專利名稱：環(huán)丙孕酮乙酸酯的改進合成方法
技術領域：
本發(fā)明涉及合成環(huán)丙孕酮乙酸酯(17α-乙酰氧基-6-氯-1α，2α-亞甲基-4，6-孕二烯-3，20-二酮)的改進方法。
背景技術：
式(M)的環(huán)丙孕酮乙酸酯(17α-乙酰氧基-6-氯-1α，2α-亞甲基-4，6-孕二烯-3，20-二酮，CAS 427-51-0) 首先在DE-AS 11 58 966中描述為具有強妊娠活性的化合物。隨后被發(fā)現其還是有效的雄激素拮抗劑(Neumann.抗雄激素環(huán)丙孕酮乙酸酯在基礎研究中的發(fā)現，化學，基礎藥理學，臨床應用和工具，Exp Clin Endocrinol(1994)，1021-32)。該化合物目前是存在于用于各種疾病的藥物組合物中的有價值藥物。
存在用于化合物的化學合成的各種策略，參見例如DE-OS 40 06 165或Neumann，同上。常規(guī)合成方法由式(A)的茄解定開始
它可由熱帶植物Solanum laciniatum，Ait的葉子提取，根據圖1，包含費力的18個步驟方法(Sree，Rao和Mahapatra，Research and Industry，27卷，1982，326-328頁；Ringold等，J.Am.Chem.Soc.，78卷，1976，816-819頁；US3,485,852；DE 1075114；Ringold等，J.Am Chem.Soc.，81，3485(1959)；GB890315；The Merck Index，12版，1996；The Merck Index，12版，1996；US3,234,093)。
發(fā)明公開本發(fā)明現在提供用于該有價值的化合物的改進合成方法，它們是更快和成本更有效的。尤其是，通過本發(fā)明，相對于常規(guī)的18步合成法，能夠以14或16步由茄解定合成環(huán)丙孕酮乙酸酯。
為實現此改善，本發(fā)明提供尤其有利的一些反應步驟。因此，在一實施方案中，它涉及制備環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)的方法，包括(a)將6，7α-環(huán)氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)通過一步法轉化為氯地孕酮乙酸酯(K2)；(b)在(K2)的1位上引入雙鍵得到去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯(L2)；和(c)引入橋接(L2)1位和2位的亞甲基得到環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)。
如下方案說明該方法
優(yōu)選，步驟(a)通過將無水氯化氫氣體通過含有6，7α-環(huán)氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)的反應混合物進行?；蛘?，使用在含水二烷中的鹽酸得到中間體氯醇，它可脫水得到乙酸氯地孕酮(Bruckner，Hampel，和Johnson，Chem.Ber.，94，1225，1961；Lednicer和Mitscher，藥物合成的有機化學，John Wiley and Sons，New York，1977)。
在另一優(yōu)選實施方案中，步驟(b)通過使用脫氫試劑2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ，CAS 84-58-2)進行，二烷可用作溶劑?；蛘撸墒褂枚趸?，例如與用作溶劑的吡啶和叔丁基醇一起使用(US專利3,485,852)，或根據Ringold等的方法，J.Amer.Soc.，81，1959，3485)。進行該步驟的另一種方法是使用在乙酸中的Pb(OAc)4(Abe，T.，Amer.Chem.Pharm，Bull.，21(6)，1973，1295-1299)。此外，DDQ可以與在苯中的4-硝基-苯酚一起使用(Abe T.，Kambegawa，A.，Chem.Pharm.Bull.，22，1974，2824-2829)。
步驟(c)方便地使用C1試劑前體碘化三甲基氧化锍(TMSI，CAS1774-47-6)和堿金屬氫化物進行，DMSO可用作溶劑(Goto，G等，Chem.Pharm.Bull.，26，1978，1718-1728)。此外，該步驟可使用重氮甲烷，用酸處理實現(Krakower and Van Dine，J.Org.Chem，31，3467(1966)。按照Wiechert和Kaspar，Chem.Ber.，93，1710(1960)，另一種方法可采用重氮甲烷和水解。另一種反應途徑可以是使用重氮甲烷和熱解掉氮(Lednicer D和Mitscher LA，藥物合成的有機化學，2卷，A Wiley-Interscience Publication，1980，166頁)。多步驟實施方案由Tolf等描述(Tolf等，Tetrahedron Lett，25，43，1984，4855-4858)。
因此，在另一方面，本發(fā)明涉及制備環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)的方法，包括使乙酸氯地孕酮(L2)與碘化三甲基氧化锍(TMSI)和堿金屬氫化物，優(yōu)選氫化鈉反應。反應可在二甲基亞砜(DMSO)中進行。
在優(yōu)選實施方案中，6，7α-環(huán)氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)通過如下方法得到，該方法包括(d)在17α-乙酰氧基孕酮(H)的6位引入雙鍵，將其轉化為4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(I2)；(e)將(I2)6位的雙鍵轉化為環(huán)氧官能團得到6，7α-環(huán)氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)。
該方法用如下方案說明
步驟(d)可通過單獨地使用氯醌(四氯-對-苯醌，CAS 118-75-2)，或氯醌與二氧化硒的混合物方便地進行(Lednicer D，Mitscher LA，藥物合成的有機化學，2卷，A Wiley-Interscience Publication，1980，182卷)。在另一實施方案中，可使用在叔丁基醇或甲苯中的氯醌(L.F.Fieser和M.Fieser，用于有機合成的試劑，1卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1967)。另一種方法是DDQ和用作催化劑的TsOH(L.F.Fieser和M.Fieser，用于有機合成的試劑，2卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1969)。
步驟(e)可用間-氯-過苯甲酸或單過氧鄰苯二甲酸進行?；蛘撸墒褂眠^苯甲酸和用作溶劑的二氯甲烷(US3,234,093)，或根據Lednicer和Mitscher的方法使用過苯甲酸，藥物合成的有機化學，2卷，A Wiley-IntersciencePublication，1980，166頁。
17α-乙酰氧基孕酮(H)可由茄解定用本領域的已知方法方便地制備。茄解定可通過例如Solanum laciniatum，Ait的干葉或新鮮或干燥綠槳果的醇提取，使用例如2-丙醇或甲醇作為提取劑，和隨后水解得到的配糖茄解堿得到。植物原料優(yōu)選在提取前被干燥和粉碎成粉末，提取劑優(yōu)選是在水中的65-85％(v/v)2-丙醇，更優(yōu)選70-80％(v/v)2-丙醇。初級提取產物茄解堿可由提取物中沉淀，例如通過向熱提取物中加入熱水和氨溶液，并使其冷卻。通常粗沉淀物通過如下實施例1中所示，通過洗滌和重結晶步驟被進一步純化，隨后例如用鹽酸酸解，得到茄解定鹽酸鹽。水解優(yōu)選在2-丙醇中的1N鹽酸中進行，隨后可通過由堿性醇溶液重結晶得到游離茄解定。茄解定隨后可通過在乙酸/乙酐中回流，例如在催化量的對甲苯磺酸(TsOH)和/或吡啶存在下，轉化為16-脫氫孕烯醇酮(16-DPA)，隨后氧化，例如用鉻酐、三氯化鉻或重鉻酸鈉，再次用乙酐回流。
在一方面，本發(fā)明涉及制備16-脫氫孕烯醇酮乙酸酯(B)的方法，其包括(k)乙?；呀舛?A)得到O，N-二乙?；呀舛ǎ?l)異構化O，N-二乙酰基茄解定得到假茄解定二乙酸酯；(m)在相轉移催化劑存在下氧化得到的假茄解定二乙酸酯。
如上所述，茄解定的乙酰基化可通過使其與乙酐在催化量的堿和/或對甲苯磺酸存在下反應得到，堿可以是吡啶。異構化可以用乙酸進行。在氧化步驟中的相轉移催化劑優(yōu)選是碘化四乙基銨或硫酸氫四丁基銨，優(yōu)選后者。作為氧化劑，可使用重鉻酸鉀、重鉻酸鈉或高錳酸鉀，優(yōu)選重鉻酸鉀，二氯甲烷可用作溶劑。氧化在酸性PH下進行，這可使用用硫酸實現，氧化產物水解得到16-DPA。
