專利名稱：鑒定浙江種源的玄參的核苷酸序列、核酸分子探針和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法鑒定道地浙玄參的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說， 是涉及一種鑒定浙江種源的玄參的核苷酸序列、核酸分子探針和方法。
背景技術(shù)：
玄參(^brap/m/aharaV^poem^/feww/.)最早"i己載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，又名元 參，浙玄參，水蘿卜，八穢麻等(中國植物志六十七巻第二分冊，1979)，是著 名中藥材"浙八味"之一，根藥用，有滋陰降火，消腫解毒的功效；現(xiàn)也運用 于化妝品生產(chǎn)，作為植物潤滑劑、防凍霜、防皺霜等。
玄參是我國特有種，分布較廣，很多地區(qū)都有栽培，其中浙江種源的玄參根 粗肥大、產(chǎn)量高、品質(zhì)佳。但是，中藥材種植上存在品種混亂問題，原材料市 場上存在品質(zhì)優(yōu)劣問題。僅僅依靠傳統(tǒng)的形態(tài)分析已不能進行品種的科學(xué)鑒定 和種源的遺傳分析。目前還沒有一種可靠有效的方法可以將品質(zhì)較好的浙江種 源的玄參與其他地區(qū)的玄參區(qū)分開來，解決藥材地道性問題。
近年來，隨著中藥現(xiàn)代化步伐的加快，中藥的標(biāo)準(zhǔn)化已成為中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展和 打入國際市場的瓶頸。藥用植物或植物藥的發(fā)展離不開標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，即目前大 力推行的GAP(Goodagriculturing Practice,中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范)工作的核 心。而種(品)質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)及科學(xué)的鑒定方法是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制和管理的前提。 迄今為止，國際上有關(guān)玄參植物化學(xué)、藥用價值等方面的研究已有不少報導(dǎo)， (戴金秋等，1994;鄒節(jié)明等，2005;謝麗華等，2000;俞靜靜等，2006.)但是 尚未見有關(guān)玄參藥材道地性DNA快速鑒定的技術(shù)的研究報導(dǎo)(Cao H.， Liu YP., 1998)。因此，有必要在DNA分子標(biāo)記水平采用新方法新技術(shù)快速鑒定浙江種 源的玄參，解決中草藥種植上品種混亂和原材料市場上品質(zhì)優(yōu)劣等問題。
(Elizabeth et al" 2003; Elizabeth, A.S. ， 2003 ) 參考文獻
《中國植物志》1979，第六十七巻，第二分冊，科學(xué)出版社。 戴金秋等，1994.浙江產(chǎn)玄參的化學(xué)成分。現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，11 (4): 16-17. 鄒節(jié)明等，2005.苦玄參HPLC指紋圖譜研究.中國藥學(xué)雜志09期. 謝麗華等.，2000.中藥玄參薄層色譜鑒別法的建立.中國中藥雜志，25(11): 654-656.
俞靜靜等，2006.玄參有效部位的藥理研究進展.Chinese Journal of the
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species-specific SCAR markers in Bentgrass. Crop Sci, 43:345 - 349.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鑒定浙江種源的玄參的核苷酸序列、核酸分子探 針和方法。
用于鑒定浙江種源的玄參的核苷酸序列是該序列來源于ISSR通用引物 UBC874擴增所得的浙江玄參特異性核苷酸序列，具體序列為
