專利名稱：用于產(chǎn)生1，2-丙二醇和丙酮醇的微生物和方法
引言 本發(fā)明涉及修飾的微生物及其用于制備1，2-丙二醇和/或丙酮醇的用途。
1，2-丙二醇或丙二醇，即C3二醇，是廣泛使用的化學(xué)品。它是用于飛機(jī)的抗凍和除冰流體、液體洗滌劑、冷卻劑、不飽和聚酯樹脂的組分。自從1993-1994年以來，丙二醇越來越多地用作乙烯衍生物的替代物，所述乙烯衍生物被認(rèn)為比丙烯衍生物的毒性更強(qiáng)。
目前使用消耗大量水的環(huán)氧丙烷水合工藝通過化學(xué)手段產(chǎn)生1，2-丙二醇。環(huán)氧丙烷可以由兩種方法中的任一種產(chǎn)生，一種使用表氯醇(epichlorhydrin)，另一種使用氫過氧化物。兩條途徑都使用高毒性物質(zhì)。此外，氫過氧化物途徑產(chǎn)生副產(chǎn)物如叔丁醇和1-苯基乙醇。為使丙烯生產(chǎn)成為有利可圖的，必須使用這些副產(chǎn)物?；瘜W(xué)途徑通常產(chǎn)生消旋的1，2-丙二醇，而兩種立體異構(gòu)體(R)1，2-丙二醇和(S)1，2-丙二醇中每種對于某些應(yīng)用是感興趣的(例如專門的化學(xué)和藥物產(chǎn)品的手性起始材料)。
丙酮醇或羥基丙酮(1-羥基-2-丙酮)是C3酮醇。這種產(chǎn)物在紡織業(yè)的甕染(vat dyeing)工藝中作為還原劑。它能有利地替代傳統(tǒng)的含硫還原劑，以減少廢水中對環(huán)境有害的硫含量。丙酮醇也是化學(xué)工業(yè)的起始材料，用于例如產(chǎn)生多元醇或雜環(huán)分子。它還具有有趣的螯合和溶劑性質(zhì)。
丙酮醇目前主要通過1，2-丙二醇的脫水或催化氧化來產(chǎn)生?，F(xiàn)在提出由可再生物料如甘油出發(fā)的新工藝(參見DE4128692和WO 2005/095536)。當(dāng)前，化學(xué)工藝產(chǎn)生丙酮醇的生產(chǎn)成本減少了它的工業(yè)應(yīng)用和市場。
用于產(chǎn)生1，2-丙二醇和/或丙酮醇的化學(xué)方法的缺點使生物合成成為具有吸引力的替代方法。已表征了兩種途徑用于通過微生物由糖天然產(chǎn)生這些產(chǎn)物。
在第一個途徑中，將6-脫氧糖(例如L-鼠李糖或L-巖藻糖)裂解成磷酸二羥基丙酮和(S)-乳醛，其能進(jìn)一步還原至(S)-1，2-丙二醇(Badia等，1985)。此途徑在大腸桿菌中有功能，但是因為脫氧己糖的高成本，不能得到經(jīng)濟(jì)上可行的工藝。
第二個途徑是通過糖酵解途徑，然后是丙酮醛途徑來代謝普通糖(例如葡萄糖或木糖)。將磷酸二羥基丙酮轉(zhuǎn)化成丙酮醛，后者可以還原成乳醛或丙酮醇。然后這兩個化合物可以進(jìn)行第二次還原反應(yīng)，得到1，2-丙二醇。此途徑由(R)-1，2-丙二醇的天然生產(chǎn)菌使用，如楔形梭菌(Clostridium sphenoides)和熱解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)。已經(jīng)使用楔形梭菌產(chǎn)生1，2-丙二醇，在磷酸鹽受限條件下效價(titer)為1.58g/l(Tran Din和Gottschalk，1985)。也已經(jīng)研究熱解糖熱厭氧桿菌用于產(chǎn)生1，2-丙二醇(Cameron和Cooney，1986，Sanchez-Rivera等，1987)。獲得的最佳性能是9g/l的效價和0.2g/g由葡萄糖的得率。然而，用這些生物獲得的性能的改進(jìn)可能由于缺少可用的遺傳工具而受到限制。
現(xiàn)有技術(shù) 大腸桿菌具有天然產(chǎn)生1，2-丙二醇和丙酮醇的基因能力。1，2-丙二醇的生物合成途徑由糖酵解中間產(chǎn)物磷酸二羥基丙酮開始。這種代謝中間產(chǎn)物能被由mgsA基因編碼的丙酮醛合酶轉(zhuǎn)化成丙酮醛(Cooper，1984，

等，1998)。丙酮醛是毒性極強(qiáng)的親電子試劑，能與大分子如DNA、RNA和蛋白質(zhì)的親核中心反應(yīng)。它在非常低的濃度(0.3至0.7mM)能抑制細(xì)胞生長并引起細(xì)胞死亡。為此，已經(jīng)研究了將丙酮醛脫毒的現(xiàn)有途徑(Ferguson等，1998)。已經(jīng)在細(xì)菌特別是在大腸桿菌中鑒定了三條途徑。
-第一條途徑是谷胱甘肽依賴型乙二醛酶I-II系統(tǒng)(由gloA和gloB基因編碼)，其可以兩個步驟將丙酮醛轉(zhuǎn)化成D-乳酸。
-第二條途徑是不依賴谷胱甘肽的乙二醛酶III酶，其催化丙酮醛轉(zhuǎn)化成D-乳酸。
-第三個系統(tǒng)包含通過丙酮醛還原酶來降解丙酮醛。
最后一個系統(tǒng)與1，2-丙二醇的產(chǎn)生相關(guān)。丙酮醛是在C1攜帶醛，在C2攜帶酮的C3酮醛。這兩個位置可以還原成醇，分別得到丙酮醇(或羥基丙酮)，其為非手性分子，和乳醛，其為能以L-或D-形式存在的手性分子(參見

圖1)。隨后這3個分子(丙酮醇，L-乳醛和D-乳醛)可以在其他位置被還原以得到手性的1，2-丙二醇。
在大腸桿菌中優(yōu)選使用的途徑目前尚未明確建立。丙酮醛還原酶，優(yōu)先使用NADPH作為輔因子，經(jīng)過純化并在大腸桿菌中部分表征(Saikusa等，1987)。這個反應(yīng)的產(chǎn)物顯示為乳醛。Misra等(1996)描述了兩種丙酮醛還原酶活性的純化，這兩種酶活性給出相同的產(chǎn)物丙酮醛。一種NADH依賴的活性可為醇脫氫酶活性，而NADPH依賴的活性可為非特異性的醛還原酶。Altaras和Cameron(1999)證明了由大腸桿菌的gldA基因編碼的甘油脫氫酶(GldA)在將丙酮醛還原成(R)-乳醛的過程中有活性，并且在將丙酮醇轉(zhuǎn)化成1，2-丙二醇的過程中也有活性。
從大腸桿菌克隆基因yghZ，表達(dá)并表征蛋白質(zhì)(Grant，2003)。它以NADPH為輔因子，對丙酮醛表現(xiàn)出了高度特異的活性，但是未表征反應(yīng)產(chǎn)物。過表達(dá)時，這個基因賦予對丙酮醛毒性的抗性。
Ko等(2005)系統(tǒng)地研究了大腸桿菌的9個醛-酮還原酶，作為將丙酮醛轉(zhuǎn)化成為丙酮醇的候選酶。他們發(fā)現(xiàn)，4個純化的酶，YafB、YqhE、YeaE和YghZ能在NADPH存在時將丙酮醛轉(zhuǎn)化成丙酮醇。根據(jù)他們的研究，丙酮醛還原酶YafB、YeaE和YghZ在脫毒方面與體內(nèi)的丙酮醛代謝最為相關(guān)。DiLuccio等(2006)顯示大腸桿菌的基因ydjG的產(chǎn)物在存在NADH時對丙酮醛有活性，但沒有進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的表征。
已經(jīng)由Cameron小組(Cameron等，1998，Altaras和Cameron，1999，Altaras和Cameron，2000)和Bennett小組(Huang等，1999，Berrios-Rivera等，2003)進(jìn)行了幾項大腸桿菌基因修飾的研究，以獲得使用簡單碳源的1，2-丙二醇產(chǎn)生菌。這些研究依賴從磷酸二羥基丙酮到1，2-丙二醇的途徑中編碼酶活性的一個或多個基因的表達(dá)。Cameron等(1998)顯示編碼大鼠晶狀體(rat lens)醛糖還原酶的基因或者gldA基因的過表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生少于0.2g/l 1，2-丙二醇?？赏ㄟ^共-表達(dá)兩個大腸桿菌基因(mgsA和gldA)來獲得此效價(titer)的改進(jìn)。通過這個組合，可獲得0.7g/l 1，2-丙二醇的效價(Altaras和Cameron，1999)。當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)完全的1，2-丙二醇途徑時，獲得效價和得率上的進(jìn)一步改進(jìn)(Altaras和Cameron，2000)。已經(jīng)在缺乏編碼乳酸脫氫酶(ldhA)的基因的菌株中過表達(dá)三個基因mgsA、gldA和fucO。通過此組合，由Cameron小組獲得的最好結(jié)果是在厭氧搖瓶培養(yǎng)中產(chǎn)生1.4g/l 1，2-丙二醇，得率為0.2g/g消耗的葡萄糖。當(dāng)外推至厭氧補(bǔ)料批式發(fā)酵罐中時，產(chǎn)生4.5g/l 1，2-丙二醇，得率為0.19g/g葡萄糖。在專利US 6,087,140，US 6,303,352和WO 98/37204中還描述了用同樣的方法獲得產(chǎn)量和得率更低的結(jié)果。Bennett小組還也使用缺乏ldhA的大腸桿菌宿主菌株過表達(dá)來自丙酮丁醇梭菌的mgs基因和來自大腸桿菌的gldA基因。在厭氧條件下的搖瓶培養(yǎng)給出1.3g/l的產(chǎn)量和0.12g/g的得率，而微需氧培養(yǎng)給出1.4g/l的產(chǎn)量和0.13g/g的得率。
在這一階段，所有這些結(jié)果都未能超過用熱解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)獲得的結(jié)果。
至今為止，尚未描述來自微生物(特別是來自大腸桿菌)的將丙酮醛轉(zhuǎn)化成丙酮醇的內(nèi)源活性的用途。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及丙酮醛還原酶活性增加的修飾的微生物，及其用于制備1，2-丙二醇和/或丙酮醇的用途。丙酮醛還原酶是來自微生物的基因的產(chǎn)物。通過過表達(dá)將丙酮醛變?yōu)楸嫉霓D(zhuǎn)化中涉及的一個或多個基因來獲得丙酮醛還原酶活性的增加，所述基因優(yōu)選選自yqhD、yafB、ycdW、yqhE、yeaE、yghZ、yajO、tas、ydjG和ydbC。
在本發(fā)明的另一個方面，也通過過表達(dá)mgsA基因而增加丙酮醛合酶的活性。
在本發(fā)明的另一個方面，通過缺失edd和/或eda基因而消除Entner-Doudoroff途徑。此外，通過削弱編碼涉及從丙酮醛合成乳酸的酶的基因(如gloA、aldA、aldB)、由丙酮酸(ldhA)、甲酸(pflA、pflB)、乙醇(adhE)和乙酸(ackA、pta、poxB)合成乳酸的酶的基因的表達(dá)而削弱不期望副產(chǎn)物的合成。