尤其有利的是在一步方法中將16-DPA(B)轉化為16，17α-環(huán)氧孕烯醇酮(C)。這可通過使(B)與過氧化物，優(yōu)選過氧化氫在堿性溶液，優(yōu)選堿性醇溶液中反應實現，在該反應中，甲醇可用作溶劑，氫氧化鈉用作堿。
隨后(C)可轉化為16-溴-17α-羥基-孕烯醇酮，例如通過加成HBr，例如在冰醋酸中，得到溴醇(bromohydrin)(D1)和溴醇乙酸酯(D2)的混合物(參見附圖3A，4A)。隨后溴醇可使用催化劑，如阮內鎳還原成17α-羥基孕烯醇酮(E2，與乙酸酯E1，Δ5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮-3-乙酸酯的混合物)，通過與甲酸反應轉化為3-甲酸酯(F)。隨后它通過與乙酐和催化的酸，例如對甲苯磺酸反應轉化為17-乙酸的二酯(G)。(G)可與丙醇鋁反應得到17α-乙酰氧基-孕酮(H)(參見附圖3A，4A)。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供制備環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)的方法，其包括(f)通過一步法在17α-乙酰氧基孕酮(H)的1和6位引入雙鍵將其轉化為1，4，6-三烯化合物(I1)；(g)引入橋接1和2位的亞甲基得到1，2α-亞甲基化合物(J1)；(h)引入橋接(J1)的6和7位的環(huán)氧基得到6，7α-環(huán)氧化合物(K1)；(i)將(K1)的環(huán)氧基團轉化為6-氯-7-羥基化合物(L1)；和(j)將(L1)轉化為環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)。
該反應過程通過如下方案說明
用于步驟(f)的優(yōu)選試劑是脫氫試劑2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ，CAS 84-58-2；Muller，M.等，Helvetica Chemica Acta，63，1878，1980)。或者，使用在無水二烷中的溴得到二溴化物(中間體)，它與三甲基吡啶反應(US2,962,510)。
步驟(g)有利地使用C1試劑前體碘化三甲基氧化锍(TMSI，CAS1774-47-6)和堿金屬氫化物進行?；蛘?，該步驟可使用重氮甲烷，用酸處理實現(Krakower和Van Dine，J.Org.Chem，31，3467(1966)。按照Wiechert和Kaspar，Chem.Ber.，93，1710(1960)，另一種方法可采用重氮甲烷和水解。另一種試劑可以是重氮甲烷和熱解掉氮(Lednicer D和Mitscher LA，藥物合成的有機化學，2卷，A Wiley-Interscience Publication，1980，166頁)。多步驟實施方案由Tolf等描述(Tolf等，Tetrahedron Lett，25，43，1984，4855-4858)。
步驟(h)可使用間-氯過苯甲酸進行(CAS 937-14-4)，在一實施方案中，二氯甲烷用作溶劑(US3,234,093)?；蛘撸珻-6雙鍵與間-氯過氧苯甲酸(m-CPBA)的環(huán)氧化可根據Shibata等，Chem.Pharm.Bull，40(4)，935-941(1992)的方法進行。
對于步驟(i)，三氟甲基磺酰氯(CAS 421-83-0)是選擇的試劑，優(yōu)選與氯化鋰結合使用?；蛘?，可在75℃使用在DMSO中的N，N-二甲基乙酰胺鹽酸鹽(Uthai Sakee，Boonsong Kongkathip and Nganpong Kongkathip，Abstract ofthe 27thScience and Technology Conference of Thailand，234頁)。最后步驟(j)可使用堿金屬乙酸鹽，如乙酸鈉進行。
因此，在另一方面，本發(fā)明涉及制備環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)的方法，其包括使式(K1)化合物 與氯化鋰/三氟甲基磺酰氯反應得到下式化合物(L1) 化合物(L1)與乙酸鹽水溶液，優(yōu)選乙酸鈉水溶液反應得到環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)。
同樣，17-α-乙酰氧基孕酮(H)可根據如上所述的本領域中的已知方法方便地由茄解定制備。
在另一方面，本發(fā)明涉及制備去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯(L2)的方法，其包括將氯地孕酮乙酸酯(K2)加入能夠將(K2)轉化為(L2)的微生物培養(yǎng)物中，由培養(yǎng)物分離得到的去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯。微生物優(yōu)選是簡單節(jié)桿菌(Arthrobacter simplex)或球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)，更優(yōu)選菌株ATCC 6946或ATCC 13805，它們可由American Type Culture Collection(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA獲得。優(yōu)選將外源電子載體加入培養(yǎng)物，例如濃度為0.1-1.0mmol/l，優(yōu)選0.2-0.4mmol/l的甲萘醌(2-甲基-1，4-萘醌)。此外，收率可通過向培養(yǎng)物加入類固醇改善，例如濃度為0.01-0.55mmol/l，更優(yōu)選0.3-0.5mmol/l的氫化可的松。當培養(yǎng)液含有5％二甲基甲酰胺(DMF)以改善類固醇的溶解性時得到良好結果。通過加入表面活性劑，優(yōu)選非離子表面活性劑進一步改善收率，更優(yōu)選濃度為0.25-1.0％(w/v)，更優(yōu)選0.5-1.0％的聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(Tween 80TM)。對B.sphaericus，0.1-0.2mmol/l氯地孕酮乙酸酯原料濃度是最佳的，而對于A.simplex，良好原料濃度是0.2-0.3mmol/l去氯地孕酮乙酸酯。盡管方法的總收率低于化學合成法，但它尤其有利于大規(guī)模生產，因為它能夠避免大量的毒性試劑(DDQ)和有機溶劑(二烷)。
在本發(fā)明中，術語“反應混合物”包括由液體和/或固體組分組成的均相混合物以及多相混合物，如懸浮液、漿狀物等。
具體的，本發(fā)明包括以下方面(1)制備環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)的方法，包括(a)將6，7α-環(huán)氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)通過一步法轉化為氯地孕酮乙酸酯(K2)；(b)在(K2)的1位上引入雙鍵得到去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯(L2)；和(c)引入橋接(L2)1位和2位的亞甲基得到環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)。
(2)項1的方法中，其中6，7α-環(huán)氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)通過如下方法得到，其包括(d)在17α-乙酰氧基孕酮(H)的6位引入雙鍵，將其轉化為4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(I2)；(e)將(I2)6位的雙鍵轉化為環(huán)氧官能團得到6，7α-環(huán)氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)。
(3)項(1)或(2)的方法，其中步驟(a)通過將無水氯化氫氣體通過含有6，7α-環(huán)氧-4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯(J2)的反應混合物進行。
(4)項(1)-(3)任一的方法，其中步驟(b)通過使用2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)進行。
(5)項(1)-(4)任一的方法，其中步驟(c)使用碘化三甲基氧化锍(TMSI)和堿金屬氫化物，優(yōu)選氫化鈉進行。
(6)項(2)-(5)任一的方法，其中步驟(d)使用氯醌進行。
(7)項(2)-(6)任一的方法，其中步驟(e)使用間-氯-過苯甲酸或單過氧鄰苯二甲酸進行。
