專利名稱：利用酶檢測(cè)電極微陣列上結(jié)合事件的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了電子檢測(cè)帶有電極的微陣列裝置中己知位置上附連的探針 與溶液中靶標(biāo)之間的結(jié)合事件的方法。采用酶部分和能改變含有酶部分的電極 的電學(xué)特性的底物溶液進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)明背景在生物技術(shù)研究和開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，微陣列已成為重要的分析研究工具。通常， 微陣列是通常是平面的固體表面上小型化的位置陣列。作為制備微陣列的一部 分，位置中可能連接有預(yù)先合成的分子，包括生物分子，或者可能含有原位合 成的分子，如DNA分子(一次合成一種單體)。附連位置通常成列和成行排列； 然而，也可采用其它形式。最常見(jiàn)的是，微陣列(具體是寡核苷酸的微陣列)是 基于硅的，最常見(jiàn)是載玻片。微陣列的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠同時(shí)進(jìn)行幾百(即使不 是幾千)個(gè)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)提高了研究分子結(jié)構(gòu)和生物功能之間關(guān)系的效率， 其中化學(xué)結(jié)構(gòu)的細(xì)微改變可能對(duì)生物活性產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。顧名思義，微陣列上 的附連點(diǎn)是微米級(jí)的，通常為l-100pm。采用微陣列的研究主要專注于脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)相關(guān) 領(lǐng)域，包括基因組學(xué)、細(xì)胞基因表達(dá)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、基因組DNA檢 測(cè)和驗(yàn)證、功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)(Wilgenbus和Lichter， 《/ Mo/. Mec/. 77:761， 1999; Ashfari等，Owcer及"59:4759, 1999; Kurian等， / PaAo/. 187:267， 1999; Hacia， A^wre Ge""/" 21增刊42， 1999; Hacia等，Mo/. 尸矽c/u'a,7 3:483， 1998;和Johnson, Cwr. 26:R171， 1998)。此外，可將 微陣列用于與肽(兩個(gè)或多個(gè)連接的天然或合成氨基酸)、小分子(如藥物化合物)、低聚物和聚合物有關(guān)的研究。有許多方法制備DNA相關(guān)分子的微陣列， 所述DNA相關(guān)分子包括天然或克隆的DNA和合成DNA。合成的相對(duì)較短的 單鏈DNA或RNA鏈通常稱為寡核苷酸。微陣列制備方法包括(l)用打點(diǎn)機(jī)器人將溶液打點(diǎn)到制備的平坦表面上； (2)通過(guò)噴墨打印或其它打印技術(shù)、采用常規(guī)亞磷酰胺化學(xué)以打印試劑進(jìn)行原位 合成；(3)采用脫保護(hù)所用的電化學(xué)產(chǎn)生的酸以及常規(guī)亞磷酰胺化學(xué)進(jìn)行原位平 行合成；(4)采用常規(guī)亞磷酰胺化學(xué)，進(jìn)行光生酸(PGA)控制的無(wú)掩模原位合成； (5)采用光切割光敏性保護(hù)基(PLPG)而進(jìn)行掩膜指導(dǎo)的原位平行合成；(6)采用 PLPG和數(shù)字光刻技術(shù)進(jìn)行無(wú)掩膜原位平行合成；和(7)通過(guò)電場(chǎng)吸引/排斥沉積 寡核苷酸。寡核苷酸微陣列合成的綜述參見(jiàn)Gao等，Bi叩olymer 73:579， 2004。用于原位寡核苷酸合成的光刻技術(shù)參見(jiàn)Fodor等，美國(guó)專利5,445,934和 要求其作為優(yōu)先權(quán)的其它專利。電場(chǎng)吸引/排斥微陣列的描述參見(jiàn)Hollis等，美 國(guó)專利5,653,939和Heller等，美國(guó)專利5,929,208。蒙哥馬禾U(Montgomery), 美國(guó)專利6，093，302、 6,280,595和6,444,1 ll(分別是蒙哥馬利I、 II和III)中描述 了采用電化學(xué)解封法進(jìn)行原位寡核苷酸合成的電極微陣列，將其納入本文作參 考。蒙哥馬利I、 II和III所述的電化學(xué)合成微陣列基于含有成列或成行的多個(gè) 微電極的半導(dǎo)體芯片。該芯片設(shè)計(jì)采用了互補(bǔ)型金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)技 術(shù)，以產(chǎn)生能平行尋址以對(duì)微陣列內(nèi)的單個(gè)微電極進(jìn)行選擇和控制的高密度微 電極陣列。為了在各個(gè)電極上提供合適的反應(yīng)性基團(tuán)，用多孔性反應(yīng)基質(zhì)材料 (層)包被微陣列。控制基質(zhì)的厚度和多孔性?？梢栽诙嗫仔曰|(zhì)上任何電極的 位置上合成生物分子以及其它分子。在某位置合成期間，通過(guò)施加電壓或電流"打開(kāi)"該電極，該電壓或電流 能產(chǎn)生電化學(xué)試劑(具體是酸性質(zhì)子)，以改變電極附近和多孔性基質(zhì)內(nèi)限定的 "虛擬瓶"小區(qū)域或體積中的pH。電化學(xué)方法產(chǎn)生的試劑能去除正在合成的 分子上的保護(hù)基，以便繼續(xù)合成DNA或者其它寡聚材料或聚合材料。只有電 極附近的pH降低，因?yàn)樗嵝栽噭┻w移離開(kāi)電極的能力僅限于天然擴(kuò)散和緩沖。合成或附連于微陣列的分子通常稱為探針。微陣列上的各個(gè)位置可以含有 不同探針。在采用微陣列進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，使溶液中的靶分子與微陣列相互作用。 如果在實(shí)驗(yàn)條件下靶標(biāo)具有足夠的親和力，那么它將結(jié)合于特定探針類型，或 者可能結(jié)合于一種以上的探針類型。需要準(zhǔn)確檢測(cè)靶標(biāo)與探針的結(jié)合事件，以 捕獲關(guān)于溶液中任何靶標(biāo)與微陣列上探針之間相互作用的數(shù)據(jù)。在微陣列中，通常采用基于光子的檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)結(jié)合事件。最常見(jiàn)的是，微陣列檢測(cè)方法使用靶標(biāo)上的熒光標(biāo)簽轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合事件；熒光量是結(jié)合量的衡 量?；蛘?，可采用可見(jiàn)染料或發(fā)光標(biāo)記。例如，在DNA雜交中，將標(biāo)簽附連 于耙DNA序列，以檢測(cè)與附連于微陣列的寡核苷酸探針的雜交。根據(jù)標(biāo)簽產(chǎn) 生的信號(hào)強(qiáng)度，可能得通過(guò)基于激光共聚焦顯微鏡的系統(tǒng)讀出構(gòu)造成單層的這 類微陣列(如通過(guò)高密度打點(diǎn)或光刻技術(shù)制備的微陣列)的數(shù)據(jù)，或通過(guò)視頻型 相機(jī)(如CCD相機(jī))讀出含有各點(diǎn)以高密度形式分布的三維基質(zhì)的微陣列的數(shù) 據(jù)。替代熒光的方式為光學(xué)檢測(cè)探針-靶標(biāo)的結(jié)合。在"掃描計(jì)量"試驗(yàn)中，用 催化金顆粒標(biāo)記耙標(biāo)。與探針結(jié)合后，將銀鹽加入溶液中，結(jié)合顆粒時(shí)沉積出 金屬銀。檢測(cè)類似于光學(xué)照相膠巻顯影，并用數(shù)字掃描儀或照相技術(shù)記錄。這 種技術(shù)能緩解熒光檢測(cè)的一些技術(shù)需求，但尚不清楚掃描計(jì)量技術(shù)在本領(lǐng)域微 陣列目前狀態(tài)歸類(rdegated)的打點(diǎn)尺寸到底有多么靈敏。通常，基于光子的閱讀器昂貴、體積大且笨重，依賴于復(fù)雜的數(shù)值算法， 必須在使用前精確校準(zhǔn)。因此，這類閱讀器通常僅限于實(shí)驗(yàn)室使用。在由微陣 列"閱讀"信號(hào)的各種情況下，常常出現(xiàn)引起假讀數(shù)或不準(zhǔn)確讀數(shù)的雜散光或其 它噪聲信號(hào)。而且，很難分辨灰色的陰影或幾乎察覺(jué)不到的信號(hào)是真陽(yáng)性還是 假陽(yáng)性。最后，熒光信號(hào)可能淬滅，信號(hào)也可能被結(jié)合靶標(biāo)附近的其它標(biāo)記自 動(dòng)吸收。與采用基于光子的閱讀器有關(guān)的其它復(fù)雜性增加了變異性。因此，本 領(lǐng)域需要改進(jìn)用于分析微陣列上結(jié)合事件的檢測(cè)方法。本發(fā)明滿足了這種需 求，改善了結(jié)合事件的檢測(cè)，并提供了可為高密度微陣列系統(tǒng)中各位置產(chǎn)生更 客觀的"是"或"否"答案的檢測(cè)系統(tǒng)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用酶檢測(cè)電極微陣列上的結(jié)合事件的方法，所述方法包括
(a) 提供含有可電學(xué)尋址的多個(gè)電極并且在對(duì)應(yīng)于電極的位點(diǎn)上連接有至少兩種不同的捕獲復(fù)合物的微陣列，其中第一捕獲復(fù)合物類型與第一分析物類 型具有親和力，第二和后續(xù)的捕獲復(fù)合物類型與后續(xù)的分析物類型具有親和力；(b) 將至少一種類型的多種分析物施加到捕獲復(fù)合物上，形成對(duì)應(yīng)于捕獲 復(fù)合物捕獲的各分析物類型的各類型結(jié)合復(fù)合物；(c) 將酶連接于結(jié)合復(fù)合物，形成報(bào)道復(fù)合物，其中報(bào)道復(fù)合物的類型對(duì)應(yīng) 于捕獲復(fù)合物捕獲的各分析物類型；(d) 使多種底物溶液依次接觸微陣列，用電信號(hào)確定位點(diǎn)上是否存在酶產(chǎn) 物，其中各底物溶液對(duì)應(yīng)于報(bào)道復(fù)合物類型，其中存在電信號(hào)是結(jié)合事件的衡優(yōu)選地，捕獲復(fù)合物由多種寡核苷酸探針組成，分析物由多種寡核苷酸靶 標(biāo)組成，寡核苷酸靶標(biāo)與寡核苷酸探針的雜交形成結(jié)合復(fù)合物，通過(guò)附連法使 酶結(jié)合于寡核苷酸靶標(biāo)，其中附連法包括通過(guò)選自下組的分子基團(tuán)連接酶(a) 抗體、抗-抗體和抗-獨(dú)特型抗體組合，(b)生物素和鏈霉親和素或親和素組合， 和(c)寡核苷酸和互補(bǔ)寡核苷酸組合，和它們的組合。優(yōu)選通過(guò)原位電化學(xué)合成 方法來(lái)合成寡核苷酸探針。優(yōu)選地，捕獲復(fù)合物由雜交于含有抗體標(biāo)簽的寡核苷酸耙標(biāo)的寡核苷酸探 針組成，通過(guò)抗體標(biāo)簽捕獲分析物，從而形成結(jié)合復(fù)合物，通過(guò)附連法使酶結(jié) 合于分析物，其中所述附連法包括附連于分析物的報(bào)道抗體和通過(guò)選自下組的 分子基團(tuán)附連于報(bào)道抗體的酶(a)抗體、抗-抗體和抗-獨(dú)特型抗體組合，(b)生 物素和鏈霉親和素或親和素組合，和(c)寡核苷酸和互補(bǔ)寡核苷酸組合，和它們 的組合。優(yōu)選通過(guò)原位電化學(xué)合成方法合成寡核苷酸探針。捕獲復(fù)合物優(yōu)選通過(guò)選 自下組的方法制備原位電化學(xué)合成、打點(diǎn)、噴墨打印、電場(chǎng)沉積和原位光刻 合成。捕獲復(fù)合物優(yōu)選由選自下組的分子組成寡核苷酸、多肽、抗體、糖基 化多肽、多糖、肽核酸和含有多個(gè)上述分子的單體的混合分子。分析物優(yōu)選由選自下組的分子組成抗原、半抗原、病毒、細(xì)菌、細(xì)胞、 蛋白質(zhì)、多糖、生物聚合物分子、脂質(zhì)、糖蛋白((x-l-酸糖蛋白)、蓖麻毒蛋白、 M13噬菌體、球形芽孢桿菌(5ac///^ g/o6/g/0(BG)芽孢、熒光素、兔IgG、山 羊IgG、 DNA、 RNA、單鏈DNA、核糖體RNA、線粒體DNA、細(xì)胞受體、糖 基化的膜結(jié)合蛋白、非糖基化的膜結(jié)合蛋白、多肽、糖基化多肽、抗體、細(xì)胞 抗原決定簇、有機(jī)分子、金屬離子、鹽陰離子和陽(yáng)離子以及有機(jī)金屬和它們的 組合。酶優(yōu)選選自辣根過(guò)氧化物酶、漆酶、卩-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、堿 性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、過(guò)氧化氫酶、乳酸氧化酶和過(guò)氧化物酶，以 及它們的組合。底物溶液優(yōu)選由含有緩沖液、鹽和酶底物溶液的水溶液組成， 其中酶底物溶液含有能與該酶發(fā)生反應(yīng)的底物。酶產(chǎn)物優(yōu)選包含可以通過(guò)電化 學(xué)方式還原或氧化的分子。電信號(hào)優(yōu)選包括差異反應(yīng)(difference response),其中差異反應(yīng)是產(chǎn)物反應(yīng) 與基礎(chǔ)反應(yīng)之間差異的衡量，其中在含有酶的位點(diǎn)上測(cè)得所述產(chǎn)物反應(yīng)，在不 含酶的位點(diǎn)上測(cè)得所述基礎(chǔ)反應(yīng)，其中產(chǎn)物反應(yīng)和基礎(chǔ)反應(yīng)選自電流、電壓 和電阻，其中差異反應(yīng)是分析物與捕獲復(fù)合物結(jié)合的衡量。本發(fā)明還提供了用酶檢測(cè)電極微陣列上的結(jié)合事件的方法，所述方法包括(a) 提供含有多個(gè)電極并且在對(duì)應(yīng)于電極的位點(diǎn)上連接有多種捕獲復(fù)合物 的微陣列，這些電極是可電學(xué)尋址的電極；(b) 將多種分析物施加到捕獲復(fù)合物上，以形成結(jié)合復(fù)合物，其中捕獲復(fù) 合物對(duì)分析物具有親和力；(c) 將酶連接于結(jié)合復(fù)合物，形成報(bào)道復(fù)合物；(d) 使底物溶液接觸所述微陣列，所述底物溶液中含有能與酶反應(yīng)的底物， 其中固體酶產(chǎn)物沉積在含酶位點(diǎn)上；和(e) 用測(cè)定溶液和電信號(hào)測(cè)定該位點(diǎn)上是否存在固體酶產(chǎn)物，其中存在電信 號(hào)是結(jié)合事件的衡量。優(yōu)選地，捕獲復(fù)合物由多種寡核苷酸探針組成，分析物由多種寡核苷酸靶 標(biāo)組成，寡核苷酸靶標(biāo)與寡核苷酸探針雜交形成結(jié)合復(fù)合物，通過(guò)附連法使酶 結(jié)合于寡核苷酸靶標(biāo)，其中附連法包括通過(guò)選自下組的分子基團(tuán)連接酶(a) 抗體、抗-抗體和抗-獨(dú)特型抗體組合，(b)生物素和鏈霉親和素或親和素組合，
和(C)寡核苷酸和互補(bǔ)寡核苷酸組合，和它們的組合。優(yōu)選通過(guò)原位電化學(xué)合成 方法來(lái)合成寡核苷酸探針。優(yōu)選地，捕獲復(fù)合物由雜交于含有抗體標(biāo)簽的寡核苷酸靶標(biāo)的寡核苷酸探 針組成，通過(guò)抗體標(biāo)簽捕獲分析物，從而形成結(jié)合復(fù)合物，通過(guò)附連法使酶結(jié)合于分析物，其中所述附連法包括通過(guò)選自下組的分子基團(tuán)連接酶(a)抗體、 抗-抗體和抗-獨(dú)特型抗體組合，(b)生物素和鏈霉親和素或親和素組合，和(c)寡核苷酸和互補(bǔ)寡核苷酸組合，和它們的組合。優(yōu)選通過(guò)原位電化學(xué)合成方法合成寡核苷酸探針。捕獲復(fù)合物優(yōu)選通過(guò)選自下組的方法制備原位電化學(xué)合成、打點(diǎn)、噴墨打印、電場(chǎng)沉積和原位光刻 合成。捕獲復(fù)合物優(yōu)選由選自下組的分子組成寡核苷酸、多肽、抗體、糖基 化多肽、多糖和含有多個(gè)上述分子的單體的混合分子。分析物優(yōu)選由選自下組的分子組成抗原、半抗原、病毒、細(xì)菌、細(xì)胞、 蛋白質(zhì)、多糖、生物聚合物分子、脂質(zhì)、糖蛋白(a-l-酸糖蛋白)、蓖麻毒蛋白、 M13噬菌體、球形芽孢桿菌(^ac說(shuō)M g/oWg《(BG)芽孢、熒光素、兔IgG、山 羊IgG、 DNA、 RNA、單鏈DNA、核糖體RNA、線粒體DNA、細(xì)胞受體、糖 基化的膜結(jié)合蛋白、非糖基化的膜結(jié)合蛋白、多肽、糖基化多肽、抗體、細(xì)胞 抗原決定簇、有機(jī)分子、金屬離子、鹽陰離子和陽(yáng)離子以及有機(jī)金屬和它們的 組合。酶優(yōu)選選自辣根過(guò)氧化物酶、漆酶、卩-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、堿 性磷酸酶或葡萄糖脫氫酶、或其組合。底物溶液優(yōu)選由含有緩沖液、鹽和酶底 物溶液的水溶液組成，其中酶底物溶液含有能與該酶發(fā)生反應(yīng)的底物。酶優(yōu)選 為辣根過(guò)氧化物酶，底物是過(guò)氧化氫和選自下組的化學(xué)物質(zhì)可氧化的芳香劑 (aromatics) 、 二茂鐵衍生物和可氧化的無(wú)機(jī)物，以及它們的組合。優(yōu)選地，固體酶產(chǎn)物為非反應(yīng)性產(chǎn)物，測(cè)定溶液是含有電子介質(zhì)的水溶液。 電子介質(zhì)優(yōu)選為氰化鉀亞鐵和氰化鉀鐵的混合物，其混合比約為10:90-90:10， 濃度約為0.1-1000毫摩爾。或者，可以還原或氧化固體酶產(chǎn)物，測(cè)定溶液是含 有緩沖液和鹽的水溶液。緩沖液優(yōu)選為磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液，鹽是氯化鈉。或者，固體酶產(chǎn)物是導(dǎo)電材料。導(dǎo)電材料優(yōu)選為聚吡咯。電信號(hào)優(yōu)選包括 差異反應(yīng)，其中差異反應(yīng)是產(chǎn)物反應(yīng)與基礎(chǔ)反應(yīng)之間差異的衡量，其中在含有