優(yōu)選地，一半葡萄糖代謝成磷酸二羥基丙酮，并最終通過缺失tpiA基因而代謝成為1，2-丙二醇和/或丙酮醇。任選地，具有有活性的tpiA基因，降低3磷酸甘油醛的活性，從而使部分可用的3磷酸甘油醛重定向于1，2-丙二醇和/或丙酮醇的合成。在本發(fā)明的一個方面，增加了糖輸入的效率，通過使用不依賴磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的糖輸入(如由galP編碼的)，或者通過將更多的PEP提供給糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，來增加糖輸入的效率。這可以通過消除消耗PEP的途徑如丙酮酸激酶(由pykA和pykF基因編碼)和/或通過促進(jìn)PEP的合成，例如通過過表達(dá)編碼PEP合酶的ppsA基因來獲得。
特別地，對于1，2-丙二醇的產(chǎn)生，可以任選地修飾微生物，以增加將磷酸二羥基丙酮轉(zhuǎn)化成1，2-丙二醇的其他酶，如甘油脫氫酶(由gldA編碼)和1，2-丙二醇氧化還原酶(由fucO編碼)。此外，對于將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA的酶有價值的是成為對厭氧條件下存在的高濃度NADH是有抗性的。這能通過在lpd基因中的特定突變而獲得。最后，為了節(jié)省NADH用于將丙酮醇還原成1，2-丙二醇，可以缺失arcA和ndh基因。用于制備1，2-丙二醇的微生物選自細(xì)菌、酵母和真菌中，但是優(yōu)選為大腸桿菌或丙酮丁醇梭菌。本發(fā)明提供通過在包含簡單或復(fù)雜碳源的適當(dāng)生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)修飾的微生物，和回收并純化產(chǎn)生的1，2-丙二醇來生產(chǎn)1，2-丙二醇的方法。
特定地，對于丙酮醇的產(chǎn)生，削弱或缺失編碼甘油脫氫酶的基因，防止1，2-丙二醇的形成。用于制備丙酮醇的微生物從細(xì)菌、酵母和真菌中選擇，但優(yōu)選為大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌。本發(fā)明的另一個目的是通過在包含簡單碳源的適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述修飾的微生物，并通過回收和純化所產(chǎn)生的丙酮醇來生產(chǎn)丙酮醇的方法。
附圖簡述 并入和構(gòu)成本說明一部分的附圖例示了本發(fā)明，并與說明一起，用于解釋本發(fā)明的原理。
圖1描繪從糖出發(fā)的1，2-丙二醇產(chǎn)生系統(tǒng)的開發(fā)中中心代謝(centralmetabolism)的遺傳工程。
圖2顯示在pH 7，在陰離子交換色譜上三個蛋白質(zhì)YQHD、YDHF和GLDA的洗脫譜。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及用于從碳源產(chǎn)生1，2-丙二醇和/或丙酮醇的修飾的微生物，其中所述微生物以增加的丙酮醛還原酶活性為特征，所述酶由來自微生物的一個或多個基因編碼。
如本文所使用的，下述術(shù)語可以用于解釋權(quán)利要求和說明。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“培養(yǎng)”、“生長”和“發(fā)酵”可互換使用，表示細(xì)菌在包含簡單碳源的適當(dāng)生長培養(yǎng)基中的生長。
術(shù)語“修飾的微生物”表示微生物如細(xì)菌、酵母或真菌，其已經(jīng)經(jīng)過修飾，增加了丙酮醛還原酶活性。這樣的修飾包括用遺傳元件轉(zhuǎn)化微生物的通常手段，包括基因置換和導(dǎo)入載體用于表達(dá)與丙酮醛還原有關(guān)的基因。還包括在普通的誘導(dǎo)突變的條件下微生物的隨機(jī)或定向突變。還包括微生物的進(jìn)化方法，如WO 2004/076659中公開的進(jìn)化方法。
術(shù)語“用于產(chǎn)生”表示微生物通過發(fā)酵產(chǎn)生目的產(chǎn)物。發(fā)酵是可以在需氧、微需氧或厭氧條件下進(jìn)行的經(jīng)典方法。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“碳源”表示碳的任何來源，其可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員用來支持微生物的正常生長，并且其可以是己糖、戊糖、單糖、二糖、寡糖、淀粉或其衍生物，半纖維素，甘油和它們的組合。
“增加的酶活”表示活性超過野生型酶的活性，后者如在任何修飾之前在相同的微生物中所測定的。相應(yīng)的未修飾的微生物是除對丙酮醛還原酶活性進(jìn)行修飾之外，與修飾的微生物具有相同特性的微生物?？梢酝ㄟ^普通方法如Misra等(Molecular and Cellular Biochemistry 156117-124(1996))或Ko等(J.Bacteriol.1875782-5789(2005))中公開的方法測量丙酮醛還原酶活性。
有利地，與相應(yīng)的未修飾的微生物的丙酮醛還原酶活性相比較，丙酮醛還原酶活性增加至少50％，優(yōu)選至少100％。
優(yōu)選地，通過過表達(dá)與丙酮醛還原有關(guān)的至少一個基因而獲得丙酮醛還原酶活性的增加。
術(shù)語“表達(dá)”指基因序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯，其可以產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)，基因產(chǎn)物。
為了獲得目的基因的過表達(dá)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解不同的方法，例如 1.用誘導(dǎo)所述目的基因更強(qiáng)表達(dá)水平的啟動子替代基因的天然啟動子。
可以通過用已知能在所選微生物中誘導(dǎo)強(qiáng)力基因表達(dá)的啟動子替代基因的天然啟動子，獲得更強(qiáng)的表達(dá)水平。對于大腸桿菌，這樣的啟動子是例如啟動子Ptrc，Ptac、Plac、λ啟動子cI或本領(lǐng)域的專家了解的其他啟動子。對于微生物的其他菌種，本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員能確定可以使用的啟動子。
2.通過下述方式向微生物中導(dǎo)入多個拷貝的與丙酮醛還原有關(guān)的所述目的基因 -導(dǎo)入攜帶和表達(dá)所述目的基因的表達(dá)載體。
-向微生物的染色體中導(dǎo)入基因的額外拷貝。
在本發(fā)明的特定實施方案中，下述基因中至少一個過表達(dá)yqhD、yafB、ydhF、ycdW、yqhE、yeaE、yghZ、yajO、tas、ydjG和ydbC。所述基因編碼能將丙酮醛轉(zhuǎn)化成丙酮醇的酶。優(yōu)選地，yqhD基因單獨或與其他基因組合過表達(dá)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，將丙酮醛活性增加的微生物進(jìn)一步修飾。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的微生物提供增加的丙酮醛合酶活性。有利地，這可以通過增加基因mgsA的表達(dá)而獲得，該基因編碼在DHAP變?yōu)楸┑霓D(zhuǎn)化中有關(guān)的丙酮醛合酶。
獲得這種增加的酶活的另一個方法是向mgsA基因?qū)胩囟ǖ耐蛔?，翻譯得到與天然蛋白質(zhì)相比較表現(xiàn)出更高活性的基因產(chǎn)物。
優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的微生物中，與Entner-Doudoroff途徑有關(guān)的至少一個基因削弱。Entner-Doudoroff途徑提供糖酵解之外的備選途徑，以將葡萄糖降解成3-磷酸甘油醛和丙酮酸。Entner-Doudoroff途徑的削弱確保大多數(shù)或最好是全部葡萄糖通過糖酵解降解，并且用于產(chǎn)生1，2-丙二醇。
優(yōu)選地，下述基因中至少一個的表達(dá)被削弱edd、eda 術(shù)語“酶活性的削弱”指與進(jìn)行任何修飾之前的進(jìn)化菌株中觀察到的活性相比，目的酶的活性降低。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解多種方法獲得這一結(jié)果，例如 -向基因中導(dǎo)入突變，降低該基因的表達(dá)水平，或者降低編碼蛋白質(zhì)的活性水平。
-由低強(qiáng)度的啟動子替代基因的天然啟動子，得到更低的表達(dá)。
-使用使相應(yīng)信使RNA或蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的元件。
-如果需要根本不表達(dá)則缺失基因。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“削弱基因的表達(dá)”表示部分或全部抑制基因的表達(dá)，即所謂“削弱的”。對表達(dá)的這種抑制可以是抑制基因的表達(dá)，缺失基因表達(dá)所需的全部或部分啟動子區(qū)域，或者缺失基因的編碼區(qū)域。優(yōu)選地，基因的削弱本質(zhì)上是基因的完全缺失，所述基因可以由選擇標(biāo)記基因替代，所述選擇標(biāo)記基因可以促進(jìn)根據(jù)本發(fā)明的菌株的鑒定、分離和純化。優(yōu)選通過Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.(2000)“One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12 using PCR products”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA976640-6645所述的同源重組技術(shù)使基因失活。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，在將丙酮醛變?yōu)槿樗岬霓D(zhuǎn)化中有關(guān)的至少一個酶的活性被削弱。這種削弱的目的在于可用的丙酮醛被合成1，2-丙二醇所必需的細(xì)胞機(jī)制使用(參見圖1)。
在丙酮醛變?yōu)槿樗岬霓D(zhuǎn)化中有關(guān)的基因具體為 -編碼乙二醛酶I的gloA基因，其催化從丙酮醛合成乳酰谷胱甘肽； -編碼乳醛脫氫酶的aldA和aldB基因(催化從(S)乳醛合成(S)乳酸)。
在微生物中有利地削弱了這些基因中的一個或多個。優(yōu)選削弱或完全缺失gloA基因。
在本發(fā)明的微生物中，優(yōu)選的是削弱與副產(chǎn)物如乳酸、乙醇和甲酸合成有關(guān)的至少一個酶。
具體地，有利地削弱編碼乳酸脫氫酶的基因ldhA，其催化由丙酮酸合成乳酸，和編碼醇-醛脫氫酶的基因adhE，其催化由乙酰-CoA合成乙醇。