(8)制備環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)的方法，其包括(f)通過一步法在17α-乙酰氧基-孕酮(H)的1和6位引入雙鍵將其轉化為1，4，6-三烯化合物(I1)；(g)引入橋接1和2位的亞甲基得到1，2α-亞甲基化合物(J1)；(h)引入橋接(J1)6和7位的環(huán)氧基得到6，7α-環(huán)氧化合物(K1)；(i)將(K1)的環(huán)氧基團轉化為6-氯-7-羥基化合物(L1)；和(j)將(L1)轉化為環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)。
(9)項(8)的方法，其中在步驟(f)中使用DDQ。
(10)項(8)或(9)的方法，其中在步驟(g)中使用TMSI和堿金屬氫化物。
(11)項(8)-(10)任一的方法，其中在步驟(i)中使用三氟甲基磺酰氯和氯化鋰。
(12)項(1)-(11)任何之一的方法，其中17α-乙酰氧基孕酮(H)通過包括以本領域已知的方法將茄解定(A)轉化為17α-乙酰氧基孕酮(H)的方法制備。
(13)項(12)的方法中，其中16-去氫孕烯醇酮乙酸酯(B)通過一步法轉化為16，17-環(huán)氧-孕烯醇酮(C)。
(14)項(13)的方法，其中(B)向(C)的轉化通過在堿性溶液中使用過氧化氫實現。
(15)制備環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)的方法，其包括使去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯(L2)與TMSI和堿金屬氫化物，優(yōu)選氫化鈉反應。
(16)制備環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)的方法，其包括使式(K1)化合物
與氯化鋰/三氟甲基磺酰氯或氯化鋰/N，N-二甲基乙酰胺鹽酸鹽反應得到下式化合物(L1) 和使化合物(L1)與乙酸鹽水溶液，優(yōu)選乙酸鈉水溶液反應得到環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)。
(17)制備16-去氫孕烯醇酮乙酸酯(B)的方法，包括(k)乙酰基化茄解定(A)得到O，N-二乙酰基茄解定；(l)異構化O，N-二乙?；呀舛ǖ玫郊偾呀舛ǘ宜狨ィ?m)在相轉移催化劑存在下氧化得到的假茄解定二乙酸酯。
(18)項(17)的方法，其中相轉移催化劑是硫酸氫四丁基銨。
(19)項(17)或(19)的方法，其中氧化劑是重鉻酸鉀或重鉻酸鈉。
(20)制備去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯(L2)的方法，包括將氯地孕酮乙酸酯(K2)加入能夠將(K2)轉化為(L2)的微生物培養(yǎng)物中，由培養(yǎng)物分離得到的去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯。
(21)項(20)的方法，其中微生物是簡單節(jié)桿菌(Arthrobacter simplex)或球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)。
(22)項(21)的方法，其中簡單節(jié)桿菌是ATCC 6946或球形芽孢桿菌是ATCC 13805。
(23)項(20)-(22)任一的方法，其中將電子載體加入培養(yǎng)物，優(yōu)選甲萘醌(2-甲基-1，4-萘醌)。
(24)項(20)-(23)任一的方法，其中向培養(yǎng)物加入類固醇，優(yōu)選氫化可的松。
(25)項(20)-(24)任一的方法，其中將表面活性劑加入培養(yǎng)物中，優(yōu)選聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。


附圖1A-1B說明由茄解定的環(huán)丙孕酮乙酸酯的常規(guī)18步合成法。
附圖2給出本發(fā)明合成途徑的實驗概要的縱覽。
附圖3A-3B說明根據本發(fā)明的途徑A由茄解定的環(huán)丙孕酮乙酸酯合成法。
附圖4A-4B說明根據本發(fā)明的途徑B由茄解定的環(huán)丙孕酮乙酸酯合成法。
附圖5A-5C說明根據本發(fā)明的途徑C由茄解定的環(huán)丙孕酮乙酸酯合成法。
實施例1由Solanum laciniatum，Ait的葉提取茄解定1.PCRNC方法1.1茄解堿分離將500g粉碎干燥的葉放在2升Erlenmeyer燒瓶中，加入1400ml含水異丙醇(80％v/v)，混合物回流4小時。過濾提取的混合物，殘余物重新提取5次，匯總所有6次濾液。合并的濾液用旋轉蒸發(fā)器濃縮直到蒸發(fā)濾液中的所有異丙醇。使混合物靜置過夜，隨后過濾。濾液加熱到80℃，加入相等體積的水?；旌衔镬o置1小時，磁力攪拌。加入25％氨水直至形成沉淀物。在80℃持續(xù)攪拌1小時。將混合物轉移到2升分液漏斗中，靜置過夜。倒出上清液，沉淀物用水徹底洗滌直至上清液無色。脫色也可通過電解或用H2O2漂白進行?；旌衔锿ㄟ^濾紙過濾，棄掉濾液。配糖生物堿的沉淀物在60℃下干燥，經柱色譜法由配糖生物堿分離茄解定和β澳洲茄邊堿。
1.2茄解堿/β澳洲茄邊堿水解將10g粗配糖茄解堿放置在250ml圓底燒瓶中，加入100ml異丙醇和8.3ml鹽酸(37％HCl)，在水浴中回流3小時。隨后使其冷卻到室溫，靜置過夜。過濾混合物，沉淀物用異丙醇(20ml)洗滌，由異丙醇和氫氧化鈉水溶液(50％)重結晶。產物(茄解定)是無色的，形成六邊形片狀體。
*茄解定收率％＝干燥葉子的0.8％(由50g干燥葉子)。
**水解還可通過使用純酶(半乳糖苷酶/葡萄糖苷酶)或來自微生物(A.niger，E.coli，酵母)的酶反應進行。
2.由Solanum laciniatum，Ait提取茄解定的替代方法2.1替代方法1(由R.Culford Bell和Linsay H.Briggs改進，Journal ofthe Chemical Society，1942，1-2頁)茄解堿分離.來自生長在Chiang Mai(泰國)灌木叢中的干的綠漿果用醇充分提取。當大多數醇通過蒸餾由提取物中除去后，加入過量的2％乙酸水溶液，通過蒸汽蒸餾除去殘余的醇。過濾水溶液，沸騰濾液，加入氨水形成顆粒狀沉淀的粗茄解堿(在冷卻下沉淀產生凍膠)。粗生物堿通過溶解在稀乙酸中并再次用氨水沉淀純化，隨后由60-80％醇和80％二烷-水重復結晶(由更高濃度醇或二烷結晶產生凍膠)得到無色尖角片狀體，m.p.284-285℃(分解)。
茄解堿水解.純生物堿用過量的3％鹽酸在100℃加熱3小時(與茄解堿鹽酸鹽相反，茄解定鹽酸鹽在冷卻下僅微溶，在結晶條件下由熱溶液也可沉淀)。冷卻后，收集鹽酸鹽，由80％醇重結晶兩次，懸浮在熱水中，用氨水堿化，在100℃加熱半小時。在冷卻后收集茄解定，由80％醇重復結晶，形成六邊形片狀體，m.p.197.5-198.5℃。
2.2替代方法2(由Linsay H.Briggs和R.C.Cambie，Journal of theChemical Society，1958，1422-5頁)S.laciniatum，Ait-茄解堿分離.將新鮮綠漿果(466g)粗切碎，立即在回流下用沸騰的醇提取2小時，由混合物分離果肉，用熱甲醇充分洗滌，在消泡劑存在下減壓濃縮濾液至少量體積。在加入等體積水后，向沸騰的溶液中加入氨水，在冷卻后收集凝結的沉淀物。灰色配糖生物堿以結晶狀態(tài)由3％乙酸溶液與氨水再沉淀兩次。由含水甲醇(75％)重復結晶(炭)得到茄解堿的無色、扁平針狀物(4.10g)，m.p.301-302℃(分解)，在296℃燒結。部分純化的物質(m.p.297-301℃)在水-飽和丁-1-醇中在氧化鋁上(預先用濕丁-1-醇攪拌，保持1小時)色譜純化，用丁-1-醇/甲醇(1∶1)展開，得到單一產物(由75％甲醇為針狀物)，m.p.301-302℃(分解)，與單獨用結晶法純化的一致。
茄解堿水解-在乙醇(10ml)中的茄堿(500mg)通過在濃鹽酸(2ml)中回流3小時水解，在水解后30分鐘沉積的結晶鹽酸鹽(細長針狀物)在冷卻過夜后收集，用水(10ml)洗滌。鹽酸鹽懸浮液用濃氨水(25ml)在100℃處理1小時得到粗糖苷配基。由甲醇結晶三次后得到茄解定大的無色六邊形片狀體，m.p.和混合m.p.196-198℃。紅外光譜與真實茄解定一致。
2.3替代方法3(U.S3,960,839，Milton Gverrero，Equador，1976)A.huapag的果實在pinton階段摘下，使用1kg的果實。每個果實通過沿果實軸兩次互相垂直的切割分成四分之一，隨后在60℃的烘箱中干燥直至足夠脆以易于粉碎。果實隨后在簡單的開槽圓盤研磨機中粉碎只是為了避免破裂種子。粉碎果實的重量是270g，基于在100℃下的失重，粉碎顆粒的固體含量是94％。
