專利名稱：新的骨量增加藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含作為有效成分的化合物，該化合物作用于成骨細(xì) 胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、 成熟或鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因而引起骨量增加等。這種藥物組合物是包含作為有效成 分的化合物的藥物組合物，該化合物給成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞傳遞信號(hào)并促 進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因而
12引起骨量增加等。其實(shí)例是包含作為有效成分的化合物的藥物組合物，該化合物作用于 RANKL，使RANKL傳遞信號(hào)給成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分 化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因而引起骨量增加等。當(dāng) 化合物作用于RANKL時(shí)，目標(biāo)RANKL的來(lái)源動(dòng)物是不受限制的。目標(biāo)RANKL的實(shí)例包括來(lái)自 不同種類動(dòng)物的RANKL，例如人RANKL、小鼠RANKL和大鼠RANKL。在此，術(shù)語(yǔ)"作用于RANKL" 是指該化合物作用于RANKL，使RANKL傳遞信號(hào)給成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞。例 如，該化合物可與RANKL結(jié)合，使RANKL傳遞信號(hào)給成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞。
作用于RANKL并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或 鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因而引起骨量增加等的化合物的實(shí)例，包括能作用于RANKL的各種 化合物，RANKL可源自不同動(dòng)物種類。這些化合物包括天然肽和非天然肽以及化學(xué)合成和 微生物來(lái)源的低分子化合物。 促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化，從而誘導(dǎo)骨 形成，因而引起骨量增加等的本發(fā)明化合物的實(shí)例包括RANK片段肽的變異體、結(jié)構(gòu)上類 似于RANK的肽、結(jié)構(gòu)上類似于RANK片段肽的肽、結(jié)構(gòu)上類似于RANK的化學(xué)物質(zhì)和結(jié)構(gòu)上 類似于RANK片段肽的化學(xué)物質(zhì)。這些化合物的實(shí)例包括RANK、能作用于RANKL的RANK片 段肽的變異體、結(jié)構(gòu)上類似于RANK并能作用于RANKL的肽、結(jié)構(gòu)上類似于RANK片段肽并能 作用于RANKL的肽、結(jié)構(gòu)上類似于RANK并能作用于RANKL的化學(xué)物質(zhì)以及結(jié)構(gòu)上類似于 RANK片段肽并能作用于RANKL的化學(xué)物質(zhì)。 另外，本文所用的術(shù)語(yǔ)"化學(xué)物質(zhì)"是指非肽或非蛋白質(zhì)化合物。術(shù)語(yǔ)"RANK"是 指膜結(jié)合RANK和可溶性RANK。術(shù)語(yǔ)"膜結(jié)合RANK"是指結(jié)合在細(xì)胞表面的RANK,其具有跨 膜區(qū)。細(xì)胞實(shí)例包括動(dòng)物細(xì)胞，例如表達(dá)天然RANK的細(xì)胞和表達(dá)重組RANK的人體細(xì)胞和 哺乳動(dòng)物細(xì)胞。同樣，術(shù)語(yǔ)"RANK"是指RANKFc。在此，RANKFc是通過(guò)將人IgGl的Fc區(qū)與 人RANK胞外區(qū)結(jié)合而獲得的融合蛋白。 此外，在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"結(jié)構(gòu)上類似于"是指所得化合物具有與RANK結(jié)構(gòu)類似并 能作用于RANKL的部分的情況。就肽和蛋白質(zhì)而言，這樣的部分在通常以氨基酸序列為代 表的一級(jí)結(jié)構(gòu)上類似于RANK。然而，在本發(fā)明中，在構(gòu)象上、而不是在氨基酸序列上類似于 RANK并且能作用于RANKL的化合物也可使用。 此外，促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化，從而 誘導(dǎo)骨形成，因而引起骨量增加等的化合物的實(shí)例，包括0PG、 OPG的變異體或片段肽、結(jié)構(gòu) 上類似于OPG的肽、結(jié)構(gòu)上類似于OPG片段肽的肽、結(jié)構(gòu)上類似于OPG的化學(xué)物質(zhì)和結(jié)構(gòu)上 類似于OPG片段肽的化學(xué)物質(zhì)。例如，所述化合物可以是這樣的化合物其作用于RANKL并 促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因 而引起骨量增加等。其實(shí)例包括0PG、能作用于RANKL的OPG的變異體或片段肽、結(jié)構(gòu)上類 似于OPG并能作用于RANKL的肽、結(jié)構(gòu)上類似于OPG片段肽并能作用于RANKL的肽、結(jié)構(gòu)上 類似于OPG并能作用于RANKL的化學(xué)物質(zhì)和結(jié)構(gòu)上類似于OPG片段肽并能作用于RANKL的 化學(xué)物質(zhì)。 另外，本文所用的術(shù)語(yǔ)"化學(xué)物質(zhì)"是指非肽或非蛋白質(zhì)化合物。術(shù)語(yǔ)"OPG"是指 膜結(jié)合OPG和可溶性O(shè)PG。術(shù)語(yǔ)"膜結(jié)合OPG"是指C-端區(qū)結(jié)合在細(xì)胞表面的OPG。這種細(xì) 胞的實(shí)例包括動(dòng)物細(xì)胞，例如表達(dá)天然OPG的細(xì)胞和表達(dá)重組OPG的人體細(xì)胞。同樣，術(shù)語(yǔ)"0PG"是指OPGFc。在此，OPGFc是通過(guò)將人IgGl的Fc區(qū)與人OPG胞外區(qū)結(jié)合而獲得的融 合蛋白(Fc融合蛋白)。 RANK類似物或OPG類似物的實(shí)例是具有RANK或OPG活性的蛋白質(zhì)或肽，其氨基酸 序列是由RANK的氨基酸序列、OPG的氨基酸序列、或其任一種的片段肽的氨基酸序列通過(guò) 一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加而獲得的。在此，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)或多個(gè)"是指"l-9個(gè)"、 優(yōu)選"1-5個(gè)"和更優(yōu)選"1個(gè)或2個(gè)"。 結(jié)構(gòu)上類似于RANK部分并與RANKL結(jié)合的肽的實(shí)例包括含有SEQ ID NO :7所示 氨基酸序列的肽(肽D)和含有SEQ ID N0:16所示氨基酸序列的肽(肽E)。這些肽是環(huán) 狀肽，其中第2位的Cys與第8位的Cys通過(guò)二硫鍵相結(jié)合。 此外，也可使用結(jié)構(gòu)上類似于RANK部分并與RANKL結(jié)合的肽鹽。這樣的肽鹽沒(méi)有 限制，只要它是藥理學(xué)上可接受的鹽。其實(shí)例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽的具體 實(shí)例包括含有乙酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸、三氟乙酸(TFA)、酒石酸和檸檬酸等有機(jī)酸的鹽；和 含有鹽酸、硫酸、硝酸和磷酸等無(wú)機(jī)酸的鹽。另外，堿加成鹽的具體實(shí)例包括含有鈉和鉀等 堿金屬的鹽，含有鈣和鎂等堿土金屬的鹽和含有銨和三乙胺等胺的鹽。在這些鹽中，優(yōu)選乙 酸鹽。具體地講，優(yōu)選呈乙酸鹽形式的包含SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:16所示氨基酸序列 的肽。 同樣，也可使用通過(guò)將GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)或人IgGl的Fc區(qū)(GST融合蛋 白或Fc融合蛋白)與結(jié)構(gòu)上類似于RANK部分并與RANKL結(jié)合的肽結(jié)合而獲得的融合蛋白。 這種融合蛋白的實(shí)例是通過(guò)將GST (谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)或人IgGl的Fc區(qū)與肽D結(jié)合 而獲得的融合蛋白(GST融合肽D或Fc融合肽D)。上述融合蛋白的體內(nèi)穩(wěn)定性得到不同程 度的改進(jìn)，并且血清半衰期得以延長(zhǎng)。同樣，可使用包含GST和表位標(biāo)簽、而非Fc區(qū)的融合 蛋白。這種表位標(biāo)簽的實(shí)例包括聚組氨酸(其包含2-12個(gè)、優(yōu)選4個(gè)以上、更優(yōu)選4-7個(gè)、 還更優(yōu)選5個(gè)或6個(gè)組氨酸)、FLAG標(biāo)簽、Myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽、Xpress標(biāo)簽、HQ標(biāo)簽、HA標(biāo) 簽、AU1標(biāo)簽、T7標(biāo)簽、VSV-G標(biāo)簽、DDDDK標(biāo)簽、S標(biāo)簽、CruzTag09、CruzTag22、CruzTag41、 Glu-Glu標(biāo)簽、Ha. 11標(biāo)簽、KT3標(biāo)簽、硫氧還蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和P -半乳糖苷 酶。 在本發(fā)明中，作用于RANKL并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、 增殖、成熟或鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因而引起骨量增加等的化合物，可稱為RANKL激動(dòng)劑 物質(zhì)。 此外，這些化合物包括抗RANKL抗體，其作用于RANKL，促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成 成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因而引起骨量增加等；而且還 包括其功能性片段。在本發(fā)明中，這種抗體可稱為RANKL激動(dòng)劑抗體。可通過(guò)已知方法，獲 得呈多克隆抗體或單克隆抗體形式的抗RANKL抗體。優(yōu)選它是單克隆抗體。單克隆抗體的 實(shí)例包括雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體和宿主所產(chǎn)生的單克隆抗體，這樣的宿主是利用包含 抗體基因的表達(dá)載體，通過(guò)遺傳工程方法轉(zhuǎn)化而來(lái)的?？赏ㄟ^(guò)如下所述的已知方法制備能 產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。具體地講，這樣的雜交瘤可制備如下采用已知免疫接種方法， 使用膜結(jié)合RANKL或可溶性RANKL或其片段肽作為致敏抗原來(lái)進(jìn)行接種，通過(guò)通用細(xì)胞融 合方法，將所得免疫細(xì)胞與已知親本細(xì)胞融合，然后通過(guò)已知篩選方法來(lái)篩選產(chǎn)生單克隆 抗體的細(xì)胞。 一旦接種RANKL，在使用前，就可允許RANKL與載體蛋白結(jié)合，所述載體蛋白例
14如牛血清白蛋白(BSA)和匙孔蜮血藍(lán)蛋白(keyhole lympet haemocyanin)等?？墒褂玫膯?br> 克隆抗體是如下產(chǎn)生的重組單克隆抗體使用雜交瘤，對(duì)抗體基因進(jìn)行克隆，將所克隆的基 因摻入到合適載體中，然后通過(guò)基因重組技術(shù)將該載體引入宿主中(例如參見(jiàn)Vandamme， A. M.等，Eur. J. Biochem. 1990 ;192 :767-775)。在這種情況下，可將編碼抗體重鏈(H鏈) 和輕鏈(L鏈)的DNA分別摻入到表達(dá)載體中，同時(shí)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞?；蛘撸蓪⒕幋aH鏈和 L鏈的DNA摻入到一個(gè)表達(dá)載體中，以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(參見(jiàn)WO 94/11523)。同樣，也可使用 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，產(chǎn)生重組抗體。例如，可通過(guò)將抗體基因插入到編碼乳汁中特別產(chǎn)生的蛋白質(zhì) (例如山羊P-酪蛋白)的基因的非末端區(qū)內(nèi)，制備融合基因。將含有已插入抗體基因的 融合基因的DNA片段注射到山羊胚胎中，將由此得到的胚胎引入雌性山羊體內(nèi)。從引入胚 胎的山羊或其后代所生的轉(zhuǎn)基因山羊分泌的乳汁中，就可得到所需抗體(Ebert， K.M.等， Bio/Technology 1994 ;12 :699-702)。 本發(fā)明抗RANKL抗體的實(shí)例包括經(jīng)人工修飾而使例如針對(duì)人的異源抗原性水平 降低的基因重組抗體，例如嵌合抗體和人源化抗體。這類抗體的具體實(shí)例包括通過(guò)已知方 法產(chǎn)生的嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。嵌合抗體可按如下方式獲取獲取編碼抗體V區(qū) 的DNA，將該DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，將所得物摻入到表達(dá)載體中，然后將載體弓I 入宿主中，用于產(chǎn)生抗體。在某些情況下，人源化抗體可稱為重建(重塑)人抗體。通過(guò)將 非人類哺乳動(dòng)物抗體(例如小鼠抗體)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)， 而得到人源化抗體。這可通過(guò)已知方法而產(chǎn)生(參見(jiàn)EP 125023和W096/02576)。人抗體 C區(qū)用于嵌合抗體或人源化抗體的C區(qū)。例如，CYl、CY2、CY3或Cy4可用于H鏈，Ck 或CA可用于L鏈。此外，為了改進(jìn)抗體穩(wěn)定性或生產(chǎn)穩(wěn)定性，可修飾人抗體C區(qū)。
可通過(guò)將抗原給予經(jīng)引入例如人抗體基因座而得到的能產(chǎn)生人源抗體的轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物，獲取人抗體。這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)例包括小鼠。產(chǎn)生能產(chǎn)生人抗體的小鼠的方法可 參見(jiàn)W002/43478等。 抗RANKL抗體不僅包括完整抗體，而且包括其功能性片段。功能性抗體片段 相當(dāng)于抗體的一部分(部分片段)，其具有針對(duì)相關(guān)抗原的至少一種抗體作用。其具 體實(shí)例包括F(ab' )2、Fab' 、 Fab、 Fv、 二硫鍵連接的Fv、單鏈Fv (scFv)及其任何聚合 物 [D. J. King. ， Applicationsand Engineering of Monoclonal Antibodies. ，1998T. J.InternationalLtd]。 另外，當(dāng)使用單克隆抗體時(shí)，可使用一種類型的單克隆抗體。然而，也可使用識(shí)別 不同表位的兩種以上類型，例如2種、3種、4種或5種單克隆抗體。 可測(cè)定上述化合物是否具有促進(jìn)信號(hào)通過(guò)RANKL傳遞的激動(dòng)劑活性，即通過(guò)例如 將抗體給予能表達(dá)RANKL的成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞前體細(xì)胞或者具有類似于成骨細(xì)胞特征 的細(xì)胞(例如成肌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞)，使抗體作用于RANKL，然后檢測(cè)所述細(xì) 胞是否發(fā)生分化或增殖。可根據(jù)例如細(xì)胞堿性磷酸酶活性、鈣化等方面的增加，確定分化或 增殖的發(fā)生與否。 此外，當(dāng)將上述化合物給予動(dòng)物時(shí)，骨密度、骨礦物質(zhì)含量和骨表面積將會(huì)增 加。術(shù)語(yǔ)"骨密度"是指礦物質(zhì)組分(例如骨鈣)的數(shù)值密度。可通過(guò)PQCT(外周定量計(jì) 算機(jī)斷層掃描，使用外周骨X射線CT掃描儀(peripheral quantitative computerized tomography with aperipheral bone X-ray CT apparatus)) 、 SXA (單會(huì)g X身寸線吸收測(cè)量
15(singleenergy X-ray absorptiometry)) 、 DXA (雙會(huì)g X身寸線吸收測(cè)量(dual energyX-ray absorptiometry)，一種雙能X射線吸收方法)等，測(cè)定骨密度。此外，當(dāng)將以上化合物給予 動(dòng)物時(shí)，通過(guò)yCT對(duì)骨的三維結(jié)構(gòu)分析可證實(shí)海綿骨密度的增加。此外，通過(guò)測(cè)定海綿骨 小梁結(jié)構(gòu)可證實(shí)BV/TV(單位骨量骨體積/總的組織體積)、骨小梁寬度和骨小梁數(shù)量上 的增加。此外，當(dāng)將上述化合物給予動(dòng)物時(shí)，通過(guò)使用PQCT的骨形態(tài)學(xué)測(cè)量可證實(shí)皮質(zhì)骨 區(qū)骨密度的增加。 上述結(jié)果表明，該化合物作用于位于成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞前體細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì) 胞、基質(zhì)細(xì)胞和成肌細(xì)胞上的RANKL，使反向信號(hào)得以傳遞，導(dǎo)致對(duì)骨形成的促進(jìn)作用。本發(fā) 明的組合物在體外可增強(qiáng)骨形成，因此可用作研究用試劑?；蛘?，它可在體內(nèi)用作藥物組合 物。 本發(fā)明的藥物組合物可用作增強(qiáng)骨形成的藥物組合物。具體地講，它可用于治療 和預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病。這些骨代謝疾病的實(shí)例包括骨質(zhì)疏松癥、青少年骨質(zhì)疏 松癥、骨發(fā)育障礙、高鈣血癥、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)癥、骨軟化癥、骨質(zhì)缺乏、溶骨性骨病、骨壞 死、佩吉特病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、因骨關(guān)節(jié)炎引起的骨量減少、炎癥性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、糖皮 質(zhì)激素治療、轉(zhuǎn)移性骨病、牙周骨丟失、因癌癥引起的骨丟失、因衰老引起的骨丟失和其它 骨量減少相關(guān)疾病。 化合物的劑量將因癥狀、患者年齡和體重等不同而異。然而，對(duì)于成人口服給藥， 劑量通常為每天約0.01mg 1000mg?？砂磫蝿┝拷o藥或多劑量給藥形式進(jìn)行給藥。另外， 對(duì)于胃腸外給藥，可通過(guò)皮下注射、肌肉注射或靜脈內(nèi)注射給予約0. 01mg 1000mg的單劑 量。另外，對(duì)于給藥時(shí)間，可在動(dòng)脈硬化病的臨床癥狀已經(jīng)發(fā)展之前或之后給藥。