相似地，可能迫使微生物使用丙酮酸脫氫酶復(fù)合物由丙酮酸產(chǎn)生乙酰-CoA、CO2和NADH，而不是乙酰-CoA和甲酸。這可以通過削弱編碼丙酮酸甲酸裂合酶的基因pflA和pflB而實現(xiàn)。
在本發(fā)明的另一個特定的實施方案中，通過削弱涉及副產(chǎn)物乙酸合成的至少一個酶而防止合成乙酸。優(yōu)選避免這樣的乙酸合成以優(yōu)化1，2-丙二醇的產(chǎn)生。
為了防止產(chǎn)生乙酸，有利地削弱了選自ackA、pta和poxB中的至少一個基因，這些基因都編碼涉及不同的乙酸生物合成途徑的酶(參見圖1)。
在本發(fā)明的特定實施方案中，削弱磷酸丙糖異構(gòu)酶活性。優(yōu)選地，通過削弱tpiA基因的表達(dá)而實現(xiàn)這個結(jié)果。tpiA基因編碼酶“磷酸丙糖異構(gòu)酶”，其催化DHAP轉(zhuǎn)化成3-磷酸甘油醛(參見圖1)。這個基因的表達(dá)的削弱確保將一半代謝的葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，2-丙二醇和/或丙酮醇。
在本發(fā)明的特定實施方案中，削弱了3-磷酸甘油醛脫氫酶的活性。3-磷酸甘油醛脫氫酶，也稱作GAPDH，是與葡萄糖變?yōu)楸岬奶墙徒廪D(zhuǎn)化有關(guān)的關(guān)鍵酶。酶的削弱使部分GA3P重定向于1，2-丙二醇和/或丙酮醇的合成。因而1，2-丙二醇對于葡萄糖的得率可大于1摩爾/摩爾。有利地，3-磷酸甘油醛脫氫酶的活性小于野生型GADPH通?；钚缘募s30％，更優(yōu)選地小于10％。
優(yōu)選地，削弱編碼GAPDH的gapA基因的表達(dá)。
優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的微生物中，增加糖輸入的效率。gapA基因表達(dá)的強(qiáng)力削弱使GAPDH反應(yīng)中碳流量降低超過50％，這將導(dǎo)致每摩爾輸入的葡萄糖合成小于1摩爾的PEP。通常用于將簡單糖輸入細(xì)胞的糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)需要PEP，因為輸入與從PEP到葡萄糖的磷酸轉(zhuǎn)移耦合，所述過程得到6-磷酸葡萄糖。因此，減少PEP的量將對糖輸入產(chǎn)生負(fù)面影響。
在本發(fā)明的特定實施方案中，可以通過不依賴磷酸烯醇丙酮酸的糖輸入系統(tǒng)將糖輸入微生物?？梢岳糜刹簧婕傲姿峄膅alP基因編碼的半乳糖-質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)體。在這種情況下，輸入的葡萄糖必須由glk基因編碼的葡萄糖激酶磷酸化。為了促進(jìn)這一途徑，增加選自galP和glk的至少一個基因的表達(dá)。結(jié)果為PTS變得不必要，而且可以通過削弱選自ptsH、ptsI或crr的至少一個基因的表達(dá)而消除。
在本發(fā)明的另一個特定的實施方案中，通過增加代謝物PEP的可用性而增加糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)的效率。由于削弱了gapA活性和朝向丙酮酸的碳流量降低，所以本發(fā)明的修飾菌株中PEP的量受到限制，導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中的葡萄糖量降低。
存在各種可以用于增加微生物菌株中PEP可用性的方法。具體地，一種方法是削弱反應(yīng)PEP→丙酮酸。優(yōu)選地，選自pykA和pykF的至少一個基因的表達(dá)在所述菌株中削弱以獲得這一結(jié)果，所述基因編碼丙酮酸激酶。另一種方法是增加PEP的可用性，利于反應(yīng)丙酮酸→PEP，所述反應(yīng)由磷酸烯醇丙酮酸合酶催化，可以通過增加酶的活性而實現(xiàn)。這個酶由ppsA基因編碼。因此，在微生物中優(yōu)選增加ppsA基因的表達(dá)。兩種修飾可以同時存在于微生物中。
在本發(fā)明的特定實施方案中，設(shè)計修飾的微生物，主要產(chǎn)生1，2-丙二醇。通過將丙酮醇和其他前體(例如乳醛)轉(zhuǎn)化成1，2-丙二醇可以獲得這一結(jié)果。這包括 -增加甘油脫氫酶活性。優(yōu)先地，增加gldA基因的表達(dá)。
-增加1，2-丙二醇氧化還原酶活性，優(yōu)選通過增加基因fucO的表達(dá)。
特別是在厭氧或微需氧條件下，有利的是，將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA的丙酮酸脫氫酶對于NADH的抑制的靈敏度較低。術(shù)語“低靈敏度”定義為參照未修飾酶的靈敏度。具體地，這些特性可以通過如下方法獲得向lpd基因(編碼PDC的硫辛酰胺脫氫酶亞基)中導(dǎo)入特定突變，使酶的蛋白質(zhì)序列中的丙氨酸55由纈氨酸替代。
在厭氧或微需氧條件下，將用于還原前體產(chǎn)物1，2-丙二醇的NADH的可用性有利地增加，這可以通過減輕全局調(diào)控子ArcA(由arcA基因編碼)介導(dǎo)的對三羧酸循環(huán)的抑制而實現(xiàn)。細(xì)胞中NADH的濃度也可以通過失活由基因ndh編碼的NADH脫氫酶II而增加。因此，優(yōu)選地，選自arcA和ndh的至少一個基因的表達(dá)被削弱。
優(yōu)選地，設(shè)計的主要產(chǎn)生1，2-丙二醇的微生物選自細(xì)菌，酵母和真菌。更優(yōu)選地，微生物選自腸桿菌科，芽孢桿菌科，梭菌科，鏈霉菌科和棒桿菌科。甚至更優(yōu)選地，微生物來自大腸桿菌菌種或者來自丙酮丁醇梭菌菌種。
在本發(fā)明的另一個特定實施方案中，設(shè)計修飾的微生物，主要產(chǎn)生丙酮醇。優(yōu)選地，這個結(jié)果可以通過削弱涉及丙酮醇轉(zhuǎn)化成為1，2-丙二醇的至少一個酶的活性而實現(xiàn)。優(yōu)選地，削弱gldA基因的表達(dá)。
有利地，設(shè)計的主要產(chǎn)生丙酮醇的微生物選自細(xì)菌，酵母和真菌。更優(yōu)選地，微生物選自腸桿菌科，芽孢桿菌科，鏈霉菌科和棒桿菌科。甚至更優(yōu)選地，微生物來自大腸桿菌菌種或者來自肺炎克雷伯氏菌菌種。
本發(fā)明還涉及用于制備1，2-丙二醇的方法，其中根據(jù)本發(fā)明的微生物在包含碳源的適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中生長，并且回收產(chǎn)生的1，2-丙二醇。在需氧、微需氧或厭氧條件下進(jìn)行1，2-丙二醇的產(chǎn)生。
在一個實施方案中，大腸桿菌種屬的微生物在包含簡單碳源的適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中生長。
在另一個實施方案中，丙酮丁醇梭菌種屬的微生物在包含簡單或復(fù)雜碳源的適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中生長。
有利地，將回收的1，2-丙二醇進(jìn)一步純化。
本發(fā)明還涉及用于制備丙酮醇的方法，其中根據(jù)本發(fā)明的微生物在包含簡單碳源的適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基中生長，并且回收產(chǎn)生的丙酮醇。在需氧、微需氧或厭氧條件下進(jìn)行丙酮醇的產(chǎn)生，優(yōu)選在需氧條件下。
有利地，將回收的丙酮醇進(jìn)一步純化。
發(fā)酵過程的培養(yǎng)條件可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。具體地，細(xì)菌在20℃-55℃的溫度發(fā)酵，優(yōu)選在25℃-40℃，并且對于丙酮丁醇梭菌優(yōu)選在約35℃，而對于大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌在約37℃。
這個過程可以以分批過程、補(bǔ)料分批過程或連續(xù)過程進(jìn)行。
“在需氧條件下”表示通過將氣體溶于液相而向培養(yǎng)物供氧。這可以通過下述方式獲得(1)將含氧氣體(例如空氣)鼓泡入液相，或(2)震蕩包含培養(yǎng)基的容器，以將液上空間包含的氧傳遞入液相。在需氧條件而不是厭氧條件下發(fā)酵的優(yōu)勢是氧作為電子受體的存在改進(jìn)了菌株以ATP形式為細(xì)胞過程產(chǎn)生更多能量的能力。因此菌株的普通代謝得到了改進(jìn)。
微需氧條件定義為這樣的培養(yǎng)條件其中低百分比的氧(例如使用包含0.1-10％氧的氣體混合物，用氮補(bǔ)至100％)溶于液相中。
厭氧條件定義為不向培養(yǎng)基供氧的培養(yǎng)條件。可以通過向培養(yǎng)基中鼓泡惰性氣體如氮氣，去除痕量的其他氣體而獲得嚴(yán)格厭氧條件?？梢允褂玫獨庾鳛殡娮邮荏w以改進(jìn)菌株的ATP生產(chǎn)，并改進(jìn)其代謝。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基”表示已知分子組成，適合微生物生長的培養(yǎng)基。例如適合所用細(xì)菌的組成已知的無機(jī)培養(yǎng)基，其中包含至少一種碳源。具體地，因此用于大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌的無機(jī)生長培養(yǎng)基可以與M9培養(yǎng)基(Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32120-128)、M63培養(yǎng)基(Miller，1992；A Short Course in B acterial GeneticsA LaboratoryManual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)或如Schaefer等(1999，Anal.Biochem.27088-96)所定義的培養(yǎng)基有相同或相似的組成，并且具體地，命名為MPG的基本培養(yǎng)基如下所述 用氫氧化鈉將培養(yǎng)基的pH調(diào)至7.4。
*痕量元素溶液檸檬酸4.37g/L，MnSO4 3g/L，CaCl2 1g/L，CoCl2，2H2O0.1g/L，ZnSO4，7H2O 0.10g/L，CuSO4，5H2O 10mg/L，H3BO3 10mg/L，Na2MoO4 8.31mg/L。
對于大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌，使用的碳源優(yōu)選為簡單碳源，可以是阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖蔗糖或木糖。特別優(yōu)選的簡單碳源是葡萄糖。
