)為引入的錯配堿基。檢 測到 5' -UTR 區(qū)域的一個 C/T 變異，采用 Patch 1. 0 (http //www, gene-regulation, com/ cgi-bin/pub/programs/patch/bin/patch. cgi)預(yù)測該 T — C 變異可引起一個 GR轉(zhuǎn)錄因子 結(jié)合位點(diǎn)的丟失，顯示該變異有潛在重要的效應(yīng)。設(shè)計一對特異引物并PCR擴(kuò)增含LPinl多態(tài)位點(diǎn)的DNA片段，根據(jù)單堿基突變位 點(diǎn)的堿基替代情況設(shè)計引物，其中反向引物根據(jù)突變位點(diǎn)鄰近序列設(shè)計，人為引入一個錯 配堿基，使引物3'端和單堿基突變的一種突變型在PCR擴(kuò)增后形成一個STYI酶切位點(diǎn)， 并應(yīng)用相應(yīng)內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，通過PCR-RFLP技術(shù)判斷LPim基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性。結(jié) 果表明使用限制性內(nèi)切酶STYI酶切判斷LPim位點(diǎn)多態(tài)性，PCR和酶切效果均較好。然后 用STYI酶進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測出雞脂肪候選基因Ipinl的5’-UTR是C還是T等位基 因，C等位基因可被STYI酶切產(chǎn)生一個268和25堿基的片段，T等位基因不能被STYI酶 切。這樣，TT純合基因型只產(chǎn)生一個四3的片段，CC純合基因型將產(chǎn)生268和25堿基的片 段；CT雜合基因型將產(chǎn)生四3、268和25堿基三種片段。分析顯示雞LPim基因不同基因型對一些屠體性狀有顯著效應(yīng)。對腹脂重、腹脂 率的效應(yīng)達(dá)到顯著水平中，TT基因型的腹脂重和腹脂率最大，TC基因型的腹脂重和腹脂率 顯著和極顯著地低于TT基因型，而TT基因型與CC基因型的差異未達(dá)到顯著水平。血清中 的甘油三酯水平在三種基因型間的差異達(dá)到P < 0. 1的顯著水平，也以TT基因型最高。顯 示LPim基因?qū)χ鞠嚓P(guān)性狀有重要的效應(yīng)，有望用于雞的標(biāo)記輔助選擇。本發(fā)明巧妙地利用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP法檢測SNPs，發(fā)現(xiàn)了影響雞脂肪性狀 的功能基因和特異性突變位點(diǎn)。目前肉雞的高腹脂含量影響了雞肉的品質(zhì)，采用標(biāo)記輔助 選擇選擇低腹脂含量的肉雞是一大發(fā)展趨勢。
具體實(shí)施例方式一.實(shí)驗材料與方法1.實(shí)驗材料
1. 1菌株和克隆載體本發(fā)明所用菌株見表
權(quán)利要求
1.一種雞脂肪候選基因Ipinl基因，其特征在于該基因的核苷酸序列如SEQID No. 1 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞脂肪候選基因Ipinl基因，其特征在于該基因的氨基酸 序列如SEQ ID No. 2所示。
3.一種雞脂肪候選基因功能突變檢測方法，其特征在于采用權(quán)利要求1所述的雞脂 肪候選基因Ipinl基因序列，與雞基因組序列比對，獲得雞的5’ -非翻譯區(qū)，針對存在的變 異，設(shè)計引物檢測5’ -UTR的變異，分析檢測到的變異位點(diǎn)及其周圍信息后，采用創(chuàng)造酶切 位點(diǎn)PCR-RFLP法檢測雞脂肪性狀侯選基因功能突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞脂肪候選基因功能突變檢測方法，其特征在于通過引入 酶切位點(diǎn)，采用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP法，用下述引物對雞的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用 STYI酶進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測出雞脂肪候選基因Ipinl的5’-UTR是C還是T是T等位 基因，正向引物5’ -AGCTCTGATGTGCCAAACCATAATA-3’ ；反向引物5’ -TCAGACTTTCAGATTGCAGCTCCTA-3，。
全文摘要
雞脂肪候選基因lpin1基因及功能突變檢測方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的雞脂肪候選基因lpin1基因，的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明提供的雞脂肪候選基因功能突變檢測方法，采用雞脂肪候選基因lpin1基因序列，與雞基因組序列比對，獲得雞的5’-非翻譯區(qū)，針對存在的變異，設(shè)計引物檢測5’-UTR的變異，檢測功能性突變位點(diǎn)所用引物，正向5′-GATTTGATCTGCTTGGAGAC-3′；反向5′-GTCATGATAGCAAAGAGCAAG-3′。利用該引物擴(kuò)增后，用限制性酶切方法進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測，可以檢測出lpin1編碼序列5’UTR的堿基是T還是C等位基因。
文檔編號C12N15/54GK102051366SQ20091006637
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日
發(fā)明者孫桂榮, 康相濤, 王彥彬, 田亞東, 陳文 , 韓瑞麗, 黃艷群 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)