actatcatcgtctttgtccatcccatcatcctgtcctccttcttcttttctcttttggagggcaagct tccacttcttaaaccacatgattctttgacgggttttcattatatttgcaagatctctcctaccttga tgtttctctttctccgaaaaataacggaaaaaaactcggggactcccaactcaacaaacaceictattc aaatcagctggacaattctcattgtaaattgtggtatccaattcatgaatgtcgggtaaaacaatgtc cggaattggtatattcaactcatccaacatctcaBctgatgggacttcacattcaaaaccatcaatct cagtgtcgctcacagaattaaccaactccatgaaattttcctaattttctttggcttttccttgtcct tttccttgtcttttgatgttggcgtcaaagaccaatcaaagggctagttaatagaaattgtttatgca aataacttacatacataacttaatagaaatttgcactcttaaagagttacgcgttaaatgtaattgaa acaaaatttgtatttactcatcaagttaaaaagggctctatELteLatttcatgctcagcaacaaagaac aagctgaaaaactgaacaatagtttcaagttgagLatgagttacttagacaceiaatgagaaaataBaag agagctcacactttctactcacattattactgccttattagaaatagcagctaagcaaaagttgaagc ttttaacagaacaacaacaatgcaacatagaacaaacttcggttaatgatagatcaatatacacacat atataaactgaatacacaaattagaaaattgatagtttttattgcaagaaattgctccaaacccttga taagtaattttataatgctcgaactggttacaaattgtatatacatccatcaatttaacacattaata caaaatgtgtcatttcttaacacatatttcatgtgtaaattacaacatttaatactcggctatctttc cat gattttgtcgatgcttctaatttcgaacaactatgtttccttacttttgaagaacaggagaacta gctataactccacagacttttctaaagtaatagaaagatagatacactactaccaagttcaaatgttt caaagcatgaaatatttgttcacgctaggacaatcacctgaaatctttcgatgacggtgaggcggcga tgggcggtgggcggcgtgacttgtgcgcgctgagggagggagggagg。
浙江種源的玄參專一性核酸分子探針是該核酸分子探針來源于權(quán)利要求1 所述核苷酸序列中的1段或2段22個核苷酸的長的寡核苷酸序列或它們的互補 序列；或者是上述這些序列經(jīng)修飾、變化，且其核苷酸變化量不超過10%的序 列。
核苷酸序歹ij為cc874u : 5'-ctatcatcgtctttgtccatcc-3'或 cc874d : 5'-tgctttgaaacatttgaacttg畫3'，或者為cc874u禾卩cc874d。
鑒定浙江種源的玄參的方法是采用PCR方法，以權(quán)利要求2或3所述的核 酸分子探針為PCR引物，進行PCR反應(yīng)，其步驟和過程按常規(guī)PCR方法進行。 所說的核酸分子探針為權(quán)利要求3所述的cc874u和cc874d。 本發(fā)明具有的有益效果
1) 樣品用量少，僅需少量樣品就可以完成整個操作。
2) 準(zhǔn)確、靈敏度高，cc874u/cc874d為浙江種源玄參的專一性分子探針，若 為其他種源，為陰性反應(yīng)。


圖1是釆用ISSR引物UBC874進行PCR擴增的電泳圖(紅色框內(nèi)的條帶 是浙江種源的玄參特有的條帶，分子量為1300bp左右)；
圖2是采用玄參浙江種源專一性核酸分子探針cc874u和cc874d對各地玄參 進行檢測的PCR擴增電泳圖3是采用玄參浙江種源專一性核酸分子探針cc874u和cc874d對各地玄參 進行檢測的PCR擴增電泳圖中YC:浙江磐安窈川種源的玄參，RL:浙江磐安仁川種源的玄參，GMC: 浙江磐安光明村種源的玄參，XJ:浙江仙居種源的玄參，PA:浙江磐安尚湖種
源的玄參，HB:湖北種源的玄參，SX:陜西種源的玄參，SC:種植在四川廣源 地區(qū)的玄參(引種自浙江)，M:分子量。
具體實施方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明可以從遺傳本質(zhì)上客觀準(zhǔn)確地鑒定浙江產(chǎn)的玄參。具體包括1提 供用于玄參浙江種源鑒定的DNA片段；2提供來源于上述DNA片段的浙江種 源玄參專一性核酸分子探針；3提供利用上述核酸分子探針鑒定浙江種源的玄
參的方法。