組合物可包括常用于制劑領(lǐng)域的載體、稀釋劑和賦形劑。例如乳糖、硬脂酸鎂等可 用作片劑的載體或賦形劑。可使用的注射用含水溶液的實(shí)例包括生理性鹽溶液以及含有葡 萄糖和其它輔助劑的等滲溶液。這種注射用含水溶液可與合適增溶劑例如醇、多元醇(例 如丙二醇)或非離子型表面活性劑聯(lián)用?？墒褂玫挠托匀芤旱膶?shí)例包括芝麻油和大豆油。 這樣的油性溶液可與增溶劑例如苯甲酸芐酯或苯甲醇聯(lián)用。 本發(fā)明的藥物組合物還可含有BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白；骨形成蛋白)家族成員，除 了含有促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化，從而誘導(dǎo)骨形 成，因而引起骨量增加等的化合物之外。 一個(gè)實(shí)例是這樣的化合物其作用于RANKL并促 進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟和鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因而 引起骨量增加等。也就是說(shuō)，將BMP家族成員和以下化合物聯(lián)用還可得到更好的效果所 述化合物作用于或不作用于RANKL并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增 殖、成熟或鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因而引起骨量增加等。具體地講，優(yōu)選將BMP家族成員 與肽D、肽E或抗RANKL抗體聯(lián)用。具體地講，本發(fā)明包括用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨 代謝疾病的藥物組合物，可將BMP家族成員與促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的 分化、增殖、成熟或鈣化的化合物(尤其是肽D、肽E或抗RANKL抗體)聯(lián)用，就可得到這樣 的藥物組合物。當(dāng)本發(fā)明的化合物與BMP家族成員聯(lián)用時(shí)，可制備同時(shí)含有這兩類物質(zhì)的 藥物制劑，用于給藥。或者，也可分別給予本發(fā)明化合物和BMP家族成員。具體地講，本發(fā) 明的藥物組合物包含BMP家族成員與促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增 殖、成熟或鈣化的化合物(尤其是肽D、肽E或抗RANKL抗體)的組合制劑。BMP家族成員的實(shí)例包括BMP-4、 BMP-2、 BMP-7和BMP_6。本發(fā)明的化合物與BMP家族成員相互作用，促 進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟和鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因而 引起骨量增加等。BMP成員的含量不受限制。然而，例如，其單劑量約為0.01mg 1000mg。
本發(fā)明還包括篩選化合物的方法，該化合物促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的 細(xì)胞的分化、增殖、成熟和鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因而引起骨量增加等。 一個(gè)實(shí)例是這樣的 化合物其作用于RANKL并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟和 鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因而引起骨量增加等。 對(duì)于篩選方法，將候選物給予成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞前體細(xì)胞或具有類似于成骨細(xì) 胞前體細(xì)胞特征的細(xì)胞(例如基質(zhì)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或成肌細(xì)胞)。然后，檢測(cè)候選化合 物是否促進(jìn)這些細(xì)胞的分化和增殖。例如，將候選化合物給予成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞前體細(xì)胞 或具有類似于成骨細(xì)胞前體細(xì)胞特征的細(xì)胞(例如基質(zhì)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或成肌細(xì)胞)， 所述細(xì)胞已表達(dá)RANKL。然后檢測(cè)候選化合物是否作用于RANKL并促進(jìn)這些細(xì)胞的分化和 增殖。可根據(jù)細(xì)胞堿性磷酸酶活性、細(xì)胞鈣化程度等方面的增加，判定分化或增殖的發(fā)生。 如果候選化合物促進(jìn)了分化或增殖，可判定該候選化合物就是能促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成 成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因而引起骨量增加等的化合 物。 一個(gè)實(shí)例是作用于RANKL并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成 熟或鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因而引起骨量增加等的化合物。 另外，當(dāng)將候選化合物給予小鼠(例如C57BL/6CrjCrlj)時(shí)，可通過(guò)檢查骨密度、 骨礦物質(zhì)含量、骨表面積等方面是否增加，而判定候選化合物是否是目標(biāo)化合物。在這種情 況下，目標(biāo)化合物就是這樣的化合物其促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、 增殖、成熟或鈣化，從而誘導(dǎo)骨形成，因而引起骨量增加等。 一個(gè)實(shí)例是這樣的化合物其作 用于RANKL并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化，從而誘 導(dǎo)骨形成，因而引起骨量增加等。 下面，參考以下實(shí)施例，進(jìn)一步詳述本發(fā)明，盡管本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限于此。
實(shí)施例1 :人間充質(zhì)干細(xì)胞的分化
試劑 合成肽用作實(shí)驗(yàn)試劑。合成肽D是含有SEQ ID NO :7所示氨基酸序列的肽，是由 9個(gè)氨基酸組成并含有通過(guò)二硫鍵彼此結(jié)合的2個(gè)半胱氨酸殘基的環(huán)肽。已經(jīng)報(bào)道合成肽 D與RANKL結(jié)合(Aoki等，JClin Invest 116:1525,2006)。作為對(duì)照肽，使用缺乏上述功
能的合成肽。
培養(yǎng)細(xì)胞 人間充質(zhì)干細(xì)胞購(gòu)自Cambrex Corporation Lonza生產(chǎn)的維持培養(yǎng)基用于繼代 培養(yǎng)。 人間充質(zhì)干細(xì)胞的分化 將人間充質(zhì)干細(xì)胞接種到96孔板(1 X 103細(xì)胞/孔)(Nunc)和48孔板(2. 4X 103 細(xì)胞/孔)(IWAKI)上。24小時(shí)后，從各板去除培養(yǎng)上清液，向其中加入成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo) 培養(yǎng)基(Lonza)。每隔3天或4天更換一次新培養(yǎng)基。 在此時(shí)，加入濃度為100 ii M的肽D (肽D處理組)。作為陰性對(duì)照，加入同樣濃度 的對(duì)照肽。
ALP (堿性磷酸酶)活性測(cè)定 分化后第7天，從各板去除培養(yǎng)上清液，細(xì)胞用丙酮/乙醇溶液固定。用磷酸對(duì)硝
基苯酯作為底物，測(cè)定ALP活性。具體地講，將含有磷酸對(duì)硝基苯酯(Nacalai) (lmg/mL)的
碳酸鹽緩沖液(5mM MgCl2，50mM NaHC03)加入到各孔(100iiL/孑L)中，再在37。C孵育。然
后用微量培養(yǎng)板閱讀器(BMG Labtech)在405nm處測(cè)定各孔的0D值。 在加入肽D (100 M)的人間充質(zhì)干細(xì)胞組中，在第7天，在分化培養(yǎng)基和維持培養(yǎng)
基內(nèi)，ALP活性顯著增加(

圖1)。另外，與對(duì)照組相比，在肽D處理組中觀察到以濃度依賴
性方式的ALP染色(圖2)。 實(shí)施例2 :人間充質(zhì)干細(xì)胞的鈣化 ALP染色 在分化期間，加入濃度為300iiM的肽D。在第7天，細(xì)胞用10%中性緩沖福爾馬 林溶液固定，接著用丙酮/乙醇溶液再次固定。 將按照下述組成而制備的染色液(500yL)加入到細(xì)胞中，再在37t:孵育10分鐘，
用水洗滌并干燥。(染色液的組成) 萘酚AS-MX磷酸鹽(SIGMA) : 5mg
N，N-二甲基甲酰胺(Wako) : 0. 5mL 0. 1M Tris-HCl(pH 8.5) : 50mL
堅(jiān)牢藍(lán)半鹽(SIGMA) : 30mg
茜素紅S染色 分化后第21天，細(xì)胞用PBS洗滌，再用10%中性緩沖福爾馬林溶液固定。
除去固定液后，細(xì)胞用水洗滌。向其中加入1X茜素紅S染色液(Nacalai) (150iiL)。將板在室溫下放置3分鐘。然后，棄去染色液，再用水洗滌并干燥。然后進(jìn)行顯 微鏡觀察。 按照與實(shí)施例1同樣的方式，培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞。將肽D(300iiM)加入到人間
充質(zhì)干細(xì)胞中。因此，無(wú)論是否誘導(dǎo)分化，在第21天觀察到強(qiáng)烈的茜素紅染色。這表明肽
D除了增加ALP活性之外，還誘導(dǎo)鈣化(圖3)。 實(shí)施例3 :小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系(MC3T3-E1)的分化 培養(yǎng)細(xì)胞 小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系MC3T3-E1(亞克隆號(hào)4)細(xì)胞購(gòu)自ATCC。
小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1) 將與10% FBS+ a MEM(GIBCO)混合的細(xì)胞接種到96孔板(8X 103細(xì)胞/孔)禾口 48 孔板(2乂104細(xì)胞/孔)上。48小時(shí)后，將各板的培養(yǎng)上清液更換為含有5mMI3-甘油磷酸 (SIGMA) 、 10 ii g/mL抗壞血酸鈉(SIGMA)的10% FBS+ a MEM。然后，每隔3天或4天更換一 次新培養(yǎng)基。作為對(duì)照，使用10XFBS+aMEM作為維持培養(yǎng)基培養(yǎng)MC3T3-El。 一旦更換培 養(yǎng)基后，就向各板中加入濃度為300iiM的肽。按照實(shí)施例1所述的方法，在第7天和第21 天進(jìn)行ALP活性測(cè)定和茜素紅S染色。
小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系的分化在加入肽D(300 ii M)的組中，在MC3T3-E1細(xì)胞分化后第7天，ALP活性顯著增加(圖4)。 肽D對(duì)鈣化的影響 在加入肽D (300 ii M)的組中，在MC3T3-E1細(xì)胞分化后21天，觀察到強(qiáng)烈的茜素紅 染色(圖5)。這表明肽D除了增加ALP活性之外，還誘導(dǎo)鈣化。這種現(xiàn)象不僅在分化培養(yǎng) 基中培養(yǎng)時(shí)、而且在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)都能觀察到。
實(shí)施例4 :小鼠成骨細(xì)胞的分化
試劑 為了實(shí)驗(yàn)，使用山羊多克隆mRANKL抗體(R&D， Saint Cruz)、單克隆mRANKL抗體 ((A):克隆88227 (R&D) ; (B):克隆12A668) (ALEXIS)和合成肽D。作為陰性對(duì)照，使用山羊 IgG(ZYMED)和對(duì)照肽。所用的合成肽D和對(duì)照肽與實(shí)施例1所用的相同。另外，作為陽(yáng)性 對(duì)照，使用300ng/mL BMP-2 (R&D)。按照實(shí)施例1所述，進(jìn)行ALP活性測(cè)定。
小鼠成骨細(xì)胞的收集 將新生小鼠顱蓋浸泡在酶溶液(0. 1%膠原酶(Wako) ，0. 2%分散酶(G0D0 SHUSEI CO. ， LTD.))中，再在37t:恒溫浴中振搖5分鐘。從中取出最初漂浮的細(xì)胞部分，再向其中 加入新的酶溶液(10mL)，再次在37t:恒溫浴中振搖IO分鐘。上述操作重復(fù)4次。每次都 收集漂浮的細(xì)胞溶液。將各次漂浮細(xì)胞溶液在250Xg離心5分鐘。將所得物懸浮在培養(yǎng) 基中，再在(A培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天或4天。用胰蛋白酶-EDTA溶液(Nacalai)收集細(xì)胞，再 用Cell Banker(Juji Kagaku(JujiField Inc.))冷凍保存。
小鼠成骨細(xì)胞的分化 使用10XFBS+aMEM，將所得小鼠成骨細(xì)胞接種在96孔板(0. 8X10V孔)上。當(dāng) 發(fā)生細(xì)胞貼壁后，在含有5mM P-甘油磷酸和10yg/mL抗壞血酸的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)細(xì)胞分 化。結(jié)果證實(shí)，到第7天，在分化培養(yǎng)基中，300iiM合成肽D引起ALP活化程度增加(圖6)。 一旦分化，就加入上述抗體(各lyg/mL)。在分化后第7天，在加入相應(yīng)因子的組中證實(shí) ALP活性顯著增加(圖7)。這種現(xiàn)象不僅在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞中、而且在維 持培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞中都能觀察到。也就是說(shuō)，與對(duì)照抗體相比，能結(jié)合RANKL 的多克隆抗體顯著誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞的分化。為了更詳細(xì)地證實(shí)抗體的作用，將不同濃度 的多克隆抗體加入到小鼠成骨細(xì)胞中，再在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。此時(shí)，抗RANKL單克隆 抗體A和抗RANKL單克隆抗體B用于檢測(cè)證實(shí)類似分化作用的可能性，同時(shí)也使用單克隆 抗體。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)抗RANKL多克隆抗體以濃度依賴性方式引起小鼠成骨細(xì)胞的ALP活性增 加，盡管觀察到某種程度的分散(圖8)。此外，抗RANKL單克隆抗體A和抗RANKL單克隆抗 體B的組合以類似方式引起小鼠成骨細(xì)胞ALP活性增加(圖8)。根據(jù)以上所述，發(fā)現(xiàn)小鼠 RANKL多克隆抗體和單克隆抗體可誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞的分化。
實(shí)施例5 :人成骨細(xì)胞的ALP活化作用 本實(shí)施例中所用的抗RANKL多克隆抗體和抗RANKL單克隆抗體等試劑與實(shí)施例4 所用的相同。另外，使用抗RANKL單克隆抗體((C):克隆12A380) (ALEXIS)、人OPGFc和人 RANKFc (R&D))。按照實(shí)施例1所述進(jìn)行ALP活性測(cè)定。所有上述抗體都是針對(duì)小鼠RANKL 的抗體。另外，已發(fā)現(xiàn)這些抗體與人RANKL交叉反應(yīng)并與之結(jié)合。
培養(yǎng)細(xì)胞 人成骨細(xì)胞購(gòu)自Cambrex Corporation專用培養(yǎng)基(Lonza)用于繼代培養(yǎng)。
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人成骨細(xì)胞的分化 將人成骨細(xì)胞接種在96孔板(3. 1 X 103/孔)和48孔板(7. 65 X 103/孔)中。當(dāng)
發(fā)生細(xì)胞貼壁后，使用含有5mM e-甘油磷酸的培養(yǎng)基進(jìn)行分化。 一旦分化，就加入抗體
(100ng/mL或Ing/mL)。培養(yǎng)進(jìn)行5天或6天，然后進(jìn)行ALP活性測(cè)定。抗RANKL多克隆抗體、抗RANKL單克隆抗體、肽D、 OPGFc和RANKFc引起人成骨細(xì)
胞ALP活性的顯著增加，證實(shí)了分化(圖9和圖10)。根據(jù)以上所述，發(fā)現(xiàn)針對(duì)小鼠RANKL
的多克隆抗體、單克隆抗體、OPGFc和RANKFc可誘導(dǎo)人成骨細(xì)胞的分化。 實(shí)施例6 :小鼠成肌細(xì)胞的分化 本實(shí)施例中所用的單克隆mRANKL抗體等試劑與實(shí)施例4所用的相同。按照實(shí)施 例1所述進(jìn)行ALP活性測(cè)定。
培養(yǎng)細(xì)胞(小鼠成肌細(xì)胞前體細(xì)胞系的)C2C12細(xì)胞購(gòu)自RIKEN。
小鼠成肌細(xì)胞的分化 將作為小鼠成肌細(xì)胞前體細(xì)胞的C2C12細(xì)胞接種在96孔板(6. 5X 103細(xì)胞/孔) 中。48小時(shí)后，將培養(yǎng)上清液更換為含有300ng/mL BMP-2 (R&D)的5% FBS+DMEM(SIGMA)。 在培養(yǎng)基更換期間，將抗體(lOOng/mL)加入其中，然后培養(yǎng)7天。證實(shí)單克隆mRANKL抗體 ((A)克隆88227 (R&D))引起小鼠成肌細(xì)胞ALP活性的顯著增加，導(dǎo)致分化為成骨細(xì)胞(圖 11)。作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明抗RANKL單克隆抗體單獨(dú)作用于具有成骨細(xì)胞前體細(xì)胞特性的小 鼠成肌細(xì)胞，從而誘導(dǎo)細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞。 實(shí)施例7 :肽D對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞的ALP活化作用RT-PCR分析