為進行提取，將粉碎的果實放置在2升Erlenmeyer燒瓶中，加入810ml含水異丙醇(按體積計77％異丙醇)。將燒瓶塞住，提取在室溫下以劇烈手動攪拌和靜置的交互5分鐘周期進行2小時。提取的混合物在圓錐漏斗中在濾紙上排水，固體放回Erlenmeyer燒瓶中。為進行第二次提取，加入另外部分(540ml)的含水異丙醇，重復交替攪拌和靜置，只是周期是1小時而不是2小時。液體同樣進行排水，隨后進行與第二次同樣的第三次提取，合并所有三次濾液。
合并的液體緩慢加入用水浴在60-70℃下加熱的1升旋轉蒸發(fā)器中。最初的壓力是約150mm汞柱，逐漸下降到50mm，此時餾出液基本上是純水。不使含水殘余物冷卻，但通過加入加熱到60-70℃的水調整其重量至510g。加水持續(xù)2分鐘，同樣攪拌混合物。立即形成沉淀物，混合物隨后靜置4小時，在此期間，其冷卻到接近室溫。
隨后上清液通過中等濾紙倒出，最后的沉淀物(P)轉移至濾紙。P是細粉碎但容易過濾的物質，其顏色是橄欖褐色。在100℃干燥后，P重量是1.9g，該物質在約160℃開始熔融，但在230℃仍未完全熔化。
將濾液放置在配有回流冷凝器的1升圓底燒瓶中，隨后加熱到80℃。保持在此溫度下，磁力攪拌，同時加入15ml的25％氨水，在80℃持續(xù)攪拌1小時以上?；旌衔锪⒓赐ㄟ^中等濾紙過濾，丟棄濾液，它具有9-10的pH，沒有糖苷。
保持在濾紙上的濾餅在吸水紙間擠壓以除去盡可能多的液體。隨后在60℃干燥到25.7g最后重量，在100℃進一步干燥達到27.7％失重。25.7g濾餅樣品分析顯示，它含有16.7g糖苷，表示在純化和分離過程中糖苷損失可以忽略。
B.在1升圓底燒瓶中放入46g濕的粗糖苷(如A部中所述制備)、138g異丙醇、37g鹽酸(37.6％HCl)和9g自來水。燒瓶配備回流冷凝器和磁性攪拌器，在水浴中回流加熱3小時。結束后，內容物是淺棕色懸浮液，使其在2小時內冷卻到室溫。隨后加入在40％(重量)氫氧化鈉水溶液，氫氧化鈉首先以5ml的增量加入，隨后滴加。在添加過程中，混合物用手劇烈打漩1-2分鐘。在約pH9時，混合物的粘度明顯下降，顏色加深，第二液相的形成變得明顯。在pH約9.5-10時停止加入堿，此時液體明顯分成兩相，可觀察到形成沉淀物，加入的氫氧化鈉溶液總量是29ml。
使混合物在室溫下靜置11/2小時，隨后借助重力通過中等濾紙過濾，沉淀物通過在吸水紙間擠壓干燥。
濾液由兩層組成，上層是棕色的，顯示除雜質外含有大部分異丙醇以及非常少量的茄解定。下層是暗棕色，顯示含有水、氯化鈉和雜質。丟棄全部濾液。濕沉淀物與加入的含水鹽酸一起攪拌直至pH在6-7之間，使其靜置過夜。隨后混合物通過中等濾紙借助重力過濾，沉淀物在吸水紙間擠壓，沉淀物在烘箱中在60℃干燥12小時。
沉淀物的干重是14g。
在所報道的純茄解定在200-202℃熔融的基礎上，估計沉淀物含有97％茄解定。過程中早期得到的不太純的樣品在191-197℃熔融，含有95％茄解定。
2.4.替代方法4
2.4.1原料收集在Bann Huay Sai District，Chiang Mai(泰國)生長3.5月的S.laciniatum的漿果(編碼No.160695-3P)和葉(編碼No.G1090395)，在烘箱中在60℃下干燥，用簡單開槽圓盤研磨機中粉碎成粉末。茄解定參照標準，16-DPA，和其它化學品由Sigma Co.(St.Louis，MO，USA)購買。用于色譜法的溶劑是HPLC級，其它溶劑是試劑級。
2.4.2由Solanum laciniatum Ait分離茄解定2.4.2.12-丙醇濃度對粗糖苷提取的效果在70℃，干葉粉(500g)在Erlenmeyer燒瓶中用0-100％v/v的2-丙醇/水提取4-5次(每次1.5l)，匯總所有的濾液，用旋轉蒸發(fā)器(Buchi，Switzerland)真空蒸發(fā)2-丙醇。濾液加熱到80℃，攪拌，同時加入30％氨水溶液直至pH達到9-10。收集形成的沉淀物，隨后粗糖苷在圓底燒瓶中用在2-丙醇中的1N鹽酸水解3小時。加入20％氫氧化鈉溶液以沉淀粗茄解定，純茄解定通過在甲醇中結晶得到。用70-80％(v/v)2-異丙醇，在此范圍內0.45％w/w的干葉，收率最佳。對該方法尤其合適的是濃度70％2-丙醇，因為這是獲得高收率茄解定的最低濃度。
2.4.2.2用于水解糖苷的各種方法的比較干葉粉(1kg)用2.4.2.1中的相同方法提取，但使用蒸餾水而不是2-丙醇。將粗糖苷分成4份，用電解、在水、乙醇或2-丙醇中的1N鹽酸等4種方法水解。
對于電解方法，在3升容器中使用2對鋁板電極(10×10cm2)向在0.02N鹽酸中的含水提取物(1.5l)中通入DC電流(30A)2小時。
在鹽酸水解中使用2-丙醇作為溶劑得到最高收率的茄解定。
2.4.2.3在Solanum laciniatum Ait果實和葉子中茄解定含量的比較干果實(60-750g)或葉子(40-750g)粉末分散在70％2-丙醇中，在提取前聲波處理2小時。將懸浮液加入套管中，將醇溶液(體積調節(jié)至300或3000ml)加入Soxhlet接受燒瓶中?；亓魅芤褐敝梁谋M，使用旋轉蒸發(fā)器真空蒸發(fā)2-丙醇。在攪拌下向殘余物中加入沸水，過濾溶液，濾液加熱到80℃，在加入30％氨水溶液過程中攪拌，直至pH達到9-10。沉淀物重復地用蒸餾水洗滌，過濾和在60℃下干燥。
將上述粗糖苷、2-丙醇和37.6％鹽酸以按重量計16.4∶76∶7.6％的比率加入圓底燒瓶中。溶液回流3小時，用真空泵過濾。收集的沉淀物溶解在2-丙醇和20％w/v氫氧化鈉溶液中，向溶液中加入大量的水以得到結晶茄解定。茄解定通過濾紙過濾，在60℃干燥。茄解定由甲醇重結晶得到無色六邊形片狀體的結晶茄解定，它用作16-DPA合成的前體。
與具有綠色粉末特性的葉子提取產物相比，由干果實用70％2-丙醇提取茄解定得到粗茄解定糖苷淺棕色粉末。由提取得到的粗糖苷被有色雜質污染，因為有色雜質和糖苷均溶解于醇中。當粗糖苷重復地用水洗滌時，觀察到較好的外觀，這是由于幾乎所有有色雜質在水中的溶解性。對于干果實和葉子，粗糖苷收率分別是2.03和2.17％w/w。對于粗糖苷水解過程，發(fā)現粗糖苷、2-丙醇和鹽酸的重量比例起完成酸水解反應和得到較少副產物反應的作用。色譜圖結果顯示糖苷的水解得到相應的糖苷配基與尤其少量的脫氫產物(澳洲茄二烯)。在水解后，在粗茄解定中所有殘留的雜質通過過濾和結晶除去。對于干果實和葉子，白色結晶純茄解定粉末的平均收率是0.34和0.44％。在干果實和葉子中茄解定的最大收率分別是0.42和0.70％，茄解定的純度超過90％(m.p.198-200℃)。該產物具有足夠的純度用作原料以轉化為16-DPA。產物的所有光譜(IR、MS和MNR)與真實樣品的光譜相同，這表示用此方法可以由S.laciniatum的果實和葉子中分離茄解定。它不需要色譜法估計殘留的雜質和有色物質，該方法是簡單、有效和低成本的，還可以用于大規(guī)模生產茄解定，因為它更便于在分離過程中同時收獲果實和葉子或全植物。
實施例2步驟1/途徑B用由在泰國種植的S.laciniatum，Ait提取的茄解定合成16-DPA(16-去氫孕烯醇酮乙酸酯，3β-乙酰氧基-孕-5，16-二烯-20-酮)1.PCRNC方法將茄解定(1g)在乙酐(5ml)、吡啶(7ml)和對甲苯磺酸(0.0250g)中的溶液回流(160℃)6小時，反應物冷卻至室溫，加入乙酸(10ml)和水(4ml)，回流(160℃)4小時?；旌衔锢鋮s到15℃，在攪拌下在20分鐘內滴加鉻酐(0.75g)在80％乙酸(3ml)中的溶液。在加入氧化劑后，反應物在室溫下攪拌4小時，加入在水中的亞硫酸鈉(0.08g)以分解過量的氧化劑。使混合物靜置過夜，加入乙酐(5ml)，回流(160℃)6小時。反應物冷卻到室溫，加入冷水以沉淀16-DPA。過濾出產物，用水洗滌并干燥，由甲醇重結晶，得到黃色粉末。產物還可在氧化鋁上用柱色譜法純化，用正己烷和乙酸乙酯(9∶1)洗脫，得到16-DPA無色針狀物。
*16-DPA％收率＝44.6，由10g茄解定。
注參見下文，相轉移催化劑(PTC)也可用于增加16-DPA的收率。
2.由種植在泰國的S.laciniatum，Ait提取的茄解定合成16-DPA的替代方法2.1替代方法1(J.Rodriguez等，J.Chem.Tech.Biotechnol，卷29，1979，525-530)二乙?；苌锏囊阴；彤悩嫽瘜⑶呀舛?2g，80％)在乙酸(12ml)中的溶液加入對甲苯磺酸(140mg)在乙酸(1.2ml)和乙酐(2.2ml)中的溶液中，混合物在室溫下攪拌1小時，隨后回流加熱6小時。隨后將溶液冷卻到15-18℃，在用乙酸(14ml)稀釋后，基于茄解定的理論轉化率，16-DPA的收率在15-20％。
茄解定(2g，80％)、乙酐(1.8ml)和吡啶(40ml)的混合物回流加熱1小時，隨后加入吡啶鹽酸鹽(3g)在吡啶(50ml)中的溶液，再回流2小時。真空蒸餾出溶劑，殘余物溶解在乙酸(60ml)中，如下所述進行隨后的步驟。
得到的16-DPA收率在20-30％間變化。
將茄解定(2g，80％)溶解在吡啶(40ml)中，回流加熱，緩慢加入乙酐(2.3ml)，再回流1.5小時。真空蒸餾出吡啶和過量乙酐。得到的殘余物用乙酸(20ml)處理，回流加熱15分鐘。對此改進方法，基于由純茄解定得到的理論值，16-DPA收率改善至48-53％。