酶的位點(diǎn)上測(cè)得所述產(chǎn)物反應(yīng)，在不含酶的位點(diǎn)上測(cè)得所述基礎(chǔ)反應(yīng)，其中產(chǎn) 物反應(yīng)和基礎(chǔ)反應(yīng)選自電流、電壓、電導(dǎo)率或電阻，其中差異反應(yīng)是分析物 與捕獲復(fù)合物結(jié)合的衡量。本發(fā)明還提供了用酶檢測(cè)電極微陣列上的結(jié)合事件的方法，所述方法包括(a) 提供含有多個(gè)電極的微陣列，這些電極是可電學(xué)尋址的電極；(b) 向這些電極施加恒定的初始電壓，而保持該電極為開(kāi)路；和(c) 在測(cè)定時(shí)間內(nèi)使各電極在約為接地或顯著不同于恒定初始電壓的電壓下連續(xù)切換，記錄測(cè)定時(shí)間內(nèi)各電極的電流，使各電極返回恒定初始電壓，然 后將下一個(gè)電極設(shè)定為接地或顯著不同于恒定初始電壓的電壓，從而測(cè)定各電 極的電反應(yīng)。優(yōu)選地，恒定初始電壓的絕對(duì)值約為0.1毫伏至5伏。測(cè)定時(shí)間優(yōu)選約為 0.1毫秒至1秒。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1提供了辣根過(guò)氧化物酶(HRP)用作檢測(cè)微陣列上結(jié)合事件的酶時(shí)本發(fā) 明的化學(xué)反應(yīng)方案。具體說(shuō)，分析物(靶標(biāo))是(xl-酸糖蛋白(AGP)，首先與生物 素標(biāo)記的第二抗體形成復(fù)合物，從而檢測(cè)分析物與微陣列的結(jié)合。第二抗體是 AGP表位特異性抗體。然后加入親和素標(biāo)記的HRP酶，使親和素連接于生物 素。用于檢測(cè)分析物AGP的微陣列位點(diǎn)上含有作為探針的另一抗體，其結(jié)合 于AGP的不同表位。第一抗體(標(biāo)記的"抗體l")通過(guò)標(biāo)記的寡核苷酸探針自身 組裝成寡核苷酸微陣列。HRP催化產(chǎn)物是可還原的，因而可將結(jié)合有HRP的 電極用作陰極，從而可在微陣列的電極上檢測(cè)。與圖l的設(shè)計(jì)相比，圖2提供了相似的夾心免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以檢測(cè)微陣列 己知位點(diǎn)上的AGP。區(qū)別是鏈霉親和素連接于生物素標(biāo)記的附連于AGP第二 表位的第二抗體，然后生物素標(biāo)記酶連接于鏈霉親和素。此外，該酶是漆酶， 而非HRP。圖3提供了 P-半乳糖苷酶作為酶、X-Gal (5-溴-4-氯-3』引哚基-l3-D-吡喃半乳糖苷)作為底物時(shí)，酶反應(yīng)的化學(xué)(情況)。該反應(yīng)形成靛藍(lán)，并產(chǎn)生電化學(xué)反
應(yīng)物。在pH約7.0的含有1毫摩爾F^VFeS+(作為氰化鉀亞鐵和氰化鉀鐵加入) 的0.01摩爾磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中進(jìn)行該反應(yīng)。溶液中X-Gal的含量為飽和 極限。鐵(III)用作電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)。圖4提供葡萄糖氧化酶用作酶、吩嗪硫酸二甲酯(5-甲基-吩嗪硫酸二甲酯) 用作底物時(shí)，酶反應(yīng)的化學(xué)情況。在pH約7.0的含有1毫摩爾Fe^/F^+(作為 氰化鉀亞鐵和氰化鉀鐵加入)的0.01摩爾磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中進(jìn)行該反應(yīng)。鐵(m)用作電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)。圖5提供HRP用作酶、鄰苯二酚和過(guò)氧化氫用作底物時(shí)，酶反應(yīng)的化學(xué) 情況。酶反應(yīng)產(chǎn)物是可還原的，并可通過(guò)將陰極電流施加于電極進(jìn)行檢測(cè)。圖6提供在電極微陣列的所選電極上測(cè)定的電流的三維圖。所選電極含有 酶擴(kuò)增體系，采用(3-半乳糖苷酶作為酶。用含有生物素的試劑以電化學(xué)方式修 飾含有酶擴(kuò)增體系的電極，所述含有生物素的試劑是含有生物素標(biāo)簽的亞磷酰 胺。在泳道l-8代表的一部分微陣列中，沒(méi)有生物素標(biāo)簽。泳道9-16顯示了含 有生物素標(biāo)簽的電極上的電流；釆用棋盤(pán)圖案，見(jiàn)圖。為了連接該酶，使鏈霉 親和素結(jié)合于生物素標(biāo)簽，使生物素化的(3-半乳糖苷酶結(jié)合于鏈霉親和素，產(chǎn) 生生物素-鏈霉親和素-生物素復(fù)合物。按照?qǐng)D3所示的反應(yīng)方案加入氧化還原 試劑和底物。數(shù)據(jù)表明，在結(jié)合有p-半乳糖苷酶的電極上電流絕對(duì)值較高，如 棋盤(pán)圖案中的負(fù)電流值所示。圖7提供了來(lái)自圖6的一部分?jǐn)?shù)據(jù)。在含有電極的位點(diǎn)上，電極9、 11、 13和15含有結(jié)合的p-半乳糖苷酶。這些電極上的電流是負(fù)電流，表明在結(jié)合 有酶的電極上存在還原性酶產(chǎn)物。圖8提供電極微陣列的所選電極上的電流圖。此圖中電極的符號(hào)(sign)有 所改變。泳道l、 3和5所示的電極表明，在這些電極上結(jié)合和檢測(cè)到熒光素 標(biāo)記的P-半乳糖苷酶。熒光素用作附連于較大酶的低分子量抗原。將親和標(biāo)記 的抗熒光素抗體放置在S2行的交替電極上，從而連接酶。數(shù)據(jù)表明，與含有 熒光素標(biāo)記的p-半乳糖苷酶的電極相關(guān)聯(lián)的已知位置的電流較高。采用落射熒 光顯微術(shù)驗(yàn)證這些數(shù)據(jù)，以確認(rèn)電化學(xué)結(jié)果。圖9提供了電極微陣列的所選電極上的電流圖。所用酶是葡萄糖氧化酶。 用生物素-鏈霉親和素復(fù)合物使葡萄糖氧化酶結(jié)合于微陣列。電極特異性親和
標(biāo)記物位于泳道2、 4、 6、 8中。葡萄糖氧化酶體系的背景信號(hào)高于其它氧化/ 還原酶。
圖IO提供了 HRP的電壓電流圖，它是罕見(jiàn)(即沒(méi)有原位合成生物分子)電 極微陣列上單個(gè)100微米直徑電極檢測(cè)的氧化還原曲線。恒電勢(shì)測(cè)定結(jié)果表明 是負(fù)電勢(shì)，電流差異(有酶和無(wú)酶)顯著。鄰苯二酚和過(guò)氧化氫用作底物。
圖11提供了電極微陣列的所選電極上電流對(duì)時(shí)間的圖。各數(shù)據(jù)點(diǎn)是不同 電極上的測(cè)定值。所用酶是HRP，底物是鄰苯二酚和過(guò)氧化氫。約3秒后電流 達(dá)到穩(wěn)定值。
圖12提供了電極陣列的所選電極的電流圖。該微陣列在連有酶的夾心抗 體中連接了不同的分析物。分析物包括蓖麻毒蛋白(RCA)、 BG芽孢(球形芽孢 桿菌)、噬菌體、AGP和FITC。在微陣列上利用電化學(xué)合成合成各分析物的不 同單鏈DNA單位。各分析物的連有抗體的互補(bǔ)DNA鏈與微陣列雜交。分析 物結(jié)合于各抗體，使第二抗體結(jié)合于各抗體。第二抗體上連有生物素。使HRP 和鏈霉親和素的復(fù)合物連接于生物素。檢測(cè)底物是鄰苯胺二胺(ODP)和過(guò)氧化 氫。
圖13提供了電極陣列的所選電極的電流圖。山羊IgG通過(guò)寡核苷酸標(biāo)記 過(guò)程結(jié)合于電極Sl(l、 3和5)和S2(2、 4禾B6)。通過(guò)與HRP偶聯(lián)的小鼠抗山 羊抗體復(fù)合物檢測(cè)山羊IgG。 ODP和過(guò)氧化氫用作底物。改變電流的符號(hào)，使 其為正。
圖14是電極陣列的所選電極的電流圖。在微陣列上原位合成兩種不同寡 核苷酸序列。將棋盤(pán)合成圖案用于各寡核苷酸。各寡核苷酸的電極的棋盤(pán)區(qū)域 包括含有各寡核苷酸的電極和沒(méi)有合成寡核苷酸的電極。生物素化寡核苷酸靶 標(biāo)樣品獲自歐普朗公司(Operon)。使生物素化寡核苷酸與微陣列上合成的寡 核苷酸雜交。將與HRP偶聯(lián)的鏈霉親和素(獲自西格瑪公司(Sigma))加入微陣 列中，結(jié)合于微陣列上雜交的生物素化寡核苷酸序列。測(cè)定各電極的電流。圖 中顯示了各寡核苷酸(寡核苷酸-5和寡核苷酸-6)的棋盤(pán)圖案的示意圖。圖中的 三維柱圖標(biāo)示電極上的電流。兔序列探針無(wú)信號(hào)。HRP用作酶，檢測(cè)底物是鄰 苯胺二胺(ODP)和過(guò)氧化氫。
圖15顯示了 100pM濃度的Rab-生物素與銀/氯化銀參比電極的檢測(cè)結(jié)果。
檢測(cè)的是電勢(shì)而非電流。HRP用作酶，檢測(cè)底物是鄰苯胺二胺(ODP)和過(guò)氧化氫。
圖16顯示了檢測(cè)AGP(上)和RCA(下)的校正曲線。對(duì)數(shù)曲線表明本發(fā)明 的高靈敏度。
圖17顯示了電流對(duì)Rab-生物素寡核苷酸濃度的依賴性。在4(TC培育2小時(shí)。
圖18顯示了在含有兩種不同酶體系的電極微陣列上電極的電流反應(yīng)，這 兩種酶體系用于檢測(cè)對(duì)各分析物特異的不同電極上AGP和蓖麻毒蛋白的結(jié)合。 顯示了設(shè)計(jì)用于捕獲AGP的電極上的反應(yīng)。
圖19顯示了在含有兩種不同酶體系的電極微陣列上電極的電流反應(yīng)，這 兩種酶體系用于檢測(cè)對(duì)各分析物特異的不同電極上AGP和蓖麻毒蛋白的結(jié)合。 顯示了設(shè)計(jì)用于捕獲蓖麻毒蛋白的電極上的反應(yīng)。
圖20是具有結(jié)合有酶部分的電極和不含酶部分的電極的電極陣列的示意 圖。酶反應(yīng)產(chǎn)生在含有酶部分的電極上沉積的產(chǎn)物。
圖21是電極微陣列的示意圖，它顯示了含有和不含沉積物的電極上電阻 的測(cè)量結(jié)果。顯示了電流介質(zhì)，作為獲得電極的電化學(xué)讀數(shù)的方法。介質(zhì)為氰 化亞鐵/氰化鐵，它們對(duì)不溶性沉積物的量很靈敏。
圖22是所選電極上沉積有不溶性酶產(chǎn)物的電極微陣列的光學(xué)顯微照片。 互補(bǔ)寡核苷酸耙標(biāo)的濃度是1皮摩爾至1納摩爾?？梢杂^察到捕獲的含生物素 互補(bǔ)寡核苷酸的濃度高和低時(shí)，不溶性物質(zhì)的沉積差異。
圖23是電極微陣列，它顯示沉積30分鐘后HRP-DAB-沉積物上-lOO mV 電化學(xué)還原2毫摩爾K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]。
圖24是電極微陣列圖像，顯示藍(lán)色沉積產(chǎn)物為較暗的電極。深蘭色區(qū)域 表明高濃度的結(jié)合RNA和隨后的HRP;相反，淺藍(lán)色表明兩者濃度都較低。
圖25是電極微陣列圖像，它顯示了閱讀微陣列的過(guò)程中各電極上的電流圖。
圖26是電極微陣列圖像，它顯示了通過(guò)電極氧化去除了所有沉積的酶產(chǎn) 物后，讀出微陣列的過(guò)程中各電極上的電流。以-0.1伏閱讀該微陣列。由于在 前一微陣列讀數(shù)過(guò)程中所有氧化的TMB均被還原，所以觀察到的電流只是由
電極充電引起的。平均來(lái)看，這種電流為0.2-0.3納安培。
圖27是用于閱讀整個(gè)微陣列上各電極的電學(xué)反應(yīng)的方法。
圖28是電極微陣列的圖像，它顯示了用圖27的讀數(shù)方案閱讀微陣列的過(guò)
程中，各電極上的電流。白色區(qū)域?qū)?yīng)于含有探針DNA的電極，由于還原了
沉積產(chǎn)物而產(chǎn)生法拉第電流。黑色區(qū)域代表不含沉積產(chǎn)物，因此電流最小。 圖29是電流與溶液中結(jié)合有酶的互補(bǔ)性靶RNA的濃度的圖。隨著溶液中
靶RNA的濃度的對(duì)應(yīng)的線性增加，電流基本上呈指數(shù)型升高。 圖30提供了酶底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖31包括含有GDH和不含GDH的電極的電流差異的三維柱狀圖。圖中 顯示了含有GDH的三個(gè)所選電極分組的電流差異的二維示意圖。圖中顯示， 寡核苷酸靶標(biāo)濃度為1納摩爾時(shí)(P1)相對(duì)于背景電流測(cè)定到顯著的電流。不出 所料，10皮摩爾(P6)和50皮摩爾(P5)時(shí)電流差異小于1納摩爾時(shí)的電流差異， 它們大約相等。施加電壓為300毫伏。
圖32包括含有GDH和不含GDH的電極的電流差異的三維柱狀圖。圖中 顯示了含有GDH的三個(gè)所選電極分組的電流差異的二維示意圖。圖中顯示， 寡核苷酸靶標(biāo)濃度為1納摩爾時(shí)(P1)相對(duì)于背景電流測(cè)定到顯著的電流。不出 所料，10皮摩爾(P6)和50皮摩爾(P5)時(shí)電流差異小于1納摩爾時(shí)的電流差異， 它們大約相等。施加電壓為500毫伏。
圖33顯示了含有GDH和HRP的電極微陣列上所選電極的平均電流的兩 幅示意圖。該示意圖顯示，在一種酶的檢測(cè)期間，不會(huì)檢測(cè)到另一種酶，即沒(méi) 有串話。
圖34包括兩幅測(cè)定電流減去背景電流與兩種不同分析物濃度的關(guān)系圖， 這兩種分析物是RCA(A)和M13噬菌體(B)。所用培育時(shí)間為12分鐘(曲線1)、 30分鐘(曲線2)和60分鐘(曲線3)。
圖35提供了在不同電極上通過(guò)的電流的二維圖。該圖是通過(guò)各電極的電 流的灰度圖，稱為方塊圖。較高的電流對(duì)應(yīng)于方塊中較淡的圖像。該圖顯示六 種雜交的轉(zhuǎn)錄物(每種轉(zhuǎn)錄物一列)各自的三種探針，并且顯示了各轉(zhuǎn)錄物在雜 交轉(zhuǎn)錄物溶液中的濃度(最下面一行)。還有九種在溶液中沒(méi)有雜交物質(zhì)的陰性 對(duì)照探針。
圖36提供了各雜交轉(zhuǎn)錄物的電極上的電流數(shù)值。該值是各轉(zhuǎn)錄物濃度下 三種不同探針的平均值。
圖37提供了相對(duì)于由九種零濃度探針計(jì)算的平均背景值的增加量。該圖 顯示，在最低濃度下電流增加l倍，在最高濃度下電流增加4.5倍。
發(fā)明詳述
以下是本文所用術(shù)語(yǔ)的定義列表-
術(shù)語(yǔ)"電極微陣列"指固體基材上的電極微陣列。各電極可單獨(dú)尋址，并 可激活成陽(yáng)極或陰極。固體基材通常是平面，具有含有電極的表面。通常，電 極大小約為0.1-100 pm。電極數(shù)目可以是少至一個(gè)，多至成千上萬(wàn)甚至幾十萬(wàn)。 通常，電極微陣列的大小不受限制，電極數(shù)目也不受限。術(shù)語(yǔ)"芯片"指電極微 陣列。術(shù)語(yǔ)"微陣列"包括電極微陣列以及其它類型的微陣列。
術(shù)語(yǔ)"反應(yīng)層"指電極上的涂層，該涂層有助于電化學(xué)合成或連接預(yù)先合 成的物質(zhì)。DNA、 RNA和其它分子可以是在電極微陣列的電極上電化學(xué)原位 合成的，或者連接于微陣列電極。對(duì)各電極而言，存在與其對(duì)應(yīng)的"位點(diǎn)"或 "位置"，這類位點(diǎn)在反應(yīng)層的某部分上。任選地，電極的相對(duì)表面具有反應(yīng) 層，在此處進(jìn)行合成或連接。所述相對(duì)表面接近電極表面，并通過(guò)電極和相對(duì) 表面之間的溶液與電極電接觸。
術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸探針"指通常在電極微陣列上原位合成的單鏈DNA或 RNA,但也可以打點(diǎn)在微陣列上。寡核苷酸探針可與溶液中的寡核苷酸靶標(biāo)基 本互補(bǔ)?？梢允穷A(yù)先合成寡核苷酸探針，然后將其連接于電極微陣列。"DNA 探針"特別指DNA鏈，"RNA探針"特別指RNA鏈。
術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸靶標(biāo)"指溶液中能夠與寡核苷酸探針雜交的單鏈DNA或 RNA。除了與寡核苷酸探針雜交以外，寡核苷酸靶標(biāo)不連接于微陣列。"DNA 靶標(biāo)"特別指DNA鏈，"RNA靶標(biāo)"特別指RNA鏈。寡核苷酸靶標(biāo)的例子 包括合成或天然的單鏈DNA或RNA，包括核糖體RNA和線粒體DNA。寡核 苷酸靶標(biāo)一般含有親和標(biāo)記物，以便連接報(bào)道復(fù)合物。