將人間充質(zhì)干細(xì)胞(3乂104細(xì)胞)接種在6孔板上，然后在成骨細(xì)胞分化培養(yǎng) 基(Lonza)或維持培養(yǎng)基(Lonza)存在下培養(yǎng)7天。將肽D (100 y M和300 y M)加入到 各孔中。此外，將肽溶劑加入到對(duì)照組中。培養(yǎng)后，細(xì)胞用PBS洗滌并溶于QIAzol Lysis Reagent (QIAGEN) (0. 75mL)中。然后，收集溶液。將溶液在室溫下放置5分鐘。然后，加入氯 仿(Wako) (0. 15mL)，通過(guò)上下顛轉(zhuǎn)而混合所得物，然后將所得物于4t:在12000Xg離心15 分鐘。將上清液收集到新管內(nèi)。用EZIRNA通用組織試劑盒(QIAGEN)和Magtration System 12GC (QIAGEN)，自上清液中分離出RNA。測(cè)定RNA濃度后，對(duì)各RNA (250ng)進(jìn)行1%瓊脂糖 凝膠電泳，以證實(shí)RNA是否降解。對(duì)未降解RNA(各500ng)進(jìn)行RT-PCR。用ThermoScript RT-PCR System(Invitrogen)和隨機(jī)引物進(jìn)行RT-PCR。 cDNA合成后，使用人堿性磷酸酶(hALP)和人I型膠原蛋白(hCollagen I)的特異 性引物進(jìn)行PCR。為了標(biāo)準(zhǔn)化，使用人GAPDH特異性引物進(jìn)行PCR。所用的PCR引物序列如 下所示。另夕卜，使用ExTaq Hot Start Version (Takara Bio Inc. ， Shiga, Japan)，在下述 條件下進(jìn)行PCR。使堿性磷酸酶(hALP)經(jīng)歷初次熱變性，在94t: 15分鐘，接著是28次循 環(huán)，在94°C 1分鐘，58°C 1分鐘和72°C 30秒，然后是72°C 10分鐘的延伸反應(yīng)。使I型膠原 蛋白(hCollagen I)經(jīng)歷初次熱變性，在94°C 15分鐘，接著是25次循環(huán)，在94°C 1分鐘， 58°C 1分鐘和72°C 30秒，然后在72°C 10分鐘的延伸反應(yīng)。使GAPDH經(jīng)歷初次熱變性，在 95°C 3分鐘，接著是28次循環(huán)，在95°C 10秒，60。C 15秒和68°C 1分鐘，然后是68°C 10分 鐘的延伸反應(yīng)。
PCR引物序列
hALP-F:5' -GGGGGTGGCCGGAAATACAT-3' (SEQ ID NO :8)hALP-R:5' -GGGGGCCAGACCAAAGATAGAGTT-3' (SEQ ID NO :9)hCollagenl-F :5， -ATTCCAGTTCGAGTATGGCG-3， (SEQ ID NO :10)hCollagenl-R :5， -TTTTGTATTCAATCACTGTCTTGCC-3' (SEQ ID NO :11)hGAPDH-F:5' -TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3' (SEQ ID NO :12)hGAPDH-R:5' -CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3' (SEQ ID NO :13) 將PCR反應(yīng)后所得到的樣品進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。在紫外光下用溴化乙錠證
實(shí)形成特定條帶(圖12A)。所得圖像用CSAnalyzer進(jìn)行分析。圖12B和圖12C顯示根據(jù)
GAPDH表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果。 在加入肽D (300 M)的人間充質(zhì)干細(xì)胞組中，在分化后第7天，在分化培養(yǎng)基和維持培養(yǎng)基內(nèi)，ALP活性都顯著增加。另外，在分化后第7天當(dāng)進(jìn)行細(xì)胞的ALP染色時(shí)，與對(duì)照組相比，在肽D處理組中證實(shí)以濃度依賴性方式發(fā)生ALP染色。然而，作為PCR分析結(jié)果，當(dāng)人間充質(zhì)干細(xì)胞在肽存在下分化7天后，證實(shí)堿性磷酸酶和I型膠原蛋白的表達(dá)水平以肽濃度依賴性方式增加(圖12A)。還是在維持培養(yǎng)基中，濃度為300 M的肽引起堿性磷酸酶和I型膠原蛋白的mRNA表達(dá)水平的增加(圖12B和圖12C)。
實(shí)施例8 :膜結(jié)合RANK導(dǎo)致C2C12分化成為成骨細(xì)胞 將與DMEM-5 % FBS混合的C0S1細(xì)胞接種在96孔板(10000細(xì)胞/孔)上，然后培養(yǎng)1天。然后，細(xì)胞用以下各種質(zhì)粒DNA來(lái)轉(zhuǎn)染經(jīng)QIAwell8質(zhì)粒純化試劑盒(Qiagen)純化的pSRa -EX1 (對(duì)照表達(dá)載體1) 、 pSRa -mRANK(小鼠RANK表達(dá)載體)和pCAGGS-mBMP-4 (小鼠BMP-4表達(dá)載體)，并使用FuGENE HD (Roche) (50ng/孔)。按照類似方式，將pCAGGS-mBMP-4 (0. 5ng)與pCAGGS (對(duì)照表達(dá)載體2) (24. 5ng)和pSR a -mRANK (25ng)混合在一起，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。作為對(duì)照，將pCAGGS-mBMP-4 (0. 5ng)與pCAGGS (24. 5ng)和pSRa-EXl(25ng)混合在一起，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。翌日，將C2C12細(xì)胞接種在C0S1板上進(jìn)行轉(zhuǎn)染(10000細(xì)胞/孔)，然后進(jìn)行培養(yǎng)。每隔3天用DMEM-2. 5% FBS更換培養(yǎng)基一次。1周后，從中去除培養(yǎng)基，然后加入混合物溶液(丙酮乙醇l : l)，進(jìn)行細(xì)胞固定。30秒后去掉固定液。將培養(yǎng)板干燥約30分鐘，其間制備ALP檢測(cè)液(5mM MgCl2， 40mMNaHC03， lmg/ml磷酸對(duì)硝基苯酯)并逐步加入到培養(yǎng)板中(每次加入100 Pi的量)，開(kāi)始反應(yīng)。60分鐘后，使用微量板閱讀器進(jìn)行測(cè)定(ABS :405nm)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)pSR a -mRANK引起ALP活性的顯著增加，因而表現(xiàn)出成骨細(xì)胞分化活性，盡管活性水平比作為陽(yáng)性對(duì)照的pCAGGS-mBMP-4所表現(xiàn)的更微弱(圖13)。另夕卜，當(dāng)pCAGGS-mBMP-4的比例降至1 %時(shí)，未觀察到pCAGGS-mBMP-4與作為對(duì)照表達(dá)載體的pSRa -EX1之間的顯著差異。然而，作為用pSR-a -mRANK同時(shí)轉(zhuǎn)染的結(jié)果，觀察到ALP活性的顯著增加(圖13)。此外，比單用pSRa-mRANK轉(zhuǎn)染而言，當(dāng)pCAGGS-mBMP-4的比例降至1 %時(shí)再與pSR a -mRANK同時(shí)轉(zhuǎn)染，觀察到ALP活性的更顯著增加(圖13)。這表明膜結(jié)合RANK與BMP-4協(xié)同作用。如上所述，膜結(jié)合RANK獨(dú)立誘導(dǎo)或與BMP-4協(xié)同誘導(dǎo)具有成骨細(xì)胞前體細(xì)胞特征的小鼠成肌細(xì)胞株的成肌細(xì)胞性C2C12細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞。 實(shí)施例9 :膜結(jié)合RANK導(dǎo)致ST2細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞(小鼠基質(zhì)細(xì)胞系的)ST2細(xì)胞購(gòu)自RIKEN。將與DMEM-5 % FBS混合的C0S1細(xì)胞接種在96孔板(10000細(xì)胞/孔)上，然后培養(yǎng)1天。然后，細(xì)胞用以下各種質(zhì)粒DNA
21來(lái)轉(zhuǎn)染經(jīng)QIAwell 8質(zhì)粒純化試劑盒(Qiagen)純化的pSRa -EX1 (對(duì)照表達(dá)載體1)和pSR a -mRANK (小鼠RANK表達(dá)載體)，并使用FuGENE HD (Roche) (50ng/孔)。翌日，將ST2細(xì)胞接種在C0S1板上進(jìn)行轉(zhuǎn)染(5000細(xì)胞/孔)并共同培養(yǎng)。另外，為了在ST2細(xì)胞中誘導(dǎo)RANKL表達(dá)，制備含有地塞米松(10—7M)和活化維生素D3 (10—8M)的系統(tǒng)，用于在ST2細(xì)胞中誘導(dǎo)RANKL表達(dá)，并制備不含這兩者的系統(tǒng)(缺乏對(duì)RANKL表達(dá)的誘導(dǎo))。3天后，將DMEM-2. 5% FBS加入其中。3天后，將培養(yǎng)基更換為DMEM-2. 5 % FBS。 l周后，去除培養(yǎng)基并將混合物溶液(丙酮乙醇l : 1)加入其中，進(jìn)行細(xì)胞固定。30秒后去掉固定液。將培養(yǎng)板干燥約30分鐘，其間制備ALP檢測(cè)液(5mM MgCl2，40mM NaHC03和lmg/ml磷酸對(duì)硝基苯酯)并逐步加入到培養(yǎng)板中(每次加入100iU的量)，開(kāi)始反應(yīng)。60分鐘后，使用微量板閱讀器進(jìn)行測(cè)定(ABS :405nm)。結(jié)果，僅在含有地塞米松(10—7M)和活化維生素D3 (10—8M)的系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)pSRa-mRANK引起ALP活性的顯著增加(RANKL誘導(dǎo))。在系統(tǒng)中，ST2細(xì)胞表現(xiàn)出成骨細(xì)胞分化活性(圖14A和圖14B)。如上所述，膜結(jié)合RANK獨(dú)立誘導(dǎo)(小鼠基質(zhì)細(xì)胞系的)的ST2細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞，所述ST2細(xì)胞具有成骨細(xì)胞前體細(xì)胞和脂肪細(xì)胞前體細(xì)胞的特征。該現(xiàn)象僅在使用ST2細(xì)胞誘導(dǎo)RANKL表達(dá)的情況下觀察到。這表明，膜結(jié)合RANK與經(jīng)誘導(dǎo)而在ST2細(xì)胞上表達(dá)的膜結(jié)合RANKL結(jié)合，使成骨細(xì)胞分化信號(hào)在ST2細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)遞。 實(shí)施例10 :破骨細(xì)胞體內(nèi)分化引起的成骨細(xì)胞的增殖和分化GST-RANKL的制備
通過(guò)PCR，將Sail位點(diǎn)和Notl位點(diǎn)加到編碼人RANKL殘基140-317的cDNA上。將內(nèi)切核酸酶用于克隆pGEX-4T-2谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的cDNA下游(GE healthcare ;Genbank檢索號(hào)U13854) 。 SEQ IDN0:14和SEQ ID NO :15分別代表GST融合蛋白編碼DNA的核苷酸序列和該蛋白的氨基酸序列，所述GST融合蛋白的氨基酸序列包含RANKL氨基酸序列位置140-317的氨基酸。當(dāng)使用IPTG(終濃度0. 5mM)，在BL21(DE3)大腸桿菌(Escherichia coli) (Invitrogen)中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)后，將細(xì)胞懸浮于提取緩沖液(50mMTris-HCl， pH 8. 0， lOOmM NaCl，lmM EDTA， ImM DTT和1X (v/v)TritonX-100)中，然后在4t:用超聲波儀破碎。在18000Xg離心15分鐘。然后，收集上清液并上樣到谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(S印harose)柱。隨后，用洗滌緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 8. 0， lOOmM NaCl，lmMDTT和O. 1% (v/v)TritonX-100)洗滌。然后，使用谷胱甘肽溶液(20mM還原型谷胱甘肽，50mM Tris-HCl和pH 8.0)進(jìn)行洗脫。通過(guò)濾器過(guò)濾后，測(cè)定經(jīng)SDS-PAGE純化的GST-RANKL的分子量和純度。分子量為47.0kDa，純度為95X以上。另外，通過(guò)鱟變形細(xì)胞裂解產(chǎn)物測(cè)定(limulusamebocyte lysate assay)，檢領(lǐng)lj內(nèi)毒素濃度為小于lEU/ug。
給予RANKL的試驗(yàn) 將57nmol (低劑量)或426nmol (高劑量)的GST-RANKL經(jīng)腹膜內(nèi)給予7周齡雌性C57BL/6N小鼠(各10只)，每24小時(shí)一次，共3次。在第3次給予后1. 5小時(shí)將小鼠處死后解剖(dissect)。為了進(jìn)行比較，給予PBS的組用作對(duì)照。 對(duì)處死后的每只小鼠都收集以下器官股骨、脛骨、大腦、肺、心、肝、胸腺、脾、腎和皮膚。通過(guò)對(duì)大腦、肺、心、肝、胸腺、脾、腎和皮膚進(jìn)行HE染色，觀察到天然發(fā)生的損傷。
骨形態(tài)學(xué)測(cè)量 作為骨形態(tài)學(xué)測(cè)量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)給予高劑量GST-RANKL結(jié)果導(dǎo)致單位骨量和骨小梁數(shù)量降至約50%。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞數(shù)增加。另外，在低劑量給予的情況下沒(méi)有觀察到這樣的降低(圖15、圖16和圖17)。 通過(guò)yCT測(cè)定股骨形態(tài)。結(jié)果，在高劑量GST-RANKL給予組中觀察到顯著的骨減少(圖18)。 對(duì)從各小鼠切取的大腦、肺、心、肝、胸腺、脾、腎和皮膚進(jìn)行HE染色并觀察。然而，
在任何組中都未觀察到異常發(fā)現(xiàn)和天然發(fā)生的損傷。 成骨細(xì)胞表面 作為給予高劑量GST-RANKL的結(jié)果，證實(shí)破骨細(xì)胞數(shù)增加，骨量降低和骨吸收。此外，當(dāng)檢查成骨細(xì)胞表面積時(shí)，發(fā)現(xiàn)它顯著增加(圖19)。這涉及因破骨細(xì)胞數(shù)增加和破骨細(xì)胞活化而增強(qiáng)的骨吸收能促進(jìn)骨形成的現(xiàn)象，表明存在骨吸收和骨形成的偶聯(lián)。人們認(rèn)為，在給予高劑量GST-RANKL的小鼠中，位于破骨細(xì)胞上的、在骨微環(huán)境中被增加和活化的RANK作用于成骨細(xì)胞上的RANKL，從而傳遞信號(hào)，用于分化、增殖、成熟或鈣化。
實(shí)施例11 :給予合成肽引起的體內(nèi)骨量增加試劑 用合成肽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。合成肽D是含有SEQ ID NO :7所示氨基酸序列的環(huán)肽，由9個(gè)氨基酸組成并含有通過(guò)二硫鍵彼此結(jié)合的2個(gè)半胱氨酸殘基。已經(jīng)報(bào)道合成肽D與RANKL結(jié)合(Aoki等，J Clin Investl16 :1525,2006)。將合成肽溶于10% DMSO(Nacalai)/PBS中，濃度lmg/ml。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6CrjCrlj小鼠購(gòu)自O(shè)riental Bio Service。所用小鼠是C57BL/6Cr jCrl j近親交配小鼠，其特征是因衰老而引起的細(xì)胞免疫力降低削弱(weakened expression)。先將小鼠在溫度23t: ±3"和濕度50% ±30%的環(huán)境下飼養(yǎng)1周。光照時(shí)間是8:00-20:00。
實(shí)驗(yàn)期間，所有小鼠都飼喂CR-LPF(Oriental Yeast Co. ， Ltd.)。
對(duì)照組(n = 5)和肽D處理組(n = 4)都籠養(yǎng)。
給藥方法和周期在8:00、14:00和20:00(每天3次)，皮下給予肽D，劑量為10mg/kg，共5天。將5X匿S0/PBS給予對(duì)照組。5天的給藥完成后12小時(shí)，處死小鼠并放血。然后，自各小鼠收集股骨和脛骨。各小鼠的全血在室溫下放置1小時(shí)，然后在5000rpm和4°C的條件下離心5分鐘。將血清收集在新管中。各小鼠的股骨和脛骨用冷70%乙醇固定。
骨密度分析 對(duì)乙醇固定的各股骨進(jìn)行單能X射線吸收測(cè)量(SXA)分析(DCS-600EX-IIIR DXA，對(duì)于動(dòng)物，ALOKA)，測(cè)定骨密度、骨礦物質(zhì)含量和骨表面積。將各骨的全長(zhǎng)劃分為20個(gè)區(qū)。測(cè)定各區(qū)的骨密度并分析肽在各區(qū)中的作用。 骨結(jié)構(gòu)分析和骨小梁結(jié)構(gòu)(trabecular structure)分析 使用外周定量計(jì)算機(jī)斷層掃描(在下文縮寫(xiě)為pQCT)和微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(在下文縮寫(xiě)為y CT)進(jìn)行骨結(jié)構(gòu)分析。Scan-Xmate-A080 (Comscantecno Co. ， Ltd.)用于ii CT， XCT-Research SA+(StratecMedizintechnik GmbH)用于pQCT。專用軟件(3D-B0N(RAT0C))使用y CT數(shù)據(jù)，用于制備三維結(jié)構(gòu)圖像和骨小梁結(jié)構(gòu)分析。另外，對(duì)于PQCT分析，測(cè)定骨密度在395mg/cm3以下的區(qū)域就是海綿骨，而測(cè)定骨密度在690mg/cm3以上的區(qū)域就是皮質(zhì)骨。 對(duì)每天3次、共給予5天肽D (10mg/kg)的各股骨進(jìn)行SXA分析，測(cè)定總骨礦物質(zhì)