氧化和水解異構化后得到的在乙酸中的溶液冷卻到15-20℃，保持溫度低于40℃，加入重鉻酸鈉在乙酸中的溶液(11％，10ml)?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?小時，隨后加入無水亞硫酸鈉(0.52g)以破壞過量氧化劑，混合物再加熱2小時。
16-DPA的分離和純化在用各種方法(結晶或用苯和氯仿提取)進行16-DPA分離和純化后，最終采用如下技術真空蒸餾含有16-DPA的溶液避免殘余物的完全干燥。其余乙酸通過加入苯和形成的共沸混合物的蒸餾脫除。將殘余物溶解在水-乙醚混合物(1∶1，100ml)中，分離醚層，水溶液用乙醚充分提取，真空除去溶劑。
得到棕黃色殘余物(3.3g)，它通過由甲醇/水(4∶1)結晶或通過在氧化鋁上進行色譜法(用苯洗脫)純化，得到非常純的產物(0.69g)，用UV、IR和NMR表征。
2.2替代方法2(A.Sree，Y.R.Rao & S N Maha Patra改進，Research andIndustry，27卷，1982年12月，326-328頁)茄解定乙酰基化和異構化假茄解定乙酸酯茄解定(100g)在乙酐(105ml)和胺溶劑(650ml)中的溶液蒸餾出乙酸和乙酐。反應混合物冷卻，加入水以分解過量乙酐。將O，N-二乙酸酯的粗產物溶解在乙酸中，回流1小時得到假茄解定二乙酸酯。
氧化和水解16-去氫孕烯醇酮乙酸酯將含有假茄解定二乙酸酯的反應混合物冷卻到15℃，在攪拌下在20分鐘內滴加鉻酐(45g)在200ml 80％乙酸水溶液中的溶液。在加入氧化劑后，反應物在室溫下攪拌1小時，加入在水中的亞硫酸鈉(5g)以分解過量氧化劑。反應混合物回流3小時，蒸餾出溶劑，加入水以沉淀16-DPA。過濾產物，洗滌并干燥，用烴溶劑提取三次，合并提取物，蒸餾出溶劑得到無色固體(44.5g)，m.p.169-72℃。
16-去氫孕烯醇酮乙酸酯將吡啶(40ml，0.05mol)和NH4CI(26.0g，0.50mol)的混合物一次加入攪拌的茄解定(210g)懸浮液中，混合物加熱到125-135℃，保持在此溫度下直至TLC顯示反應完成(通常8-9小時)。隨后加入乙酸(400ml)、1，2-二氯乙烷(400ml)和水(54ml)，混合物冷卻到0℃。滴加預冷至0℃的CrO3(88.2g，0.882mol)在水(124ml)和乙酸(42ml)中的溶液，同時保持溫度在7-10℃。當90％溶液(200ml)加入后，中斷冷卻，在其余部分加入后，混合物在室溫攪拌1小時。隨后加入氯化鈉(100g)在水(1.5l)和甲醇(16ml)中的溶液，再持續(xù)攪拌1小時。酮酯用1，2-二氯乙烷(1×450ml和3×60ml)提取，合并的提取物用水(2×500ml)洗滌以除去殘留的鉻鹽。向有機相中加入固體NaOAc×3H2O(70g，0.51mol)，共沸蒸餾出溶劑以除去水(4-6h)。冷卻的殘余物仔細地用水(2l)處理以得到固體產物，它用過濾收集，產物用水充分洗滌直至濾液完全無色。(為使殘留鉻鹽的完全除去，將需要1天后的類似洗滌)。由甲醇(400ml)結晶得到純16-去氫孕烯醇酮乙酸酯(4)；收率117.1-123.8g(65.0-69.0％)；mp167-172℃。
2.3替代方法3(由Chowdhury I等的US5,808,117改進，1998年9月)(a)茄解定乙酸水解成假茄解定二乙酸酯 將50g茄解定加入40ml乙酐中，在壓力反應容器中加入150ml二甲苯，開始加熱，同時攪拌直至達到溫度200℃和相應壓力5kg/cm2。在達到所需的溫度(190-200℃)后反應進行10小時。停止加熱，使其在攪拌下冷卻1小時，通過排出管放出溫度低于100℃的產物。進行樣品的TLC(薄層色譜法)分析顯示僅在TLC板上顯示一個主要斑點。
在旋轉蒸發(fā)器中減壓(約50mbar)除去溶劑，回收的溶劑保持循環(huán)，在除去最后痕量溶劑后，得到固體物質，它被證實是假茄解定。
(b)假茄解定氧化成O，N-二乙酸酯(i)氧化劑溶液制備將25g三氧化鉻(CrO3)溶解在25ml水和10ml冰醋酸中得到透明溶液，將其預冷到0℃-5℃。
(ii)氧化劑溶液的加入將如上得到的茄解定二乙酸酯溶解在100ml二氯乙烷和100ml冰醋酸和25ml水中。混合物冷卻到0-5℃，在保持反應混合物溫度低于5℃下向其中滴加如上制備的氧化劑溶液直至加完。在滴加氧化劑溶液完成后，中斷冷卻，使反應混合物的溫度上升到15℃，并在該溫度下攪拌25分鐘。當薄層色譜法顯示反應完成后，加入5g氯化鈉在水(200ml)和甲醇(10ml)中的溶液，持續(xù)攪拌20分鐘。
(iii)O，N-二乙酸酯提取酮酯O，N-二乙酸酯由反應混合物用1，2-二氯乙烷(4次，200ml)提取，分離后有機層減壓蒸餾以回收溶劑。得到O，N-二乙酸酯的膠狀殘余物，使用石油醚和乙酸乙酯經柱色譜法純化。
(c)O，N-二乙酸酯水解和降解為16-DPA。使如上得到的O，N-二乙酸酯在200ml冰醋酸中回流5小時，反應用TLC監(jiān)測。在反應完成后，通過減壓(50mbar)蒸餾回收乙酸。隨后冷卻的殘余物用冷水(1l)處理以除去存在的最大數量的鉻鹽，最終通過過濾收集分離出的固體16-DPA。
殘余物用冷水充分洗滌5次，最終固體殘余物用1.5l石油醚(b.p.60-80℃)極限提取，得到16-DPA黃色溶液，遺留黑色殘余物。
蒸餾黃色溶液得到粗黃色16-去氫孕烯醇酮乙酸酯，由乙醇重結晶得到乳白色結晶，16-DPA的收率為60％。
2.4.替代方法4用相轉移催化法(PTC)由茄解定合成16-DPA2.4.1乙?；彤悩嫽瘜⑶呀舛?1g)、吡啶(10ml)和乙酐(5ml)的混合物回流2小時，隨后冷卻。隨后將混合物傾入加入冰和氨水中，過濾出沉淀物并干燥。產物在冰醋酸(10ml)中回流1小時，真空蒸餾出冰醋酸得到黃色殘余物。
2.4.2氧化和水解2.4.2.1常規(guī)技術對于過氧化氫用作氧化劑，2.4.1的殘余物與冰醋酸(10ml)和過氧化氫(30mol％過量)在70℃回流5小時，隨后加入水以破壞過量氧化劑。反應混合物用乙酸乙酯提取，蒸發(fā)溶劑。殘余物在冰醋酸(10ml)中回流。對于高錳酸鉀、重鉻酸鉀和三氧化鉻用作氧化劑，將在異構化得到的在冰醋酸中的溶液冷卻到0-15℃，在攪拌下在3小時內滴加高錳酸鉀、重鉻酸鉀或三氧化鉻(30mol％過量)在冰醋酸(10ml)中的溶液。隨后加入甲醇以破壞過量氧化劑，反應混合物回流2小時，真空蒸餾出溶劑。
2.4.2.2相轉移催化技術將2.4.1的殘余物溶解在二氯甲烷(10ml)中，將氧化劑(30mol％過量)和相轉移催化劑(碘化四乙基銨或硫酸氫化四丁基銨；10mol％氧化劑)溶解在水(10ml)中，滴加到反應混合物中?；旌衔锉粍×覕嚢瑁瑫r通過加入硫酸保持pH在0-1。浴溫保持在0-15℃3小時，由系統(tǒng)中分離有機相，用水洗滌幾次。隨后真空除去溶劑直至獲得膠質物質。產物在冰醋酸(10ml)中回流2小時，真空蒸餾。
2.4.3純化產物的膠質物質充入硅膠60柱(Merck，Germany)中，用石油醚和乙酸乙酯以增加的極性洗脫。由洗脫得到純16-PDA。由甲醇重結晶16-PDA得到桿狀結晶。
2.4.4.茄解定和16-DPA分析2.4.4.1定性分析分離的茄解定首先由薄層色譜法(TLC)檢測，與真實樣品比較，使用硅膠60 GF254鋁板(Merck，Germany)，用由氯仿/甲醇(9∶1)組成的移動相展開。斑點通過在加熱板加熱前在TLC板上噴灑30％v/v硫酸溶液顯示。16-PDA以相同方法檢測，但用由乙酸乙酯/石油醚(2∶8)組成的移動相展開，斑點在254nm的UV燈下檢測。
2.4.4.2定量分析茄解定用高效液相色譜(HPLC，Thermo Separation Products Inc.，Califomia，USA)在205nm使用Lichrosorb C-18柱(250×4.6mm內徑；10μm粒徑，HPLC Technology，UK)和0.01 M Tris-HCl緩沖液/乙腈(20∶80體積比)作為移動相以2.00ml/min流量和20μl注射體積分析。16-DPA用HPLC在254nm使用Hypersil C-18柱(250×4.6mm內徑；10μm粒徑；250°A平均孔徑，Hichrom，UK)分析，用100％甲醇作移動相，流量1.00ml/min和注射體積5μl。
2.4.4.3鑒定與真實樣品相比較，茄解定和16-DPA通過熔點(m.p.)測量(StuartScientific，UK)、IR(Jasco FTIIR-5OOO，Japan)、GC-MS(Varian Satum 2100，UK)和NMR(Hitachi R-1500，Japan)測定。
2.5.替代方法4的結果和討論KMnO4、CrO3、Na2Cr2O7或K2Cr2O7可用作氧化劑。碘化四乙基銨或硫酸氫四丁基銨可用作相轉移催化劑。相對于茄解定，16-DPA的最佳收率用硫酸氫四丁基銨和K2Cr2O7獲得(37.0％)。