術(shù)語(yǔ)"捕獲復(fù)合物"指能夠捕獲溶液中的"分析物"的化學(xué)物質(zhì)。分析物 是感興趣的化學(xué)物質(zhì)，通過(guò)捕獲復(fù)合物捕獲分析物稱為"結(jié)合事件"。捕獲通
常指形成鍵，如氫鍵，但通常不意味著形成共價(jià)鍵。分析物不結(jié)合捕獲復(fù)合物， 除非分析物和捕獲復(fù)合物互相具有親和力。親和力包括但不限于抗體-抗原 相互作用、鏈霉親和素-生物素、親和素-生物素和寡核苷酸的互補(bǔ)堿基配對(duì)。"結(jié)合復(fù)合物"指通過(guò)結(jié)合事件得到的物質(zhì)。例如，捕獲復(fù)合物可包含在電極 微陣列上原位合成的寡核苷酸探針，生物素化寡核苷酸可以是分析物。存在足 夠的互補(bǔ)堿基配對(duì)且溶液條件允許進(jìn)行雜交時(shí)，生物素化寡核苷酸(分析物)與 寡核苷酸探針雜交(捕獲復(fù)合物)。"報(bào)道復(fù)合物"可能連接生物素以檢測(cè)結(jié)合 事件。還例如，捕獲復(fù)合物可包含抗體一與寡核苷酸探針雜交的寡核苷酸靶標(biāo) 化合物。分析物是溶液中能夠特異性結(jié)合該抗體的化學(xué)物質(zhì)(抗原)。"報(bào)道復(fù) 合物"可連接于抗原，以檢測(cè)結(jié)合事件(抗原與捕獲復(fù)合物)。第一捕獲復(fù)合物 是特定類型的復(fù)合物。相似地，后續(xù)捕獲復(fù)合物包括任何和所有其它捕獲復(fù)合 物。第一分析物的類型是對(duì)第一捕獲復(fù)合物有親和力的特定類型的分析物。相 似地，后續(xù)捕獲復(fù)合物包括對(duì)特定類型的捕獲復(fù)合物有親和力的任何和所有其 它分析物。電極微陣列可能含有針對(duì)多種靶標(biāo)(分析物)的多種類型的捕獲復(fù)合 物，即第一捕獲復(fù)合物和一種或多種后續(xù)捕獲復(fù)合物，其中各后續(xù)捕獲復(fù)合物 對(duì)后續(xù)靶標(biāo)(分析物)有親和力。術(shù)語(yǔ)"報(bào)道復(fù)合物"指能夠結(jié)合結(jié)合復(fù)合物且含有酶作為報(bào)道復(fù)合物一部 分的化學(xué)復(fù)合物。報(bào)道復(fù)合物提供了檢測(cè)結(jié)合事件的方法?？梢酝ㄟ^(guò)依次加入 互相結(jié)合并在加入最后一種化學(xué)物質(zhì)時(shí)形成報(bào)道復(fù)合物的不同化學(xué)物質(zhì)依次 形成報(bào)道復(fù)合物。最后一種化學(xué)物質(zhì)含有酶。例如，報(bào)道復(fù)合物可以是酶-鏈 霉親和素復(fù)合物，其中鏈霉親和素能夠結(jié)合與寡核苷酸探針雜交的寡核苷酸耙 標(biāo)上的生物素。還例如，報(bào)道復(fù)合物可包含"報(bào)道抗體"，其含有能結(jié)合某抗 原的抗體，該抗原是通過(guò)連接于捕獲復(fù)合物的第一抗體捕獲的。報(bào)道抗體可含 有結(jié)合于抗體的生物素、結(jié)合于生物素的鏈霉親和素和結(jié)合于鏈霉親和素的 酶。該抗體能結(jié)合與第一抗體結(jié)合的分析物。該酶能夠產(chǎn)生可以在電極位點(diǎn)上 檢測(cè)到的氧化還原產(chǎn)物?？赏ㄟ^(guò)先加入抗體-生物素復(fù)合物，然后加入鏈霉親 和素-酶復(fù)合物，而形成報(bào)道抗體?；蛘?，可單獨(dú)加入鏈霉親和素，然后加入 生物素-酶復(fù)合物。其它報(bào)道抗體的描述參見(jiàn)以下說(shuō)明書(shū)。術(shù)語(yǔ)"緩沖液"指能夠控制pH或抵抗pH改變的任何水溶液。緩沖液包
含單獨(dú)的下述化合物或其組合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、硼酸鹽、乙酸鹽、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、雙(2-羥乙基)亞氨基 三(羥甲基)甲垸(雙Tris)、 N-(2-乙酰胺基)-2-亞氨基二乙酸(ADA)、 2-[(2-氨基-2-氧乙基)氨基]乙磺酸(ACES)、哌嗪-N,N'-雙(2-乙磺酸(PIPES)、 3-(^嗎啉代)-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、 1，3-雙[三(羥甲基)甲基氨基]丙垸(雙Tris丙烷)、N,N-雙 (2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、 N-(2-羥乙基)哌 嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、 3-[N,N-雙(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸(DIPSO)、 3-[N-三(羥甲基氨基]-2-羥基丙磺酸 (TAPSO)、三(羥甲基)氨基甲垸(TRIZMA)、 N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(2-羥基丙磺 酸)(HEPPSO)、哌嗪-N，N'-雙(2-羥基丙磺酸)(POPSO)、 ^(2-羥乙基)哌嗪"^'-(3-丙磺酸)(EPPS)、三乙醇胺(TEA)、 N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、 N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(Bicine)、 N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、 3-[(l,l-二甲 基-2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸(AMPSO)、 2-(N-環(huán)己基氨基)乙磺酸(CHES)、 3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-l-丙磺酸(CAPSO)、 2-氨基-2-甲基-l-丙醇(AMP)和3-(環(huán) 己基氨基)-l-丙磺酸(CAPS)。術(shù)語(yǔ)"酶底物溶液"指含有能與酶反應(yīng)的底物分子的水溶液。下面列舉了 不同酶的底物的例子。此外，溶液中可以單獨(dú)存在以下任何一種物質(zhì)，或其組 合輔酶、表面活性劑、防腐劑、粘度調(diào)節(jié)劑、光穩(wěn)定劑和促進(jìn)劑。輔酶的例 子包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和過(guò)氧化氫。 酶底物溶液的配方可能是供應(yīng)商的專利。表面活性劑的例子包括吐溫(R)、十 二烷基硫酸鈉和3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)。防腐劑的例子是乙二醇。術(shù)語(yǔ)"可氧化的芳香劑"指能夠與酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生可在電極上還原的產(chǎn) 物的芳香基化學(xué)物質(zhì)。可氧化的芳香劑包括單獨(dú)的下述化合物和其組合具有 R1、 R2、 R3、 R4、 RS和W的圖30所示的化合物A，其中^選自羥基、氨基、 -0117或^118119， R2、 R3、 R4、 R5和R6獨(dú)立地選自氫、烷基、烯基、炔基、 芳基、雜芳基、取代的烷基、取代的烯基、取代的炔基、取代的芳基、腈、鹵 素、羥基、氨基、-OR7、 -NR8R9、酯、酰胺、羰基、氨基甲酸酯、脲、硫酯、 硫酰胺、硫代羰基、硫代碳酸酯、醛、酮、亞胺、烯、多環(huán)系統(tǒng)或取代的多環(huán) 系統(tǒng)，其中W選自烷基、芳基、氫、雜芳基、取代的烷基、取代的芳基、酯、
酮、醛、氨基甲酸酯、羰基、甲硅垸基醚，其中RS或R"蟲(chóng)立地選自垸基、 芳基、氫、雜芳基、取代的烷基、取代的芳基、酰胺、酮、醛、脲、氨基甲酸 酯、硫酯、硫酰胺、硫代羰基或硫代氨基甲酸酯。術(shù)語(yǔ)"二茂鐵衍生物"指能夠與酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生可在電極上還原的產(chǎn)物 的化學(xué)物質(zhì)。通常，二茂鐵化合物是具有高電子轉(zhuǎn)移特性的有機(jī)金屬試劑。二 茂鐵衍生物包括單獨(dú)以下化合物及其組合二茂鐵、乙?；F、苯甲酰二 茂鐵、正丁基二茂鐵、二茂鐵單羧酸、丁酰二茂鐵、環(huán)己烯基二茂鐵、環(huán)戊烯 基二茂鐵、二甲基氨基甲基二茂鐵、乙基二茂鐵、己?；F、己基二茂鐵、 辛酰基二茂鐵、戊酰基二茂鐵、戊基二茂鐵、丙酰二茂鐵、丙基二茂鐵、i,r-二乙?；F、l,l'-二丁基二茂鐵、l，l'-二丁酰二茂鐵、l,l'-二乙基二茂鐵、i,r-二己酰基二茂鐵、i,r-二己基二茂鐵、i,r-二丙基二茂鐵、4-二茂鐵?；?ferrocenoyl) 丁酸、4-二茂鐵?；∷狨?、3-二茂鐵?；?、3-二茂鐵酰基 丙酸酯、二茂鐵基乙酸、二茂鐵基乙腈、4-二茂鐵基丁酸、4-二茂鐵基丁酸酯、 二茂鐵基羧基醛(FerrocenylCarboxaldehyde)、 二茂鐵基羧酸、二茂鐵基乙醇、 二茂鐵基甲醇、5-二茂鐵基戊酸、5-二茂鐵基戊酸酯、卡托辛(0&10"1^)(2,2-雙(乙基二茂鐵基)丙烷、氨基二茂鐵、甲酰胺基二茂鐵、異氰基二茂鐵、異硫 氰酸根合二茂鐵和二膦l,l'雙(二苯基膦基)二茂鐵。其它有機(jī)金屬的例子包括 雙(2,2'-聯(lián)吡啶)-4,4'-二羧基聯(lián)吡啶-釕和B卜啉鋅。術(shù)語(yǔ)"可氧化的無(wú)機(jī)物"指能夠與酶發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生可在電極上還原的產(chǎn) 物的無(wú)機(jī)化學(xué)物質(zhì)?？裳趸臒o(wú)機(jī)物包括單獨(dú)的下述化合物和其組合碘、莫爾鹽(硫酸銨亞鐵(n))和氰基鐵酸(n)鉀。術(shù)語(yǔ)"烷基"指具有單自由基(singleradical)且最多含有約20個(gè)碳原子， 但較好的是含有最多10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。垸基的例子包括但不限 于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊 基、異戊基、新戊基、叔戊基、異己基、正己基、正庚基和正辛基。取代的垸 基中有一個(gè)或多個(gè)氫原子被其它基團(tuán)取代，或者一個(gè)或多個(gè)碳被二價(jià)或三價(jià)基 團(tuán)或原子替代。術(shù)語(yǔ)"烯基"指具有單自由基、含有至少一個(gè)碳-碳雙鍵且最多含有約20 個(gè)碳原子，但較好的是含最多10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。烯基的例子包
括但不限于乙烯基、l-丙烯基、2-丁烯基、1,3-丁二烯基、2-戊烯基、2，4-己 二烯基、4-(乙基)-l,3-己二烯基和2-(甲基)-3-(丙基)-l,3-丁二烯基。取代的烯基 中有一個(gè)或多個(gè)氫原子被其它基團(tuán)取代，或者一個(gè)或多個(gè)碳被二價(jià)、三價(jià)或四 價(jià)基團(tuán)或原子替代。術(shù)語(yǔ)"炔基"指具有單自由基、含有至少一個(gè)碳-碳三鍵且最多含有約20 個(gè)碳原子，但較好的是含最多10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈垸基。炔基的例子包 括但不限于乙炔基、l-丙炔基、2-丙炔基、l-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、 4-戊炔基、5-己炔基、6-庚炔基、7-辛炔基、l-甲基-2-丁炔基、2-甲基-3-戊炔 基、4-乙基-2-戊炔基和5,5-甲基-1,3-己炔基。取代的炔基中有一個(gè)或多個(gè)氫原 子被其它基團(tuán)取代，或者一個(gè)或多個(gè)碳被二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)基團(tuán)或原子替代。術(shù)語(yǔ)"環(huán)烷基"指形成至少一個(gè)環(huán)的垸基，其中所述環(huán)具有約3-14個(gè)碳 原子。環(huán)垸基的例子包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。取代 的環(huán)烷基中有一個(gè)或多個(gè)氫原子被其它基團(tuán)取代，或者一個(gè)或多個(gè)碳被二價(jià)、 三價(jià)或四價(jià)基團(tuán)或原子替代。術(shù)語(yǔ)"環(huán)烯基"指形成至少一個(gè)環(huán)并且該環(huán)中具有至少一個(gè)碳-碳雙鍵的 烯基，其中所述環(huán)具有約3-14個(gè)碳原子。環(huán)烯基的例子包括但不限于環(huán)丙 烯基、環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、1，3-環(huán)戊二烯基和環(huán)己烯基。取代的環(huán)烯基中有 一個(gè)或多個(gè)氫原子被其它基團(tuán)取代，或者一個(gè)或多個(gè)碳被二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)基 團(tuán)或原子替代。術(shù)語(yǔ)"環(huán)炔基"指形成至少一個(gè)環(huán)并具有至少一個(gè)碳-碳三鍵的炔基，其 中所述環(huán)含有最多約14個(gè)碳原子。形成具有至少一個(gè)三鍵和至少一個(gè)雙鍵的 環(huán)的基團(tuán)是環(huán)炔基。環(huán)炔基的例子包括但不限于環(huán)辛炔基。取代的環(huán)炔基中有 一個(gè)或多個(gè)氫原子被其它基團(tuán)取代，或者一個(gè)或多個(gè)碳被二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)基 團(tuán)或原子替代。術(shù)語(yǔ)"芳基"指大多數(shù)原子為碳原子，含有單自由基，且具有約4-20個(gè) 碳原子的芳環(huán)基。芳環(huán)結(jié)構(gòu)可以包括有一個(gè)或兩個(gè)雜原子的環(huán)。芳基的例子包 括但不限于苯基、萘基和蒽基。取代的芳基中有一個(gè)或多個(gè)氫原子被其它基 團(tuán)取代，或者一個(gè)或多個(gè)碳被二價(jià)或三價(jià)基團(tuán)或原子替代。術(shù)語(yǔ)"雜"在用于化學(xué)基團(tuán)命名時(shí)，或"雜原子"是指除碳和氫以外的原