23含量、骨表面積和骨密度。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)給予肽D導(dǎo)致骨礦物質(zhì)含量增加和骨密度顯著增加(p < 0. 05vs對(duì)照組)(圖20A 圖20C)。此外，作為SXA20分段分析對(duì)各區(qū)骨密度的測(cè)定結(jié)果證實(shí)，在自股骨遠(yuǎn)端的第6區(qū)至第9區(qū)中骨密度的顯著增加(p < 0. 05vs對(duì)照組)(圖21)。另外，作為PQCT對(duì)股骨密度分析結(jié)果，在位于距離股骨遠(yuǎn)端5mm的區(qū)域中證實(shí)皮質(zhì)骨密度的顯著增加(P < 0.05vs對(duì)照組)(圖22A)。作為厚度測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)外膜周的周長(zhǎng)(periadventitialcircumference)、夕卜膜內(nèi)的周長(zhǎng)(endoadventitial circumference)、骨礦物質(zhì)含量和區(qū)內(nèi)皮質(zhì)骨骨表面積、內(nèi)膜周長(zhǎng)(intimal circumference)縮短，表明皮質(zhì)骨的量向內(nèi)增加(圖22B)。 同時(shí)，對(duì)位于生長(zhǎng)板附近的海綿骨中豐富的干衝端區(qū)(metaphyseal region)進(jìn)行y CT三維結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給予肽D后，在位于距離股骨遠(yuǎn)端2mm位置的海綿骨含量增加(圖23)。因此，通過(guò)yCT，對(duì)海綿骨區(qū)進(jìn)行骨小梁結(jié)構(gòu)測(cè)定。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)海綿骨的BV/TV和骨小梁寬度增加(圖24A 圖24C)。 對(duì)于肽D對(duì)骨的作用而言，根據(jù)yCT的骨小梁結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)果，證實(shí)了骨吸收抑制作用，盡管觀察到微弱作用。然而，作為給予僅5天的結(jié)果，肽在干骺端區(qū)引起皮質(zhì)骨骨密度增加的原因，尚不能用上述骨吸收的微弱抑制來(lái)解釋。結(jié)果表明肽具有骨形成作用。
實(shí)施例12 :骨形態(tài)學(xué)測(cè)量 在將合成肽D給予小鼠的實(shí)施例11的實(shí)驗(yàn)中，在開(kāi)始給予合成肽D后第l天和第4天，將與2%碳酸(hydrogen carbonate) /乙醇水溶液混合的鈣黃綠素(Nacalai)經(jīng)腹膜內(nèi)給予各組各小鼠，劑量為0. 01mL/g(體重)，用于鈣黃綠素標(biāo)記。在從處死的各小鼠收集到的股骨中，將位于距離乙醇固定的股骨遠(yuǎn)端5mm的區(qū)域包埋在甲基丙烯酸甲酯(MMA)樹(shù)脂中，從而制備未脫鈣標(biāo)本。該區(qū)與以下區(qū)相同在實(shí)施例11的肽D處理組中，作為SXA分析結(jié)果，證實(shí)所述區(qū)的骨密度顯著增加。標(biāo)本進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，然后測(cè)定類骨質(zhì)表面積、成骨細(xì)胞表面積、骨鈣化表面積、鈣化率、骨形成率等。結(jié)果，在肽D處理組中觀察到鈣化率和骨形成率增加(圖25A和圖25B)。對(duì)肽D處理組進(jìn)行SXA分析和pQCT分析，證實(shí)皮質(zhì)骨密度顯著增加。這可能是因?yàn)?，作為給予肽的結(jié)果，鈣化率和骨形成率在體內(nèi)增加，引起皮質(zhì)骨密度增加。 實(shí)施例13 :對(duì)肽D引起ALP活性增強(qiáng)的作用機(jī)制的分析(信號(hào)分子的磷酸化)
將與10% FBS+ a MEM (SIGMA)混合的MC3T3-E1細(xì)胞接種在6孔板(7. 5X 104細(xì)胞/孑L)上。12小時(shí)后，從中去除培養(yǎng)基并向其中加入含有200iiM肽D或200ng/ml BMP-2的培養(yǎng)基。在相關(guān)附圖所示的各時(shí)間點(diǎn)去除培養(yǎng)基。將PBS加入到細(xì)胞中，用刮器(Falcon)收集細(xì)胞。通過(guò)于fC在1200rpm離心5分鐘得到細(xì)胞沉淀。將RIPA緩沖液(100 y L)加入到所收集的沉淀中，用于細(xì)胞膜的溶解。此外，所得物在4t:在14500rpm條件下離心25分鐘。收集上清液作為細(xì)胞提取物。 一部分細(xì)胞提取物用于定量測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(PIERCE)。對(duì)于SDS-PAGE，將相當(dāng)于細(xì)胞提取物1/4量的樣品緩沖液(Fermentas)加入其中，再在95。C加熱5分鐘。將所制備的7. 5 y g或10 y g樣品上樣到10%聚丙烯酰胺凝膠(BioRad)上，在170V電泳1小時(shí)。電泳后，在80mA進(jìn)行40分鐘，將電泳樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)上。將膜在封閉液(Nacalai)中在室溫下振搖1小時(shí)，然后將第一抗體加入其中，接著在室溫下振搖1小時(shí)，再在4t:振搖12小時(shí)。除去第一抗體溶液后，將膜洗滌3次，接著在含有第二抗體的封閉液中，在室溫下振搖1小時(shí)。除去第二抗體溶液后，將膜洗滌3次。用ECL plus(GE Healthcare Bioscience)進(jìn)行檢測(cè)。
另外，如下給出第一抗體和第二抗體的組合。 (1)第一抗體磷酸化p38抗體(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))；第二抗體HRP綴合的山羊抗兔IgG(Santa Cruz) (2)第 一 抗體P38抗體(Santa Cruz);第二抗體HRP綴合的山羊抗小鼠IgGl (SouthernBiotech) (3)第一抗體13 _肌動(dòng)蛋白抗體(Santa Cruz);第二抗體HRP綴合的山羊抗兔IgG(Santa Cruz) (4)第一抗體GSK3 a / p抗體(Santa Cruz);第二抗體HRP綴合的山羊抗小鼠IgG(SIGMA) (5)第一抗體磷酸化GSK3a/13抗體(細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))；第二抗體HRP綴合的山羊抗小鼠IgG (SIGMA) (6)第一抗體磷酸化smadl/5/8 (細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))；第二抗體HRP綴合的山羊抗兔IgG(Santa Cruz)。 通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)涉及主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的MAP激酶p38磷酸化，BMP-2和PTH作為已知的骨形態(tài)發(fā)生因子正是通過(guò)該途徑而誘導(dǎo)骨形成。結(jié)果，在加入肽D后12小時(shí)可檢測(cè)到顯著的p38磷酸化(圖26)。另外，也可檢測(cè)到在加入肽D后短時(shí)間內(nèi)發(fā)生p38磷酸化。然而，未觀察到顯著變化(圖27)。同時(shí)，在加入BMP-2作為對(duì)照后1小時(shí)，觀察到p38磷酸化。 其次，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的GSK3P磷酸化，Wnt正是通過(guò)該途徑起到骨形態(tài)發(fā)生因子的作用。證實(shí)在加入肽D后1小時(shí)和3小時(shí)誘導(dǎo)GSK3P磷酸化(圖28)。同樣，在加入BMP-2作為對(duì)照后1小時(shí)和3小時(shí)觀察到相似程度的GSK3 P磷酸化。 此外，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)用于信號(hào)傳遞途徑的Smadl/5/8磷酸化，BMP正是通過(guò)該途徑起到骨形態(tài)發(fā)生因子的作用。結(jié)果顯示在未受剌激的MC3T3-E1細(xì)胞中Smad發(fā)生磷酸化。在加入肽D后至少3小時(shí)內(nèi)沒(méi)有誘導(dǎo)Smadl/5/8磷酸化(圖29)。同時(shí)，在加入BMP-2作為對(duì)照后3小時(shí)，觀察到Smadl/5/8發(fā)生磷酸化。根據(jù)以上觀點(diǎn)，加入肽D后至少在3小時(shí)內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Smadl/5/8的活化沒(méi)有發(fā)生到與BMP-2活化相當(dāng)?shù)某潭?。然而，在加入肽D后12小時(shí)觀察到顯著的p38磷酸化，其程度大于在加入BMP-2后1小時(shí)所觀察到的磷酸化。因此表明肽D使用的信號(hào)明顯不同于BMP-2所用的信號(hào)。同時(shí)，在加入肽D后1小時(shí)和3小時(shí)觀察到GSK3 13磷酸化，其程度相當(dāng)于加入BMP-2所觀察到的那樣，表明肽D部分地使用類似于BMP-2所用的信號(hào)。 實(shí)施例14 :對(duì)由肽D引起的ALP活性增強(qiáng)機(jī)制的分析(抑制劑作用)
將與10% FBS+a MEM(SIGMA)混合的MC3T3-E1細(xì)胞接種在96孔板(1. 5X 104細(xì)胞/孔)上。12小時(shí)后，從中去除培養(yǎng)基并向其中加入含有SB203580p38抑制劑(Calbiochem)的培養(yǎng)基。此夕卜，在l小時(shí)后，向其中加入200iiM肽D或100ng/ml BMP-2，然后培養(yǎng)5天。然后，按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行ALP活性測(cè)定。結(jié)果，以SB203580濃度依賴性方式抑制由肽D引起的ALP活性增強(qiáng)。在濃度為1PM時(shí)觀察到顯著抑制，在濃度為lOyM時(shí)觀察到完全抑制(圖3Q)。另一方面，在BMP-2用作對(duì)照的情況下，在濃度為liiM時(shí)未觀察到對(duì)ALP活性增強(qiáng)的顯著抑制，在濃度為10 M時(shí)則觀察到微弱抑制效果。
同樣，加入作為Wnt拮抗劑的rhDkk-1 (R&D)，濃度為0. 25 y g/ml、0. 5 y g/ml和lyg/ml。 l小時(shí)后，向其中加入200iiM肽D，然后培養(yǎng)5天。然后，按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行ALP活性測(cè)定。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Dkk-1雖然弱但顯著地以濃度依賴性方式抑制ALP活性增強(qiáng)(圖31)。 另外，如上所述，加入作為BMP拮抗劑的BMPR-IA(R&D)，濃度為0. 25 ii g/ml和lyg/ml。 1小時(shí)后，向其中加入200iiM肽D或200ng/ml BMP_2，然后培養(yǎng)5天。然后，按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行ALP活性測(cè)定。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)BMPR-IA顯著抑制由肽D和BMP-2引起的ALP活性增強(qiáng)(圖32)。根據(jù)以上結(jié)果，肽D的作用很可能依賴于BMP誘導(dǎo)或細(xì)胞穩(wěn)定而自發(fā)產(chǎn)生的BMP。 實(shí)施例15 :對(duì)由肽D(肽D和BMP-2的協(xié)同作用)引起的ALP活性增強(qiáng)機(jī)制的分析 為了檢查肽D和BMP-2的協(xié)同效應(yīng)，使用C2C12細(xì)胞進(jìn)行ALP活性測(cè)定，在這類細(xì)胞中，ALP活性增強(qiáng)的發(fā)生依賴于BMP-2的加入。將與5% FBS+ a MEM (SIGMA)混合的C2C12細(xì)胞接種在96孔板(1乂104細(xì)胞/孔)上。6小時(shí)后，從中去除培養(yǎng)基。向其中分別加入含有50 ii M肽D的培養(yǎng)基、含有l(wèi)OOng/ml BMP-2的培養(yǎng)基、含有200ng/ml BMP-2的培養(yǎng)基以及含有50 M肽D和lOOng/ml BMP-2組合的培養(yǎng)基后培養(yǎng)6天。按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行ALP活性測(cè)定。結(jié)果，在僅含50 M肽D的培養(yǎng)基的情況下，未觀察到ALP活性增強(qiáng)作用。BMP-2以濃度依賴性方式增強(qiáng)ALP活性。同時(shí)，與只存在BMP-2的培養(yǎng)基相比，在含有50 ii M肽D禾P lOOng/mL BMP-2的培養(yǎng)基的情況下，證實(shí)ALP活性水平增加至少5倍(圖33)。這些結(jié)果支持以下論點(diǎn)實(shí)施例14所述的肽D的作用很可能依賴于BMP誘導(dǎo)或細(xì)胞穩(wěn)定而自發(fā)產(chǎn)生的BMP。源自成肌細(xì)胞株的C2C12細(xì)胞不同于源自成骨細(xì)胞株的MC3T3-E1細(xì)胞，因此在常規(guī)培養(yǎng)條件下，C2C12細(xì)胞中的ALP活性水平極低。當(dāng)C2C12細(xì)胞在加入BMP-2的情況下培養(yǎng)時(shí)，則會(huì)如本實(shí)施例所示地增強(qiáng)ALP活性，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞。在沒(méi)有BMP2的情況下，認(rèn)為C2C12細(xì)胞不響應(yīng)肽D。同時(shí)，如以上實(shí)施例所示，MC3T3-E1細(xì)胞表現(xiàn)出ALP活性的顯著增加，甚至在只加入肽D的情況下。這強(qiáng)烈表明肽D的作用依賴于BMP誘導(dǎo)或MC3T3-E1細(xì)胞中穩(wěn)定而自發(fā)產(chǎn)生的BMP。
此外，也檢查了 BMP-2和肽D對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的協(xié)同作用。將與10 %FBS+ a MEM (SIGMA)混合的MC3T3-E1細(xì)胞接種在96孔板(1. 5X 104細(xì)胞/孔)上。12小時(shí)后，從中去除培養(yǎng)基，在加入30ng/mLBMP-2和150 y M肽D的情況下進(jìn)行ALP活性測(cè)定。結(jié)果，肽D和BMP-2表現(xiàn)出對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性增強(qiáng)的附加作用(圖34)。
對(duì)ALP活性而言，BMP-2和肽D對(duì)C2C12細(xì)胞和MC3T3-E1細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)如圖33所示。另外，已經(jīng)報(bào)道，在C2C12細(xì)胞中RANKL表達(dá)水平增加，當(dāng)將BMP-2加入到細(xì)胞中時(shí)(Fujita等，Molecular Cancer 6:71,2007)。因此，當(dāng)加入BMP時(shí)，通過(guò)RT-PCR證實(shí)RANKL表達(dá)。 將C2C12細(xì)胞接種在96孔板(5X 103細(xì)胞/孔)上。在細(xì)胞貼壁后，將BMP-2加入其中，使其濃度為100ng/mL。 36小時(shí)后，將TRIZOL溶液(Invitrogen) (84 y L)加入到各孔中，進(jìn)行細(xì)胞裂解，由此進(jìn)行RNA提取。每組從6孔收集所得物，制備樣品。將氯仿(Wako)(0. lmL)加入到樣品中，劇烈地上下顛倒而混合，然后于4t:在12000Xg離心15分鐘。將上清液收集到新管內(nèi)。將異丙醇(Nacalai) (0. 25mL)加入其中，然后上下顛倒而混合。將所得物在室溫下放置10分鐘，于4t:在12000Xg離心10分鐘。從中去除上清液。然后，將70X乙醇(lmL)加入到其中，于4t:在12000Xg離心5分鐘。再次從中去除上清液。測(cè)定其RNA濃度，用2 ii g所得物進(jìn)行RT-PCR。使用ThermoScriptRT-PCR系統(tǒng)(Invitrogen)和隨機(jī)引物進(jìn)行RT-PCR。 cDNA合成之后，使用小鼠RANKL特異性引物進(jìn)行PCR。為了標(biāo)準(zhǔn)化，使用小鼠GAPDH特異性引物進(jìn)行PCR。所用PCR引物序列如下所示。用ExTaq Hot StartVersion (Takara Bio Inc. ， Shiga, Japan)，在下述條件下進(jìn)行PCR。 使小鼠RANKL經(jīng)歷初次熱變性，在94°C 2分鐘，接著是35次循環(huán)，在94°C 20秒，60°C 20秒和72°C 40秒，然后是72°C 10分鐘的延伸反應(yīng)。使GAPDH經(jīng)歷初次熱變性，在95°C 3分鐘，接著是25次循環(huán)，在95°C 10秒，60。C 15秒和68°C 1分鐘，然后是68°C 10分鐘的延伸反應(yīng)。mRANKL-F:5' -GGCAAGCCTGAGGCCCAGCCATTT-3' (SEQ ID NO :17)
mRANKL-R:5' -GTCTCAGTCTATGTCCTGAACTTT-3' (SEQ ID NO :18)
mGAPDH-F:5' -CACCATGGAGAAGGCCGGGG—3' (SEQ ID NO :19)
mGAPDH-R:5' -GACGGACACATTGGGGGTAG-3' (SEQ ID NO :20) 結(jié)果，證實(shí)在C2C12細(xì)胞中RANKL表達(dá)水平增加，當(dāng)將BMP-2加入到細(xì)胞中時(shí)(圖35)。結(jié)果表明，BMP-2作用于C2C12細(xì)胞，促進(jìn)RANKL表達(dá)，因而支持肽D對(duì)RANKL的作用。
實(shí)施例16 :對(duì)肽D和肽E的活性比較 在肽D上取代一個(gè)氨基酸，制備肽E (SEQ ID NO : 16)。測(cè)定TRAP活性和ALP活性，比較肽D和肽E對(duì)引起破骨細(xì)胞分化和成骨細(xì)胞分化的作用。將與10% FBS+a MEM(SIGMA)混合的RAW264細(xì)胞接種在96孔板(2Xl(f細(xì)胞/孔)上。證實(shí)細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為含有10nM GST-RANKL(Oriental Yeast Co. ，Ltd.)的10% FBS+a MEM。將肽D和肽E分別加入其中，濃度為25iiM、50iiM、100iiM和200 y M，然后培養(yǎng)4天。培養(yǎng)終止后，將100 y L丙酮/乙醇加入到各孔中，進(jìn)行細(xì)胞固定，然后通風(fēng)干燥30分鐘。 為了得到濃度為1. 5mg/mL的TRAP溶液緩沖液，使用50mM檸檬酸緩沖液并加入0. 2M酒石酸鈉溶液(體積為檸檬酸緩沖液的1/10)調(diào)節(jié)磷酸對(duì)硝基苯酯(Nacalai)，制備溶液。將所得TRAP溶液緩沖液加入到各孔中，加入量為100iiL，再在37t:孵育45分鐘。然后，將IN NaOH溶液(50iiL)加入其中，終止反應(yīng)。按照實(shí)施例1同樣的方式，使用微量培養(yǎng)板閱讀器(BMG Labtech)在405nm處測(cè)定各孔的OD值。 此外，比較肽D和肽E對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞中的ALP活性增強(qiáng)作用。肽D和肽E的使用濃度為25 ii M、50 ii M、 100 ii M和200 y M，在實(shí)施例14所述的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，然后按照實(shí)施例1所述的方法測(cè)定ALP活性。 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)肽D和肽E都抑制TRAP活性并以濃度依賴性方式增強(qiáng)ALP活性(圖36和圖37)。對(duì)于TRAP活性而言，與肽E相比，在濃度為lOOiiM和200 y M時(shí)，肽D表現(xiàn)出顯著抑制作用(圖36)。另外，對(duì)于ALP活性而言，與肽E相比，在濃度為50yM和100yM時(shí)，肽D表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)作用(圖37)。當(dāng)在達(dá)到幾乎相同作用的濃度下比較肽D和肽E時(shí)，發(fā)現(xiàn)單個(gè)氨基酸取代導(dǎo)致TRAP活性抑制作用降至原先水平的一半。同樣，ALP活性增強(qiáng)作用降至原先水平的約1/4。已經(jīng)知道，這樣的單個(gè)氨基酸取代導(dǎo)致肽D對(duì)sRANKL的親和力水平降至原先水平的約1/3(Aoki等，J Clin Invest 116:1525,2006)。上述結(jié)果表明，肽D