因此對于丙酮丁醇梭菌，生長培養(yǎng)基可以與梭菌生長培養(yǎng)基(CGM，Wiesenborn等，Appl.Environm.Microbiol.，542717-2722)或由Monot等(Appl.Environm.Microbiol.，441318-1324)或Vasconcelos等(J.Bacteriol.，1761443-1450)給出的無機(jī)生長培養(yǎng)基組成相同或相似。
對于丙酮丁醇梭菌，使用的碳源為簡單或復(fù)雜碳。簡單碳源可以是阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖或木糖。特別優(yōu)選的簡單碳源是葡萄糖。復(fù)雜碳源可以是淀粉或半纖維素。特別優(yōu)選的復(fù)雜碳源是淀粉。
本發(fā)明在上文、下文和實施例中針對大腸桿菌描述。因此對于本發(fā)明的初始和進(jìn)化菌株可以削弱、缺失或過表達(dá)的基因主要使用來自大腸桿菌的基因的名稱(denomination)來定義。然而，這種指定根據(jù)本發(fā)明具有更一般的意義，并覆蓋了其他微生物中相應(yīng)的基因。使用來自大腸桿菌的基因的GenBank參考符號(reference)，本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員能確定大腸桿菌之外的其他生物體中的等同基因。
鑒定同源序列和它們的百分比同源性的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的，并且具體包括可以在網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上以網(wǎng)站上指示的默認(rèn)參數(shù)使用的BLAST程序。獲得的序列可以使用例如程序CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)以這些網(wǎng)站上指示的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行研究(比對)。
PFAM數(shù)據(jù)庫(比對和隱藏的Markov模型的蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫，http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)是蛋白質(zhì)序列比對的大集合。每個PFAM能夠顯示多重比對，查看蛋白質(zhì)域，評價生物體之間的分布，訪問其他數(shù)據(jù)庫并顯示已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
通過比較源自代表了44個主要的系統(tǒng)發(fā)生系的66個完全測序單細(xì)胞基因組的蛋白質(zhì)序列而獲得COG(蛋白質(zhì)直向同源組的簇，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)。每個COG由至少三個系定義，從而能夠鑒定古老的保守的域。
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1)從大腸桿菌MG1655 lpd*ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd(對于菌株的構(gòu)建參見WO 2005/073364)的恒化培養(yǎng)物收集微生物生物質(zhì)，所述培養(yǎng)在嚴(yán)格厭氧或微需氧條件下進(jìn)行。
2)通過離心收獲細(xì)胞，用50mM HEPES緩沖液pH 7.5和5mM DTT洗滌兩次，重懸于相同的緩沖液中，然后在-20℃保存。
3)通過聲處理破碎細(xì)胞(0℃，在厭氧條件下，四個30秒的循環(huán)，每次循環(huán)之間間隔2分鐘，存在蛋白酶抑制劑)。通過離心消除細(xì)胞碎片，通過硫酸鏈霉素處理將存在于細(xì)胞勻漿中的核酸沉淀，或者通過酶處理(Benzonase)使其水解(表I)。
表1.對細(xì)胞勻漿進(jìn)行Benzonase或硫酸鏈霉素(粗體)處理對與丙酮醛還原有關(guān)的酶活性的影響。
根據(jù)表1，硫酸鏈霉素處理更加有效，得到更高的比活性。使得可以去除污染物(核酸和不期望的蛋白質(zhì))，同時保持目的酶的生物活性。
4)將硫酸鏈霉素處理的細(xì)胞勻漿離心，并使其通過連至AKTA純化系統(tǒng)的陰離子交換色譜柱(Ressource Q，Amersham Bioscience)，所述柱用50mMHEPES緩沖液和5mM DTT平衡。在pH 7或7.5或8進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。通過連續(xù)KCl梯度(2％)洗脫蛋白質(zhì)，并作為單獨級分收集。
5)將包含酶活性的洗脫級分匯集并施加于疏水相互作用色譜柱(Hitrapphenyl sepharose，Amersham Biosciences)，所述柱用50mM HEPES緩沖液和5mM DTT平衡。
如果需要，可以加入最后一步凝膠滲透色譜。
在每個步驟后確定得率和純化因子。在最后一步純化后，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離活性組分中殘余的蛋白質(zhì)。通過關(guān)聯(lián)級分活性與點跡(spot)大小而鑒定目的蛋白質(zhì)。切除蛋白質(zhì)點，洗滌并用特定的蛋白酶消化(胰蛋白酶消化)，并進(jìn)行質(zhì)譜(LC-MS/MS和MALDI)鑒定。
b)在厭氧條件下生長的菌株大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中與丙酮醛還原有關(guān)的酶的鑒定 在pH 7使用陰離子交換色譜進(jìn)行純化過程，然后用疏水相互作用色譜，鑒定出兩個可還原丙酮醛的依賴NADPH的酶由yqhD基因編碼的YQHD(42KDa)和由ydhF基因編碼的YDHF(33KDa)(圖2)。發(fā)現(xiàn)第三種在依賴NADH和NADPH的丙酮醛還原中有活性的酶(由gldA基因編碼的甘油脫氫酶)。
當(dāng)在pH 8進(jìn)行陰離子交換色譜，然后是疏水相互作用色譜，和凝膠滲透色譜的最后步驟時，鑒定出另一個可還原丙酮醛的依賴NADPH的酶由dkgB(yafB)基因編碼的2，5-二酮-D-葡糖酸還原酶B(29KDa)。
c)在微需氧條件下生長的菌株大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中與丙酮醛還原有關(guān)的酶的鑒定 由所設(shè)計的在pH 7.5使用陰離子交換色譜的純化過程，鑒定出由ycdW基因編碼的稱為YCDW的36KDa蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)催化依賴NADPH的丙酮醛的還原。
當(dāng)在pH 7.5進(jìn)行陰離子交換色譜，然后是疏水相互作用色譜時，鑒定出另外兩個依賴NADPH催化丙酮醛還原的酶由yqhD基因編碼的YQHD(42KDa)(已從在厭氧條件下生長的細(xì)胞中純化)和由dkgA(yqhE)基因編碼的2，5-二酮-D-葡糖酸還原酶A(31KDa)。
實施例2在菌株大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中導(dǎo)入缺失ΔyqhD、ΔyafB、ΔydhF和ΔycdW，以評價所述基因是否涉及丙酮醛還原 a)構(gòu)建修飾的菌株大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::Km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd 根據(jù)操作規(guī)程1，消除菌株大腸桿菌MG1655lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd::cm中的氯霉素抗性盒。
操作規(guī)程1抗性盒的消除 根據(jù)下述技術(shù)消除氯霉素和/或卡那霉素抗性盒。通過電穿孔將攜帶在氯霉素和/或卡那霉素抗性盒的FRT位點發(fā)揮作用的FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20導(dǎo)入菌株。在42℃系列培養(yǎng)后，用表2中給出的寡核苷酸通過PCR分析，檢查抗生素抗性盒是否丟失。
使用表2給出的寡核苷酸檢查菌株中先前建立的修飾是否存在。
將獲得的菌株命名為大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd。
表2.用于檢查抗性盒的插入或抗性盒的丟失的寡核苷酸 b)大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd修飾菌株的構(gòu)建 為了消除卡那霉素抗性盒和失活ldhA基因，根據(jù)操作規(guī)程2，向缺失大部分基因的ldhA基因中插入氯霉素抗性盒。
操作規(guī)程2導(dǎo)入用于重組和重組體選擇的PCR產(chǎn)物 使用表3中選擇和給出的用于替代基因或基因間區(qū)域的寡核苷酸，從質(zhì)粒pKD3擴(kuò)增氯霉素抗性盒或從質(zhì)粒pKD4擴(kuò)增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.(2000))。然后通過電穿孔將獲得的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入攜帶質(zhì)粒pKD46的受體菌株，所述質(zhì)粒中表達(dá)的系統(tǒng)λRed(γβ，exo)對同源重組極為有利。然后選擇對抗生素有抗性的轉(zhuǎn)化體，并用表2中給出的適當(dāng)?shù)墓押塑账幔ㄟ^PCR分析，檢查抗性盒的插入。
用表2中給出的寡核苷酸檢查菌株的其他修飾。
將得到的菌株命名為大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd。
表3.用于通過用PCR產(chǎn)物重組而在大腸桿菌MG1655中替代染色體區(qū)域的寡核苷酸 c)修飾菌株大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔyqhD的構(gòu)建 通過使用操作規(guī)程2中所述技術(shù)，用表3中給出的寡核苷酸插入卡那霉素抗生素抗性盒并缺失相關(guān)基因的大部分而使菌株大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中的yqhD基因失活。