茄解定首先在兩個連續(xù)步驟中轉化為假茄解定二乙酸酯即茄解定乙?；玫絆，N-二乙?；呀舛?，和二乙酸酯異構化得到假茄解定二乙酸酯。得到的殘余物在TPC下用各種氧化劑和常規(guī)方法氧化。氧化產物進一步水解得到16-PDA。最后，用柱色譜法分離產物?；谶B續(xù)操作而不純化中間體的茄解定理論值，最高收率(37.0％，93％純度，m.p.169-172℃)在使用硫酸氫四丁基銨和重鉻酸鉀的PTC系統(tǒng)中得到。由m.p.、IR、MS和NMR表征的產物與真實樣品相同。在硫酸氫四丁基銨用作相轉移催化劑條件下的重鉻酸鉀得到比碘化四乙基銨和常規(guī)技術更好的收率。
在常規(guī)技術中，用重鉻酸鉀得到的產物收率高于用高錳酸鉀的收率。然而，即使是強氧化劑，三氧化鉻不能用于PTC，這是因為它不被碘化。在過氧化氫情況下，由于它低的氧化效力，未觀察到氧化產物。
在我們通過使用重鉻酸鉀作為氧化劑在PTC下氧化假茄解定二乙酸酯制備16-PDA的新方法中，不僅產物可容易地由系統(tǒng)分離，而且在水相中過量的活性重鉻酸鹽可重新使用，此外，使用較低毒性和較少數量的鉻。因此，可以預期低成本和低廢物產生，這對16-PDA的工業(yè)生產規(guī)模是有利的。
實施例3步驟2/途徑B由16-去氫孕烯醇酮乙酸酯(16-DPA)合成16，17α-環(huán)氧孕烯醇酮(Percy L.Julian等，J.Am.Chem.Soc.，72卷，1950，5145-5147頁)將3g5，16-孕二烯-3β-醇-20-酮乙酸酯溶解在200ml甲醇中，在冷卻至15℃后，溶液用6ml 4N氫氧化鈉溶液處理，隨后立即用12ml 30％過氧化氫溶液處理。隨后混合物在冰箱中在5℃貯存23小時。將甲醇溶液傾入800ml水中，分離生成的白色固體。用水充分洗滌并干燥后的固體重量為2.63g(95％)，在180-186℃下熔化。樣品由甲醇重結晶得到無色針狀物，在187-190℃熔化。
*％收率＝100.43，由8g原料實施例4步驟3/途徑B由16，17α-環(huán)氧孕烯醇酮合成16-溴-17α-羥基-孕烯醇酮(H.J.Ringold等，J.Am.Chem.Soc.，78卷，1956，816-819頁)在10分鐘內向107g的16α，17α-環(huán)氧-Δ5-孕烯-3β-醇-20-酮在1.11冰醋酸中的攪拌懸浮液中加入溴化氫在冰醋酸(215ml，32％w/v)中的溶液，內部溫度用冰冷卻保持在18℃。在加完后在幾分鐘內得到均勻溶液，隨后即刻溴醇部分結晶。在18℃25分鐘反應時間后，混合物傾入7升水中，收集粗溴醇，用水充分洗滌，在室溫下空氣干燥24小時。
*％收率＝88.57(42.13+46.44)，由5g原料實施例5步驟4/途徑B由16-溴-17α-羥基孕烯醇酮(溴醇)合成17α-羥基孕烯醇酮(H.J.Ringold等，J.Am.Chem.Soc.，卷78，1956，816-819頁)將所有粗溴醇懸浮在5L96％乙醇與400g阮內鎳中，懸浮液加熱到沸騰，除去催化劑，用沸騰乙醇充分洗滌。合并的濾液濃縮至500ml，用冰冷卻，收集生成的沉淀物。該步驟產生91.0gΔ5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮-3-乙酸酯。
*％收率＝84.19(41.57+42.62)，由5g原料。
實施例6步驟5/途徑B由17α-羥基孕烯醇酮合成5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮-3-甲酸酯(甲酸酯)(H.J.Ringold等，J.Am.Chem.Soc.，78卷，1956，816-819頁)將90gΔ5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮在2.3L的85％甲酸中的懸浮液在70℃下攪拌2小時，在任何時間都不產生均勻溶液，但注意結晶形式的改變?；旌衔镌诒欣鋮s，收集甲酸酯，重量為81.0g(83％)，顯示203-207℃的熔點，樣品由丙酮結晶，顯示207-209℃的熔點。
*％收率＝98.83，由10g原料實施例7步驟6/途徑B由5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮-3-甲酸酯(甲酸酯)合成5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮-3-甲酸酯17-乙酸酯(二酯)(H.J.Ringold等，J.Am.Chem.Soc.，78卷，1956，816-819頁)將100g所述甲酸酯、2.5g對甲苯磺酸水合物和400ml乙酐的混合物在攪拌下在80℃攪拌30分鐘，使其在室溫下靜置2小時，最終在0℃下過夜。收集二酯，首先用少量冷乙酐洗滌，隨后用熱水洗滌。干燥產物的重量為99.5g(89％)，顯示192-196℃的熔點，由丙酮結晶得到分析樣品，顯示熔點198-200℃。
*％收率＝94.78，由10g原料實施例8步驟7/途徑B由5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮-3-甲酸酯17-乙酸酯(二酯)合成17α-乙酰氧基孕酮(H.J.Ringold等，J.Am.Chem.Soc.，78卷，1956，816-819.頁)將所述二酯(51g，m.p.192-196℃)溶解在1.4L工業(yè)二甲苯和環(huán)己酮中，蒸餾溶液(收集250ml餾出液)除去水分。在5分鐘內將溶解在210ml二甲苯中的異丙醇鋁(51g)加入緩慢蒸餾的溶液中，隨后再持續(xù)蒸餾45分鐘(再收集210ml餾出液)。迅速冷卻混合物，加入冰和水的混合物，通過蒸汽蒸餾除去溶劑。得到的固體通過過濾收集并干燥，用熱丙酮提取，隨后由該溶劑結晶，得到40.7g(86％)17α-乙酰氧基-孕酮，熔點240-243℃，進一步純化的樣品顯示熔點243-247℃。
*％收率＝78.95，由29原料。
實施例9步驟8I途徑B由17α-乙酰氧基孕酮合成17α-乙酰氧基-4，6-孕二烯-3，20-二酮(GiichiGoto，等，Chem.Pharm.Bull.，26卷(6)，1978，1718-1728頁)向17α-乙酰氧基孕酮(5.0g)在叔丁基醇(50ml)中的溶液加入氯醌(4.0g)，反應混合物加熱到80℃5小時。冷卻后，將反應混合物傾入10％Na2CO3溶液中，產物用CH2CI2提取。提取物用水洗滌，用Na2SO4干燥，蒸發(fā)溶劑得到粗結晶。由丙酮重結晶得到(4.6g)無色針狀物。
*％收率＝98.53，由4g原料。
實施例10步驟9/途徑B由17α-乙酰氧基-4，6-孕二烯-3，20-二酮合成17α-乙酰氧基-6，7α-環(huán)氧-4-孕烯-3，20-二酮(步驟9-2/途徑B)1.PCRNC方法將1.0g的17α-乙酰氧基-4，6-孕二烯-3，20-二酮溶解在30ml二氯甲烷中，加入0.9g間氯過苯甲酸。使溶液在室溫下靜置24小時。將反應混合物傾入5％碳酸鈉溶液中，產物用二氯甲烷提取。提取物用水洗滌，用無水硫酸鈉干燥。蒸發(fā)溶劑得到17α-乙酰氧基-6，7α-環(huán)氧-4-孕烯-3，20-二酮(無色油狀物)。殘余物在硅膠上經色譜分離，使用石油醚和乙酸乙酯混合物(3∶2)，得到無色針狀物。
*％收率＝95.02，由1g原料。
2.由17α-乙酰氧基-4，6-孕二烯-3，20-二酮合成17α-乙酰氧基-6，7α-環(huán)氧-4-孕烯-3，20-二酮的替代方法2.1替代方法1(US3,234,093，Rudoff Wiechert等，1966)將2.34g的1，2α-亞甲基-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯溶解在含有844mg過苯甲酸的18.25ml二氯乙烷中。溶液在+5℃下貯存16小時，在室溫下7小時。隨后用二氯甲烷和硫酸亞鐵水溶液、碳酸氫鈉溶液稀釋，用水洗滌至中性。
2.2替代方法2(Giichi Goto等，Chem，Pharm.Bull，26卷(6)，1978，1718-1728頁)向17β-乙酰氧基-1，2α-亞甲基-6α，7α-環(huán)氧-16β-異丙基雄-4-烯-3-酮(1.5g)在CH2Cl2(30ml)中的溶液加入間氯過苯甲酸(0.9g)，使溶液在室溫靜置24小時。將反應混合物傾入5％Na2CO3溶液中，產物用CH2CI2提取，提取物用水洗滌，用Na2SO4干燥，蒸發(fā)溶劑。
2.3替代方法3(U.S3485852，HowardJ.Ringold，1969)將4g的19-去甲-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮17-乙酸酯在100ml氯仿中的溶液冷卻到0℃，隨后與溶解在乙醚中的等摩爾當量的單過鄰苯二甲酸混合。得到的反應混合物在室溫下放置20小時，隨后用水稀釋。接著分離有機層，用碳酸氫鈉水溶液洗滌，隨后用水洗滌直至中性，隨后用無水硫酸鈉干燥，最后蒸發(fā)至干。干殘余物由丙酮/己烷中重結晶得到6α，7α-環(huán)氧-19-去甲-Δ4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯。隨后以每個環(huán)節(jié)重復該過程，但一個例外是Δ4，6孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯用作原料類固醇，因此得到6α，7α-環(huán)氧-Δ4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯。