27作用于RANKL，從而表現(xiàn)出對(duì)破骨細(xì)胞中TRAP活性的中和作用并表現(xiàn)出對(duì)成骨細(xì)胞中ALP活性的促進(jìn)作用。 實(shí)施例17 :對(duì)由肽D與RANKL敲減引起的ALP活性增加機(jī)制的分析
BMP-2和肽D對(duì)C2C12細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)如圖33所示。在這一點(diǎn)上，當(dāng)加入BMP-2時(shí)，證實(shí)C2C12細(xì)胞中RANKL表達(dá)水平增加(圖35)。然后，使用RNAi stealth,在MC3T3-E1細(xì)胞中進(jìn)行RANKL敲減，以便檢查肽D對(duì)ALP活性的增強(qiáng)作用和RANKL敲減的影響。將OPTiMEM(Invitrogen) (20 ii L)禾口 RNA-stealth select (tnfrsf 11) (Invitrogen) (1. 2pmol)在各孔中輕輕混合。5分鐘后，將LipofectamineRNAiMAX (Invitrogen) (0. 2 ii L)加入其中，將各所得物在室溫下放置20分鐘。此外，將MC3T3-E1細(xì)胞接種到各孔(4Xl(f細(xì)胞)中，然后在(A培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。從中去除培養(yǎng)液，將含有200iiM肽D或200ng/ml BMP-2的a MEM加入其中，再培養(yǎng)5天。然后，按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行ALP活性測(cè)定。另外，對(duì)于3類RANKL(TNFRSF11) (KD)陰性對(duì)照，使用Stealth RNAi陰性通用對(duì)照(Invitrogen)進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)?；厥毡匾康募?xì)胞，并通過(guò)實(shí)施例7所述的方法從中提取mRNA。然后，通過(guò)RT-PCR，使用SEQ ID N0:17和SEQ ID NO : 18所示引物，證實(shí)RANKL敲減。當(dāng)用對(duì)照1和對(duì)照2作為陰性對(duì)照來(lái)分別比較KD1和KD2時(shí)，發(fā)現(xiàn)RANKL mRNA水平以特定方式顯著降低，而GAPDH mRNA水平卻不受影響(圖38)。在RANKL敲減組(包括KD1和KD2兩種情況)中，當(dāng)加入肽D時(shí)，ALP活性增強(qiáng)程度顯著降低。這表明RANKL起到肽D受體的作用(圖38)。另外，在MC3T3-E1細(xì)胞中，僅由BMP-2引起的ALP活性增強(qiáng)并不受RANKL敲減的影響。
這些結(jié)果表明，肽D作用于成骨細(xì)胞和能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞(例如成骨細(xì)胞前體細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和成肌細(xì)胞)，從而增強(qiáng)BMP的作用或與BMP聯(lián)合起作用，因而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。另外，也表明在某些細(xì)胞例如C2C12細(xì)胞中，BMP促進(jìn)RANKL表達(dá)，從而與肽D聯(lián)合起作用。 實(shí)施例18 :合成肽D的純化方法對(duì)ALP活性增加的影響 —般而言，純化合成肽D含有三氟乙酸鹽(TFA)。因此，已經(jīng)考慮到合成肽D濃度增加將會(huì)引起對(duì)細(xì)胞的損傷。就以上觀點(diǎn)而言，合成肽D中的三氟乙酸鹽用乙酸鹽或鹽酸鹽來(lái)替代。所得產(chǎn)物用于下述實(shí)驗(yàn)，以使所獲得的肽表現(xiàn)出低毒性和高ALP活性。用大腸桿菌制備的BMP-2 (R&D)和未用鹽進(jìn)行任何替代的合成肽D(50iiM和150 yM)用作陽(yáng)性對(duì)昭。 將與10% FBS+aMEM(SIGMA)混合的MC3T3-E1細(xì)胞(小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞)接種在96孔板(2乂104細(xì)胞/孔)上。細(xì)胞貼壁后，從中除去培養(yǎng)基，然后在加入50yM和150iiM肽D(乙酸鹽和鹽酸鹽)的情況下進(jìn)行ALP活性測(cè)定。加入用大腸桿菌制備的50ng/mL BMP-2 (R&D)、由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的BMP-2 (R&D)、由NSO細(xì)胞產(chǎn)生的BMP-4 (R&D)和合成月太D (50 ii M禾P 150 ii M) (TFA鹽)，作為陽(yáng)性對(duì)照。另外，CHO細(xì)胞表達(dá)的BMP-2的ED50值為40-200ng/mL。大腸桿菌表達(dá)的BMP-2的ED50值為0. 3-1. 0 y g/mL。在加入各因子(theindividualfactors)后第5天，除去培養(yǎng)上清液，使用實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行ALP活性測(cè)定。結(jié)果，在MC3T3-E1細(xì)胞中，呈乙酸鹽形式的肽表現(xiàn)出ALP活性增強(qiáng)作用的最高水平(圖39A)。同時(shí)，在呈鹽酸鹽形式的肽D情況下，卻未觀察到這樣的高活性水平。如上所述，發(fā)現(xiàn)所用鹽的差異影響了這樣的活性，甚至當(dāng)合成肽含有共有氨基酸序列時(shí)。
其次，檢查了呈乙酸鹽形式的合成肽D和BMP-2對(duì)ALP活性的協(xié)同效應(yīng)。將與10%FBS+a MEM(SIGMA)混合的MC3T3-E1細(xì)胞(小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞)接種在96孔板(2X 104細(xì)胞/孔)上。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞貼壁后，從中除去培養(yǎng)基，在5ng/mL BMP-2 (由CHO細(xì)胞產(chǎn)生)與6. 25 ii M、 12. 5 ii M、25 ii M、50 ii M和100 y M合成肽D混合的情況下測(cè)定ALP活性。在加入各因子后第5天，除去培養(yǎng)上清液，按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行ALP活性測(cè)定。結(jié)果，證實(shí)了 ALP活性的增加，并且它們依賴于呈乙酸鹽形式的合成肽D的劑量(圖39B)。
在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，也檢查了呈乙酸鹽形式的合成肽D與BMP-4(R&D)的協(xié)同效應(yīng)。將與10% FBS+a MEM(SIGMA)混合的MC3T3-E1細(xì)胞(小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞)接種在96孔板(2乂104細(xì)胞/孔)上。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞貼壁后，從中除去培養(yǎng)基，再將100iiM呈乙酸鹽形式的合成肽D加入到2ng/mL BMP-4中。在加入各因子后第5天，除去培養(yǎng)上清液，按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行ALP活性測(cè)定。 作為同時(shí)加入合成肽D和BMP-4的結(jié)果，證實(shí)ALP活性顯著增加。證實(shí)呈乙酸鹽形式的合成肽D不僅在BMP-2的情況下，而且在BMP-4的情況下都表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)(圖39C)。
上述結(jié)果表明，在合成肽D純化時(shí)，使用乙酸鹽、而非引起細(xì)胞損傷的三氟乙酸鹽(TFA)，可極大地誘導(dǎo)ALP活性。同樣，對(duì)于ALP活性增強(qiáng)能力，使用替代為乙酸鹽的合成肽D組合可表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，而且這樣的情況不僅包括BMP-2，而且包括BMP-4。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中決定使用呈乙酸鹽形式的肽D。 實(shí)施例19 :對(duì)RANKL抗體的ALP活性增強(qiáng)機(jī)制的分析(RANKL抗體和BMP-2的協(xié)同效應(yīng)) 為了實(shí)驗(yàn)，使用單克隆mRANKL抗體((A):克隆88227 (R&D);和(B):克隆12A668 (ALEXIS))、對(duì)照抗體(Oriental Yeast Co. ， Ltd.)和單克隆mRANKL抗體#22 (克隆IKK22/5)禾P #36(克隆IKK36/12)。 抗體#22禾P抗體#36是由Ko Okumura教授(School of Medicine, JuntendoUniversity)轉(zhuǎn)讓的。這些抗體描述于Biochemical andBiophysicalResearch Communication 2006 ;347， 124-132。使用替代為乙酸鹽的合成肽D。由哺乳動(dòng)物細(xì)胞(CHO細(xì)胞)(R&D)產(chǎn)生的BMP-2 (用于C2C12細(xì)胞)和由大腸桿菌表達(dá)的BMP-2 (R&D)(用于小鼠成骨細(xì)胞)用作BMP-2，用于添加。制造商的使用說(shuō)明介紹說(shuō)，由哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的BMP-2的活性比由大腸桿菌產(chǎn)生的BMP-2的活性強(qiáng)約10倍。在加入各因子之后第5天除去培養(yǎng)上清液，然后按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行ALP活性測(cè)定。
為了檢查單克隆RANKL抗體和BMP-2的協(xié)同效應(yīng)，使用C2C12細(xì)胞進(jìn)行ALP活性測(cè)定，在這類細(xì)胞中，對(duì)ALP活性增強(qiáng)的誘導(dǎo)依賴于BMP-2的加入。將與5 %FBS+ a MEM (SIGMA)混合的C2C12細(xì)胞接種在96孔板(1 X 104細(xì)胞/孔)上。6小時(shí)后，從中去除培養(yǎng)基。向其中分別加入含有O. 3ii g/mL單克隆RANKL抗體的培養(yǎng)基、含有50ng/mlBMP-2 (在CHO細(xì)胞中表達(dá)(R&D))的培養(yǎng)基以及含有單克隆RANKL抗體與50ng/ml BMP-2組合的培養(yǎng)基。在加入各因子后第6天，從中除去各培養(yǎng)上清液，然后按照實(shí)施例l所述的方法進(jìn)行ALP活性測(cè)定。結(jié)果，在分別只含0. 3 g/mL單克隆抗體A、 B或#22的每種培養(yǎng)基中，觀察到顯著的ALP活性增強(qiáng)作用。另外，在分別含有單克隆抗體A或B并加入BMP-2的每種培養(yǎng)基中觀察到ALP活性的顯著增加(圖40)。 用小鼠成骨細(xì)胞作進(jìn)一步檢查。將與10% FBS+a MEM (SIGMA)混合的小鼠成骨細(xì)胞接種在96孔板(8Xl(f細(xì)胞/孔)上。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞貼壁后，從中除去培養(yǎng)基，然后在0. 3-3 ii g/mL RANKL抗體的情況下或在RANKL抗體與50ng/mL BMP-2 (在大腸桿菌中表達(dá)
29(R&D))混合的情況下，進(jìn)行ALP活性測(cè)定。在加入各因子后第4天，從中除去各培養(yǎng)上清液，然后按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行ALP活性測(cè)定。結(jié)果，在小鼠成骨細(xì)胞中，使用濃度為3 ii g/mL的單克隆抗體A和濃度為0. 3 y g/mL的單克隆抗體B，證實(shí)ALP活性的少量而顯著的增加。在對(duì)照抗體(Oriental Yeast Co. ， Ltd.)用作陰性對(duì)照的情況下，未觀察到這樣的作用。另外，在單克隆抗體#36和#22的情況下，在濃度為0. 3 ii g/mL和3 y g/mL時(shí)，證實(shí)ALP活性的顯著增加(圖41)。此外，在所有上述單克隆抗體的情況下，證實(shí)了 BMP-2和單克隆RANKL抗體對(duì)ALP活性的協(xié)同作用(圖42)。如上所述，在小鼠成骨細(xì)胞中，用于實(shí)驗(yàn)的所有抗RANKL單克隆抗體都表現(xiàn)出ALP活性增強(qiáng)作用，盡管增強(qiáng)程度因抗體的不同而異。另外，抗體表現(xiàn)出與BMP-2的協(xié)同ALP活性增強(qiáng)作用。 實(shí)施例20 :GST-RANKL的作用與肽D (乙酸鹽)和BMP-2協(xié)同效應(yīng)的關(guān)系 將BMP-2和呈乙酸鹽形式的肽D同時(shí)加入到MC3T3-E1細(xì)胞中，導(dǎo)致ALP活性增強(qiáng)
的協(xié)同效應(yīng)。檢查了加入GST-RANKL對(duì)這樣的ALP活性增強(qiáng)的影響。 使用實(shí)施例19所述的RANKL抗體。所用的GST-RANKL和GST是由Oriental YeastCo. ，Ltd生產(chǎn)的。另外，使用BMP-2 (由CHO細(xì)胞產(chǎn)生)(R&D)。使用替代為乙酸鹽的合成肽D。 將與10% FBS+aMEM(SIGMA)混合的MC3T3-E1細(xì)胞(小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞)接種在96孔板(2乂104細(xì)胞/孔)上。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞貼壁后，從中去除培養(yǎng)基。為了更換，將含有100 ii M呈乙酸鹽形式的肽D的培養(yǎng)基、含有100 ii M呈乙酸鹽形式的肽D與5ng/mLBMP-2混合的培養(yǎng)基以及含有肽D與BMP-2混合物的培養(yǎng)基(其中已加入lOOnM GST-RANKL或GST)加入其中。在加入各因子后第5天，除去各培養(yǎng)上清液，然后按照實(shí)施例l所述的方法進(jìn)行ALP活性測(cè)定。結(jié)果，在MC3T3-E1細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GST-RANKL能顯著抑制肽D (乙酸鹽)和BMP-2對(duì)ALP活性增強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)(圖43)。同時(shí)，在加入GST的組中未觀察到顯著程度的抑制。這些結(jié)果表明，肽D作用于MC3T3-E1細(xì)胞上表達(dá)的RANK,從而引起ALP活性增強(qiáng)。認(rèn)為GST-RANKL對(duì)細(xì)胞膜上的RANKL具有拮抗性，因此抑制肽D的活性。
實(shí)施例21 :在肽D或RANKL抗體處理的小鼠成骨細(xì)胞中的增殖反應(yīng)
在實(shí)施例19和實(shí)施例20中描述了可觀察ALP活性增強(qiáng)作用，當(dāng)同時(shí)加入肽D或RANKL抗體和BMP-2時(shí)。檢查了能表現(xiàn)出與BMP-2有協(xié)同效應(yīng)的肽D和RANKL抗體，看它們?cè)谛∈蟪晒羌?xì)胞中是否會(huì)誘導(dǎo)增殖反應(yīng)。 使用替代為乙酸鹽的合成肽D。另外，使用BMP-2 (在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生)(R&D)。
將與10% FBS+ a MEM (SIGMA)混合的小鼠成骨細(xì)胞接種在96孔板(2X 103細(xì)胞/孔)上。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞貼壁后，從中除去培養(yǎng)基。將含有100iiM肽D(乙酸鹽)的培養(yǎng)基、含有實(shí)施例19所述的任一種RANKL抗體(3 y g/mL)的培養(yǎng)基和含有任一種上述因子并與5ng/mLBMP-2混合的培養(yǎng)基分別加入其中。72小時(shí)培養(yǎng)后，將WST-1 (Roche)加入其中，加入量為各培養(yǎng)基的1/10，再在37t:孵育3小時(shí)。然后，使用微量培養(yǎng)板閱讀器(BMG Labtech)測(cè)定各孔的OD值(450nm)(參考波長(zhǎng)595nm)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論BMP-2是否存在，肽D和RANKL抗體B都能促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞增殖(圖44)。然而，肽D表現(xiàn)出微弱作用，而其它RANKL抗體(#22、 #36和A)則不表現(xiàn)出增殖促進(jìn)作用。 根據(jù)以上所述，發(fā)現(xiàn)存在著能促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞增殖的抗RANKL單克隆抗體和不能促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞增殖的抗RANKL單克隆抗體，這取決于這些抗體所識(shí)別的表位的差異。同時(shí)，如實(shí)施例19所述，發(fā)現(xiàn)甚至是不能促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞增殖的抗RANKL單克隆抗體在小鼠成骨細(xì)胞中也可表現(xiàn)出ALP活性增強(qiáng)作用；也就是說(shuō)，分化促進(jìn)作用。簡(jiǎn)而言之，可通過(guò)適當(dāng)選擇能識(shí)別不同表位的抗RANKL單克隆抗體來(lái)引起成骨細(xì)胞的增殖或分化。
實(shí)施例22 :肽D對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的作用機(jī)制的分析(DNA微陣列)