將得到的菌株命名為大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔldA，ΔaldB，Δedd，ΔyqhD::km。
使用表2中給出的寡核苷酸檢查菌株中的其他修飾。
然后根據(jù)操作規(guī)程1消除氯霉素和卡那霉素抗性盒。
將獲得的菌株命名為大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔyqhD。
d)修飾菌株大腸桿菌MG1655lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔyafB的構(gòu)建 通過使用操作規(guī)程2中所述技術(shù)，用表3中給出的寡核苷酸插入卡那霉素抗生素抗性盒并缺失相關(guān)基因的大部分而使菌株大腸桿菌MG1655中的yafB基因失活。將得到的菌株命名為大腸桿菌MG1655ΔyafB::km。
通過用噬菌體P1轉(zhuǎn)導(dǎo)的技術(shù)，進(jìn)行由卡那霉素抗性盒進(jìn)行基因置換而缺失菌株大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中的基因yafB。
操作規(guī)程3用噬菌體P1轉(zhuǎn)導(dǎo)而缺失基因 通過用噬菌體P1轉(zhuǎn)導(dǎo)的技術(shù)，由抗性盒(卡那霉素或氯霉素)進(jìn)行基因置換而缺失受體大腸桿菌菌株中的所選基因。操作規(guī)程為兩個步驟(i)用單一基因缺失制備菌株MG1655的噬菌體裂解物和(ii)由這一噬菌體裂解物轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌株。
噬菌體裂解物的制備 -用單一基因缺失的菌株MG1655的100μl過夜培養(yǎng)物接種10ml LB+Cm 30μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl25mM。
-在37℃震蕩溫育30分鐘。
-加入由野生型菌株MG1655制備的100μl噬菌體裂解物P1(約1×109個噬菌體/ml)。
-在37℃震蕩3小時直至細(xì)胞裂解。
-加入200μl氯仿，并漩渦震蕩。
-在4500g離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片。
-將上清液轉(zhuǎn)移至無菌管中，并加入200μl氯仿。
-在4℃保存裂解物。
轉(zhuǎn)導(dǎo) -將LB培養(yǎng)基中大腸桿菌受體菌株的5ml過夜培養(yǎng)物在1500g離心10分鐘。
-將細(xì)胞沉淀(pellet)懸浮于2.5ml MgSO4 10mM，CaCl25mM中。
-對照管100μl細(xì)胞 包含單一基因缺失的菌株MG1655的100μl噬菌體P1 -測試管(tube test)100μl細(xì)胞+包含單一基因缺失的菌株MG1655的100μl噬菌體P1 -在30℃無震蕩溫育30分鐘。
-在每個管中加入100μl 1M檸檬酸鈉，并漩渦震蕩。
-加入1ml LB。
-在37℃震蕩溫育1小時。
-在7000rpm將管離心3分鐘后涂布于LB+Cm 30μg/ml的平板上。
-37℃過夜培養(yǎng)。
然后選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化體，并用表1中給出的適當(dāng)?shù)墓押塑账?，通過PCR分析檢查缺失的插入。
用表2中給出的寡核苷酸檢查菌株的其他修飾。
將得到的菌株命名為大腸桿菌MG1655lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔyafB::km。
然后根據(jù)操作規(guī)程1消除氯霉素和卡那霉素抗性盒。
將獲得的菌株命名為大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔyafB。
e)修飾菌株大腸桿菌MG1655lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔydhF的構(gòu)建 通過使用操作規(guī)程2中所述技術(shù)，用表3中給出的寡核苷酸插入卡那霉素抗生素抗性盒并缺失相關(guān)基因的大部分而使菌株大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中的基因ydhF失活。將得到的菌株命名為大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔydhF::km。
用表2中給出的寡核苷酸檢查菌株中的其他修飾。
根據(jù)操作規(guī)程1消除氯霉素或卡那霉素抗性盒。
將獲得的菌株命名為大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔydhF。
f)修飾菌株大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔplfAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔycdW的構(gòu)建 通過使用操作規(guī)程2中所述技術(shù)，用表3中給出的寡核苷酸插入卡那霉素抗性盒并缺失相關(guān)基因的大部分而使菌株大腸桿菌MG1655中的ydhW基因失活。將得到的菌株命名為大腸桿菌MG1655ΔycdW::km。
使用操作規(guī)程3中所述噬菌體P1轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，由卡那霉素抗性盒進(jìn)行基因置換而缺失菌株大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔplfAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd中的基因ycdW。
由菌株MG1655ΔycdW::km獲得噬菌體P1的裂解物，并使用這種噬菌體裂解物轉(zhuǎn)導(dǎo)菌株大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，.ΔplfAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd。
將得到的菌株命名為大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，.ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔycdW::km。
用表2中給出的寡核苷酸檢查菌株的其他修飾。
然后根據(jù)操作規(guī)程1消除氯霉素和卡那霉素抗性盒。
將獲得的菌株命名為大腸桿菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔydcW。
f)在編碼已鑒別的丙酮醛還原酶的基因中包含缺失的菌株的培養(yǎng) 在微需氧條件下，在MPG培養(yǎng)基中，在pH 6.7和37℃，在錐形瓶中培養(yǎng)攜帶缺失ΔyqhD、ΔyafB、ΔydhF和ΔycdW的四株菌株。
在培養(yǎng)72h后，通過HPLC測定培養(yǎng)物上清液中的丙酮醇和1，2-丙二醇的產(chǎn)量。結(jié)果示于表4中。
表4在編碼丙酮醛還原酶的基因中包含缺失的菌株的1，2-丙二醇和丙酮醇生產(chǎn)(每個數(shù)值是來自兩次不同培養(yǎng)的兩個數(shù)值的平均值) 結(jié)果顯示，鑒別的所有丙酮醛還原酶都涉及丙酮醛變?yōu)楸己瓦M(jìn)一步變?yōu)?，2-丙二醇的轉(zhuǎn)化。yqhD的缺失導(dǎo)致強(qiáng)的生長抑制，這可能是由于丙酮醛的積累而引起的。yafB和ydhF的缺失也對丙酮醇和1，2-丙二醇的產(chǎn)生具有大的影響。
實施例3大腸桿菌MG1655(pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA)、大腸桿菌MG1655(pME101VB01-yafB-mgsA-gldA)和大腸桿菌MG1655(pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)的修飾菌株的構(gòu)建 為了增加1，2-丙二醇的產(chǎn)生，使用trc啟動子由質(zhì)粒pME101VB01表達(dá)不同組合的基因。
a)質(zhì)粒pME101VB01的構(gòu)建 質(zhì)粒pME101VB01衍生自質(zhì)粒pME101，并且攜帶多克隆位點，其中包含對下述罕見限制性內(nèi)切酶特異性的識別位點序列NheI、SnaBI、PacI、BglII、AvrII、SacII和AgeI，然后是丙酮丁醇梭菌ATCC824的adc轉(zhuǎn)錄終止子。
為了由低拷貝載體表達(dá)，如下構(gòu)建質(zhì)粒pME101使用寡核苷酸PME101F和PME101R PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pCL1920(Lerner和Inouye，1990，NAR 18，15p4631-GenBank AX085428)，并將來自攜帶lacI基因和trc啟動子的載體pTrc99A(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J)的BstZ 17I-XmnI片段插入擴(kuò)增的載體中。
PME101F(SEQ ID NO 55) ccgacagtaagacgggtaagcctg PME101R(SEQ ID NO 56) agcttagtaaagccctcgctag 使用合成的雙鏈核酸接頭產(chǎn)生pME101VB01，所述接頭包含多克隆位點和adc轉(zhuǎn)錄終止子。將兩個互補(bǔ)的100個堿基的寡核苷酸退火，所述寡核苷酸的側(cè)翼為用NcoI和HindIII消化的限制性位點。將100個堿基對的產(chǎn)物亞克隆進(jìn)用NcoI/HindIII消化的質(zhì)粒pME101，以產(chǎn)生pME101VB01。
pME101VB011，由100個堿基組成(SEQ ID NO57) catgggctagctacgtattaattaaagatctcctagggagctcaccggtTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTAggcgcgcca pME101VB012，由100個堿基組成(SEQ ID NO58) agcttggcgcgccTAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAaccggtgagctccctaggagatctttaattaatacgtagctagcc 具有 -對應(yīng)于多克隆位點的區(qū)域(帶下劃線的小寫字母) -對應(yīng)于丙酮丁醇梭菌ATCC 824pSOL1(NC_001988)的adc轉(zhuǎn)錄終止子(序列179848至179814)的區(qū)域(大寫字母)。