子。雜原子的例子包括但不限于氧、氮、磷、硫、硼、硅和硒。術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)"指一種環(huán)結(jié)構(gòu)，所述環(huán)結(jié)構(gòu)上具有至少一個(gè)環(huán)，該環(huán)上有至 少一個(gè)形成該環(huán)一部分的雜原子，且具有約3-20個(gè)原子連接形成環(huán)結(jié)構(gòu)。具 有6個(gè)原子的雜環(huán)的例子是吡啶。雜環(huán)結(jié)構(gòu)的其它例子包括但不限于以下芳族結(jié)構(gòu)吖啶、味唑、苯并吡喃、咪唑、呋喃、B引哚、喹啉和磷啉(phosphinoline)。 雜環(huán)結(jié)構(gòu)的例子包括但不限于以下非芳族結(jié)構(gòu)氮丙啶、1，3-二硫戊環(huán)、1,3-二氮雜環(huán)丁垸和1,4,2-嗯唑磷烷(oxazaphospholidine)。雜環(huán)結(jié)構(gòu)的例子包括但不 限于以下稠合芳族結(jié)構(gòu)和非芳族結(jié)構(gòu)2H-呋喃并[3,2-b]吡喃、5H-吡啶并 [2,3-d]-o-噁嗪、lH-吡唑并[4,3-d]噁唑、4H-咪唑并[4,5-d]噻唑、硒唑并[5，4匿f] 苯并噻唑和環(huán)戊二烯并[b]吡喃。術(shù)語(yǔ)"多環(huán)基團(tuán)"指具有一個(gè)以上的環(huán)的碳環(huán)結(jié)構(gòu)，所述碳環(huán)結(jié)構(gòu)具有約 4-20個(gè)碳原子形成環(huán)結(jié)構(gòu)。多環(huán)基團(tuán)的例子包括但不限于雙環(huán)[1丄0]丁垸、 雙環(huán)[5.2.0]壬烷和三環(huán)[5.3丄1]十二垸。術(shù)語(yǔ)"鹵代"或"鹵素"的含義包括氟、氯、溴或碘。 術(shù)語(yǔ)"雜原子基團(tuán)"指一個(gè)雜原子，或結(jié)合在一起并具有兩個(gè)自由價(jià)的一 個(gè)以上的雜原子，所述自由價(jià)在兩個(gè)原子之間形成共價(jià)橋連。例如，氧自由基 -O-可以在兩個(gè)甲基之間形成橋，形成CH3-0-CH3(二甲基醚)，或可以在兩個(gè) 碳之間形成橋連，形成環(huán)氧化物，如順或反2,3-環(huán)氧丁垸。與通常用法不同的 是本文中所用術(shù)語(yǔ)雜原子基團(tuán)表示垸基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基和 環(huán)炔基中的基團(tuán)取代，并不表示形成環(huán)狀橋如環(huán)氧化物，除非術(shù)語(yǔ)環(huán)狀橋 與術(shù)語(yǔ)雜原子基團(tuán)一起使用來(lái)表示通常用法中的含義。使用雜橋(如環(huán)氧橋) 命名法的雜原子基團(tuán)的例子包括但不限于亞疊氮基(一N-N—HN-)、偶氮 (—N=N—)、 二亞氨基(—NH—NH—)、橋二氧(一0—0—)、橋二硫基(—S—S—)、 橋硫基(一S—)、橋硫氧亞氨基(ep池ioximino)(—S—0—NH—)、橋氧基(一0—)、 橋氧亞氨基(epoxyimino)(一O一NH—)、橋氧次氮基(—0—N=)、橋氧硫基 (epoxythio)( —0—S—)、橋氧硫氧基(epoxythioxy)( —O—S —0—)、呋喃基 (furano)(—C*H20_)、亞氨基(一NH-)和次氮基(一N=)。使用形成環(huán)橋的命名 法的雜原子基團(tuán)的例子包括但不限于橋氧基(一0—)、橋硫基(一S—)、橋 硒基(episeleno)(一Se—)、橋二氧(一O—0—)、橋二硫(一S—S—)、人4-磺垸基 (sulfano)(—SH2—)、橋氧硫(一O—S—)、橋氧硫氧基(一0—S—0—)、橋氧亞 氨基(一0_NH—)、橋亞氨基(一NH—)、 二氮垸基(diazano)(一NH—NH—)、 二 氮烯基(diazeno)(—N-N—)、三氮-l-烯基(triaz[l]eno)(—N=N—NH—)、磷垸 基(phosphano)( —PH— )、錫烷基(stannano)( —SnH2_ )、橋氧亞甲基 (epoxymethano)(—0—CH2—)、橋氧亞乙基(epoxyethano) (—0—CH2—CH2_)、 橋氧丙烯-l-基(epoxyprop[l]eno)(-0-CH-CH-CH2-)。術(shù)語(yǔ)"橋(bridge)"指環(huán)結(jié)構(gòu)的一部分與該環(huán)結(jié)構(gòu)的另一部分之間通過(guò)碳 氫橋(hydrocarbon bridge)的連接。橋的例子包括但不限于橋亞甲基(methano)、 橋亞乙基(ethano)、亞乙烯基(etheno)、橋亞丙基(propano)、橋亞丁基(butano)、 2-亞丁烯基(2-buteno)和橋亞苯基(benzeno)。術(shù)語(yǔ)"雜橋"指環(huán)結(jié)構(gòu)的一部分與該環(huán)結(jié)構(gòu)的另一部分之間通過(guò)一個(gè)或多 個(gè)雜原子基團(tuán)的連接，或通過(guò)雜橋?qū)⒕€型結(jié)構(gòu)的一部分與該線型結(jié)構(gòu)的另一部 分相連形成的環(huán)。術(shù)語(yǔ)"氧基(oxy)"指二價(jià)基團(tuán)-0-。術(shù)語(yǔ)"氧代(oxo)"指二價(jià)基團(tuán)=0。術(shù)語(yǔ)"羰基"指基團(tuán)-C(O)-，其中的碳具有用于連接的兩個(gè)自由基。 術(shù)語(yǔ)"酰胺"或"?；被?指基團(tuán)-NH-C(O)-R，其中氮具有一個(gè)用于 連接的單自由基，R是氫或未取代的或取代的垸基、烯基、炔基、環(huán)垸基、環(huán) 烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"烷氧基"指基團(tuán)-O-R，其中，氧具有單自由基，R是氫或未取代或 取代的垸基、烯基、炔基、環(huán)垸基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。 其中R是烷基的垸氧基的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧 基、戊氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基、1,1-二甲基乙氧基、1,1-二甲基丙氧基、 1,1-二甲基丁氧基、U-二甲基戊氧基、l-乙基-l-甲基丁氧基、2,2-二甲基丙氧 基、2,2-二甲基丁氧基、l-甲基-l-乙基丙氧基、1,1-二乙基丙氧基、1,1,2-三甲 基丙氧基、1，1，2-三甲基丁氧基、1,1,2,2-四甲基丙氧基。R是烯基的垸氧基的 例子包括但不限于乙烯氧基、l-丙烯氧基、2-丙烯氧基、l-丁烯氧基、2-丁 烯氧基、3-丁烯氧基、l-甲基-丙-2-烯氧基、1,1-二甲基-丙-2-烯氧基、1,1,2-三 甲基-丙-2-烯氧基和1,1-二甲基-丁-2-烯氧基、2-乙基-l,3-二甲基-丁-l-烯氧基。
R是炔基的垸氧基的例子包括但不限于乙炔氧基、l-丙炔氧基、2-丙炔氧基、l-丁炔氧基、2-丁炔氧基、3-丁炔氧基、l-甲基-丙-2-炔氧基、1,1-二甲基-丙-2-炔氧基和U-二甲基-丁-2-炔氧基、3-乙基-3-甲基-丁-l-炔氧基。R是芳基的垸 氧基的例子包括但不限于苯氧基、2-萘氧基和l-蒽氧基。術(shù)語(yǔ)"?；?指基團(tuán)-C(O)R，其中，碳具有單自由基，R是氫或未取代的 或取代的垸基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán)基 團(tuán)。?；睦影ǖ幌抻谝阴；?、丙?；?、丁?；?、異丁?；⑽祯；?、 異戊酰基、丙烯?；⒈蝉；?propioloyl)、甲基丙烯?；?、丁烯?；惗?烯?；?、苯甲酰基和萘甲?；Ｐg(shù)語(yǔ)"酰氧基"指基團(tuán)-O-C(O)R，其中氧具有單自由基，R是氫或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)垸基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán) 基團(tuán)。酰氧基的例子包括但不限于乙酰氧基、乙基甲酰氧基、2-丙烯基甲酰 氧基、戊基甲酰氧基、1-己炔基甲酰氧基、苯甲酰氧基、環(huán)己基甲酰氧基、2-萘甲酰氧基、3-環(huán)癸烯基甲酰氧基。術(shù)語(yǔ)"氧基羰基"指基團(tuán)-C(O)-O-R，其中碳具有單自由基，R是氫或未 取代的或取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或 多環(huán)基團(tuán)。氧羰基的例子包括但不限于甲氧基羰基、乙氧基羰基、異丙氧基羰基、苯氧基羰基和環(huán)己氧基羰基。術(shù)語(yǔ)"烷氧基羰氧基"指基團(tuán)-O-C(O)-O-R，其中氧具有單自由基，R是 氫或未取代的或取代的垸基、烯基、炔基、環(huán)垸基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、 雜環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"羧基"指基團(tuán)-C(O)OH，其中碳具有單自由基。術(shù)語(yǔ)"氨基"指基團(tuán)-NH2，其中氮具有單自由基。術(shù)語(yǔ)"仲氨基"指基團(tuán)-NH-R，其中氮具有單自由基，R是氫或未取代的 或取代的垸基、烯基、炔基、環(huán)垸基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán)基 團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"叔氨基"指基團(tuán)-NR2111，其中氮原子具有單自由基，w和pe獨(dú)立地選自以下基團(tuán)未取代和取代的垸基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔 基、芳基、雜環(huán)和多環(huán)基團(tuán)。
術(shù)語(yǔ)"l，2-亞肼代"指基團(tuán)-NH-NH-,其中氮具有與相同原子相連的單自 由基。術(shù)語(yǔ)"l，2-亞肼基"指基團(tuán)-NH-NH-，其中氮原子具有與不同原子相連 的單自由基。術(shù)語(yǔ)"肼基"指基團(tuán)NH2-NW-，其中氮(N"具有單自由基。 術(shù)語(yǔ)"亞肼基"指基團(tuán)NH2-N5^，其中氮(N"具有兩個(gè)自由基。 術(shù)語(yǔ)"羥基亞氨基"指基團(tuán)HO-Nt5其中氮(N"具有兩個(gè)自由基。 術(shù)語(yǔ)"垸氧基亞氨基"指基團(tuán)R-0-，-，其中氮(N"具有兩個(gè)自由基，R是未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)垸基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"疊氮基"指基團(tuán)N3-，其中氮(N"具有單自由基。術(shù)語(yǔ)"氧化偶氮基"指基團(tuán)-N，0)-N、其中每個(gè)氮具有一個(gè)自由基。術(shù)語(yǔ)"烷基氧化偶氮基(alkazoxy)"指基團(tuán)R-N(0)-N*-，其中氮(N"具有一個(gè)自由基，R是氫或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。氧化偶氮苯是一個(gè)示例化合物。術(shù)語(yǔ)"氰基"指基團(tuán)-CN。術(shù)語(yǔ)"異氰基"指基團(tuán)-NC。術(shù)語(yǔ)"氰酸根"指基團(tuán)-OCN。術(shù)語(yǔ)"異氰酸根"指基團(tuán)-NCO。術(shù)語(yǔ)"雷酸根"指基團(tuán)-ONC。術(shù)語(yǔ)"硫氰酸根"指基團(tuán)-SCN。術(shù)語(yǔ)"異硫氰酸根"指基團(tuán)-NCS。術(shù)語(yǔ)"硒氰酸根"指基團(tuán)-SeCN。術(shù)語(yǔ)"異硒氰酸根"指基團(tuán)-NCSe。術(shù)語(yǔ)"羧酰氨基"或"酰氨基"指基團(tuán)-NH-CO-R，其中，氮具有單自由基，R是氫或未取代的或取代的垸基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"酰亞氨基"指基團(tuán)-N-C(O)-R，其中，氮具有兩個(gè)自由基，R是氫或未取代的或取代的垸基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"亞硝基"指基團(tuán)O二N-，其中，氮具有單自由基。 術(shù)語(yǔ)"氨氧基"指基團(tuán)-0-NH2，其中，氧具有單自由基。 術(shù)語(yǔ)"亞胺酰基(carxoimidioy)"指基團(tuán)-C(NH)-R，其中，碳具有單自由基，R是氫或未取代的或取代的垸基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。
術(shù)語(yǔ)"亞肼基"指基團(tuán)-C(NH-NH2)-R，其中，碳具有單自由基，R是氫 或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)垸基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜 環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"甲醛肟基(hydroximoyl)"或"肟(oxime)"指基團(tuán)-C(NH-OH)-R，其中，碳具有單自由基，R是氫或未取代的或取代的垸基、烯基、炔基、環(huán)垸基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"肼基"指基團(tuán)R-C(O)-NH-HN-，其中，每個(gè)氮具有單自由基，R是氫或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"脒基"指基團(tuán)-C(NH)-NH2，其中，碳具有單自由基。術(shù)語(yǔ)"硫化物"指基團(tuán)-S-R，其中，硫具有單自由基，R是氫或未取代的或取代的垸基、烯基、炔基、環(huán)垸基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"硫醇"指基團(tuán)-S-，其中，硫具有兩個(gè)自由基，氫硫醇指-SH。 術(shù)語(yǔ)"硫代?；?指基團(tuán)-C(S)-R，其中，碳具有單自由基，R是氫或未取代的或取代的垸基、烯基、炔基、環(huán)垸基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"亞砜"指基團(tuán)-S(O)-R，其中，硫具有單自由基，R是氫或未取代 的或取代的垸基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán) 基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"硫代亞砜"指硫取代亞砜中的氧；該術(shù)語(yǔ)包括在R基團(tuán)的第一個(gè) 碳被氧基取代時(shí)以及當(dāng)亞砜與另一個(gè)基團(tuán)上的硫原子相連時(shí)，對(duì)連接在硫和該 R基團(tuán)之間的氧的取代。術(shù)語(yǔ)"砜"指基團(tuán)-S(O)(O)-R，其中，硫具有單自由基，R是氫或未取代 的或取代的垸基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)或多環(huán) 基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"硫代砜"指硫取代在砜的一個(gè)或兩個(gè)位置上的氧；該術(shù)語(yǔ)包括在 R基團(tuán)的第一個(gè)碳被氧基取代時(shí)以及當(dāng)亞砜與另一個(gè)基團(tuán)上的硫原子相連時(shí)， 對(duì)連接在硫和該R基團(tuán)之間的氧的取代。術(shù)語(yǔ)"磷酸酯"指基團(tuán)R1R2P04-，其中，氧具有單自由基，R1選自氫、未取代的和取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)
和多環(huán)基團(tuán)，R2選自未取代的和取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、 環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)和多環(huán)基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"取代的"或"取代"在本文對(duì)化學(xué)物質(zhì)的描述中獨(dú)立地具有選 自以下的含義至少一個(gè)碳上的氫被單價(jià)基取代、至少一個(gè)碳上的兩個(gè)氫 被二價(jià)基取代、至少一個(gè)末端碳(甲基)上的三個(gè)氫被三價(jià)基取代、至少一個(gè) 碳和相連的氫(如亞甲基)被二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)基替代，以及它們的組合。要 滿足價(jià)數(shù)的要求限制了取代。取代發(fā)生在烷基、烯基、炔基、環(huán)垸基、環(huán) 烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)和多環(huán)基團(tuán)上，提供取代的烷基、取代的烯基、 取代的炔基、取代的環(huán)烷基、取代的環(huán)烯基、取代的環(huán)炔基、取代的芳基、 取代的雜環(huán)和取代的多環(huán)基團(tuán)。在烷基、烯基、炔基、環(huán)垸基、環(huán)烯基、 環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)和多環(huán)基團(tuán)上的取代基團(tuán)獨(dú)立地選自垸基、烯基、 炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜環(huán)、多環(huán)基團(tuán)、鹵素、雜原子 基團(tuán)、氧基(oxy)、氧代、羰基、酰胺、烷氧基、?；ⅤＱ趸?、氧羰基 (oxycarbonyl)、烷氧基羰氧基、羧基、亞氨基、氨基、仲氨基、叔氨基、1,2-亞肼代、肼基、亞肼基、羥基亞氨基(hydroxyimino)、疊氮基、氧化偶氮基 (azoxy)、烷基氧化疊氮基、氰基、異氰基、氰氧基，異氰酸根、氰硫基、 雷酸根、異硫氰酸根、異硒代氰酸根、硒代氰酸根、羧酰氨基(carboxyamido)、 ?；鶃啺被?、亞硝基、氨基氧代、羧亞氨基、腙?；?、肟、?；禄㈦?基、硫化物、硫醇、亞砜、硫代亞砜(thiosulfoxide)、砜、硫代砜(thiosulfone)、 硫代硫酸根、羥基、甲?；⒘u基過(guò)氧基、過(guò)氧羥基、過(guò)氧酸、氨基甲酰 基、三甲基甲硅烷基、次氮基、硝基、酸式硝基、亞硝基、脲亞氨基、草 氨酰基、五唑基、硒基、硫氧化(thiooxi)、氨磺酰基、氨亞磺?；?sulfenamoyl)、 次磺基(sulfeno)、氨亞硫?；?sulfmamoyl)、亞磺基、亞硫?；⒒腔?、磺 氨基、磺酸根、磺?；⒒酋６趸?sulfonyldioxy)、氫硫醇、四唑基、硫 代氨甲酰基、硫代縮二脲亞氨基(thiocarbazono)、硫代雙偶氮酮基 (thiocarbodiazono)、岳1H戈碳酰月井基(thiocarbonohydyazido)、硫f^H基、硫代 羧基、氰硫基、硫醛基、硫代?