將與10%FBS+aMEM(SIGMA)混合的MC3T3-E1細(xì)胞接種在10cm皿(2乂105細(xì)胞/孔)上。12小時(shí)后，從中除去培養(yǎng)基。將含有200iiM肽D(乙酸鹽)或150ng/ml BMP-2 (在大腸桿菌中產(chǎn)生(R&D))的培養(yǎng)基加入其中。在12小時(shí)和96小時(shí)除去部分培養(yǎng)基，在此時(shí)將TRIZOL溶液(Invitrogen) (3mL)加入到各孔中，進(jìn)行細(xì)胞裂解。然后，通過(guò)實(shí)施例15所述的方法進(jìn)行總RNA的提取。對(duì)每次提取的總RNA(2 y g)進(jìn)行DNA微陣列分析(MouseGenome 4302. OAffymetrix)。另外，使用基因芯片掃描儀3000 (GeneChip Scanner 3000，Affymetrix 690036)進(jìn)行掃描，并用基因芯片操作軟件(Gene Chip Operating Software,1.4版)進(jìn)行數(shù)字化。 結(jié)果，在加入肽D后12小時(shí)，發(fā)現(xiàn)IRS-1、 IGF-1、 FGF受體2、 PDGF受體P 、 PDGF受體a 、CTGF和I型膠原蛋白a 1鏈和I型膠原蛋白a 2鏈的基因表達(dá)水平顯著增加(圖45)。此夕卜，在96小時(shí)后，IGF-2、ALP、BMP-4、0C(骨鈣蛋白)、FGF2、PDGFc、PDGF a禾PPDGFP的基因表達(dá)水平顯著增加(圖46)。已知I型膠原蛋白、ALP和骨鈣蛋白都是成骨細(xì)胞標(biāo)記。在實(shí)施例7中，肽D引起人間充質(zhì)干細(xì)胞中I型膠原蛋白和ALP的基因表達(dá)水平增加。然而，同樣在MC3T3-E1細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因的表達(dá)水平也增加。此外，已知作為晚期成骨細(xì)胞分化標(biāo)記的骨鈣蛋白(0C)基因的表達(dá)水平急劇增加。因此，認(rèn)為肽D使MC3T3-E1細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞。 實(shí)施例23 :根據(jù)通過(guò)RT-PCR的DNA陣列分析的證實(shí) 使用DNA微陣列，在發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出增加的表達(dá)信號(hào)的基因中，對(duì)已知作為成骨細(xì)胞標(biāo)記的堿性磷酸酶(ALP)、I型膠原蛋白(Coll)和骨f丐蛋白(0C)的基因進(jìn)行RT-PCR，用于證實(shí)。對(duì)實(shí)施例22中收集的各基因的總RNA (2 ii g)進(jìn)行RT-PCR。用ThermoScript RT-PCRSystem (Invitrogen)和隨機(jī)引物進(jìn)行RT-PCR。 cDNA合成后，使用小鼠堿性磷酸酶(mALP)、小鼠I型膠原蛋白a 1 (mColI)和小鼠骨鈣蛋白(mOC)的特異性引物進(jìn)行PCR。為了標(biāo)準(zhǔn)化，使用小鼠GAPDH特異性引物進(jìn)行PCR。所用的PCR引物序列如下所示。用Ex Taq Hot Start Version (Takara Bio Inc., Shiga,Japan)，在下述條件下進(jìn)行PCR。使堿性磷酸酶(mALP)經(jīng)歷初次熱變性，在95°C 3分鐘，接著是28次循環(huán)，在95°C 10秒，6(TC 15秒和68°C 1分鐘，然后是68°C 10分鐘的延伸反應(yīng)。使I型膠原蛋白al(mColI)經(jīng)歷初次熱變性，在93t:3分鐘，接著是20次循環(huán)，在94t:30秒，58t: 30秒和72t: 15秒，然后是72t: IO分鐘的延伸反應(yīng)。使骨鈣蛋白(mOC)經(jīng)歷初次熱變性，在95 °C 3分鐘，接著是28次和30次循環(huán)，在94。C 30秒，58 。C 30秒和72°C 15秒，然后是72°C 10分鐘的延伸反應(yīng)。使GAPDH經(jīng)歷初次熱變性，在95°C 3分鐘，接著是20次循環(huán)，在94°C 10秒，58t: 15秒和68°C 1分鐘，然后是68°C 10分鐘的延伸反應(yīng)。
PCR引物序列 mALP-F:5' -CCAAGCAGGCTCTGCATGAA-3， (SEQ ID NO :21)
mALP-R:5' -GCCAGACCAAAGATGGAGTT-3' (SEQ ID NO :22)
mOC-F:5' -TCTGACAAAGCCTTCATGTCC—3' (SEQ ID NO :23)
m0C-R:5' -AAATAGTGATACCATAGATGCG-3' (SEQ ID NO :24)
mColl-F:5' -CCTGGTAAAGATGGTGCC—3' (SEQ ID NO :25)
mColl-R:5' -CACCAGGTTCACCTTTCGCACC-3' (SEQ ID NO :26)
mGAPDH-F:5' -CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3' (SEQ ID NO :19)
mGAPDH-R:5' -GACGGACACATTGGGGGTAG-3' (SEQ ID NO :20) 對(duì)各反應(yīng)溶液的一部分進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后用溴化乙錠溶液染色。結(jié)果，就DNA微陣列分析結(jié)果而言，證實(shí)肽D和BMP-2引起ALP、Co11和OC的基因表達(dá)水平顯著增加(圖47A)。將各對(duì)照的基因表達(dá)水平指定為l，將各表達(dá)強(qiáng)度數(shù)字化并創(chuàng)建圖。結(jié)果，與通過(guò)DNA微陣列分析證實(shí)的結(jié)果相比，更能明確地觀察到基因表達(dá)水平的顯著增加(圖47B)。
因此，也根據(jù)通過(guò)RT-PCR而觀察到的基因表達(dá)水平的變化，證實(shí)肽D能引起MC3T3-E1細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞。 實(shí)施例24 :給予合成肽，對(duì)骨形成標(biāo)記進(jìn)行體內(nèi)分析試劑 在本實(shí)驗(yàn)中使用替代為乙酸鹽的合成肽D。將合成肽D溶于PBS中，濃度lmg/mL。
將PBS給予對(duì)照組。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6CrjCrlj小鼠購(gòu)自KITAYAMA LABES Co. ，Ltd。所用小鼠是C57BL/6CrjCrl j近親交配小鼠，其特征是它們經(jīng)歷因衰老而引起的細(xì)胞免疫力降低削弱。先將小鼠在溫度23°C ±3"和濕度50% ±30%的環(huán)境下飼養(yǎng)1周。光照時(shí)間是8:00-20:00。
實(shí)驗(yàn)期間，所有小鼠都飼喂MF (Oriental Yeast Co. ， Ltd.)。
對(duì)照組(n = 6)和肽D處理組(n = 7)都籠養(yǎng)。
給藥方法和周期 在8:00、 14:00和20:00 (每天3次)，皮下給予合成呈乙酸鹽形式的肽D，劑量為10mg/kg，共5天。將PBS給予對(duì)照組。5天的給藥完成后12小時(shí)，處死小鼠并放血。然后，自各小鼠收集股骨和脛骨。各小鼠的全血在室溫下放置1小時(shí)，然后在5000rpm和4t:的條件下離心5分鐘。將血清收集在新管中。各小鼠的股骨和脛骨用冷70%乙醇固定。從各脛骨上小心除去肌肉等。然后，各脛骨用PBS洗滌并用剪刀剪切成lmm的碎片，然后用液氮冷凍。將TRIZOL溶液(Invitrogen) (lmL)加入到各冷凍脛骨中，然后用Polytron勻漿。按照實(shí)施例7所述的方法進(jìn)行總RNA的提取。將每種所得的總RNA樣品溶于DEPC水(50iiL)中。按照實(shí)施例7所述的方法，對(duì)自各小鼠提取的總RNA(500ng)進(jìn)行RT-PCR。使用ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen)和隨機(jī)引物進(jìn)行RT-PCR。
cDNA合成后，正如實(shí)施例23的情況一樣，使用小鼠堿性磷酸酶(mALP)、小鼠I型膠原蛋白al鏈(mCollagen a I)和小鼠骨鈣蛋白(mOC)的特異性引物進(jìn)行PCR。為了標(biāo)準(zhǔn)化，使用小鼠GAPDH特異性引物進(jìn)行PCR。 PCR條件與實(shí)施例23所用的相同。變性循環(huán)次數(shù)為對(duì)于mOC， 23次循環(huán)；對(duì)于mCollagen a I， 20次循環(huán)；和對(duì)于mALP， 28次循環(huán)。在mGAPDH數(shù)據(jù)的情況下，次數(shù)為23次循環(huán)。對(duì)PCR反應(yīng)后所得樣品進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳。使用溴化乙錠，在紫外光下證實(shí)特定條帶的形成。所得圖像用CSAnalyzer分析并根據(jù)GAPDH表達(dá)水平而標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果，在肽D處理組中觀察到各因子表達(dá)水平的增加(圖48)。根據(jù)以上所述，在小鼠骨組織的情況下，也證實(shí)了給予肽D引起成骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因的表達(dá)。
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實(shí)施例25 :肽D對(duì)小鼠脛骨的作用機(jī)制的分析(DNA微陣列) 自實(shí)施例24所述各小鼠脛骨中提取的總RNA (2 P g)，用于DNA微陣列(每組n =
2)。按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行DNA微陣列分析(MouseGenome 4302. OAffymetrix)。另外，使用基因
芯片掃描儀3000(Affymetrix 690036)進(jìn)行掃描，并用基因芯片操作軟件(1.4版)進(jìn)行數(shù)
字化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與標(biāo)準(zhǔn)樣品相比，在肽D處理組的小鼠脛骨樣品中，0C、ALP、1型膠原蛋白
a 2鏈(CoLl a 2)、血小板衍生生長(zhǎng)因子C(PDGFc)肽、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFRP )
和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)表現(xiàn)出明顯更高的信號(hào)(圖49)。不僅在加入肽D的小鼠成骨
細(xì)胞前體細(xì)胞中，而且在給予肽D的小鼠脛骨中，都證實(shí)骨形態(tài)發(fā)生因子(例如OC和ALP)
的增加，表明肽D在體內(nèi)也可增強(qiáng)骨形成。 實(shí)施例26 :證實(shí)2 :通過(guò)RT-PCR的DNA陣列分析 按照實(shí)施例23，對(duì)ALP、 CoLl和OC進(jìn)行RT-PCR，使用DNA微陣列得到證實(shí)數(shù)據(jù)。為了得到更詳細(xì)證實(shí)數(shù)據(jù)，對(duì)各種不同生長(zhǎng)因子及其受體進(jìn)行RT-PCR，從而通過(guò)DNA微陣列分析，使用得自實(shí)施例23的MC3T3-E1細(xì)胞的各組cDNA，確認(rèn)信號(hào)增加。
按照實(shí)施例23所述的方法合成各cDNA。合成后，使用小鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(mBMP-4)、小鼠結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(mCTGF)、小鼠血小板衍生生長(zhǎng)因子(mPDGFc肽)及其受體(mPDGFRI3)、小鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(mFGF2)及其受體(mFGFR2)、胰島素樣生長(zhǎng)因子2(mlGF-2)和胰島素受體底物(mIRS-l)的特異性引物進(jìn)行PCR。為了標(biāo)準(zhǔn)化，使用小鼠GAPDH特異性引物進(jìn)行PCR。所用的PCR引物序列如下所示。用Ex Taq Hot StartVersion (Takara Bio Inc. ， Shiga, J即an)，在下述條件下進(jìn)行PCR。使BMP-4經(jīng)歷初次熱變性，在95。C3分鐘，接著是31次循環(huán)，在95。C 10秒，58。C 15秒和72°C 30秒，然后是68°C 10分鐘的延伸反應(yīng)。使CTGF經(jīng)歷初次熱變性，在95°C 3分鐘，接著是31次循環(huán)，在95°C 10秒，58°C 15秒和72°C 30秒，然后是72°C 10分鐘的延伸反應(yīng)。使FGF2經(jīng)歷初次熱變性，在95°C 3分鐘，接著是34次循環(huán)，在95°C 10秒，58。C 15秒和72°C 30秒，然后是72°C 10分鐘的延伸反應(yīng)。使FGFR2經(jīng)歷25次循環(huán)的熱變性(95°C 10秒，58°C 15秒和72°C 30秒)和72°C 10分鐘的延伸反應(yīng)。使IGF-2經(jīng)歷31次循環(huán)的熱變性(95°C 10秒，58" 15秒和72°C 30秒)和72°C 10分鐘的延伸反應(yīng)。使PDGFc肽、PDGFRP和IRS-1經(jīng)歷23次循環(huán)的熱變性(95°C 10秒，58°C 15秒和72°C 30秒)和72°C 10分鐘的延伸反應(yīng)。使GAPDH經(jīng)歷初次熱變性，在95°C 3分鐘，接著是20次循環(huán)，在94°C 10秒，58。C 15秒和68°C 1分鐘，然后是6『C IO分鐘的延伸反應(yīng)。對(duì)各反應(yīng)溶液的一部分進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，然后用溴化乙錠溶液染色。 因此，根據(jù)DNA微陣列分析所得結(jié)果，使用MC3T3-E1細(xì)胞，證實(shí)加入肽D能引起IRS1、 PDGFRP 、 PDGFc、 FGFR2、 FGF2、 CTGF、 BMP-4和IGF-2的基因表達(dá)水平的顯著增加，正如0C、 ALP和Coll的情況一樣(圖50A)。將各對(duì)照的基因表達(dá)水平指定為l，將表達(dá)強(qiáng)度數(shù)字化并創(chuàng)建圖。結(jié)果，與通過(guò)DNA微陣列分析證實(shí)的結(jié)果相比，更能明確地觀察到IRS-1和PDGFRP的基因表達(dá)水平的顯著增加(圖50B)。對(duì)于其它因子，得到與DNA微陣列分析的情況下所得到的類似的結(jié)果。 根據(jù)以上所述，認(rèn)為肽D作用于成骨細(xì)胞，其方式使得由肽D剌激的成骨細(xì)胞自身產(chǎn)生細(xì)胞因子(例如PDGFRP 、 PDGFc、 IGF-1、 IGF-2、 FGF2、 CTGF和BMP-4和一組生長(zhǎng)因子)，并且還產(chǎn)生一組細(xì)胞因子的受體(例如PDGFRP和FGFR2)和生長(zhǎng)因子，導(dǎo)致以自分泌方式促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化、增殖和骨形成。生理上的反向信號(hào)從RANK通過(guò)RANKL而傳遞給與破骨細(xì)胞接觸的成骨細(xì)胞，以自分泌/旁分泌方式引起鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。這不僅導(dǎo)致對(duì)接觸破骨細(xì)胞的成骨細(xì)胞的分化、增殖和骨形成的促進(jìn)作用，而且導(dǎo)致對(duì)存在于破骨細(xì)胞附近的成骨細(xì)胞的促進(jìn)作用。
PCR引物序列mBMP-4-F:5' -ATGAGGGATCTTTACCGGCT-3' (SEQ ID NO :27)
mBMP-4-R:5' -TTTATACGGTGGAAGCCCTG-3' (SEQ ID NO :28)
mCTGF-F:5' -AGTGTGCACTGCCAAAGATG-3' (SEQ ID NO :29)
mCTGF-R:5， -GGCCAAATGTGTCTTCCAGT-3， (SEQ ID NO :30)
mFGF2-F:5' -AAGCGGCTCTACTGCAAGAA-3' (SEQ ID NO :31)
mFGF2-R:5' -TCGTTTCAGTGCCACATACC-3' (SEQ ID NO :32)
mFGFR2-F:5' -CTTTGGCCTGGCCAGGGATATCAAC-3' (SEQ ID NO :33)
mFGFR2-R:5' -CCAACTGCTTGAATGTGGGTCTCT-3' (SEQ ID NO :34)
mIGF2-F:5， -CCCGCTGTTCGGTTTGCATAC-3， (SEQ ID NO :35)
mlGF2-R:5' -ACGGTTGGCACGGCTTGAAG-3' (SEQ ID NO :36)
mlRSl-F:5' -AGCGTAACTGGACATCACAGCAG-3' (SEQ ID NO :37)
mlRSl-R:5' -CGGTGTCACAGTGCTTTCTTGTTG-3， (SEQ ID NO :38)
mPDGFRP-F:5' -GTCTGGTCTTTTGGGATCCTACTCT-3' (SEQ ID NO :39)
mPDGFRP-R:5' -CTCCTCATCTACCTGCTGGTACT-3' (SEQ ID NO :40)
mPDGFc-F:5' -CTGATTCGGTACCTAGAGCCAGAT-3' (SEQ ID NO :41)
mPDGFc-R:5' -CTGTCCTCTTTAGCTCTTCCCGT-3' (SEQ ID NO :42)
mGAPDH-F:5， -CACCATGGAGAAGGCCGGGG—3， (SEQ ID NO :19)
mGAPDH-R:5， -GACGGACACATTGGGGGTAG—3， (SEQ ID NO :20)
實(shí)施例27 :Fc融合肽的產(chǎn)生 使用EcoRV和BglII (TOYOBO)對(duì)pFUSE-hlgGl-Fc2表達(dá)載體(Invivogen)進(jìn)行限制酶處理。使用1%瓊脂糖凝膠(Wako)進(jìn)行電泳。從凝膠上切下DNA片段，然后使用MagExtractor (TOYOBO)對(duì)片段進(jìn)行純化。同時(shí)，對(duì)插入部分進(jìn)行退火(95°C 5分鐘)并冷卻至25°C (每次循環(huán)溫度都降低1°C )，使用寡核苷酸PDFl-F(SEQ ID NO :43) 、 PDFl-R(SEQID NO :44) 、PAF1-F(SEQ ID NO :45)禾PPAF1-R(SEQ IDNO :46)，從而合成了兩種不同的雙鏈DNA(PDF和PAF1)。制備PAF1 (是含有SEQ ID NO :47所示氨基酸序列的肽A的插入DNA)作為PDF1的陰性對(duì)照，PDF1是含有肽D的插入DNA。載體經(jīng)過(guò)限制酶處理，使用LigationMighty Mix(TAKARA)將兩種不同插入序列在16。C連接1小時(shí)。將所得物的一部分(5 y L)轉(zhuǎn)化到DH5a (Invitrogen)中。在含有零霉素(Invitrogen)的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。用Mini Pr印Kit(BioRad)純化所得菌落。對(duì)各質(zhì)粒進(jìn)行限制酶處理和序列分析，以證實(shí)目標(biāo)質(zhì)粒。SFQ ID NO :50和SEQ ID NO :51分別代表Fc融合肽D(肽D和Fc的融合蛋白)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :52和SEQ ID NO :53分別代表Fc融合肽D (肽A和Fc的融合蛋白)的核苷酸序列和氨基酸序列。PDF1-F :CTACTGCTGGAGCCAGTACCTGTGCTACGGTGGAGGTGGTAGCG(SEQID NO :43)