b)用于表達(dá)1，2-丙二醇的生物合成途徑中基因的不同組合的質(zhì)粒(pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA、pME101VB01-yafB-mgsA-gldA和pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)的構(gòu)建 使用表1中給出的寡核苷酸從基因組大腸桿菌MG1655PCR擴(kuò)增不同的基因。
表5.用于擴(kuò)增1，2-丙二醇途徑的基因的寡核苷酸 用表5中所述限制性酶剪切PCR擴(kuò)增的片段，并克隆進(jìn)質(zhì)粒pME101VB01的限制性位點。構(gòu)建下述質(zhì)粒pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA、pME101VB01-yafB-mgsA-gldA和pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA。
然后將質(zhì)粒導(dǎo)入菌株大腸桿菌MG1655。
實施例4能以高產(chǎn)量產(chǎn)生1，2-丙二醇的大腸桿菌MG1655 Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF(pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA)，(pJB137-PgapA-ppsA)、大腸桿菌MG1655 Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF(pME101VB01-yafB-mgsA-gldA)，(pJB137-PgapA-ppsA)和大腸桿菌MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF(pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)，(pJB137-PgapA-ppsA)的修飾菌株的構(gòu)建 使用操作規(guī)程2中所述的技術(shù)，用表3中給出的寡核苷酸，用FRT-CmR-FRT和工程改造的啟動子替代225bp的上游gapA序列，從而用合成的短Ptrc16啟動子(SEQ ID NO 69gagctgttgacgattaatcatccggctcgaataatgtgtgg)替代菌株大腸桿菌MG1655中的天然gapA啟動子。
用表2中給出的寡核苷酸，通過PCR分析檢查抗性盒的插入。
將得到的菌株命名為大腸桿菌MG1655 Ptrc16--gapA::cm。
使用操作規(guī)程2中所述技術(shù)，用表3給出的寡核苷酸，通過插入卡那霉素抗生素抗性盒和缺失相關(guān)基因的大部分而使菌株大腸桿菌MG1655中的基因edd-eda失活。將獲得的菌株命名為大腸桿菌MG1655Δedd-eda::km。
根據(jù)操作規(guī)程3，將缺失轉(zhuǎn)移進(jìn)菌株大腸桿菌MG1655Ptrc16-gapA::cm。
將得到的菌株命名為大腸桿菌MG1655Ptrc16-gapA::cm，Δedd-eda::km。
然后根據(jù)操作規(guī)程1消除抗生素抗性盒。
根據(jù)操作規(guī)程2，用表3中給出的寡核苷酸，構(gòu)建菌株MG1655ΔgloA::cm，并根據(jù)操作規(guī)程3將缺失轉(zhuǎn)移進(jìn)先前構(gòu)建的菌株中。將得到的菌株命名為大腸桿菌MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA::cm。
根據(jù)操作規(guī)程2中所述技術(shù)，用表3給出的寡核苷酸，通過插入卡那霉素抗生素抗性盒和缺失相關(guān)基因的大部分而使先前的菌株中的基因pykA失活。將得到的菌株命名為大腸桿菌MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA::cm，ΔpykA::km。
然后根據(jù)操作規(guī)程1消除抗生素抗性盒。
根據(jù)操作規(guī)程2中所述技術(shù)，用表3給出的寡核苷酸，通過插入氯霉素抗生素抗性盒而使基因pykF失活。將得到的菌株命名為大腸桿菌MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF::cm。
然后根據(jù)操作規(guī)程1消除抗生素抗性盒。
在每個步驟，使用表3中給出的寡核苷酸檢查先前構(gòu)建的所有缺失是否存在。
為了增加磷酸烯醇丙酮酸的產(chǎn)生，使用gapA啟動子由質(zhì)粒pJB137表達(dá)ppsA基因。為了構(gòu)建質(zhì)粒pJB137-PgapA-ppsA，使用下述寡核苷酸從大腸桿菌MG1655的基因組DNA PCR擴(kuò)增基因ppsA。
1.gapA-ppsAF，由65個堿基組成(SEQ ID NO70) ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC 具有 -與基因ppsA(1785136至1782758)的序列(1785106-1785136)同源的區(qū)域(大寫字母)，網(wǎng)站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的參照序列，和 -與gapA啟動子(1860794-1860761)同源的區(qū)域(小寫字母) 2.ppsAR，由43個堿基組成(SEQ ID NO71) aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC 具有 -與基因ppsA(1785136至1782758)的區(qū)域的序列(1782758-1782780)同源的區(qū)域(大寫字母) -限制性位點HindIII(帶下劃線的字母) 同時使用下述寡核苷酸擴(kuò)增大腸桿菌基因gapA的gapA啟動子區(qū)域 1.gapA-ppsAR，由65個堿基組成(SEQ ID NO72) GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtgaataaaagg 具有 -與基因ppsA(1785136至1782758)的序列(1785106-1785136)同源的區(qū)域(大寫字母)，和 -與gapA啟動子(1860794-1860761)同源的區(qū)域(小寫字母)。
2.gapAF，由33個堿基組成(SEQ ID NO73) ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc 具有 -與gapA啟動子(1860639-1860661)同源的區(qū)域(小寫字母)。
-限制性位點SmaI(帶下劃線的字母) 然后使用寡核苷酸ppsAR和gapAF將兩個片段融合(Horton等，1989Gene7761-68)。用限制性酶HindIII和SmaI剪切PCR擴(kuò)增的片段，并克隆進(jìn)載體pJB137(EMBL登錄號U75326)的HindIII/SmaI位點，得到載體pJB137-PgapA-ppsA。
將不同的pME101VB01質(zhì)粒和pJB137-PgapA-ppsA導(dǎo)入菌株大腸桿菌MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF。將獲得的菌株分別命名為大腸桿菌MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF，pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA，pJB137-PgapA-ppsA(菌株1)，大腸桿菌MG1655 Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF，pME101VB01-yafB-mgsA-gldA，pJB137-PgapA-ppsA(菌株2)和大腸桿菌MG1655 Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF，pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA，pJB137-PgapA-ppsA(菌株3)。
實施例5在需氧條件下不同菌株1，2-丙二醇生產(chǎn)的比較。
在需氧條件下，在錐形瓶實驗中，在以葡萄糖作為碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)如實施例4中所述獲得的菌株(菌株1、2和3)和對照菌株(對照1MG1655pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA，對照2MG1655 pME101VB01-yafB-mgsA-gldA，對照3MG1655pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA和對照4MG1655Ptrc16-gapA，Δedd-eda，ΔgloA，ΔpykA，ΔpykF)。在34℃或37℃進(jìn)行培養(yǎng)，并通過用MOPS緩沖培養(yǎng)基而保持pH。在培養(yǎng)結(jié)束時，通過HPLC分析發(fā)酵液中的1，2-丙二醇、丙酮醇和殘余的葡萄糖，并計算1，2-丙二醇對葡萄糖的得率和1，2-丙二醇+丙酮醇對葡萄糖的得率。

序列表
<110>代謝探索者公司(METABOLIC EXPLORER)
<120>用于產(chǎn)生1，2-丙二醇和丙酮醇的微生物和方法
<130>D25262
<150>PCT/IB2007/001677
<151>2007-03-23
<160>73
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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gtcctttggc tttgagctgg tgtaggctgg agctgcttcg 100
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ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt tttgcagcgt60
agtctgagaa atactggtca gcatatgaat atcctcctta g 101