在釆用ISSR分子標(biāo)記研究各地產(chǎn)的玄參的遺傳多樣性時發(fā)現(xiàn)，ISSR通用 引物UBC874擴增的帶型中，浙江產(chǎn)的玄參有特異性條帶，能將其與其他地區(qū) 的玄參區(qū)別開。因此，可根據(jù)此特異性條帶合成專一性的核酸分子探針，建立 快速、準(zhǔn)確鑒定浙江種源玄參的分子生物學(xué)方法，用于玄參藥材道地性的檢測。
本發(fā)明提供的用于鑒別浙江種源玄參的核苷酸序列來源于采用ISSR通用引 物UBC874擴增所得的浙江玄參的特異性序列，該序列的結(jié)構(gòu)特征如序列表中 的序列1 (<210〉1)所示。
該序列(<210>1)可通過如實施例1所述的方法得到；或者按已知的該序 列核苷酸組成與排列，在商業(yè)化的DNA自動合成儀上按常規(guī)方法合成而得到。
本發(fā)明的浙江種源玄參專一性核酸分子探針是以上述浙江玄參特異性核苷 酸序列為基礎(chǔ)，利用Primer Primer 5.0 (Vinay Singh, 1998)軟件設(shè)計得出。該分 子探針為浙江玄參特異性核苷酸序列中的1段或2段22個核苷酸組成的寡核苷 酸序列，或它們的互補序列；或者是上述這些序列再經(jīng)修飾、變化，且其核苷 酸變化量不超過總核苷酸量的10%的序列。。
本發(fā)明的上述浙江玄參專一性核酸分子探針為序列表中<210>2和<210>3 所示的序列(分別簡稱為cc874u和cc874d)。
本發(fā)明的上述浙江玄參專一性核酸分子探針，可按照預(yù)先根據(jù)浙江玄參特 異性核苷酸序列設(shè)計好的序列，通過常規(guī)的DNA合成方法合成而得到(例如可 以使用商業(yè)化的DNA自動合成儀進行合成)。
本發(fā)明的上述浙江玄參專一性核酸分子探針，具有極高的專一性，能與浙 江種源的玄參專一性反應(yīng)，但不與其他種源的玄參的DNA發(fā)生反應(yīng)。所以，利 用該核酸分子探針，通過PCR方法可以快速、準(zhǔn)確地鑒別浙江種源的玄參。
本發(fā)明所提供的玄參浙江種源的鑒定方法，可采用PCR方法以前面所述 的本發(fā)明的核酸分子探針(優(yōu)選為cc874u和cc874d)為PCR引物，進行PCR 反應(yīng)。具體步驟和過程按常規(guī)PCR方法的操作進行按照經(jīng)過優(yōu)化的PCR體系 逐一將樣品加入PCR管中，放入PCR儀器，采用經(jīng)過優(yōu)化的PCR程序進行PCR 擴增。采用該PCR方法可快速、準(zhǔn)確地檢測鑒定玄參的浙江種源，而且樣品用
由于本發(fā)明所提供的核酸分子探針為浙江種源的玄參專一性探針，因此， 在樣品種源未知的情況下，可以通過檢測樣品中是否存在該段寡核苷酸序列， 鑒定出其是否為浙江種源，為玄參藥材道地性的鑒定提供了客觀、快速、準(zhǔn)確 的方法，解決了藥材巿場上玄參種源混雜的問題。
序列表中的<210>1序列是浙江種源的玄參特異性核苷酸序列，其中帶下劃 線的部分(70-92bp和1210-1232bp)分別為本發(fā)明的浙江種源玄參專一性寡核 苷酸分子探針cc874u和cc874d。
以下通過具體實施例對本發(fā)明作進一步說明 實施例1:浙江種源玄參特異性核苷酸序列的制備
1基因組DNA的提取
采用改良CTAB法(Doyle, 1991)提取葉片基因組DNA。步驟如下
1) 取約0.05克的硅膠干燥葉片，加入少量PVP粉，置入磨樣管中，用 BIO101磨樣機研磨，SPEED 4.0, TIME 20s 。
2) 迅速加入65。C預(yù)熱的2XCTAB提取緩沖液(含2。/。b-巰基乙醇)800 — 1000ul， 搖均后轉(zhuǎn)入5ml離心管中，再用800—1000ul2XCTAB清洗磨樣管， 轉(zhuǎn)入同一個5ml管中，65。 C水浴30分鐘。
3) 冷卻至室溫，加等體積的氯仿異戊醇(24: 1)，混合均勻(緩慢顛 倒)15-30分鐘，室溫10000rpm離心10 — 15分鐘。
4) 吸取上層水相，加入1/10體積的10%CTAB，輕輕混勻，再加入等體 積的氯仿異戊醇(24:1)抽提，重復(fù)步驟(3)。
5) 吸取上層水相，加入0.5體積的5MNaCl混勻，再加入等體積-2(TC預(yù) 冷的異丙醇，輕輕搖勻，于放置2小時或過夜。
6) 10000rpm離心10min，使DNA附著離心管管底，棄水相。
7) 加75%乙醇浸洗2-3次，用無水乙醇清洗一次，去乙醇，風(fēng)干。
8) 用適量O.lxTE溶解DNA沉淀，-20 1;保存?zhèn)溆谩?2 ISSR—PCR
用ISSR通用引物UBC874進行PCR擴增，擴增體系如下表所示10XBuffer (Mg2+ free)2. 5W (IX Buffer )
MgCl2 (25mM)(2. 0 mM )
d,s (10 mM)0. 5H1 (0. 2 mM)
引物UBC874 (5贈214 (0. 4 MM )
