專利名稱：：腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)及腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：醫(yī)學(xué)研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有重要關(guān)系的核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測(cè)定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別診斷，重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鑒別的重要診斷標(biāo)志。腺苷脫氨酶的活性測(cè)定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據(jù)申請(qǐng)人了解，目前國(guó)際上普遍采用紫外光法，其測(cè)定原理是腺苷(白色結(jié)晶粉末)+水(H20)腺苷脫氨酶肌苷(Inosine)+氨離子(NH4+)，此反映過(guò)程生成的肌苷會(huì)在波長(zhǎng)為265nm處顯現(xiàn)，因此可以通過(guò)測(cè)定此波長(zhǎng)處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無(wú)法用一般醫(yī)院的可見光分析儀測(cè)定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實(shí)推廣應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用間接酶循環(huán)擴(kuò)增法(IndirectEnzymaticRecyclingMethod)、酶比色法(EnzymaticColorimetricMethod)及酶(偶)聯(lián)法(CoupleReaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。本發(fā)明腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定方法如下腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨氨+2水+6高鐵細(xì)胞色素c亞硝酸還原酶/Ca"亞硝酸+6亞鐵細(xì)胞色素c亞硝酸+3還原型輔酶亞硝酸還原酶氫氧化銨+3輔酶+水這種方法應(yīng)用腺苷脫氨酶(AdenosineDeaminase;EC3.5.4.4)酶(偶)聯(lián)亞硝酸還原醇(nitritereductase;EC1.7.2.2)、另一禾中亞石肖酸還原醇(nitritereductase;EC1.7.1.4)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。腺苷脫氨酶及需要鈣離子激活的亞硝酸還原酶(EC1.7.2.2)都作為作用酶，功能為將腺苷酶解產(chǎn)生氨，再生成亞硝酸。另一個(gè)亞硝酸還原酶(EC1.7.1.4)作為循環(huán)酶亞硝酸還原酶(EC1.7.1.4)的酶促作用使亞硝酸再次產(chǎn)生氨離子(氫氧化銨)，使氨可以不斷的被重復(fù)循環(huán)利用。亞硝酸還原酶(EC1.7.1.4)又作為顯色酶，一次可以將三個(gè)還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為三個(gè)輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算腺苷脫氨酶的活性濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明腺苷脫氨酶診斷試劑較為理想<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>鈣離子是亞硝酸還原酶(EC1.7.2.2)的激活劑，因此氯化鈣可用其它鈣鹽取代。本發(fā)明的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶。還原型輔酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑l緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣。試劑2緩沖液、穩(wěn)定齊U、亞硝酸還原酶。試劑3緩沖液、穩(wěn)定齊U、亞硝酸還原酶。還原型輔酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，其還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一種。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例一本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為單試劑，包括[OO42]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑500mmol/L還原型輔酶0.25mmol/L亞硝酸還原酶10000U/L亞硝酸還原酶10000U/L腺苷5mmol/L高鐵細(xì)胞色素C5,1/L氯化f丐3mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度I.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)腺苷脫氨酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值-4180。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。實(shí)施例二本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為雙試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液lOOmmol/L穩(wěn)定劑50mmol/L還原型輔酶0.25mmol/L腺苷5mmol/L高鐵細(xì)胞色素C5,1/L氯化鈣3mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液lOOmmol/L穩(wěn)定劑500mmol/L亞硝酸還原酶10000U/L亞硝酸還原酶10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度I.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)腺苷脫氨酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值-2170。L加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢效主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。實(shí)施例三本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為三試劑，包括試劑l三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶腺苷高鐵細(xì)胞色素C氯化鈣試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑亞硝酸還原酶試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑亞硝酸還原酶100,1/50mmol/L0.25,1/L5mmol/L5mmol/L3mmol/L100,1/500,1/L10000U/L11IOO,I,500,1/L10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)腺苷脫氨酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值-2170。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。申請(qǐng)人:經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上
發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉?？傊瑢?shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0006;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線下降；試劑可測(cè)有效(R>0.99)線形范圍可達(dá)400U/L;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過(guò)±4%;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達(dá)0.013±0.007AA/min/U/L;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。權(quán)利要求一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的腺苷脫氨酶活性濃度測(cè)定方法，其方法如下腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨氨+2水+6高鐵細(xì)胞色素c亞硝酸還原酶/Ca2+亞硝酸+6亞鐵細(xì)胞色素c亞硝酸+3還原型輔酶亞硝酸還原酶氫氧化銨+3輔酶+水將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小結(jié)果。2.—種腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，主要成分包括試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。氯化鈣可用其它鈣鹽取代。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成單劑試劑。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶組成。還原型輔酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在試劑1或試劑2中的位置可以不限。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、亞硝酸還原酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、亞硝酸還原酶組成。還原型輔酶、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑1——4000mmol/L或0.1%_100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。6亞鐵細(xì)胞色素c緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶亞硝酸還原酶亞硝酸還原酶腺苷高鐵細(xì)胞色素C氯化鈣全文摘要本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定腺苷脫氨酶活性濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、腺苷、高鐵細(xì)胞色素C、氯化鈣、二個(gè)不同的亞硝酸還原酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的速度，從而測(cè)算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。文檔編號(hào)C12Q1/26GK101750380SQ20081024427公開日2010年6月23日申請(qǐng)日期2008年12月10日優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日公開號(hào)200810244274.X發(fā)明者王爾中申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司