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ttagcgggcg gcttcgtata tacggcggct gacatccaac gtaatgtcat gattttcgcc60
cagttgggtc atgccgtgct ccatatgaat atcctcctta g 101
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tctgtgataa cggcgcttgt gtaggctgga gctgcttcg 99
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<400>40
tcccattcag gagccagacc ttccgggcta accaggcggt cgttgcaatc cagtgcggcg60
atcgcttttt tatcttcggc catatgaata tcctccttag 100
<210>41
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>41
ttacggtacg tcgtacccca gtgccgcttt acggatacga aaccattgtt gacgggtcat60
tttcagtgtt tctgcttcga ctgtaggctg gagctgcttc g 101
<210>42
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>42
atggttcagc gtattactat tgcgccgcaa ggcccggagt tttcccgttt tgtgatgggc60
tactggcgat tgatggactg gcatatgaat atcctcctta g 101
<210>43
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>43
atgagaataa atttcgcaca acgcttttcg ggagtcagta tggatatcat cttttatcac60
ccaacgttcg atacccaatg gtgtaggctg gagctgcttc g 101
<210>44
<211>99
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>44
ttagtagccg cgtgcgcggt cgacttgccc gcagaccctc tccccttttt cgagctgggc60
aatggtgcga gaaatgtacc atatgaatat cctccttag 99
<210>45
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>45
agtcatatat tccaccagct atttgttagt gaataaaagc cacacattat tcgagccgga60
tgattaatag tcaacagctc tgtaggctgg agctgcttcg 100
<210>46
<211>79
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>46
gctcacatta cgtgactgat tctaacaaaa cattaacacc aactggcaaa attttgtccc60
atatgaatat cctccttag 79
<210>47
<211>102
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>47
cgcgcgagac tcgctctgct tatctcgccc ggatagaaca agcgaaaact tcgaccgttc60
atcgttcgca gttggcatgc ggtgtaggct ggagctgctt cg 102
<210>48
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>48
gcttagcgcc ttctacagct tcacgcgcca gcttagtaat gcggtcgtaa tcgcccgctt60
ccagcgcatc tgccggaacc catatgaata tcctccttag 100
<210>49
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>49
atgcgtcttc ttcataccat gctgcgcgtt ggcgatttgc aacgctccat cgatttttat60
accaaagtgc tgggcatgaa gtgtaggctg gagctgcttc g 101
<210>50
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>50
ttagttgccc agaccgcgac cggcgtcttt ctcttcgatt aactcaattt tgtaaccgtc60
cggatcttcc acaaacgcga catatgaata tcctccttag 100
<210>51
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>51
cgcggcgggt gccaacgttg tacgtatgaa cttttctcac ggctcgcctg aagatcacaa60
aatgcgcgcg gataaagttc gtgtaggctg gagctgcttc g 101
<210>52
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>52
cgccgcatcc ggcaacgtac ttactctacc gttaaaatac gcgtggtatt agtagaaccc60
acggtactca tcacgtcgcc ccatatgaat atcctcctta g 101
<210>53
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>53
cgcggcgggt gccaacgttg tacgtatgaa cttttctcac ggctcgcctg aagatcacaa60
aatgcgcgcg gataaagttc gtgtaggctg gagctgcttc g 101
<210>54
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>54
cgccgcatcc ggcaacgtac ttactctacc gttaaaatac gcgtggtatt agtagaaccc60
acggtactca tcacgtcgcc ccatatgaat atcctcctta g 101
<210>55
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>55
ccgacagtaa gacgggtaag cctg 24
<210>56
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>56
agcttagtaa agccctcgct ag 22
<210>57
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>57
catgggctag ctacgtatta attaaagatc tcctagggag ctcaccggtt aaaaataaga60
gttaccttaa atggtaactc ttattttttt aggcgcgcca 100
<210>58
<211>100
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>58
agcttggcgc gcctaaaaaa ataagagtta ccatttaagg taactcttat ttttaaccgg60
tgagctccct aggagatctt taattaatac gtagctagcc 100
<210>59
<211>79
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>59
ctagctagcg gcgtaaaaag cttagcgggc ggcttcgtat atacggcggc tgacatccaa60
cgtaatgtcg tgattttcg 79
<210>60
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>60
cgatgcacgt catgaacaac tttaatctgc acaccccaac ccg 43
<210>61
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>61
cgtacgtact gtaggaaagt taactacgg 29
<210>62
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>62
gaagatcttt acttcagacg gtccgcgag 29
<210>63
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>63
gacctaggct ctaaaggagc aattatgg28
<210>64
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>特異性引物
<400>64
cgagctctta ttcccactct tgcagg 26
<210>65
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>65
catgccatgg ctatccctgc atttggttta 30
<210>66
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>66
ctagctagct taatcccatt caggagccag 30
<210>67
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>67
catgccatgg ctaatccaac cgttattaag c31
<210>68
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>68
ctagctagct tagccgccga actggtcagg 30
<210>69
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的啟動子
<400>69
gagctgttga cgattaatca tccggctcga ataatgtgtg g41