；?、氨基硫脲基(thiosemicarbazido)、硫代 亞磺基、硫代磺基、硫脲基、硫代(thioxo)、三氮垸基、三氮烯基、三嗪基、 三硫代(trithio)、三硫代磺基、亞磺基亞胺酸(sumnimidicacid)、磺基亞胺酸 (sulfonimidic acid)、 亞磺基腙酸(sulfinohydrazonic acid)、 磺基腙酸 (sulfonohydrazonic acid)、 亞石黃基蘿圣月虧酸(sulfmohydroximic acid)、擴(kuò)基P5月虧 酸(sulfonohydroximicacid)和磷酸酯，以及它們的組合。作為取代的例子， 例如乙垸上的一個(gè)氫原子被羥基取代，得到乙醇；丙垸的中間碳上的兩個(gè) 氫被氧基取代，得到丙酮(二甲基甲酮)。作為取代的另一個(gè)例子，例如丙烷 的中間碳(次甲基)被氧基(-O-)替代，得到二甲醚(CH3-0-CH3)。作為取代的 又一個(gè)例子，例如苯上的一個(gè)氫原子被苯基取代，得到聯(lián)苯。如上所述， 雜原子基團(tuán)可以替代烷基、烯基或炔基內(nèi)的亞甲基(:CH2)，形成直鏈或支鏈 的取代結(jié)構(gòu)，而不是形成環(huán)，或者替代環(huán)烷基、環(huán)烯基或環(huán)炔基的環(huán)內(nèi)的 亞甲基，形成雜環(huán)。作為另一個(gè)例子，例如次氮基(-N"可以替代苯上的其 中一個(gè)碳和相連的氫，得到吡啶，或用氧基替代，得到吡喃。術(shù)語(yǔ)"未取代的"指在烷基、烯基、炔基、環(huán)垸基、環(huán)烯基、環(huán)炔基或芳 基上的碳和氫都沒(méi)有被取代?？蓪ぶ冯姌O微陣列和結(jié)合事件電極微陣列包括多個(gè)可尋址電極。可尋址電極是可電學(xué)控制該電極以在電 極上產(chǎn)生電流或電壓的電極。電極微陣列優(yōu)選成列或成行排列，但也可采用其 它形式。電極可以是圓形或其它合適的幾何形狀，包括部分成環(huán)狀或適當(dāng)斷開(kāi) 的線條格子。也可采用其它幾何形狀，包括2005年4月15日提交的題為 "Neutralization and Containment of Redox Species Produced by Circumferential Electrodes"(圓形電極產(chǎn)生的氧化還原物質(zhì)的中和和包含)的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào) 11/108,078(納入本文作參考)所述的幾何形狀。各電極占據(jù)了微陣列的表面區(qū) 域。在含有電極的特定區(qū)域內(nèi)，可原位合成分子。可以合成的分子類型包括小 分子、低聚物和聚合物。還可合成生物分子如肽、DNA和RNA。在電極微陣 列上合成的分子通常稱為探針。電極微陣列還常常含有連接于微陣列表面的多孔性反應(yīng)基質(zhì)(層)。多孔性 反應(yīng)基質(zhì)連接有探針，并提供三維虛擬瓶用于約束電極的試劑。在圓形電極的 情況下，可以認(rèn)為該瓶是圓柱形。在優(yōu)選實(shí)施方式中，多孔性反應(yīng)基質(zhì)選自蔗 糖、單糖、二糖、三糖、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、N-羥基琥珀酰亞胺、琥
珀酰亞胺衍生物和其組合。在優(yōu)選實(shí)施方式中，可采用其它多孔性反應(yīng)基質(zhì)材料，包括2004年9月18日提交的題為"Electrode Array device having an adsorbed porous reaction layer"(吸附有多孔性反應(yīng)層的電極陣列裝置)的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào) 10/992，252(納入本文作參考)。在另一實(shí)施方式中，多孔性反應(yīng)層是膜，膜材料 選自聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、三纖維素乙酸酯、聚氨酯、瓊脂糖、含有PTFE 樹(shù)脂的控制多孔性玻璃和它們的組合。最常見(jiàn)的是，微陣列含有多個(gè)探針?lè)肿?。或者和罕?jiàn)地，微陣列可含有一 種探針?lè)肿宇愋?。在最常?jiàn)的微陣列形式中，探針是可結(jié)合于DNA或RNA的 互補(bǔ)序列的寡核苷酸，其中所述DNA或RNA是寡核苷酸靶標(biāo)。根據(jù)雜交條件， 含有與探針幾乎互補(bǔ)的區(qū)域的靶標(biāo)可結(jié)合于探針。檢測(cè)微陣列上的結(jié)合或雜交 事件是獲得有用和準(zhǔn)確數(shù)據(jù)的主要挑戰(zhàn)之一。大多數(shù)市售產(chǎn)品通常是通過(guò)將寡 核苷酸打點(diǎn)或噴墨打印到平坦的非多孔性表面如載玻片上制備的。存在使樣品 寡核苷酸(靶標(biāo))變成用熒光染料標(biāo)記的市售樣品標(biāo)記試劑盒。它常常是以商品 名德克薩斯紅⑧或CY⑧染料，包括CY3 DIRECT⑧和CY5 DIRECT⑧出售的熒 光染料。最常見(jiàn)的是，通過(guò)具有顯微鏡放大或成像拼合功能的常見(jiàn)熒光計(jì)布置 "閱讀"微陣列。讀數(shù)包括在打點(diǎn)或合成探針的已知位置上觀察熒光。閱讀微陣列熒光以檢測(cè)結(jié)合事件是通用的檢測(cè)方法。然而，存在著光學(xué)問(wèn)題、難以用 熒光染料標(biāo)記、偶發(fā)性高背景問(wèn)題，以及最重要的是，熒光顯微設(shè)備成本極高。 因此，需要用復(fù)雜程度低且變異性降低的較低成本的設(shè)備檢測(cè)微陣列上的結(jié)合 事件。本發(fā)明方法采用電化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)合事件，以提供變異性較低的較低成本 的方法。該方法包括將電壓或電流施加于電極微陣列上的電極，以檢測(cè)結(jié)合事 件。用電壓或電流檢測(cè)酶反應(yīng)的產(chǎn)物或酶反應(yīng)產(chǎn)物的影響?？梢栽陉?yáng)極氧化該 產(chǎn)物，或在陰極還原該產(chǎn)物。微陣列上的電極可以用作陽(yáng)極或陰極。僅限于在 有源(active)電極，而非相鄰(neighboring)電極檢測(cè)局部電流或電壓信號(hào)。不存 在這類限制稱為電極間的"串話"。本發(fā)明在結(jié)合事件檢測(cè)期間電極之間串話很 少或無(wú)串話。優(yōu)選地，與未發(fā)生結(jié)合事件的電極相比，檢測(cè)到電壓或電流改變， 則說(shuō)明發(fā)生了結(jié)合事件?；蛘?，可通過(guò)電阻率改變來(lái)檢測(cè)結(jié)合事件。電極微陣 列優(yōu)選為康柏瑪其克公司 (CombiMatrixCorporation)的CUSTOMARRAY12K 。(每平方厘米約12,000個(gè)電極)?；蛘?，電極微陣列是 康柏瑪其克公司的CUSTOMARRAY902W(每平方厘米約1,000個(gè)電極)。其它 電極微陣列也適合用于實(shí)施本發(fā)明。通常，微陣列上任何密度的電極均適合實(shí) 施本發(fā)明，只要各電極之間間隔足夠距離。電極微陣列上的免疫實(shí)驗(yàn)根據(jù)抗體與少數(shù)分析物形成復(fù)合物的能力進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，所述分析物通常 是抗原或半抗原。抗體對(duì)特定分析物的選擇性提供了高度特異且高度靈敏的實(shí) 驗(yàn)。通常，免疫實(shí)驗(yàn)是基于一種或多種抗體與分析物的結(jié)合。分析物的例子包 括抗原、半抗原、病毒、細(xì)菌、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、多糖、生物聚合物分子、脂質(zhì)、 糖蛋白(a-l-酸糖蛋白)、蓖麻毒蛋白、M13噬菌體、球形芽孢桿菌(5ac/〃船 g/o6扭/)(BG)芽孢、熒光素、兔IgG、山羊IgG、 DNA、 RNA、單鏈DNA、核 糖體RNA、線粒體DNA、細(xì)胞受體、糖基化的膜結(jié)合蛋白、非糖基化的膜結(jié) 合蛋白、多肽、糖基化多肽、抗體、細(xì)胞抗原決定簇、有機(jī)分子、金屬離子、 鹽陰離子和陽(yáng)離子以及有機(jī)金屬，和它們的組合。與免疫實(shí)驗(yàn)有關(guān)的問(wèn)題可能 源于以下能力(1)組裝可檢測(cè)結(jié)構(gòu)的能力和(2)發(fā)生抗體結(jié)合時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)的能 力。理想情況下，僅在含有合適探針的位置上發(fā)生抗體結(jié)合?？赏ㄟ^(guò)存在酶反 應(yīng)產(chǎn)物而間接測(cè)定抗體結(jié)合事件。結(jié)合抗體后，需要一種檢測(cè)結(jié)合抗體的方法。通常，最常見(jiàn)的檢測(cè)方法包 括使用標(biāo)記，包括放射性標(biāo)記、酶或熒光標(biāo)記。最常見(jiàn)的方法是使用連接于結(jié) 合于抗體的部分或直接連接于抗體的熒光標(biāo)簽。在這種方法中，用熒光成像系 統(tǒng)觀察含有該抗體的微陣列上的位置。熒光圖像和探針身份知識(shí)的組合提供了 靶標(biāo)的檢測(cè)。最常見(jiàn)的使用酶標(biāo)記的免疫實(shí)驗(yàn)是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)。 最普遍的酶免疫實(shí)驗(yàn)是夾心法和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合法。用96孔微量滴定板進(jìn)行最傳 統(tǒng)的免疫實(shí)驗(yàn)；也可采用其它平板，如384孔板或更多孔板。通常，對(duì)常規(guī)免 疫實(shí)驗(yàn)的限制包括(l)難以進(jìn)行多重測(cè)定；(2)分析時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)；(3)整個(gè)過(guò) 程分為多個(gè)階段，使該方法較復(fù)雜并且需要經(jīng)過(guò)充分培訓(xùn)的工作人員；(4)在實(shí) 踐中，無(wú)法使該裝備小型化；(5)完成了自動(dòng)化但困難重重；和(6)必須在實(shí)驗(yàn) 室進(jìn)行。因此，本領(lǐng)域需要一種復(fù)雜程度降低、分析時(shí)間縮短、能夠小型化、
自動(dòng)化和能夠在非實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的改進(jìn)的免疫實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明方法利用了夾心免疫實(shí)驗(yàn)和連接于報(bào)道抗體的酶。在電極微陣列上 進(jìn)行的夾心免疫實(shí)驗(yàn)中，使第一結(jié)合抗體結(jié)合于微陣列的已知位置上。通常， 第一結(jié)合抗體稱為捕獲抗體。第一結(jié)合抗體優(yōu)選連接于與電極微陣列已知位置 上原位合成的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸。或者，將電極微陣列上的寡核苷酸打 點(diǎn)到已知位置上。通過(guò)與微陣列上的互補(bǔ)鏈雜交使第一結(jié)合抗體連接于微陣 列，從而按照互補(bǔ)鏈的位置提供第一抗體的位置圖。這類雜交和作圖稱為自身 組裝微陣列。使含有分析物的溶液接觸微陣列，以便使分析物結(jié)合于抗體。感興趣分析 物通常只結(jié)合于特定抗體，從而提供高特異性。使含有第二抗體的溶液接觸微 陣列，以使第二抗體連接于結(jié)合的分析物。第二抗體用作報(bào)道抗體，就是說(shuō)該 抗體能報(bào)道連接有分析物的微陣列位置。優(yōu)選地，報(bào)道抗體與酶共價(jià)連接。或者，報(bào)道抗體可含有生物素分子?？?將鏈霉親和素-酶偶聯(lián)物或親和素-酶偶聯(lián)物連接于此生物素分子?；蛘撸蓪?鏈霉親和素連接于生物素，然后將另一生物素連接于鏈霉親和素，其中第二個(gè) 生物素共價(jià)連接于酶?；蛘撸蓪⑦B接有酶的抗-物種抗體連接于報(bào)道抗體。 或者，報(bào)道抗體可結(jié)合有鏈霉親和素或親和素。然后，將生物素標(biāo)記的酶連接 于鏈霉親和素或親和素?；蛘撸瑘?bào)道抗體可連接有寡核苷酸。連接有酶的互補(bǔ) 寡核苷酸與連接于報(bào)道抗體的寡核苷酸雜交。該酶優(yōu)選為氧化還原酶?；蛘?， 該酶是引起切割反應(yīng)而產(chǎn)生氧化還原產(chǎn)物的酶，所述產(chǎn)物是可以在電極上氧化 或還原的酶。或者，所述產(chǎn)物是在電極上沉積的固體；可通過(guò)電阻、電導(dǎo)率或 氧化還原反應(yīng)檢測(cè)固體產(chǎn)物?？膳c免疫實(shí)驗(yàn)一起構(gòu)建和使用本發(fā)明方法，所述免疫實(shí)驗(yàn)包括夾心型免疫 實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建和使用使該酶連接于抗體復(fù)合物。報(bào)道抗體結(jié)合于微陣列已知位置 上連接的探針抗體結(jié)合的分析物時(shí)，形成該復(fù)合物。夾心實(shí)驗(yàn)形式能夠使用若干形式，而不難提供(合成)基于分析物的單獨(dú)的抗體-酶偶聯(lián)物。圖1和2顯示了夾心形式的免疫實(shí)驗(yàn)的例子。也可采用以前所述的其它形式。 用于免疫實(shí)驗(yàn)的酶體系
本文介紹了不同酶體系。各自具有不同的活化電勢(shì)。各自在獨(dú)特的pH范 圍內(nèi)起作用。 一些酶體系可能需要氧化還原介質(zhì)。各體系的底物可能不同。產(chǎn) 物可能是可被直接氧化或還原的可溶性產(chǎn)物；產(chǎn)物可以是不溶的，并沉積在連 接有酶部分的位點(diǎn)上。提供了各體系的反應(yīng)方案。辣根過(guò)氧化物酶在一個(gè)實(shí)施方式中，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)用作酶。該酶較小(約36千道 爾頓)，并具有大周轉(zhuǎn)率(底物飽和時(shí)酶催化反應(yīng)的最大初始速率)。HRP是能催 化還原過(guò)氧化氫的氧化酶，過(guò)氧化氫可能損壞某些聚合型多孔基質(zhì)或膜。圖5 顯示了用鄰苯二酚和過(guò)氧化氫作底物，HRP催化的反應(yīng)方案。HPR將催化其 它底物與過(guò)氧化氫的反應(yīng)。例如，其它底物包括可氧化的芳香劑、二茂鐵衍 生物和可氧化的無(wú)機(jī)物。采用鄰苯二酚和過(guò)氧化氫的HRP催化反應(yīng)如下鄰苯二酚+11202—醌+1120。檢測(cè)(電流測(cè)量法檢測(cè))結(jié)合有酶復(fù)合物的電極(陰極)上的抗體結(jié)合事件的氧化還原反應(yīng)如下醌+2e—+2H+—鄰苯二酚。優(yōu)選地，以-0.3伏與鉑絲進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)溶液優(yōu)選為0.05摩爾檸檬酸-磷酸鈉緩沖液，其中含有0.2摩爾硫酸鈉，pH為5.0。優(yōu)選地，溶液中的過(guò)氧 化氫濃度為1毫摩爾。溶液中的鄰苯二酚濃度優(yōu)選為1毫摩爾。碘和過(guò)氧化氫是可與HRP —起使用的另一種底物對(duì)。采用碘和過(guò)氧化氫 的HRP催化反應(yīng)如下2「+2H++H202—I2+2H20 。用于以電流測(cè)量法檢測(cè)結(jié)合有酶復(fù)合物的電極(極性設(shè)定為陰極)上的抗體結(jié)合事件的氧化還原反應(yīng)如下I2+2e——21一。鄰苯二胺(OPD)和過(guò)氧化氫是另一與HRP —起使用的底物對(duì)。采用OPD 和過(guò)氧化氫的HRP催化反應(yīng)如下 OPD+H202—ox-OPD+H20 。用于以電流測(cè)量法檢測(cè)結(jié)合有酶復(fù)合物的電極(陰極)上的抗體結(jié)合事件 的氧化還原反應(yīng)如下ox-OPD+2H++2e—OPD 。優(yōu)選地，以-0.1伏與鉑絲進(jìn)行采用OPD的實(shí)驗(yàn)。溶液優(yōu)選為0.05摩爾檸 檬酸-磷酸鈉緩沖液，其中含有0.2摩爾硫酸鈉，pH為5.0。優(yōu)選地，溶液中的 OPD和過(guò)氧化氫濃度均約為1毫摩爾。漆酶在另一實(shí)施方式中，漆酶用作酶。漆酶是類似于HRP的氧化酶，但用氧 代替了過(guò)氧化氫。漆酶能催化其它底物與氧的反應(yīng)。例如，其它底物包括鄰苯二胺(OPD)和可氧化的芳香劑。采用鄰苯二酚和氧的漆酶催化反應(yīng)如下鄰苯二酚+02—醌+1120。以電流測(cè)量法檢測(cè)結(jié)合有酶復(fù)合物的電極(陰極)上的抗體結(jié)合事件的氧化還原反應(yīng)如下醌+2e—+2H+—鄰苯二酚。優(yōu)選地，以-0.3伏與鉑絲進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)溶液優(yōu)選為0.05摩爾檸檬酸-磷酸鈉緩沖液，其中含有0.2摩爾硫酸鈉，pH為5.0。