Taq酶(5U / W )0. 25W (1, 2 U)
模板DNA ( 30 ng / (4 )2. 5H1 (60ng)
ddH2015. 7614
總體積25^1
PCR程序為
94。C5 min
94°C30 sec
59。C45 sec
72。C1.5 min
72°C10 min
4°C保溫
45 cycles
PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1，紅色框內(nèi)的條帶(分子量為1300bp左右)是采 用ISSR引物UBC874進行PCR擴增時尋找到的浙江種源的玄參特有的條帶。 如圖所示，浙江種源的玄參(包括種植于四川的玄參)在分子量1300bp左右均 有條帶出現(xiàn)，而其他種源的玄參在分子量1300bp左右沒有條帶出現(xiàn)。因此，此 條帶即為浙江種源玄參的特有條帶。 3序列測定
PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳，對只在浙江群體中出現(xiàn)的 特異性ISSR片段進行切膠，采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Sangon， Shanghai, China) 回收純化所切片段。然后將所純化的DNA片段連接到PUCm-T載體(Sangcm， Shanghai, China)上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中。目的片段采用引物M13+/-于商業(yè)化的DNA自動測序儀上測定，得到如序列表中<210>1序列所示的核苷 酸組成與排列。
實施例2:玄參浙江種源專一性核酸分子探針cc874u和cc874d的制備
在獲得浙江玄參特異性核苷酸序列的基礎(chǔ)上，利用Primer Primer 5.0 (Vinay Singh, 1998)軟件設(shè)計，得出cc874u和cc874d (分別為序列表中<400>1所示的 70-92bp和1210-1232bp)的核苷酸組成與排列是用于鑒定浙江種源的玄參的良
好寡核苷酸片段。根據(jù)cc874u和cc874d的核苷酸組成的排列(序列表中<210>2 和<210>3序列所示的核苷酸組成與排列)，在DNA自動合成儀上合成得到。 實施例3:玄參浙江種源的鑒定(常規(guī)PCR方法)
1 、 DNA的提取采用改良CTAB法提取玄參DNA
2 、 PCR反應(yīng)體系為
10XBuffer (Mg2+ free)2. 541 (IX Buffer )
MgCl2 (25mM)21^1 (2. 0 mM )
dNTPs (10 mM)0. 514 (0. 2 mM)
cc874u(5140(0. 4 MM )
cc874d(5MM)(0. 4 MM )
T叫酶(5U / Pi )0.25H1 (1.2 U)
模板DNA ( 30 ng / Ml )2. 5W (60ng)
ddH2015. 76t4
總體積25ri
3、 PCR操作取2個0.5毫升PCR管，按照步驟2分別加入22.5微升PCR 混合液，然后一管加入DNA2.5微升，另一管加入2.5微升PCR混合液(對照)， 放于PCR儀卜.，按下列程序進行PCR反應(yīng) 940C
94。C 59。C 72。C 72°C
5 mm 30 sec 45 sec 1.5 min 10 min
45 cycles
PCR擴增結(jié)果用含有0.1% EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結(jié)果見 圖2和圖3，如圖所示，浙江種源的玄參(包括種植于四川的玄參)在分子量 1300bp左右均有條帶出現(xiàn)，而其他種源的玄參在分子量1300bp左右沒有條帶出 現(xiàn)。表明采用cc874u和cc874d進行PCR檢測，若樣品中含有浙江種源的玄 參則為陽性反應(yīng)，反之則為陰性反應(yīng)(無PCR擴增帶)，說明了 cc874u和cc874d 引物的專一性。
權(quán)利要求
1、一種用于鑒定浙江種源的玄參的核苷酸序列，其特征是該序列來源于ISSR通用引物UBC874擴增所得的浙江玄參特異性核苷酸序列，具體序列為tccctccctccctcccttaaatccgaatccacaattacactcctactactctcaacaccctccaaatcactatcatcgtctttgtccatcccatcatcctgtcctccttcttcttttctcttttggagggcaagcttccacttcttaaaccacatgattctttgacgggttttcattatatttgcaagatctctcctaccttgatgtttctctttctccgaaaaataacggaaaaaaactcggggactcccaactcaacaaacacactattcaaatcagctggacaattctcattgtaaattgtggtatccaattcatgaatgtcgggtaaaacaatgtccggaattggtatattcaactcatccaacatctcaactgatgggacttcacattcaaaaccatcaatctcagtgtcgctcacagaattaaccaactccatgaaattttcctaattttctttggcttttccttgtccttttccttgtcttttgatgttggcgtcaaagaccaatcaaagggctagttaatagaaattgtttatgcaaataacttacatacataacttaatagaaatttgcactcttaaagagttacgcgttaaatgtaattgaaacaaaatttgtatttactcatcaagttaaaaagggctctatataatttcatgctcagcaacaaagaacaagctgaaaaactgaacaatagtttcaagttgaaatgagttacttagacacaaatgagaaaataaaagagagctcacactttctactcacattattactgccttattagaaatagcagctaagcaaaagttgaagcttttaacagaacaacaacaatgcaacatagaacaaacttcggttaatgatagatcaatatacacacatatataaactgaatacacaaattagaaaattgatagtttttattgcaagaaattgctccaaacccttgataagtaattttataatgctcgaactggttacaaattgtatatacatccatcaatttaacacattaatacaaaatgtgtcatttcttaacacatatttcatgtgtaaattacaacatttaatactcggctatctttccatgattttgtcgatgcttctaatttcgaacaactatgtttccttacttttgaagaacaggagaactagctataactccacagacttttctaaagtaatagaaagatagatacactactaccaagttcaaatgtttcaaagcatgaaatatttgttcacgctaggacaatcacctgaaatctttcgatgacggtgaggcggcgatgggcggtgggcggcgtgacttgtgcgcgctgagggagggagggagg。
2、 一種以權(quán)利要求1的核苷酸序列為基礎(chǔ)而設(shè)計的浙江種源的玄參專一性 核酸分子探針，其特征是該核酸分子探針來源于權(quán)利要求1所述核苷酸序列中 的1段或2段22個核苷酸的長的寡核苷酸序列或它們的互補序列；或者是上述 這些序列經(jīng)修飾、變化，且其核苷酸變化量不超過10%的序列。
3、 按照權(quán)利要求2所述的核酸分子探針，其特征是其核苷酸序列為:cc874u: 5'-ctatcatcgtctttgtccatcc-3'或cc874d: 5'誦tgctttgaaacatttgaacttg-3'，或者為cc874u 和cc874d。
4、 一種用權(quán)利要求2或3所述的核酸分子探針鑒定浙江種源的玄參的方法， 其特征是采用PCR方法，以權(quán)利要求2或3所述的核酸分子探針為PCR引物， 進行PCR反應(yīng)，其步驟和過程按常規(guī)PCR方法進行。
5、 按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所說的核酸分子探針為權(quán)利要求 3所述的cc874u和cc874d。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定浙江種源的玄參的核苷酸序列、核酸分子探針和方法。屬于利用分子生物學(xué)方法鑒定玄參藥材道地性的技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了浙江種源的玄參(Srophularia ningpoensis)特異性核苷酸序列及來源于該序列的核酸分子探針，以及利用該探針鑒別玄參浙江種源的方法。本發(fā)明具有的有益效果1)樣品用量少，僅需少量樣品就可以完成整個操作。2)準(zhǔn)確、靈敏度高，cc874u/cc874d為浙江種源玄參的專一性分子探針，若為其他種源，為陰性反應(yīng)。
文檔編號C12N15/11GK101096708SQ20071006988
公開日2008年1月2日 申請日期2007年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月3日
發(fā)明者傅承新, 潘蘭蘭, 趙云鵬, 川 陳, 陳炳龍 申請人:浙江大學(xué)