<210>70
<211>65
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>70
ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatgtcc aacaatggct cgtcaccgct60
ggtgc65
<210>71
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>71
aatcgcaagc ttgaatccgg ttatttcttc agttcagcca ggc 43
<210>72
<211>65
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>72
gcaccagcgg tgacgagcca ttgttggaca tatattccac cagctatttg ttagtgaata60
aaagg65
<210>73
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>73
acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc 3權(quán)利要求
1.用于由碳源產(chǎn)生1，2-丙二醇和/或丙酮醇的修飾的微生物，其中所述微生物以增加的丙酮醛還原酶活性為特征，所述酶由來自微生物的一個或多個基因編碼。
2.權(quán)利要求1的微生物，其中與相應(yīng)的未修飾的微生物的丙酮醛還原酶活性相比，丙酮醛還原酶活性增加至少50％，優(yōu)選至少100％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項的微生物，其中通過過表達(dá)與丙酮醛還原有關(guān)的至少一個基因而增加丙酮醛還原酶活性。
4.權(quán)利要求3的微生物，其中通過將與丙酮醛還原有關(guān)的基因之一的天然啟動子替代為誘導(dǎo)所述基因的更強(qiáng)表達(dá)水平的啟動子而獲得過表達(dá)。
5.權(quán)利要求3的微生物，其中通過將與丙酮醛還原有關(guān)的至少一個基因的多個拷貝導(dǎo)入微生物而獲得過表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一項的微生物，其中下述基因中至少一個過表達(dá)yqhD、yafB、ydhF、ycdW、yqhE、yeaE、yghZ、yajO、tas、ydjG和ydbC。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的微生物，其中丙酮醛合酶活性增加。
8.權(quán)利要求7的微生物，其中mgsA基因的表達(dá)增加。
9.權(quán)利要求7的微生物，其中mgsA基因包含特定突變。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的微生物，其中與Entner-Doudoroff途徑有關(guān)的至少一個酶的活性被削弱。
11.權(quán)利要求10的微生物，其中下述基因中至少一個的表達(dá)被削弱edd、eda。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項的微生物，其中與丙酮醛轉(zhuǎn)化成乳酸有關(guān)的至少一個酶的活性被削弱。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的微生物，其中下述基因中至少一個的表達(dá)被削弱gloA、aldA、aldB。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項的微生物，其中與乳酸、甲酸或乙醇合成有關(guān)的至少一個酶的活性被削弱。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的微生物，其中下述基因中至少一個的表達(dá)被削弱ldhA、pflA、pflB、adhE。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項的微生物，其中涉及乙酸合成的至少一個酶的活性被削弱。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的微生物，其中下述基因中的至少一個的表達(dá)被削弱ackA、pta、poxB。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項的微生物，其中磷酸丙糖異構(gòu)酶的活性被削弱。
19.權(quán)利要求18的微生物，其中tpiA基因的表達(dá)被削弱。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項的微生物，其中3-磷酸甘油醛脫氫酶活性被削弱。
21.權(quán)利要求20的微生物，其中g(shù)apA基因的表達(dá)被削弱。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21的微生物，其中糖輸入的效率增加。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的微生物，其中使用不依賴磷酸烯醇丙酮酸的糖輸入系統(tǒng)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的微生物，其中選自galP和glk中至少一個基因的表達(dá)增加。
25.根據(jù)權(quán)利要求20或21的微生物，其中通過增加代謝物“磷酸烯醇丙酮酸”的可用性來改進(jìn)糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的效率。
26.權(quán)利要求25的微生物，其中至少一種丙酮酸激酶的活性被削弱。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的微生物，選自pykA和pykF中至少一個基因的表達(dá)被削弱。
28.權(quán)利要求25至27中任一項的微生物，其中磷酸烯醇丙酮酸合酶活性增加。
29.權(quán)利要求28的微生物，其中ppsA基因的表達(dá)增加。
30.根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項的微生物，其中甘油脫氫酶活性增加。
31.權(quán)利要求30的微生物，其中g(shù)ldA基因的表達(dá)增加。
32.根據(jù)權(quán)利要求1至31中任一項的微生物，其中1，2-丙二醇氧化還原酶活性增加。
33.權(quán)利要求32的微生物，其中fucO基因的表達(dá)增加。
34.根據(jù)權(quán)利要求1至33中任一項的微生物，其中利于將丙酮酸代謝成乙酰-CoA的酶對NADH的抑制的敏感性低于未修飾的酶。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的微生物，其中l(wèi)pd基因具有導(dǎo)致丙氨酸55被纈氨酸替代的點突變。
36.根據(jù)權(quán)利要求1至35中任一項的微生物，其中選自arcA和ndh中的至少一個基因的表達(dá)被削弱。
37.根據(jù)權(quán)利要求1至36中任一項的微生物，其中微生物選自下組細(xì)菌、酵母和真菌。
38.權(quán)利要求37的微生物，其中微生物選自下組腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)和棒桿菌科(Corynebacteriaceae)。
39.權(quán)利要求38的微生物，其中微生物是大腸桿菌(Escherichia coli)或丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。
40.根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項的微生物，其中丙酮醇變?yōu)?，2-丙二醇的轉(zhuǎn)化中涉及的至少一個酶的活性被削弱。
41.權(quán)利要求40的微生物，其中g(shù)ldA基因的表達(dá)被削弱。
42.根據(jù)權(quán)利要求40或41的微生物，其中微生物選自下組細(xì)菌、酵母和真菌。
43.權(quán)利要求42的微生物，其中微生物選自下組腸桿菌科、芽孢桿菌科、鏈霉菌科和棒桿菌科。
44.權(quán)利要求43的微生物，其中微生物是大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。
45.用于制備1，2-丙二醇的方法，其中將根據(jù)權(quán)利要求1至39中任一項的微生物在包含碳源的適當(dāng)生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并回收產(chǎn)生的1，2-丙二醇。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中微生物來自大腸桿菌菌種，并且碳源是簡單碳源。
47.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中微生物來自丙酮丁醇梭菌菌種，并且碳源是復(fù)雜碳源。
48.根據(jù)權(quán)利要求45至47中任一項的方法，其中將回收的1，2-丙二醇進(jìn)一步純化。
49.用于制備丙酮醇的方法，其中將根據(jù)權(quán)利要求1至29或40至44中任一項的微生物在包含簡單碳源的適當(dāng)生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并回收產(chǎn)生的丙酮醇。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中將回收的丙酮醇進(jìn)一步純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及丙酮醛還原酶活性增加的修飾的微生物，和其用于制備1，2-丙二醇和/或丙酮醇的用途。具體地，這種增加的丙酮醛還原酶活性通過增加來自微生物的特定基因的表達(dá)而獲得。本發(fā)明還涉及通過發(fā)酵丙酮醛還原酶活性增加的微生物而產(chǎn)生1，2-丙二醇和/或丙酮醇的方法。
文檔編號C12P7/02GK101641444SQ200880009585
公開日2010年2月3日 申請日期2008年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月23日
發(fā)明者菲利普·索凱爾, 伊莎貝爾·邁尼爾-薩爾斯, 弗朗索瓦·沃爾克, 雷納·菲格 申請人:代謝探索者公司