優(yōu)選地，溶液中的鄰苯 二酚為1毫摩爾。，-半乳糖苷酶在另一實(shí)施方式中，P-半乳糖苷酶用作酶。(3-半乳糖苷酶能催化切割寡糖 和糖基衍生物上倒數(shù)第二個(gè)13-半乳糖殘基的反應(yīng)。卩-半乳糖苷酶的反應(yīng)方案見(jiàn) 圖3。優(yōu)選地，底物是X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-(5-D-吡喃半乳糖苷)。X-Gal 是(3-半乳糖苷酶的非誘導(dǎo)性生色底物。(3-半乳糖苷酶能水解X-Gal，形成藍(lán)色 沉淀。(3-半乳糖苷酶的周轉(zhuǎn)率低于其它酶，但該酶在中性pH下非常穩(wěn)定。優(yōu) 選地，水溶液中X-Gal約為0.1毫摩爾。優(yōu)選將X-Gal溶解于二甲基甲酰胺中， 然后在劇烈攪拌的條件下加入約0.01摩爾的磷酸鹽緩沖鹽水中。pH優(yōu)選7.0。 X-Gal不會(huì)與玻璃或金屬電極發(fā)生作用。因此，需要電子介 質(zhì)使電子穿梭于電極表面。電子介質(zhì)優(yōu)選氰化鐵/亞鐵溶液，包括氰化鉀亞鐵和 氰化鉀鐵。該溶液優(yōu)選為50:50的鐵:亞鐵。用電流測(cè)量法檢測(cè)時(shí)，氰化鐵/亞 鐵溶液的鐵濃度優(yōu)選約為10毫摩爾。優(yōu)選將溶液中總鐵濃度調(diào)節(jié)得較低。用 電勢(shì)計(jì)檢測(cè)是將所選電勢(shì)施加于電極與參比電極，而不讓電流通過(guò)連接電極的 電路。參比電極的例子是銀/氯化銀?？梢噪S著加入底物濃度的升高，按比例提 高氰化鐵/亞鐵的濃度。優(yōu)選地，電壓設(shè)定為0伏(鉬電極)和0.5V(電極微陣列)。葡萄糖氧化酶在另一實(shí)施方式中，葡萄糖氧化酶用作酶。葡萄糖氧化酶是氧化酶。反應(yīng)方案見(jiàn)圖4。優(yōu)選地，反應(yīng)在pH約為7.5的緩沖液中發(fā)生。緩沖液優(yōu)選為濃度 約為O.Ol摩爾的磷酸鹽緩沖鹽水。底物優(yōu)選為葡萄糖，它高度可溶于水。優(yōu)選 用5-甲基-吩嗪硫酸甲酯(PMS)再生酶。PMS使用氰化亞鐵/鐵轉(zhuǎn)變?cè)陔姌O上檢 測(cè)。優(yōu)選地，將微陣列外鉑電極的電勢(shì)設(shè)定為O伏，將微陣列電極電勢(shì)設(shè)定為 0.5伏。相對(duì)于P-半乳糖苷酶反應(yīng)，葡萄糖氧化酶反應(yīng)有一些優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)是， 此反應(yīng)的所有組分在水性緩沖液中極其易溶。然而，需要電子介質(zhì)如PMS。 PMS傾向于隨時(shí)間被"空氣氧化"， 一定要新鮮制備或在適當(dāng)?shù)亩栊詶l件下儲(chǔ) 存，否則會(huì)產(chǎn)生較高的背景信號(hào)。葡萄糖脫氫酶在另一實(shí)施方式中，葡萄糖脫氫酶用作酶。采用底物葡萄糖和2,6-二氯靛 酚(DCPI)的葡萄糖脫氫酶反應(yīng)方案如下葡萄糖+DCPI(ox)—葡糖酸+DCPI (紅色)。以電流測(cè)量法檢測(cè)結(jié)合有酶復(fù)合物的電極(陽(yáng)極)上的抗體結(jié)合事件的氧化還原反應(yīng)如下DCPI(紅色)—DCPI (ox)+2e—。優(yōu)選地，以-0.3伏與鉑絲進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)溶液優(yōu)選含有約50毫摩爾哌 嗪-N,N'-雙(2-乙磺酸)(PIPES)緩沖液，pH6.8，其中含有約1納摩爾吡咯并喹啉 醌(PQQ)、約1微摩爾氯化鈣、約64微摩爾DCIP和約120毫摩爾葡萄糖。更優(yōu)選地，在PBS溶液中用GDH進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，所述PBS溶液中含 有CaCl2、 PQQ、 2，6-二氯靛酚(DCIP)、吩嗪硫酸乙酯(phenazine ethosulfate， PES)
和葡萄糖。在約+300-500毫伏與常見(jiàn)的ITO反電極(counterelectrode)下進(jìn)行 檢測(cè)。GDH催化葡萄糖氧化，該反應(yīng)伴隨著PES的還原。反應(yīng)如下葡萄糖+PES(氧化)—葡糖酸+PES(還原)這一反應(yīng)后，還原的PES還原了 DCIP:DCIP(氧化)+PES(還原)—DCIP(還原)+PES(氧化)通過(guò)向電極施加正電壓氧化DCIP的還原形式。檢測(cè)到按照以下等式的氧 化反應(yīng)產(chǎn)生的氧化電流DCIP(還原)-電子—DCIP(氧化)。堿性磷酸酶在另一實(shí)施方式中，堿性磷酸酶(AP)用作酶。AP能在水存在下催化氨基 酚磷酸酯(底物)的去磷酸化反應(yīng)。該反應(yīng)能夠形成氨基酚，它是檢測(cè)到的產(chǎn)物。反應(yīng)方案如下氨基酚磷酸酯+1120—^n磷酸酯+氨基酚通過(guò)連接有AP的電極上發(fā)生的電化學(xué)氧化，檢測(cè)電極上的氨基酚。檢測(cè) 到的電流是陽(yáng)極電流。電流大小與氨基酚形成量成正比。氨基酚形成量是酶反 應(yīng)的結(jié)果，因此與結(jié)合于電極的AP量成正比。多重氧化還原酶放大的檢測(cè)在另一實(shí)施方式中，用不同的獨(dú)特酶標(biāo)記各分析物特異性抗體、靶標(biāo)或附 連于微陣列的第二抗體。在各個(gè)酶體系中，化學(xué)特征是獨(dú)特的，因此在信號(hào)獲 取期間串話有限(或無(wú)串話)。為使用各種酶體系提供了一個(gè)例子。優(yōu)選地，采 用了至少兩種不同酶，它們選自辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、漆酶(Lac)、葡萄糖脫 氫酶(GDH)、葡萄糖氧化酶(GO)或(3-半乳糖苷酶((3-Gal)。為在常見(jiàn)電極微陣列 上使用前三種提供了一個(gè)例子。然而，同一電極微陣列上可以使用若干種酶體 系，以便在底物溶液(含有緩沖液和各種酶底物)改變時(shí)，特定酶僅在適合連接 于微陣列的特定酶、而非其它酶的條件下產(chǎn)生信號(hào)。HRP是過(guò)氧化氫氧化還原酶，它能還原過(guò)氧化氫，伴隨著氧化許多有機(jī) 物。漆酶(氧的氧化還原酶)能氧化類似于與HRP發(fā)生反應(yīng)的化合物的化合物， 但它能將氧還原成水。因?yàn)樗鼈兙哂邢嗨频拿柑禺愋?均測(cè)定為陰極電流)，所 以必須控制添加底物/緩沖液的順序。采用葡萄糖脫氫酶體系時(shí)，將葡萄糖氧化成葡糖酸，而2,6-二氯靛酚(DCPI)被還原。在將還原的DCPI再氧化時(shí)測(cè)定陽(yáng) 極電流。葡萄糖脫氫酶體系與HRP或漆酶無(wú)重疊，因?yàn)闇y(cè)定的是陽(yáng)極電流， 而非陰極電流。此外，底物顯著不同。當(dāng)漆酶和HRP用于同一免疫實(shí)驗(yàn)體系時(shí)，選擇先引入哪一底物對(duì)進(jìn)行合 適的實(shí)驗(yàn)很重要。合并的漆酶和HRP體系不受各酶體系的化學(xué)性質(zhì)影響，而 是受檢測(cè)步驟中電極的電化學(xué)性質(zhì)的影響。這種檢測(cè)的復(fù)雜情況是有機(jī)底物還 原時(shí)在陰極產(chǎn)生痕量過(guò)氧化氫的結(jié)果。產(chǎn)生過(guò)氧化物使得檢測(cè)復(fù)雜化，因?yàn)槠?酶和HRP酶的底物相似。因此，在利用HRP的免疫實(shí)驗(yàn)體系中先運(yùn)行漆酶實(shí) 驗(yàn)總是產(chǎn)生痕量陽(yáng)性反應(yīng)，這必須予以考慮。然而，大量過(guò)氧化物抑制了漆酶 的化學(xué)反應(yīng)；因此，嘗試測(cè)定釆用HRP和漆酶時(shí)的酶化學(xué)性質(zhì)時(shí)，應(yīng)該先進(jìn) 行漆酶實(shí)驗(yàn)，以防止過(guò)氧化物引起的漆酶抑制。在含有一種以上酶的酶放大體系的另一實(shí)施方式中，葡萄糖脫氫酶(GDH) 和HRP用作酶。電極微陣列的所選電極上合成了探針。其它電極上合成了隨 機(jī)序列。釆用互補(bǔ)靶標(biāo)在微陣列上自身組裝GDG和HRP。在一個(gè)實(shí)施方式中， 吡咯并喹啉醌(PQQ)用作GDH體系的輔因子。GDH通過(guò)涉及電子受體底物的 反應(yīng)催化葡萄糖氧化，如下所述葡萄糖+電子受體—葡糖酸+還原的電子受體(電子供體)可以在電極上檢測(cè)因酶反應(yīng)而形成的電子供體，如下所述 電子供體-電子+電子受體與HRP檢測(cè)相反，在較高的電極電勢(shì)(HRP^0.1伏，GDH=+0.3伏)下進(jìn) 行GDH檢測(cè)，與HRP的陰極電流相反，檢測(cè)陽(yáng)極電流，gp，可分別由HRP 和GDH反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)定電流而不互相干擾，因?yàn)殡娏鞯臉O性不同； 一種是正性， 一種是負(fù)性。因此，可以用這兩種酶設(shè)計(jì)雙酶系統(tǒng)檢測(cè)，類似于雙色光學(xué)檢測(cè)。 優(yōu)選地，在過(guò)氧化氫存在下TMB用作HRP底物。通過(guò)不溶性沉積產(chǎn)物產(chǎn)生的電阻進(jìn)行氧化還原酶放大檢測(cè) 在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，酶底物在連接有酶的微陣列電極上反應(yīng)并形成
沉積物。優(yōu)選地，該酶是HRP。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的所選底物會(huì)通過(guò)酶反 應(yīng)形成不溶性產(chǎn)物。優(yōu)選地，該底物是3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，它在過(guò)氧化 氫存在下由HRP酶氧化形成不溶性產(chǎn)物。其它底物如二茂鐵衍生物也適合實(shí) 施本發(fā)明。不想局限于理論，隨著酶反應(yīng)進(jìn)行，氧化產(chǎn)物形成沉積在微陣列表面層上 的不溶性化合物。因此，微陣列位置上酶數(shù)量越多，結(jié)合有酶的位點(diǎn)的多孔性 反應(yīng)層上產(chǎn)生和發(fā)現(xiàn)的不溶性物質(zhì)越多。這層不溶性物質(zhì)在電極表面上形成" 絕緣層"。與不含沉積物的電極相比，含有沉積物的電極的電阻改變?？赏ㄟ^(guò) 電極的電化學(xué)讀數(shù)監(jiān)測(cè)這種改變的電阻。說(shuō)明本發(fā)明兩個(gè)電極的示意圖見(jiàn)圖 20，它顯示的一個(gè)電極含有酶和沉積物，另一個(gè)電極不含酶或沉積物。優(yōu)選地，電流介質(zhì)實(shí)現(xiàn)了電極的電化學(xué)讀數(shù)。優(yōu)選地，該介質(zhì)是氰化鐵/ 亞鐵對(duì)，它對(duì)不溶性沉積物的量很靈敏。不想局限于理論，不溶性沉積物將降 低K3[Fe(CN)6](K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]體系)的電化學(xué)還原的電流。說(shuō)明電流 介質(zhì)的兩個(gè)電極的示意圖見(jiàn)圖21，它顯示的一個(gè)電極含有酶和沉積物，另一個(gè) 電極不含酶或沉積物，因此電流更高。用酶反應(yīng)產(chǎn)物作為沉積層進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，該方法合并 了酶放大和信號(hào)收集的原理，從而提高了靈敏度。因此，理論上的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)限 是每點(diǎn)一個(gè)分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，在非優(yōu)化條件下能檢測(cè)10塵摩爾15-聚體寡核苷酸。其次，雖然因?yàn)槊阜磻?yīng)和檢測(cè)方案的分開(kāi)的導(dǎo)致該方法需要一 個(gè)額外步驟，但由于這種分開(kāi)，電化學(xué)檢測(cè)不需要快速檢測(cè)步驟?？梢栽趲资?分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)而電極微陣列的化學(xué)性質(zhì)不會(huì)發(fā)生改變。最后，因 為檢測(cè)信號(hào)是測(cè)定沉積物質(zhì)引起的電流降低，所以可施加高電流(陽(yáng)極或陰極 電流)?？赏ㄟ^(guò)改變氧化還原介質(zhì)的濃度和/或施加的電壓以及沉積時(shí)間來(lái)控制 電流密度。因此，即便可能采用相當(dāng)?shù)偷膭?dòng)態(tài)范圍，也不需要低電流測(cè)定的設(shè) 備。對(duì)于超低電流測(cè)定可能是限制參數(shù)的高密度/低電極尺寸微陣列而言，不需 要低電流測(cè)定特別重要。通過(guò)減少不溶性沉積產(chǎn)物進(jìn)行氧化還原酶放大檢測(cè)在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，用酶標(biāo)記的靶標(biāo)檢測(cè)生物識(shí)別-結(jié)合事件，如DNA雜交或抗體-抗原相互作用。該酶能催化有電化學(xué)活性的不溶性物質(zhì)的沉積。通過(guò)減少不溶性物質(zhì)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。如同其它實(shí)施方式那樣，這一實(shí)施 方式是通過(guò)將結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)殡娀瘜W(xué)信號(hào)而進(jìn)行熒光檢測(cè)的另選方式。采用隨后接 觸底物并形成反應(yīng)產(chǎn)物的酶標(biāo)記的靶標(biāo)實(shí)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)變，所述反應(yīng)產(chǎn)物是表面結(jié) 合的電活性分子、分子簇或聚合分子?？赏ㄟ^(guò)將電壓或電流施加于含有探針-靶標(biāo)-酶復(fù)合物的電極檢測(cè)電活性產(chǎn)物。這種方案減輕了熒光技術(shù)中昂貴光學(xué) 器件的需要，并增加了通過(guò)初始結(jié)合事件酶學(xué)放大信號(hào)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的這一實(shí)施方式提供了測(cè)定結(jié)合事件的方法，該方法改進(jìn)了熒光相 關(guān)問(wèn)題。在這個(gè)實(shí)施方式中，提供了酶放大法，藉由這種方法使酶產(chǎn)物為不溶 性產(chǎn)物并沉積在含有探針-靶標(biāo)-酶復(fù)合物的電極表面上。不溶性酶產(chǎn)物有電化 學(xué)活性，可通過(guò)向表面施加電壓并監(jiān)測(cè)所產(chǎn)生的電流而轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。在監(jiān)測(cè) 期間還原該酶產(chǎn)物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，酶是HRP，底物是過(guò)氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。 HRP能在過(guò)氧化氫存在下氧化TMB，從而形成不溶性氧化分子或分子簇，沉 積在結(jié)合有HRP的電極上。去除TMB并用緩沖液取代，以終止氧化反應(yīng)。通 過(guò)將電壓施加于電極以還原氧化的酶產(chǎn)物，從而檢測(cè)氧化的TMB。能夠形成 不溶性反應(yīng)產(chǎn)物的其它酶底物組合也適合實(shí)施本實(shí)施方式，需要注意不溶性反 應(yīng)產(chǎn)物能夠在檢測(cè)期間被還原或氧化。在優(yōu)選實(shí)施方式中，氧化TMB的表面濃度與該位點(diǎn)上的酶量、溶液中過(guò) 氧化物和TMB兩者的濃度、以及總反應(yīng)時(shí)間成正比。這種普通關(guān)系適用于酶 和底物的任何組合。用這種方法可以控制所有變量。 一旦不溶性沉淀物結(jié)合于 電極表面后，施加還原電勢(shì)會(huì)改變氧化狀態(tài)，產(chǎn)生與該電極上氧化物質(zhì)的量成 正比的法拉第電流。檢測(cè)這種電流，作為定量電極表面上的結(jié)合量 (如)RNA-DNA結(jié)合量的基礎(chǔ)。文中所述的檢測(cè)方案類似于停流實(shí)驗(yàn)，其中可控制酶反應(yīng)條件，如時(shí)間和 底物濃度。得到的電信號(hào)與表面上的酶產(chǎn)物量成正比，并且與底物濃度和反應(yīng) 時(shí)間有關(guān)聯(lián)。由于可以采用這種方法控制這兩種變量，所以可進(jìn)行定量。通過(guò)連續(xù)閱讀進(jìn)行氧化還原酶放大檢測(cè)