PAF1-F :CTACTGCGCTGCAGCTGCAGCTTGCTACGGTGGAGGTGGTAGCG(SEQID NO :45)
PAF1-R :GATCCGCTACCACCTCCACCGTAGCAAGCTGCAGCTGCAGCGCAGTAG(SEQ ID NO :46)
YCAAAAACY(SEQ ID NO :47)
實(shí)施例28 :Fc融合肽D的ALP活性增強(qiáng)能力 將COS-1細(xì)胞接種到10cm皿(各2 X 106細(xì)胞)中。將表達(dá)Fc融合肽D的質(zhì)粒、表達(dá)Fc融合肽A的質(zhì)粒和在實(shí)施例27中制備的pFUSE-hlgGl-Fc2載體(各5 y g)轉(zhuǎn)染到COS-1細(xì)胞中(使用FuGENEHD (Roche)) 。 8小時(shí)后，將各培養(yǎng)基都更換為OptiMEM(GIBCO)(lOmL)后培養(yǎng)72小時(shí)?；厥崭髋囵B(yǎng)上清液并于4t:以2000rpm離心5分鐘以除去雜質(zhì)，例如死細(xì)胞。然后，使用濃縮濾器(Amicon)濃縮各培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的Fc融合肽。在各培養(yǎng)上清液中Fc融合肽D(SEQ IDNO :50)和Fc融合肽A(SEQ ID NO :52)的產(chǎn)生和Fc的產(chǎn)生，都通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定相應(yīng)大小(約30KDa)的條帶而得以證實(shí)。 將所得Fc融合肽D、 Fc融合肽A和Fc對(duì)照用a MEM稀釋。將稀釋液加入到已接種MC3T3-E1細(xì)胞(2乂104細(xì)胞/孔)的96孔板(Nunc)上，然后進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第5天，按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行ALP活性測(cè)定。結(jié)果證實(shí)Fc融合肽D引起ALP活性增強(qiáng)至顯著程度(圖51)。同時(shí)，在加入Fc融合肽A的組或在加入Fc對(duì)照的組中，卻未觀察到這樣的ALP活性增強(qiáng)作用。上述結(jié)果表明，將肽D與Fc融合而得到的Fc融合肽D能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，正如在肽D的情況下一樣。
實(shí)施例29 :合成肽D的純化方法對(duì)TRAP活性的影響
檢測(cè)實(shí)施例18中產(chǎn)生的肽D鹽替代品對(duì)TRAP活性的影響。 將與10% FBS+a MEM(SIGMA)混合的RAW264細(xì)胞接種在96孔板(2X 103細(xì)胞/孔)上。發(fā)生細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為含有5nMGST-RANKL(Oriental Yeast Co. ，Ltd.)的10% FBS+a MEM。將濃度為25 y M和100 y M的呈TFA形式的肽D、呈乙酸鹽形式的肽D和呈鹽酸鹽形式的肽D分別加入其中，然后培養(yǎng)4天。培養(yǎng)完成后，將丙酮/乙醇(lOOiiL)加入到各孔中，進(jìn)行細(xì)胞固定，然后通風(fēng)干燥30分鐘。按照實(shí)施例16所述的方法進(jìn)行TRAP活性測(cè)定。結(jié)果證實(shí)濃度為25 i！ M的呈TFA鹽形式的肽D具有顯著TRAP活性抑制作用。然而，證實(shí)替代為乙酸鹽或鹽酸鹽的肽D卻沒(méi)有這樣的抑制作用。另外，濃度為lOOyM的呈TFA鹽形式的肽D具有顯著高抑制作用。同時(shí)，證實(shí)呈乙酸鹽形式的肽D具有顯著抑制作用，然而，所述抑制作用卻比呈TFA形式的肽D的作用更微弱(圖52)。另外，證實(shí)呈鹽酸鹽形式的肽D對(duì)TRAP活性抑制沒(méi)有作用，甚至當(dāng)其濃度為100 ii M時(shí)。如圖39A所示，也證實(shí)，對(duì)于破骨細(xì)胞形成抑制活性而言，使用不同鹽會(huì)影響活性水平，甚至在共有氨基酸序列存在時(shí)。證實(shí)了呈鹽酸鹽形式的肽D既沒(méi)有成骨細(xì)胞分化活性，又沒(méi)有破骨細(xì)胞形成抑制活性。然而，與呈TFA形式的肽D相比，證實(shí)了呈乙酸鹽形式的肽D具有更高的成骨細(xì)胞分化活性和更低的破骨細(xì)胞形成抑制活性。這些結(jié)果表明，可通過(guò)修飾(例如取代)來(lái)分別控制肽D的兩種活性(即成骨細(xì)胞分化活性和破骨細(xì)胞形成抑制活性)。也可產(chǎn)生僅具有成骨細(xì)胞分化活性的修飾肽D或僅具有破骨細(xì)胞形成抑制活性的修飾肽D。
實(shí)施例30 :對(duì)各種RANKL抗體中和能力的檢測(cè) 為了檢測(cè)具有ALP活性增強(qiáng)能力的RANKL抗體的功能，檢測(cè)了各種RANKL抗體中和RANKL破骨細(xì)胞形成活性的能力。在此使用小鼠單克隆RANKL抗體(#22、 #36、 A和B)。將與10% FBS+a MEM(SIGMA)混合的RAW264細(xì)胞接種在96孔板(2X 103細(xì)胞/孔)上。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為含有5nM小鼠sRANKL(P印roTechEC，Ltd)的10%FBS+ a MEM。將各種RANKL抗體(1 y g/mL)分別加入其中，然后培養(yǎng)4天。培養(yǎng)完成后，將丙酮/乙醇(lOOiiL)加入到各孔中，進(jìn)行細(xì)胞固定，然后通風(fēng)干燥30分鐘。按照實(shí)施例16所述的方法進(jìn)行TRAP活性測(cè)定。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)抗體#22和抗體B具有TRAP活性抑制作用，而另一方面，發(fā)現(xiàn)抗體ft36和抗體A沒(méi)有中和活性(圖53)。相比之下，抗體ft36和抗體A顯著促進(jìn)RANKL破骨細(xì)胞形成活性。這可能是因?yàn)檫@些抗體當(dāng)與其結(jié)合時(shí)，引起sRANKL的結(jié)構(gòu)變化，致使sRANKL形成三聚體，因而當(dāng)sRANKL與位于RAW264細(xì)胞上的RANK結(jié)合時(shí)促進(jìn)RANK成簇，導(dǎo)致對(duì)破骨細(xì)胞形成的促進(jìn)作用。
實(shí)施例31 :GST融合肽的制備 正如實(shí)施例27的情況 一 樣，使用寡核苷酸GPDl-F(SEQ ID NO :48)和GPDl-R(SEQ ID NO :49)制備包含肽D編碼序列和接頭序列并具有添加在其兩端的EcoRI和BamHI限制酶位點(diǎn)的插入DNA。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，使用內(nèi)切核酸酶，將插入DNA克隆到pGEX-4T-2 (GEhealthcare ;Genbank檢索號(hào)U13854)谷胱甘肽S_轉(zhuǎn)移酶下游。SEQ IDNO :54和SEQ ID NO :55分別代表GST融合肽D的核苷酸序列和氨基酸序列，該GST融合肽D是肽D與GST的融合蛋白。DH5a (Invitrogen)用于轉(zhuǎn)化。按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)所得的陽(yáng)性克隆，然后使用IPTG(終濃度0.5mM)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。然后，將細(xì)胞懸浮在提取緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 8. 0， lOOmM NaCl，lmM EDTA， ImM DTT和1X (v/v)TritonX-100)中，再使用超聲波儀，在冰上進(jìn)行勻漿。所得物在18000Xg離心15分鐘。回收上清液并用于上樣到谷胱甘肽瓊脂糖凝膠柱上。然后，該柱用洗滌緩沖液(50mM Tris-HCl， pH 8. 0， lOOmMNaCl，lmM DTT和O. 1% (v/v) TritonX-100)洗滌，再用谷胱甘肽溶液(12mM還原型谷胱甘肽，50mM Tris-HCl和pH 8.0)洗脫。洗脫后，用磷酸緩沖液(PBS)進(jìn)行透析。對(duì)純化的GST融合肽D進(jìn)行SDS-PAGE，以確認(rèn)其分子量。分子量約為27kDa。 GST融合肽D用0. 22- y m濾器(Pall Corporation)過(guò)濾除菌，然后用于下述實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例32 :抗人RANKL單克隆抗體的制備 按照標(biāo)準(zhǔn)方法，用含有人RANKL胞外結(jié)構(gòu)域(aal40-317)的GST-RANKL (OrientalYeast Co. ，Ltd.)來(lái)免疫小鼠，從而制備雜交瘤。所制備的雜交瘤在DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(含有4. 5g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺)+10% FBS中培養(yǎng)，再通過(guò)有限稀釋而克隆。然后，選擇6個(gè)不同雜交瘤，回收每個(gè)雜交瘤的培養(yǎng)上清液。每個(gè)回收培養(yǎng)上清液各自通過(guò)O. 22-ym濾器(Pall Corporation)過(guò)濾，然后用于上樣到蛋白G瓊脂糖凝膠柱(GE healthcare)上。其后，該柱用PBS洗滌?？贵w用洗脫緩沖液(0. lM甘氨酸-HCl，pH 2. 7)洗脫。另外，洗脫下來(lái)的抗體立即用中和緩沖液(1M Tris-HCl，pH 9.0)中和，再用PBS透析，然后用0. 22-y m濾器過(guò)濾除菌。經(jīng)SDS-PAGE證實(shí)抗體的L鏈和H鏈條帶后，使用分光光度計(jì)，根據(jù)A280的吸光度求出濃度。 實(shí)施例33 :抗人RANKL單克隆抗體中和能力的檢測(cè) 為了評(píng)論ALP活性增強(qiáng)能力與RANKL抗體中和能力之間的偶然關(guān)系(casualrelationship)，檢測(cè)了實(shí)施例32中制備的抗人RANKL單克隆抗體對(duì)RANKL破骨細(xì)胞形成能力的中和活性影響。使用克隆4G4、克隆7H12和克隆lOCll。將與10% FBS+ a MEM (SIGMA)混合的RAW264細(xì)胞接種在96孔板(2Xl(f細(xì)胞/孔)上。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為含有5nM人sRANKL (P印roTech EC，Ltd)的10% FBS+a MEM。將0. 0625 ii g/mL、0. 25 ii g/mL和liig/mL抗人RANKL單克隆抗體分別加入其中，然后培養(yǎng)4天。培養(yǎng)完成后，將丙酮/乙醇(100i!L)加入到各孔中，進(jìn)行細(xì)胞固定，然后通風(fēng)干燥30分鐘。按照實(shí)施例16所述的方法進(jìn)行TRAP活性測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用濃度為1 y g/mL時(shí)，10C11具有顯著TRAP活性抑制作用。然而，當(dāng)使用濃度為0. 25 ii g/mL和0. 0625 y g/mL時(shí)，10C11卻沒(méi)有表現(xiàn)出這樣的抑制作用(圖54)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)7H12在各濃度時(shí)都具有強(qiáng)烈中和能力；另一方面，證實(shí)4G4沒(méi)有中和作用。 實(shí)施例34 :GST融合肽D和抗人RANKL單克隆抗體對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化的作用
將人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC ;Lonza)接種在96孔板(Nunc) (2X 103細(xì)胞/孔)上。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的制備方法是將100nM地塞米松(SIGMA) 、10mM BGP (SIGMA)和50 ii g/mL抗壞血酸加入到專用的維持培養(yǎng)基(Lonza)中。將10nMGST融合肽D和GST或3種抗人RANKL單克隆抗體(濃度為0. 3 y g/mL和3 y g/mL)加入其中，然后進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第5天，按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行ALP活性測(cè)定。結(jié)果，在hMSC的情況下，證實(shí)GST融合肽D引起ALP活性的顯著增加(圖55)。單獨(dú)加入GST不能引起ALP活性的變化。同時(shí)，當(dāng)實(shí)施例33所用的3種抗人RANKL單克隆抗體加入到hMSC中時(shí)，10C11抗體引起ALP活性的顯著增強(qiáng)(圖56)。同時(shí)，證實(shí)4G4和7H12沒(méi)有ALP活性增強(qiáng)作用。 根據(jù)以上所述，發(fā)現(xiàn)通過(guò)將肽D與GST融合而得到的GST融合肽D促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞，正如在肽D的情況下一樣?？偨Y(jié)由實(shí)施例28中的Fc融合肽D引起的對(duì)成骨細(xì)胞分化促進(jìn)作用的上述結(jié)果，表明與某種蛋白質(zhì)融合的肽D可表現(xiàn)出與肽D相當(dāng)?shù)淖饔?。另外，上述?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，某些抗人RANKL單克隆抗體具有促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的作用。也就是說(shuō)，已經(jīng)知道，能將RANKL特定部分識(shí)別為表位的抗體作用于RANKL，從而傳遞成骨細(xì)胞分化信號(hào)。根據(jù)這一點(diǎn)，可以設(shè)計(jì)、篩選和產(chǎn)生有效傳遞成骨細(xì)胞分化信號(hào)的抗RANKL單克隆抗體。正如實(shí)施例21所述的抗小鼠RANKL單克隆抗體B的情況一樣，存在著作用于RANKL的抗RANKL單克隆抗體，從而轉(zhuǎn)導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖信號(hào)。也已知道，能將RANKL特定部分識(shí)別為表位的抗體作用于RANKL，從而傳導(dǎo)成骨細(xì)胞分化信號(hào)。如上所述，可以通過(guò)篩選許多抗RANKL單克隆抗體，來(lái)尋找能有效傳導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖或分化信號(hào)的抗體，從而找到最佳抗體。 另外，如實(shí)施例19和實(shí)施例30所述，已經(jīng)知道，可中和由RANKL引起的破骨細(xì)胞分化的抗小鼠RANKL單克隆抗體(抗體ft22和B)包括對(duì)成骨細(xì)胞具有增殖作用的抗體(B)和沒(méi)有這種作用的抗體(S22)，并且剌激成骨細(xì)胞分化的抗小鼠RANKL單克隆抗體(#22、#36、 A和B)包括中和抗體和非中和抗體。此外，已經(jīng)知道，中和由RANKL引起的破骨細(xì)胞分化的抗人RANKL單克隆抗體(7H12和10C11)包括能剌激成骨細(xì)胞分化的抗體(10C11)和沒(méi)有這種作用的抗體(7H12)。同時(shí)，有另一種抗人RANKL單克隆抗體，上述作用全部沒(méi)有(4G4)。這些事實(shí)表明，可以允許不同抗RANKL單克隆抗體分別表現(xiàn)出抗RANKL單克隆抗體可顯示的上述3種作用(即對(duì)破骨細(xì)胞分化的中和作用、對(duì)成骨細(xì)胞增殖的剌激作用和對(duì)成骨細(xì)胞分化的剌激作用)。另外，就抗體B而言，也可允許單一抗體具有上述3種作用(破骨細(xì)胞分化中和作用、成骨細(xì)胞增殖和成骨細(xì)胞分化)。此外，就抗體#22和10C11而言，也可允許單一抗體具有上述3種作用中的任何2種。
工業(yè)實(shí)用性
根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)知道，在成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞中，除了自RANKL至RANK的正向信號(hào)傳遞之外，還發(fā)生自RANK(其是RANKL受體)至RANKL(其是RANK配體)的反向信號(hào)傳遞。同樣，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)知道，RANKL與RANK之間的雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制骨吸收和骨形成的偶聯(lián)。人們認(rèn)為，自位于破骨細(xì)胞上的膜結(jié)合RANK傳遞給位于成骨細(xì)胞上的膜結(jié)合RANKL的反向信號(hào)在生理性骨代謝中控制骨吸收和骨形成的偶聯(lián)。使用這樣的反向信號(hào)允許開(kāi)發(fā)能增加骨量的藥物。具體地講，對(duì)成骨細(xì)胞分化和成熟的增強(qiáng)作用是由反向信號(hào)引起的，當(dāng)作用于RANKL的分子(例如膜結(jié)合RANK、RANK類似物肽、抗RANKL抗體、可溶性RANK、 0PG及其變異體和類似物)作用于膜結(jié)合RANKL時(shí)，就會(huì)傳遞這樣的反向信號(hào)，導(dǎo)致骨量增加。 可以使用膜結(jié)合RANK、 RANK類似物肽、抗RANKL抗體、可溶性RANK、 OPG及其變異體和類似物、以及能促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物，用于增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化和成熟，導(dǎo)致骨量增加；所述化合物是天然或合成的低分子量化合物，例如能作用于RANKL的分子。具體地講，這樣的化合物可用于醫(yī)藥產(chǎn)品、體外診斷試劑等。另外，可通過(guò)篩選能促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物，例如能作用于RANKL的分子，來(lái)搜索或開(kāi)發(fā)新的骨形成促進(jìn)劑。此外，促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物，例如能作用于RANKL的分子，可用作給成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞傳遞信號(hào)的試劑，導(dǎo)致成骨細(xì)胞或這類細(xì)胞的分化和成熟。除了成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞之外，有許多已知的能表達(dá)RANKL的細(xì)胞，例如T細(xì)胞、B細(xì)胞和滑膜細(xì)胞。然而，促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物，例如能作用于RANKL的分子，可用作以類似方式將信號(hào)傳導(dǎo)給上述細(xì)胞的物質(zhì)，導(dǎo)致所述細(xì)胞的分化、成熟和/或活化。這樣的化合物可用作醫(yī)藥產(chǎn)品、體外診斷試劑、研究用試劑等，用于各種不同用途。