2.4替代方法4(DE1158966，Rudolf Wiechert等，1963.)將2.34g的1，2α-亞甲基-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯溶解在含有844mg過苯甲酸的18.25ml二氯甲烷中。溶液保持在+5℃16小時，在室溫下7小時。隨后用二氯甲烷稀釋，用硫酸鐵(II)水溶液、碳酸氫鈉溶液洗滌，隨后用水洗滌至中性。在干燥后，有機相用硫酸鈉減少至干。將得到的1.62g粗1，2α-亞甲基-6，7α-環(huán)氧-Δ4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯溶解在109ml冰醋酸中，該溶液用氯化氫氣體飽和，貯存在室溫20小時。隨后用二氯甲烷稀釋，用水洗滌至中性。干燥后，有機相用硫酸鈉減少至干。將得到的粗6-氯-1α-氯甲基-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯加入20ml三甲基吡啶，在氮氣下加熱至沸騰20分鐘。在用乙醚稀釋后，用4N鹽酸和水洗滌至中性。
在硫酸鈉干燥后并減少至干的殘余物在硅膠上進行色譜分離，用苯和乙醚(19∶1)混合物洗脫得到900mg的6-氯-1，2α-亞甲基-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯，由異丙基醚重結晶后，具有200-201℃的熔點。
UV＝ε281＝17820(甲醇)。
實施例11步驟10/途徑B由6，7α-環(huán)氧-4-孕烯合成氯地孕酮乙酸酯(步驟10-2/途徑B)1.PCRNC方法將3.3640g的17α-乙酰氧基-6，7α-環(huán)氧-4-孕烯-3，20-二酮溶解在80ml冰醋酸中，無水氯化氫氣體流緩慢通過懸浮液4小時，貯存20小時，隨后傾入冰水中。過濾形成的沉淀物，得到氯地孕酮乙酸酯淺黃色粉末。
*氯地孕酮收率％＝91.18，由6，7α-環(huán)氧-4-孕烯開始
2.由6，7α-環(huán)氧-4-孕烯制備氯地孕酮乙酸酯的替代方法2.1替代方法1(US3485852，Howard J.Ringold，1969)將1g的6α，7α-環(huán)氧-19-去甲-Δ4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯懸浮在35ml冰醋酸中，隨后無水氯化氫氣體流緩慢通過懸浮液，在10分鐘內所有存在的固體物質溶解。所述氣體通過持續(xù)總共5小時，隨后通過在35℃下減壓蒸餾濃縮溶液至其最初體積的約三分之一，傾入冰水中。通過過濾收集形成的沉淀物，用水洗滌直至中性，然后干燥。由二氯甲烷/己烷重結晶得到6-氯-19-去甲-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯。
以每個細節(jié)重復該過程，只有一項例外，即用無水溴化氫氣體代替氯化氫氣體，得到相應的6-溴-19-去甲-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯。
同樣，通過用6α，7α-環(huán)氧-19-去甲-Δ4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯替代原料類固醇和用無水溴化氫氣體代替無水氯化氫氣體，保持所有其它因素相同，得到6-溴-Δ4，6-孕二烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯。
2.2替代方法2(US3234093，Rudolf Wiechert等，1966)將1.62g粗1，2α-亞甲基-6α，7α-環(huán)氧-Δ4-孕烯-17α-醇-3，20-二酮-17-乙酸酯溶解在109ml冰醋酸中，溶液隨后在室溫下用氯化氫氣體飽和，貯存20小時。隨后用二氯甲烷稀釋，用水洗滌直至中性。
有機相用硫酸鈉干燥，隨后濃縮至干。
2.3替代方法3(Giichi Goto等，Chem.Pharm.Bull.，26卷(6)，1978，1718-1728頁)將17β-乙酰氧基-1，2α-亞甲基-6α，7α-環(huán)氧-16β-異丙基雄-4，6-二烯-3-酮(2.0g)在冰醋酸(20ml)中的溶液用無水氯化氫飽和，在室溫靜置20小時后，反應混合物傾入冰水中，產物用CH2CI2提取。提取物以通常的方式加工得到17β-乙酰氧基-1α-氯-甲基-6-氯-16β-異丙基雄-4，6-二烯-3-酮(1.74g)，將其溶解在γ-三甲基吡啶(15ml)中，在N2下回流30分鐘。冷卻珀，反應混合物用CH2CI2提取，提取物用5％HCl溶液、水洗滌，用Na2SO4干燥，蒸發(fā)溶劑得到粗結晶，由醚重結晶得到1.4g無色針狀物。
實施例12步驟11/途徑B
由氯地孕酮乙酸酯合成去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯(步驟11/途徑B)1.PCRNC方法1.1化學合成將1.0g氯地孕酮乙酸酯溶解在二烷(40ml)中，加入2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)(0.636g)。反應混合物回流6小時(110℃)。在冷卻到室溫后，溶液通過中性氧化鋁短柱，產物用乙酸乙酯洗脫。蒸發(fā)洗脫劑至干得到淺黃色去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯。
*去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯％收率＝81.43，由1g氯地孕酮1.2生物技術合成細菌細胞培養(yǎng).保存在礦物油分層瓊脂斜面中的標準細菌的兩種菌株，A.simplex(ATCC 6946)和B.sphaericus(ATCC 13805)在TSA(Tryptic SoyAgar，Difco，USA)中繼代培養(yǎng)48小時。每個菌株在250ml振蕩燒瓶中在25±2℃在含有(g/l)在50mmol Tris-HCl緩沖液pH7.8中的酵母，5；硫酸銨，3和氯化鎂，0.1的100ml第一級培養(yǎng)介質中以200rpm生長48小時。細菌細胞濃度主要用平板計數法測定。
生物轉移.將每部分細菌細胞懸浮液加入與第一級培養(yǎng)液相同的調節(jié)到50.0ml的第二級培養(yǎng)液中，培養(yǎng)物在250-ml燒瓶中在25±2℃，200rpm生長48h。向培養(yǎng)液中加入如下描述的各種化學物質(在進一步研究中使用對于每種細菌的各個效果的預先最佳結果)。如上所述保持條件，在0、4、24、48、72和96小時收集所有培養(yǎng)反應物(各為0.5ml)用于HPLC分析。
為最佳化外源電子載體的效果，向培養(yǎng)液中加入氯地孕酮乙酸酯和溶解在二甲基甲酰胺(DMF)(5％)中的不同濃度的甲萘醌(0-1.2mmol/l)。
為最佳化底物和有機溶劑的效果，向培養(yǎng)液中加入甲萘醌和不同濃度的氯地孕酮乙酸酯(0.12-0.50mmol/l)和DMF(5或10％)。
為最佳化類固醇誘導物的效果，向培養(yǎng)液中加入氫化可的松2％的乙醇溶液(0-0.55mmol/l)。在氫化可的松存在下培養(yǎng)24小時后，加入在DMF中的甲萘醌和氯地孕酮乙酸酯。
為最佳化表面活性劑的效果，在氫化可的松存在下培養(yǎng)24小時后，向培養(yǎng)液中加入甲萘醌、氯地孕酮乙酸酯和在DMF中的各種濃度的Tween 80(0-1.00％w/v)。
為最佳化D(+)-葡萄糖的效果，在第二級培養(yǎng)液中包含不同濃度的D(+)-葡萄糖(0-10.0g/l)，在氫化可的松存在下培養(yǎng)24小時后，加入甲萘醌、氯地孕酮乙酸酯和在DMF中的Tween 80。
HPLC分析.培養(yǎng)混合物的樣品(0.5ml)通過渦流混合2分鐘用2.0ml氯仿提取。氯仿部分(0.5ml)轉移到取樣小瓶，用高效液相色譜(HPLC，ThermoSeparation Products Inc.，USA)在282nm測定氯地孕酮乙酸酯和去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯濃度。每個樣品(5μl)在250×4.6mm Hypersil 5μODS 250A柱(Hichrom Inc.，USA)使用流量為1.0ml/min的甲醇/水(70∶30體積)作為移動相進行分析。去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯和氯地孕酮乙酸酯與其它化合物得到完全的分離，保留時間分別9.3和11.3min。其它檢測到的化合物是氫化可的松、脫氫皮醇和甲萘醌。