在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供了閱讀含有可通過(guò)氧化還原反應(yīng)檢測(cè)的酶 產(chǎn)物的電極微陣列的方法。為了閱讀電極微陣列，將所有電極設(shè)定為略高于接 地電勢(shì)的低電勢(shì)。該電勢(shì)優(yōu)選約為10毫伏。維持這種低電勢(shì)狀態(tài)，同時(shí)通過(guò) 不提供任何通向低電阻接地的途徑使所有電極處于開(kāi)路中。由于施以開(kāi)路，沒(méi) 有電流流動(dòng)。缺少電流防止產(chǎn)物的氧化還原狀態(tài)發(fā)生任何改變。將各電極依次 設(shè)定為接地，然后在開(kāi)路狀態(tài)下回復(fù)至低電勢(shì)。不同時(shí)將兩個(gè)電極設(shè)定為接地， 然后在開(kāi)路狀態(tài)下回復(fù)到低電勢(shì)。電極設(shè)定為接地時(shí)，電路是通路，使得電流由電極流向電極微陣列的其余 部分(由于存在低正電勢(shì))。這種電流能還原各電極上的酶產(chǎn)物并氧化微陣列其 它電極上的物質(zhì)。這種連續(xù)方案有效地將整個(gè)微陣列用作反電極，將接地電極 用作工作電極。優(yōu)選地，將電極設(shè)定為接地后立即測(cè)定接地電極的電流。為了 閱讀整個(gè)微陣列，將各個(gè)電極依次轉(zhuǎn)向接地、閱讀，然后轉(zhuǎn)回施加電勢(shì)。測(cè)定 的電流是充電和法拉第電流的線性組合。由于超電勢(shì)很低(如IO毫伏)，所以最 大程度降低了充電電流，它被法拉第電流所遮蔽?；蛘?，利用約-10毫伏的負(fù) 電勢(shì)在電極上氧化產(chǎn)物，從而閱讀微陣列。可以設(shè)定酶反應(yīng)的時(shí)間，然后在預(yù)定終點(diǎn)立即終止該反應(yīng)。此時(shí)，終止了 動(dòng)態(tài)過(guò)程；因此，對(duì)檢測(cè)酶反應(yīng)沒(méi)有時(shí)間限制。按照本發(fā)明制備電極微陣列， 在電極微陣列上終止酶反應(yīng)，18小時(shí)后閱讀微陣列。采用非常低的超電勢(shì)；因此由充電引起的背景電流非常小。背景電流小能提高信噪比。只有一個(gè)電極用作工作電極。微陣列上其余電極是有效的反電極；因此，不需要采用單獨(dú)的" 微陣列外"電極實(shí)現(xiàn)這一目的。此外，由于在某一點(diǎn)上所有電極均被移交(rdegate訴作反電極，所以所有電極均可用于實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。?shí)施例1 辣根過(guò)氧化物酶在第一個(gè)免疫實(shí)驗(yàn)中，以電流測(cè)量法檢測(cè)HRP催化反應(yīng)的產(chǎn)物醌。以-0.3 伏與鉑絲在水溶液中進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，所述溶液中含有0.05摩爾擰檬酸-磷酸鈉緩 沖液，pH 5.0，同時(shí)含有0.2摩爾硫酸鈉。鄰苯二酚濃度為l毫摩爾，過(guò)氧化 氫濃度為l毫摩爾。為了連接HRP，以棋盤(pán)圖案在電極微陣列上原位合成探針
DNA。采用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)和用于去除保護(hù)基的電化學(xué)產(chǎn)生的酸。用生物 素標(biāo)記與探針DNA互補(bǔ)的靶DNA。用1納摩爾靶DNA的2XPBST溶液在40 攝氏度培育l小時(shí)，使靶DNA與探針DNA雜交。加入含有鏈霉親和素標(biāo)簽的HRP，以便用HRP-鏈霉親和素復(fù)合物溶液連 接生物素。該復(fù)合物包含偶聯(lián)于鏈霉親和素的80個(gè)HRP單元形成的專利聚合 物。鏈霉親和素-HRP復(fù)合物購(gòu)自研究診斷公司(Research Diagnostics, Inc)。為 了制備鏈霉親和素-HRP溶液，用2XPBST將1微升鏈霉親和素-HRP 80復(fù)合 物稀釋至5000微升。接觸時(shí)間為60分鐘，溶液溫度為25攝氏度。結(jié)果顯示， 電極微陣列上獲得了預(yù)計(jì)的棋盤(pán)圖案，如連接有酶的電極上電流增加所證明的 那樣，即沒(méi)有HRP的位置上的陰極電流低于結(jié)合了 HPR的位置的陰極電流。 電流較高表明醌在電極上還原為鄰苯二酚。此外，在預(yù)計(jì)位置上存在結(jié)合，而 相鄰電極位置之間不存在噪聲或串話。實(shí)施例2 漆酶在第二個(gè)免疫實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)電流測(cè)量法檢測(cè)漆酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物醌。以-0.3 伏與鉑絲在水溶液中進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，所述溶液中含有0.05摩爾檸檬酸-磷酸鈉緩 沖液，pH 5.0，同時(shí)含有0.2摩爾硫酸鈉。鄰苯二酚濃度為l毫摩爾，氧濃度 未測(cè)定，但由溶液中天然存在的量決定。為了連接漆酶，以棋盤(pán)圖案在電極微 陣列上原位合成靶DNA。采用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)和用于去除保護(hù)基的電化 學(xué)產(chǎn)生的酸。用生物素標(biāo)記與探針DNA互補(bǔ)的耙DNA。用1納摩爾靶DNA 的2XPBST溶液在40攝氏度培育1小時(shí)，使靶DNA與探針DNA雜交。用1 微克/毫升鏈霉親和素的2XPBST溶液在25攝氏度培育60分鐘，從而加入鏈 霉親和素，，使其連接于生物素。用1微克/毫升漆酶-生物素復(fù)合物的2XPBST 溶液在25攝氏度培育60分鐘，從而加入含有生物素標(biāo)簽的漆酶，，使其連接 于鏈霉親和素。結(jié)果顯示，電極微陣列上獲得了預(yù)計(jì)的棋盤(pán)圖案，如結(jié)合有漆酶的電極上 電流增加所證明的那樣，即結(jié)合了漆酶的位置的陰極電流高于沒(méi)有漆酶的位置 的陰極電流。電流較高表明醌在電極上還原為鄰苯二酚。此外，在預(yù)計(jì)位置上
存在結(jié)合，而相鄰電極位置之間不存在噪聲或串話。 實(shí)施例3P-半乳糖苷酶免疫實(shí)驗(yàn)在電極微陣列上進(jìn)行的免疫實(shí)驗(yàn)中，P-半乳糖苷酶用作酶，底物是X-Gal。 采用生物素化(3-半乳糖苷酶。在pH 7.0的磷酸鹽緩沖鹽水中進(jìn)行反應(yīng)。緩沖 液濃度為0.01 M。為了制備溶液，將所選量的X-Gal溶解于DMF，因?yàn)樗?DMF中非常易溶，但在水中的溶解度低。將含有X-Gal的DMF加到水性緩沖 液中。X-Gal的終濃度為約0.1毫摩爾，這接近飽和濃度。將含有X-Gal的DMF 加入緩沖液的過(guò)程中，劇烈攪拌緩沖液，以防止由于X-Gal的水溶性有限所致 的X-Gal沉淀。如果加入X-Gal的DMF溶液時(shí)不劇烈攪拌，X-Gal會(huì)沉淀下 來(lái)。該溶液的不穩(wěn)定性需要每天制備新鮮溶液。使用濃度約為10毫摩爾的氰 化鐵/亞鐵溶液進(jìn)行電流檢測(cè)。將電極微陣列的電壓設(shè)定為0伏(微陣列外的鉑 電極)和0.5伏。通過(guò)電化學(xué)合成法(標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)和用以去除保護(hù)基的電 化學(xué)產(chǎn)生的酸)原位合成電極微陣列(康柏瑪其克公司)的所選電極上的探針 DNA。修飾連接于探針DNA的最后一個(gè)DNA單位，使其含有生物素標(biāo)簽。 將鏈霉親和素加入微陣列中，以結(jié)合生物素。按照?qǐng)D3所示的反應(yīng)方案加入氧 化還原試劑和底物。卩-半乳糖苷酶免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)果見(jiàn)圖6。在泳道l-8代表的微陣列 的一部分中，沒(méi)有置入生物素標(biāo)簽。在泳道9-16中，生物素化p-半乳糖苷酶 加到微陣列中，以結(jié)合鏈霉親和素，從而形成生物素-鏈霉親和素-生物素復(fù)合 物。這些數(shù)據(jù)顯示了微陣列兩部分，即泳道1-8與含有卩-半乳糖苷酶的泳道9-16 之間的電流測(cè)量反應(yīng)差異。圖6所示所選電極的負(fù)電流值表明結(jié)合了 P-半乳糖 苷酶。在合成過(guò)程中相鄰電極用作對(duì)應(yīng)電極，相鄰電極不含生物素標(biāo)簽。相似 地，圖7將這種微陣列概況表示為圖6所示三維圖形的切片圖(slice)(行)。電極 9、 11、 13和15含有J3-半乳糖苷酶，不出所料，這些電極上電流的絕對(duì)值較 高。實(shí)施例4釆用熒光素的P-半乳糖苷酶免疫試驗(yàn)在免疫化學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)中，捕獲和檢測(cè)含熒光素的|3-半乳糖苷酶。采用標(biāo)準(zhǔn) 亞磷酰胺化學(xué)和用以解封亞磷酰胺上保護(hù)基的電化學(xué)產(chǎn)生的酸在電極微陣列(康柏瑪其克公司)上原位合成探針DNA。靶DNA與探針DNA互補(bǔ)，且連接 有抗熒光素抗體。采用約85微摩爾溶液(每200微升緩沖液約2.5毫克靶DNA)、 40攝氏度的溫度和60分鐘的時(shí)間使含有抗體的靶DNA雜交于探針DNA。使 卩-半乳糖苷酶標(biāo)記的熒光素的溶液接觸微陣列，以使熒光素結(jié)合于靶DNA上 的抗體。溶液濃度為約l納摩爾；溫度為25'C;接觸時(shí)間為60分鐘。將用作 低分子量抗原的熒光素連接于較大酶。所用底物是O.l毫摩爾的X-Gal的水溶液。為了制備底物溶液，使X-Gal 溶解于二甲基甲酰胺，然后在劇烈攪拌的情況下加入約0.01摩爾磷酸鹽緩沖鹽 水。pH為7.0。氰化鐵/亞鐵溶液用作電子介質(zhì)。氰化物溶液包含鐵/亞鐵比例 為50:50的氰化鉀亞鐵和氰化鉀鐵。氰化鐵/亞鐵溶液的鐵濃度為10毫摩爾。 電壓設(shè)定為0伏(鉑電極)和0.5伏(電極微陣列)。電流測(cè)量的結(jié)果見(jiàn)圖8。探針DNA位于電極微陣列的第2排(S2)，泳道1 、 3和5。按照?qǐng)D3的反應(yīng)方案，含有熒光素-P-半乳糖苷酶的電極位點(diǎn)的電流值 提高。用落射熒光顯微鏡確證和驗(yàn)證F-P-半乳糖苷酶與覆蓋電極的多孔性反應(yīng) 層的結(jié)合。落射熒光數(shù)據(jù)準(zhǔn)確跟蹤了用本發(fā)明方法獲得的檢測(cè)電極電流的結(jié) 果。實(shí)施例5葡萄糖-氧化酶電化學(xué)檢測(cè)在本實(shí)施例中，用附連有生物素的葡萄糖氧化酶進(jìn)行試驗(yàn)。采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷 酰胺化學(xué)和用以解封亞磷酰胺上保護(hù)基的電化學(xué)產(chǎn)生的酸在電極微陣列(康柏 瑪其克公司)上原位合成探針DNA。靶DNA與探針DNA互補(bǔ)，且連接有抗熒 光素標(biāo)簽。采用約15納摩爾(每200微升緩沖液約2.5納克靶DNA) 、 40攝氏 度的溫度和60分鐘的時(shí)間使耙DNA雜交于探針DNA。鏈霉親和素溶液接觸 微陣列，以使鏈霉親和素結(jié)合于靶DNA上的生物素。溶液濃度為IO納摩爾鏈 霉親和素的2XPBST溶液；溫度為25攝氏度；時(shí)間為60分鐘。 采用濃度為10納摩爾的酶溶液、25攝氏度的溫度和60分鐘的時(shí)間將含 有生物素標(biāo)簽的酶連接于鏈霉親和素。為了檢測(cè)該酶，采用含有0.01摩爾緩沖 液(pH 7.5)、 40毫摩爾(3-D-葡萄糖、0.3毫摩爾PMS和比例為50:50的氰化亞 鐵/鐵的底物溶液?？傝F濃度為10毫摩爾。以氰化鉀亞鐵和氰化鉀鐵的形式加 入氰化亞鐵/鐵。圖9顯示了所選電極上電流的三維圖的切片圖。葡萄糖氧化酶 位于泳道2、 4、 6和8。如圖所示，按照?qǐng)D4所示的反應(yīng)方案，結(jié)合有葡萄糖 氧化酶的電極上電流的絕對(duì)值增加。實(shí)施例6用鄰苯二酚進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶檢測(cè)在本實(shí)施例中，HRP是酶，鄰苯二酚和過(guò)氧化氫是底物。通過(guò)含電極很 少(即，無(wú)多孔性膜或其上合成的探針)微陣列裝置(康柏瑪其克公司)上一個(gè)100 微米直徑的電極監(jiān)測(cè)過(guò)氧化物酶反應(yīng)的氧化還原曲線。將微陣列浸沒(méi)在溶液 中，用其上的電極監(jiān)測(cè)溶液氧化還原化學(xué)。結(jié)果見(jiàn)圖IO。圖10中各曲線的各 數(shù)據(jù)點(diǎn)代表同一電極上的測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表明，在負(fù)電勢(shì)下，有和無(wú)HRP酶 的電流測(cè)量差異是顯著的。結(jié)果的圖案有些類似循環(huán)伏安曲線。在一段時(shí)間上 進(jìn)行電流實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖ll。如圖11所示，在一段時(shí)間后電流變平。因此， 開(kāi)始測(cè)定的最佳時(shí)間是約3秒后，即開(kāi)始變平時(shí)。圖ll中各數(shù)據(jù)點(diǎn)是不同電 極上的測(cè)定結(jié)果。實(shí)施例7五種分析物的HRP免疫試驗(yàn)在本實(shí)施例中，在電極微陣列上電化學(xué)檢測(cè)HRP產(chǎn)物。檢測(cè)五種分析物， 包括(x-l-酸糖蛋白(AGP)、植物凝集素蓖麻毒蛋白(RCA)、 M13噬菌體、球形 芽孢桿菌(BG)芽孢和熒光素。微陣列是每平方厘米上含有1170個(gè)電極的康柏 瑪其克公司的98001 CMOS芯片。電極的直徑為約90微米。兔的多克隆抗-人a-l-酸糖蛋白(AGP)、單克隆抗-FITC抗體、人AGP、多 克隆抗-蓖麻毒蛋白(RCA)抗體(兔血清中)、RCA和共價(jià)連接有蓖麻毒蛋白的瓊 脂糖珠獲自密蘇里州圣路易斯的西格瑪化學(xué)藥品公司(Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.)。單克隆抗噬菌體(M13)抗體和單克隆抗噬菌體抗體 的HRP偶聯(lián)物購(gòu)自新澤西州皮斯卡塔韋的安瑪西亞-法瑪西亞生物科技公司 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N丄)。M13噬菌體(初始包裝)是威 斯康星州麥迪遜的普洛麥格公司(Promega)的產(chǎn)品。此外，SBCCOM(阿伯丁試 驗(yàn)場(chǎng)(Aberdeen Proving Grounds))為此實(shí)施例提供了球形芽孢桿菌芽孢以及多 克隆抗-BG芽孢抗體(來(lái)自山羊)。4-[N-馬來(lái)酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-l-羧酸琥珀酰亞胺基酯(SMCC)交聯(lián)試 劑、生物素-LC-LCNHS和活化的瓊脂糖珠獲自伊利諾斯州羅克福德的皮爾斯 化學(xué)品公司(Pierce Chemical Company, Rockford， 111)。 P-6和P-30離心柱獲自 加州里士滿的伯樂(lè)公司(Biorad， Richmond, Calif)。由歐普朗公司(Operon)(加 州阿拉米達(dá)的凱杰公司(Qiagen， Alameda， Calif.))制備用于修飾蛋白質(zhì)的寡核 苷酸。用作熒光素類似物的3' FITC標(biāo)記的15聚體互補(bǔ)物也獲自歐普朗公司 (Operon)。用瓊脂糖-AGP偶聯(lián)柱親和純化多克隆抗-AGP抗體，所述偶聯(lián)柱是用購(gòu) 自威斯康星州密爾沃基的皮爾斯化學(xué)制品公司(Pierce Chemical Company, Milwaukee, Wis.)的試劑盒制備的。將該抗體的PBS(pH 7.5)溶液加載到標(biāo)記柱 上，用甘氨酸緩沖液，pH2.8洗脫。在A280下監(jiān)測(cè)洗脫溶液，將合適組分收 集到微量滴定板中，用loxPBS， pH7.4中和；然后用lxPBS， pH7.4將樣品 透析過(guò)夜。以類似方式，采用與蓖麻毒蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖親和純化兔抗-蓖麻 毒蛋白抗體。生物素-LC-LC-NHS(l mg/ml的二甲基甲酰胺溶液)與蛋白質(zhì)在pH 7.4的 水相中發(fā)生反應(yīng)，使抗體生物素化。標(biāo)記反應(yīng)中生物素與抗體的摩爾比為 10:1(生物素的最終最終濃度為70微摩爾)。使該反應(yīng)進(jìn)行l(wèi)小時(shí)，然后使該溶 液通過(guò)伯樂(lè)公司的P-6離心柱。收集洗脫液，儲(chǔ)存于4攝氏度待用。通過(guò)以下方法用含有微陣列上直接合成的探針寡核苷酸的互補(bǔ)序列的寡 核苷酸標(biāo)記抗體(l)先用Cleland試劑還原含有保護(hù)巰基的寡核苷酸，在伯樂(lè) 的P-6離心柱上分離；(2)然后抗體單獨(dú)與SMCC發(fā)生反應(yīng)，標(biāo)記蛋白質(zhì)上的 反應(yīng)性胺，然后用P-6柱純化；(3)然后，將SMCC標(biāo)記抗體與含巰基的寡核 苷酸混合，以使該寡核苷酸共價(jià)連接于該抗體；和(4)用伯樂(lè)(Biorad)P-30離心