序列表的自由文本(Free Text) SEQ ID NO :7和16 :合成肽，其中第2位的Cys與第8位的Cys通過(guò)二硫鍵相結(jié)合。 SEQ ID NO :8—13、 SEQ ID NO :17—46、 SEQ ID NO :48和49 :引物 本文所引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
權(quán)利要求
一種用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合物，所述組合物包含作為有效成分的作用于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物。
2. 權(quán)利要求l的用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合物，其中所述 作用于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞 的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物作用于位于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞上的 RA亂。
3. 權(quán)利要求1的用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合物，其中所述作 用于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的 分化、增殖、成熟或鈣化的化合物是選自以下的化合物RANK、 RANK片段肽的變異體、結(jié)構(gòu) 上類似于RANK的肽、結(jié)構(gòu)上類似于RANK片段肽的肽、結(jié)構(gòu)上類似于RANK的化學(xué)物質(zhì)、結(jié)構(gòu) 上類似于RANK片段肽的化學(xué)物質(zhì)、0PG、0PG的變異體或片段肽、結(jié)構(gòu)上類似于OPG的肽、結(jié) 構(gòu)上類似于OPG片段肽的肽、結(jié)構(gòu)上類似于OPG的化學(xué)物質(zhì)和結(jié)構(gòu)上類似于OPG片段肽的 化學(xué)物質(zhì)。
4. 權(quán)利要求2的用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合物，其中所述 作用于位于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞上的RANKL并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成 成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或*丐化的化合物是選自以下的化合物RANK、能作用于 RANKL的RANK片段肽的變異體、結(jié)構(gòu)上類似于RANK并能作用于RANKL的肽、結(jié)構(gòu)上類似于 RANK片段肽并能作用于RANKL的肽、結(jié)構(gòu)上類似于RANK并能作用于RANKL的化學(xué)物質(zhì)、結(jié) 構(gòu)上類似于RANK片段肽并能作用于RANKL的化學(xué)物質(zhì)、OPG、能作用于RANKL的OPG的變異 體或片段肽、結(jié)構(gòu)上類似于OPG并能作用于RANKL的肽、結(jié)構(gòu)上類似于OPG片段肽并能作用 于RANKL的肽、結(jié)構(gòu)上類似于OPG并能作用于RANKL的化學(xué)物質(zhì)和結(jié)構(gòu)上類似于OPG片段 肽并能作用于RANKL的化學(xué)物質(zhì)。
5. 權(quán)利要求1或2的用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合物，其中所 述作用于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì) 胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物是由SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:16所示氨基酸序列 組成的肽。
6. 權(quán)利要求1或2的用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合物，其中所 述作用于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì) 胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物是包含SEQ ID NO :7或SEQ ID N0:16所示氨基酸序 列的肽和GST或IgGl的Fc區(qū)的融合蛋白。
7. 權(quán)利要求1或2的用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合物，其中所 述作用于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì) 胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物是抗RANKL抗體或其功能性片段。
8. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合物， 其中所述骨量減少相關(guān)骨代謝疾病選自骨質(zhì)疏松癥、青少年骨質(zhì)疏松癥、骨發(fā)育障礙、高鈣 血癥、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)癥、骨軟化癥、骨質(zhì)缺乏、溶骨性骨病、骨壞死、佩吉特病、類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎、因骨關(guān)節(jié)炎引起的骨量減少、炎癥性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、糖皮質(zhì)激素治療、轉(zhuǎn)移性骨 病、牙周骨丟失、因癌癥引起的骨丟失和因衰老引起的骨丟失。
9. 權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合物， 所述組合物還包含作為有效成分的BMP家族成員。
10. 權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合 物，其中所述能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞選自成骨細(xì)胞前體細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和 成肌細(xì)胞。
11. 一種篩選作用于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞，給成骨細(xì)胞或能分化成成 骨細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)并促進(jìn)所述細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物的方法；所述方 法包括判斷候選化合物是否是作用于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞，給成骨細(xì)胞或 能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞傳遞信號(hào)并促進(jìn)所述細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物，即 通過(guò)允許候選化合物接觸表達(dá)RANKL的成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并證實(shí)所述 候選化合物是否能夠促進(jìn)所述成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或 鈣化。
12. 權(quán)利要求11的篩選方法，其中所述作用于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并 促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物作用于位于 成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞上的RANKL。
13. —種篩選作用于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞，給成骨細(xì)胞或能分化成成 骨細(xì)胞的細(xì)胞傳遞信號(hào)并促進(jìn)所述細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物的方法；所述方 法包括判斷候選化合物是否是作用于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞，給成骨細(xì)胞或 能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞傳遞信號(hào)并促進(jìn)所述細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物，即 通過(guò)將候選化合物給予小鼠并證實(shí)在所述小鼠中是否觀察到選自以下的至少一種現(xiàn)象在 骨密度、骨礦物質(zhì)含量、骨表面積、單位骨量、骨小梁寬度和骨小梁數(shù)量方面的增加。
14. 權(quán)利要求13的篩選方法，其中所述作用于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并 促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物作用于位于 成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞上的RANKL。
15. 權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的篩選方法，其中所述能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞選自成 骨細(xì)胞前體細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和成肌細(xì)胞。
16. —種用于成骨細(xì)胞分化和成熟的藥物，所述藥物包含作為活性劑的作用于成骨細(xì) 胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、 成熟或*丐化的化合物。
17. 權(quán)利要求16的用于成骨細(xì)胞分化和成熟的藥物，其中所述作用于成骨細(xì)胞或能分 化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣 化的化合物作用于位于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞上的RANKL。
18. 權(quán)利要求16的用于成骨細(xì)胞分化和成熟的藥物，其中所述作用于成骨細(xì)胞或能分 化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣 化的化合物是選自以下的化合物RANK、RANK片段肽的變異體、結(jié)構(gòu)上類似于RANK的肽、結(jié) 構(gòu)上類似于RANK片段肽的肽、結(jié)構(gòu)上類似于RANK的化學(xué)物質(zhì)、結(jié)構(gòu)上類似于RANK片段肽 的化學(xué)物質(zhì)、0PG、 0PG的變異體或片段肽、結(jié)構(gòu)上類似于0PG的肽、結(jié)構(gòu)上類似于0PG片段 肽的肽、結(jié)構(gòu)上類似于0PG的化學(xué)物質(zhì)和結(jié)構(gòu)上類似于0PG片段肽的化學(xué)物質(zhì)。
19. 權(quán)利要求17的用于成骨細(xì)胞分化和成熟的藥物，其中所述作用于位于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞上的RANKL并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、 增殖、成熟或鈣化的化合物選自RANK、能作用于RANKL的RANK片段肽的變異體、結(jié)構(gòu)上類 似于RANK并能作用于RANKL的肽、結(jié)構(gòu)上類似于RANK片段肽并能作用于RANKL的肽、結(jié)構(gòu) 上類似于RANK并能作用于RANKL的化學(xué)物質(zhì)、結(jié)構(gòu)上類似于RANK片段肽并能作用于RANKL 的化學(xué)物質(zhì)、0PG、能作用于RANKL的OPG的變異體或片段肽、結(jié)構(gòu)上類似于OPG并能作用于 RANKL的肽、結(jié)構(gòu)上類似于OPG片段肽并能作用于RANKL的肽、結(jié)構(gòu)上類似于OPG并能作用 于RANKL的化學(xué)物質(zhì)和結(jié)構(gòu)上類似于OPG片段肽并能作用于RANKL的化學(xué)物質(zhì)。
20. 權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的用于成骨細(xì)胞分化和成熟的藥物，其中所述作用于成 骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增 殖、成熟或鈣化的化合物是包含SEQ ID N0:7或SEQ ID NO :16所示氨基酸序列的肽。
21. 權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的用于成骨細(xì)胞分化和成熟的藥物，其中所述作用于成 骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增 殖、成熟或鈣化的化合物是包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :16所示氨基酸序列的肽和GST 或IgGl的Fc區(qū)的融合蛋白。
22. 權(quán)利要求20的用于成骨細(xì)胞分化和成熟的藥物，其中所述作用于成骨細(xì)胞或能分 化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣 化的化合物是呈乙酸鹽形式的包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :16所示氨基酸序列的肽。
23. 權(quán)利要求19的用于成骨細(xì)胞分化和成熟的藥物，其中所述作用于成骨細(xì)胞或能分 化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞并促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣 化的化合物是抗RANKL抗體或其功能性片段。
24. 權(quán)利要求16-23中任一項(xiàng)的用于成骨細(xì)胞分化和成熟的藥物，其中所述能分化成 成骨細(xì)胞的細(xì)胞選自成骨細(xì)胞前體細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和成肌細(xì)胞。
25. —種用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合物，所述組合物包含作 為有效成分的包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :16所示氨基酸序列的肽。
26. —種用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合物，所述組合物包含作 為有效成分的包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :16所示氨基酸序列的肽和GST或IgGl的 Fc區(qū)的融合蛋白。
27. 權(quán)利要求25的用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合物，其中所述 有效成分是呈乙酸鹽形式的包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :16所示氨基酸序列的肽。
28. 權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)的用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合 物，其中所述骨量減少相關(guān)骨代謝疾病選自骨質(zhì)疏松癥、青少年骨質(zhì)疏松癥、骨發(fā)育障礙、 高鈣血癥、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)癥、骨軟化癥、骨質(zhì)缺乏、溶骨性骨病、骨壞死、佩吉特病、類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎、因骨關(guān)節(jié)炎引起的骨量減少、炎癥性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、糖皮質(zhì)激素治療、轉(zhuǎn)移性 骨病、牙周骨丟失、因癌癥引起的骨丟失和因衰老引起的骨丟失。
29. 權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)的用于治療或預(yù)防骨量減少相關(guān)骨代謝疾病的藥物組合 物，所述組合物還包含作為有效成分的BMP家族成員。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了含有RANKL作用分子的骨形成增強(qiáng)劑，所述分子能增強(qiáng)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、成熟或鈣化。具體地講，本發(fā)明公開(kāi)了用于治療或預(yù)防伴有骨量減少的代謝性骨病的藥物組合物，所述組合物包含作為有效成分的能作用于位于成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞上的RANKL以促進(jìn)成骨細(xì)胞或能分化成成骨細(xì)胞的細(xì)胞的分化、增殖、成熟或鈣化的化合物。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101772351SQ20088010132
公開(kāi)日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2008年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月5日
發(fā)明者保田尚孝, 古屋優(yōu)里子, 田口祐介 申請(qǐng)人:東方酵母工業(yè)株式會(huì)社