在A.simplex and B.sphaericus中，沒有甲萘醌的反應混合物具有非常低的生產能力。B.sphaericus的所有培養(yǎng)物，在0.3 to 1.2mmol/l甲萘醌存在下得到比沒有外源電子載體的培養(yǎng)物高3-5倍的去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯收率。但在超過0.3mM的較高濃度下，甲萘醌明顯不能增加產物收率。
在5％和10％DMF中，底物濃度由0.50mmol/l降低至0.12mmol/l，對于B.sphaericus，導致底物更完全的轉化，在5％DMF中時，在0.12mmol/l氯地孕酮乙酸酯時，具有約15％的最高收率。
帶有類固醇誘導物的A.simplex的所有條件在4小時得到最多產物，超過沒有氫化可的松的情況。氫化可的松不僅誘導用于氯地孕酮乙酸酯生物轉變的酶活性，而且本身完全轉化為脫氫皮質醇。
在A.simplex中，0.25-1.00％(w/v)的Tween 80濃度改善收率，優(yōu)選范圍為0.5-1.00％。對A.simplex，在0.75％w/v的Tween 80濃度得到28.7％的最高收率。
用DDQ的氯地孕酮乙酸酯的化學脫氫方法通常以較高收率使用，但尤其對于大規(guī)模生產，該方法使用大量的毒性試劑(DDQ)和有機溶劑(二烷)，必然直接影響環(huán)境。另一總量是由DDQ產生對苯二酚，它不得不與產物一起用柱色譜法處理，這進一步增加了成本。另一方面，通過在含水培養(yǎng)液中，使用A.simplex或B.sphaericus游離細胞，氯地孕酮乙酸酯向去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯的生物轉變過程，可用作清潔合成方法的有利替代途徑。對于A.simplex，用于起始0.25mmol/l氯地孕酮乙酸酯的生物轉變，最佳條件是5％DMF，0.41mmol/l氫化可的松和0.75％w/v Tween 80，對于B.sphaericus，用于起始0.12mmol/l氯地孕酮乙酸酯，最佳條件是0.6mmol/l甲萘醌，5％DMF，0.41mmol/l氫化可的松和0.25g/l D(+)-葡萄糖。在兩種菌株的總效果得到少于40％的去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯產生。
兩相體系和細胞固定技術還開發(fā)用于氯地孕酮向去乙酰去氫氯地孕酮的生物轉變。
應用脂質體以增溶底物和上述實驗的產物也引起用于增加生物轉變收率。
2.替代方法2.1替代方法1(Anthony Y.等，Steroids，卷62 221-225t頁1997)將二氯二氰基苯醌(100mg，3.3當量)加入氯地孕酮乙酸酯(63mg，1.45×l0-4mole)在二烷(2ml)中的溶液中，在攪拌下回流過夜。在冷卻到室溫后，過濾反應混合物，加入三滴吡啶，蒸發(fā)至干。殘余物用乙酸乙酯提取，用飽和碳酸氫鈉水溶液，水洗滌，干燥(Na2SO4)和蒸發(fā)得到50mg(80％)。
2.2替代方法2(Bernardo Beyer等.Steroids.31卷，481-488頁，1980)將氯地孕酮乙酸酯(1g.2.68mmol)和2，3-二氯-5，6-二氰基苯醌(0.92g.4.05mmol)在二烷(40ml)中的溶液回流16小時，隨后冷卻。形成沉淀的對苯二酚，濾液中的溶劑經減壓除去。得到的黑色固體在活化的硅酸鎂上進行色譜分離，用苯-CHCl3洗脫得到白色固體61％)。
2.3替代方法3(Giichi Goto等，Chem.Pharm.Bull.26卷(6)1987，1718-1728頁)向氯地孕酮乙酸酯(3.5g)在二烷(40ml)中的溶液中加入DDQ(2.8g)，反應混合物回流5小時，冷卻后，溶液以相同方式處理，由乙醚重結晶得到去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯(3.2g)無色針狀物。
實施例13步驟12/途徑B由去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯合成環(huán)丙孕酮乙酸酯將1.2g碘化三甲基氧化锍(5.6mmol)和0.08g氫化鈉(3.3mmol)溶解在10ml二甲基亞砜(IDMSO)中，在氮氣中在5℃攪拌30分鐘。隨后加入0.5g去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯(1.24mmole)，攪拌5小時。使混合物在室溫下24小時，混合物傾入1N HCl(帶冰)溶液中，過濾沉淀物，用水洗滌。由異丙醚重結晶得到環(huán)丙孕酮乙酸酯白色粉末。
*％收率＝51.51，由0.5g原料。
權利要求
1.制備環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)的方法，其包括(f)通過一步法在17α-乙酰氧基-孕酮(H)的1和6位引入雙鍵將其轉化為1，4，6-三烯化合物(I1)；(g)引入橋接1和2位的亞甲基得到1，2α-亞甲基化合物(J1)；(h)引入橋接(J1)6和7位的環(huán)氧基得到6，7α-環(huán)氧化合物(K1)；(i)將(K1)的環(huán)氧基團轉化為6-氯-7-羥基化合物(L1)；和(j)將(L1)轉化為環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)。
2.權利要求1的方法，其中在步驟(f)中使用DDQ。
3.權利要求1或2的方法，其中在步驟(g)中使用TMSI和堿金屬氫化物。
4.權利要求1-3任一的方法，其中在步驟(i)中使用三氟甲基磺酰氯和氯化鋰。
5.權利要求1-4任何之一的方法，其中17α-乙酰氧基孕酮(H)通過包括以本領域已知的方法將茄解定(A)轉化為17α-乙酰氧基孕酮(H)的方法制備。
6.權利要求5的方法，其中16-去氫孕烯醇酮乙酸酯(B)通過一步法轉化為16，17-環(huán)氧-孕烯醇酮(C)。
7.權利要求6的方法，其中(B)向(C)的轉化通過在堿性溶液中使用過氧化氫實現。
8.制備環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)的方法，其包括使式(K1)化合物 與氯化鋰/三氟甲基磺酰氯或氯化鋰/N，N-二甲基乙酰胺鹽酸鹽反應得到下式化合物(L1) 和使化合物(L1)與乙酸鹽水溶液，優(yōu)選乙酸鈉水溶液反應得到環(huán)丙孕酮乙酸酯(M)。
9.制備16-去氫孕烯醇酮乙酸酯(B)的方法，包括(k)乙酰基化茄解定(A)得到O，N-二乙?；呀舛?；(l)異構化O，N-二乙酰基茄解定得到假茄解定二乙酸酯；(m)在相轉移催化劑存在下氧化得到的假茄解定二乙酸酯。
10.權利要求9的方法，其中相轉移催化劑是硫酸氫四丁基銨。
11.權利要求9或10的方法，其中氧化劑是重鉻酸鉀或重鉻酸鈉。
12.制備去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯(L2)的方法，包括將氯地孕酮乙酸酯(K2)加入能夠將(K2)轉化為(L2)的微生物培養(yǎng)物中，由培養(yǎng)物分離得到的去乙酰去氫氯地孕酮乙酸酯。
13.權利要求12的方法，其中微生物是簡單節(jié)桿菌(Arthrobacter simplex)或球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)。
14.權利要求13的方法，其中簡單節(jié)桿菌是ATCC 6946或球形芽孢桿菌是ATCC 13805。
15.權利要求12-14任一的方法，其中將電子載體加入培養(yǎng)物，優(yōu)選甲萘醌(2-甲基-1，4-萘醌)。
16.權利要求12-15任一的方法，其中向培養(yǎng)物加入類固醇，優(yōu)選氫化可的松。
17.權利要求12-16任一的方法，其中將表面活性劑加入培養(yǎng)物中，優(yōu)選聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于由茄解定合成環(huán)丙孕酮乙酸酯(17α－乙酰氧基－6－氯－1α，2α－亞甲基－4，6－孕二烯－3，20－二酮)的改善方法，本發(fā)明的方法比現有技術的方法簡短，因此更經濟。
文檔編號C12R1/07GK1990499SQ20071000165
公開日2007年7月4日 申請日期2003年4月14日 優(yōu)先權日2002年4月29日
發(fā)明者阿蘭亞·馬諾斯羅伊, 吉拉德杰·馬諾斯羅伊, 杜昂·巴德哈蘇克, 帕塔納·斯里帕拉基特, 羅蘭·梅爾, 羅爾夫·沃納 申請人:貝林格爾.英格海姆國際有限公司