柱去除過(guò)量寡核苷酸。用以下方法使抗體在芯片表面上自身組裝。于40'C將抗體-寡核苷酸樣品 的2XPBST(含有0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液)溶液與芯片培育1小時(shí)。該溶 液含有五種不同的抗體-寡核苷酸偶聯(lián)物(不同的抗體特異性)。各抗體-寡核苷 酸偶聯(lián)物在含有合成的寡核苷酸互補(bǔ)物的預(yù)定電極上自身組裝。換言之，各抗 體附連有獨(dú)特的寡核苷酸，以便通過(guò)互補(bǔ)探針DNA的位置確定抗體在微陣列 上的位置。采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)和用以去除保護(hù)基的電化學(xué)產(chǎn)生的酸在微陣 列上原位合成DNA探針。用2xPBST緩沖液洗滌微陣列兩次，在與探針DNA 雜交后干燥。將含有分析物的溶液與活化芯片一起培育1小時(shí)。用2xPBST緩 沖液洗滌該微陣列，然后在含有生物素化抗分析物抗體(或者在噬菌體的情況 下，HRP-Ab偶聯(lián)物)的溶液中浸沒(méi)1小時(shí)。用2xPBST緩沖液洗滌該微陣列， 然后放入含有鏈霉親和素-HRP偶聯(lián)物的溶液中(0.5小時(shí)；僅用于AGP和蓖麻 毒蛋白分析物)。最后，用2xPBST緩沖液洗滌該微陣列，保持在2xPBST中直 到開(kāi)始測(cè)定。通過(guò)用合成kras序列(癌基因15-聚體序列)修飾的亞區(qū)域確定陰 性對(duì)照。處理此亞區(qū)域的方法類似于所有其它電極(接觸分析物、生物素化抗 體、SA-HRP和酶底物)。測(cè)定各電極上的電流，如果平均信號(hào)比背景高三倍標(biāo) 準(zhǔn)差則認(rèn)為結(jié)合有酶。當(dāng)BG芽孢是分析物時(shí)，將上述方法改變成通過(guò)結(jié)合抗體捕獲這些芽孢的 方案。這些芽孢本身容易從懸浮它們的水溶液中沉淀出來(lái)。這可能是由于聚集 或其它因素。將含有芽孢的懸浮液加到微陣列表面上，使其沉淀，但不時(shí)地混 合該溶液。然后在后續(xù)洗滌步驟中洗掉未通過(guò)特異性抗體結(jié)合于所選電極的芽 孢。酶緩沖液條件和HRP催化反應(yīng)底物如下反電極上的電勢(shì)設(shè)定為0.3伏， 芯片電極上的電勢(shì)設(shè)定為0伏。因此，隨著HRP將底物轉(zhuǎn)變?yōu)槊府a(chǎn)物，電子 由芯片流向反應(yīng)介質(zhì)。反應(yīng)緩沖液含有擰檬酸鹽/磷酸鹽(50毫摩爾)，其中含有 0.2MNaCl，pH為5.0。該溶液含有0.003%過(guò)氧化氫和1毫摩爾鄰苯二胺(OPD)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)和最大信號(hào)測(cè)定，60分鐘是檢測(cè)低濃度分析物的最佳培育時(shí)間。 然而，當(dāng)分析物濃度較高時(shí)，可采用較短的培育時(shí)間(12分鐘或更短)更快地獲 得結(jié)果。圖34顯示了實(shí)驗(yàn)反應(yīng)與分析物濃度和培育時(shí)間的關(guān)系，(A)中分析物
為蓖麻毒蛋白，(B)中分析物為M13噬菌體。所用的培育時(shí)間為12分鐘(曲線 1)、 30分鐘(曲線2)和60分鐘(曲線3)。圖12顯示了由五種分析物的多重免疫實(shí)驗(yàn)輸出的電流。 分析物培育時(shí)間為1小時(shí)。各分析物特異性抗體在棋盤(pán)圖案中以4x10陣 列排列(使用交替的電極)。分析物濃度如下RCA(l ng/ml)、 AGP (2.75微克 /ml)、 BG芽孢(2xl0S個(gè)芽孢/ml)和噬菌體(10"pfu/ml)。為了檢測(cè)FITC分析物， 在芯片上培育1微克FITC寡核苷酸(與芯片上的序列互補(bǔ))。接下來(lái)與生物素 化抗-FITC抗體培育該芯片。含有存在的每種分析物的所有生物素化抗體的混 合物中存在此抗體。因?yàn)椴捎昧瞬煌瑵舛?，所以所有分析物的?qiáng)度不相同。陰 性對(duì)照是15-聚體kras序列，見(jiàn)第25-27行。其它(kras修飾的)對(duì)照電極也位于 分析物特異性區(qū)域之間的各行(第5、 10、 15、 20行)中。各分析物的試驗(yàn)性能 因各抗體-分析物對(duì)的親和常數(shù)而不同。實(shí)施例8 HRP免疫試驗(yàn)在本實(shí)施例中，辣根過(guò)氧化物酶是酶，鄰苯二酚和過(guò)氧化氫是底物。兔IgG 和山羊IgG是親和標(biāo)記的，并分別結(jié)合于電極微陣列的上半部分和下半部分。 通過(guò)加入HRP標(biāo)記的抗山羊抗體和抗-兔抗體完成結(jié)合?？赡懿捎肏RP標(biāo)記的 山羊抗兔抗體和HRP標(biāo)記的小鼠單克隆抗山羊抗體進(jìn)行檢測(cè)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié) 果見(jiàn)圖13。具體說(shuō)，圖13顯示了檢測(cè)結(jié)合于電極微陣列上所選電極的兔IgG 的電流。微陣列是獲自康柏瑪其克公司(Combimatrix Corporation)的電極微陣 列。用HRP標(biāo)記的山羊抗-Rb抗體進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。樣品在S4(1、 3、 5)和S5 (2、 4)中。改變電流標(biāo)識(shí)符以展示這些數(shù)據(jù)。另外，圖13顯示了結(jié)合于所選電 極的山羊IgG的檢測(cè)。用HRP標(biāo)記的抗山羊抗體和抗兔抗體進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。 樣品在S1 (1、 3、 5)和S2 (2、 4、 6)中。這些數(shù)據(jù)與根據(jù)采用熒光標(biāo)記抗體和 標(biāo)準(zhǔn)熒光檢測(cè)的早期工作的預(yù)期結(jié)果一致。實(shí)施例9兩種靶標(biāo)的HRP和OPD試驗(yàn)
在這個(gè)實(shí)施例中，寡核苷酸靶標(biāo)(兩個(gè))是生物素標(biāo)簽附連于3'末端的15-聚體單鏈DNA單元，它購(gòu)自歐普朗公司。第一靶標(biāo)構(gòu)型為5'-15聚體A-生物 素3'，第二耙標(biāo)的構(gòu)型為5'-15聚體B-生物素-3'。在含有約1000個(gè)電極的引腳 格柵微陣列(pin grid microarray) (PGA)形式的電極微陣列上原位合成與寡核 苷酸靶標(biāo)互補(bǔ)的寡核苷酸探針，該微陣列購(gòu)自康柏瑪其克公司。以棋盤(pán)圖案在 電極微陣列的兩個(gè)不同區(qū)域上合成探針。合成寡核苷酸探針后，寡核苷酸靶標(biāo) 與PGA上的互補(bǔ)寡核苷酸探針雜交。雜交條件包括40攝氏度1小時(shí)、寡核苷 酸靶標(biāo)濃度為1 nM。雜交溶液包含寡核苷酸的2x磷酸鹽緩沖鹽水0.05n/。吐溫(R)(PBST)。用 2xPBST洗滌PGA。含有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)簽的鏈霉親和素的溶液與雜交的 PGA微陣列一起培育。培育使得鏈霉親和素-HRP復(fù)合物結(jié)合于生物素化的雜 交靶探針。培育時(shí)間為45分鐘，溫度為25攝氏度。該復(fù)合物包含偶聯(lián)于鏈霉 親和素的80個(gè)HRP單元形成的專利聚合物。鏈霉親和素-HRP復(fù)合物購(gòu)自研 究診斷公司(Research Diagnostics, Inc)。為了制備鏈霉親和素-HRP溶液，用 2xPBST將1微升鏈霉親和素-HRP 80復(fù)合物稀釋至5000微升。用2xPBST洗 滌PGA。使含有1毫摩爾鄰苯胺二胺(OPD)和1毫摩爾過(guò)氧化氫的底物溶液接 觸PGA。相對(duì)于反電極，將-0.3伏電勢(shì)施加于工作電極，并測(cè)定電流。如圖 14所示，結(jié)合有HRP的電極的電流值較高，因?yàn)檠趸腛PD產(chǎn)物被還原。通 過(guò)三維柱狀圖和右上角二維插圖中的黑色方塊描述了較高電流。實(shí)施例10電勢(shì)測(cè)定圖15顯示了寡核苷酸雜交電化學(xué)檢測(cè)的三維圖。具體說(shuō)，在電極微陣列(康 柏瑪其克公司)上原位合成Rab和Kras寡核苷酸序列。Kras序列構(gòu)型為5'-15-聚體C-3'。所用的Rab序列為5'-15聚體D-3'。通過(guò)原位電化學(xué)技術(shù)合成的寡 核苷酸探針Kras位置的序列為5' 15-聚體C'-3'， Rab位置的序列為5'-15聚體 D'-3'，其中15-聚體C'與15-聚體C序列互補(bǔ)，15-聚體D'與15聚體D序列互 補(bǔ)。采用鉑絲為反電極。DNA靶標(biāo)是購(gòu)自歐普朗生物技術(shù)公司(Operon
Biotechnologies, Inc.)的生物素化Rab樣品。將生物素化Rab靶標(biāo)加到微陣列 中，以便與微陣列上的探針DNA雜交(l納摩爾，40攝氏度，l小時(shí))。將鏈霉 親和素偶聯(lián)的HRP加到微陣列中，以便與生物素化Rab序列復(fù)合。測(cè)定各電 極的電極電勢(shì)與Ag/AgCl參比電極。這些數(shù)據(jù)見(jiàn)圖15(三維圖形)。發(fā)現(xiàn)Rab 寡核苷酸探針為正信號(hào)。不出所料，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Kras探針的信號(hào)。實(shí)施例11校正曲線在本實(shí)施例中，將三種分析物混合成一種溶液，并加到制備的電極微陣列 中。微陣列裝置在不同已知位置上合成許多不同寡核苷酸探針的能力使得能夠 在一片芯片上檢測(cè)多種分析物。在各種情況下，用標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)方法以酶標(biāo)記準(zhǔn)備 研究的樣品。合并多種樣品，以便使所有待研究靶標(biāo)來(lái)自單一合并樣品。合并 AGP樣品、蓖麻毒蛋白和兔Rab寡核苷酸樣品，用HRP作為酶在一個(gè)微陣列 (康柏瑪其克公司)上進(jìn)行研究。即使靶標(biāo)組是蛋白質(zhì)或核酸，只有含有合適探 針的位置能檢測(cè)到靶標(biāo)。根據(jù)多個(gè)微陣列研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)AGP而言檢測(cè)限度是 每毫升5皮克，對(duì)蓖麻毒蛋白而言是每毫升300皮克；此濃度轉(zhuǎn)換為2.5塵摩 爾。動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍跨越四個(gè)對(duì)數(shù)。圖16顯示了就AGP和蓖麻毒蛋白而言電流 與分析物濃度的關(guān)系。圖17提供了溫度40攝氏度、雜交時(shí)間為2小時(shí)時(shí)Rab-生物素寡核苷酸 靶標(biāo)的負(fù)電流與濃度對(duì)數(shù)的圖。圖17中的各數(shù)據(jù)點(diǎn)代表了不同電極微陣列的 平均負(fù)電流，其中使各微陣列接觸不同濃度的寡核苷酸靶標(biāo)。實(shí)施例12采用HRP和漆酶的多種酶免疫試驗(yàn)在本實(shí)施例中，在同一電極微陣列上使用漆酶和HRP，以進(jìn)行AGP和蓖 麻毒蛋白混合物的免疫試驗(yàn)。作為第一個(gè)步驟，制備試驗(yàn)試劑。通過(guò)抗體上的 伯胺將15聚體寡核苷酸附連于第一抗體。就漆酶而言抗體是抗AGP，就HRP 而言抗體是抗RCA。用二硫鍵修飾3'末端上的寡核苷酸，其5'末端上含有18 個(gè)單位的PEG。因此，寡核苷酸的結(jié)構(gòu)如下PEG(18)-15-聚體DNA-S-S-R。 R
基團(tuán)為甲基，但可以是另一個(gè)基團(tuán)。采用兩種不同的15聚體寡核苷酸； 一種 用于漆酶， 一種用于HRP。為了制備硫修飾的寡核苷酸，將含有二硫鍵的寡核苷酸(10微升1毫摩爾 母液)與30微升10xPBS和5微升二硫蘇糖醇(DTT)溶液(l毫克/毫升的水溶液) 混合。然后在室溫下培育該混合物4小時(shí)，分兩次施加到用lx磷酸鹽緩沖鹽 水(PBS)預(yù)平衡的P6柱上。得到的硫修飾的寡核苷酸具有以下結(jié)構(gòu) PEG(18)-15-聚體-S曙H。為了制備抗體，加入交聯(lián)接頭。將琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基) 環(huán)己烷-l-羧酸酯(SMCC)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，以獲得毫克/毫升的濃度。 將SMCC溶液(1.2微升)加入50微升lxPBS配制的所需抗體溶液(l毫克/毫升) 中。然后在室溫下培育該混合物2小時(shí)，分兩次施加到用lxPBS預(yù)平衡的P6 柱上。如下所述，將修飾寡核苷酸連接于修飾抗體。合并修飾的寡核苷酸和抗體 溶液，室溫培育2小時(shí)。然后，分兩次將該混合物施加到用lxPBS預(yù)平衡的 P30柱上。得到的結(jié)構(gòu)如下15-聚體-PEG(18)-抗體。然后，收集、冷凍和儲(chǔ) 存連接寡核苷酸的抗體。通過(guò)在電極上合成互補(bǔ)性寡核苷酸制備含有約1000個(gè)電極的電極微陣列 (康柏瑪其克公司)。合成兩種不同類型的互補(bǔ)寡核苷酸(標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)和電化學(xué)解封)， 一種用于漆酶， 一種用于HRP。控制各互補(bǔ)寡核苷酸的位置。 使附連有寡核苷酸的第一抗體接觸微陣列，以便進(jìn)行自身組裝。將標(biāo)記到所選寡核苷酸的兩種抗體懸浮于含有0.05%吐溫20的2xPBS (2xPBST)中，濃度約為l-5微克/毫升。將電極微陣列與寡核苷酸標(biāo)記抗體一起于40攝氏度培育1小時(shí)。然后用0.5毫升2xPBST洗滌微陣列三次。使分析物蓖麻毒蛋白(HRP)和AGP(漆酶)接觸微陣列，以便連接于各自的抗體。將不同濃度的分析物懸浮于2xPBST。將含分析物的溶液(30微升)施加于微陣列。在室溫下將微陣列與含分析物的溶液一起培育1小時(shí)。然后用0.5毫升2xPBST洗滌該微陣列3次。然后，將第二抗體連接于微陣列以形成夾心結(jié)構(gòu)。在不同階段連接漆酶和HRP的各第二抗體，即各抗體的不同溶液。在HRP階段，使2xPBST配制的生物素化第二抗體(0.2毫克/毫升)接觸該微陣列。室溫下培育該微陣列1小時(shí)。 然后用0.5毫升2xPBST洗滌該微陣列3次。然后將HRP-鏈霉親和素偶聯(lián)物(l微克/毫升)的2xPBST溶液加入微陣列 中。在室溫下將該微陣列與HRP-鏈霉親和素偶聯(lián)物溶液一起培育1小時(shí)。然 后用0.5毫升2xPBST洗滌該微陣列3次。加入游離生物素、然后洗滌，從而 封閉鏈霉親和素上的其余位點(diǎn)。在漆酶階段，使生物素化第二抗體(0.2毫克/毫升)的2xPBST溶液接觸該 微陣列。在室溫下培育該微陣列1小時(shí)。然后用0.5毫升2xPBST洗滌該微陣 列3次。然后，使鏈霉親和素接觸該微陣列，以便將生物素結(jié)合到漆酶夾心結(jié) 構(gòu)的第二抗體上。使生物素化漆酶接觸該微陣列，以便結(jié)合于連接于漆酶夾心 結(jié)構(gòu)第二抗體上生物素的鏈霉親和素。首先，電化學(xué)檢測(cè)漆酶夾心結(jié)構(gòu)，然后 電化學(xué)檢測(cè)HRP夾心結(jié)構(gòu)。在鄰苯二酚和空氣氧存在下，采用漆酶標(biāo)記抗體進(jìn)行的AGP免疫試驗(yàn)產(chǎn) 生正信號(hào)，如圖18所示。試驗(yàn)溶液為含有0.2摩爾硫酸鈉的0.05摩爾擰檬酸-磷酸鈉緩沖液(pH 5.0)。溶液中的過(guò)氧化氫濃度為1毫摩爾。溶液中的鄰苯二 酚濃度為l毫摩爾。溫度為室溫。施加電壓為-0.3伏。不出所料，采用HRP標(biāo)簽進(jìn)行的蓖麻毒蛋白免疫試驗(yàn)沒(méi)有信號(hào)，如圖18 右側(cè)所示。洗滌微陣列并將其放入含有OPD和過(guò)氧化氫的底物溶液中時(shí)，采 用HRP標(biāo)簽時(shí)觀察到蓖麻毒蛋白的正信號(hào)，如圖19的右側(cè)所示。用-0.1伏與 鉑絲進(jìn)行采用OPD的試驗(yàn)。該溶液為0.05摩爾檸檬酸-磷酸鈉緩沖液，其中含 有0.2摩爾硫酸鈉，pH為5.0。 OPD和過(guò)氧化氫的濃度均為1毫摩爾。溫度為 環(huán)境溫度。還可觀察到與檢測(cè)AGP有關(guān)的漆酶標(biāo)記抗體的低強(qiáng)度反應(yīng)。如本實(shí)施例所述使用夾心結(jié)構(gòu)時(shí)，必須按照本實(shí)施例所述的順序進(jìn)行試 驗(yàn)。換言之， 一定要在HRP檢測(cè)之前進(jìn)行漆酶檢測(cè)。否則，可能發(fā)生酶串話。 串話很明顯，因?yàn)槊竵?lái)自相關(guān)家族，從而通過(guò)還原氧或過(guò)氧化氫氧化同一有機(jī) 物。使用兩種不同氧化還原酶時(shí)多重酶系統(tǒng)變得更有效?？梢圆捎玫脑S多其它 酶系統(tǒng)之一是葡萄糖脫氫酶與漆酶或HRP。實(shí)施例13
采用HRP和葡萄糖脫氫酶的多種酶免疫試驗(yàn)在本實(shí)施例中，在同一電極微陣列上使用HRP和葡萄糖脫氫酶(GDH)， 以證明在多種酶免疫試驗(yàn)中使用這些酶的可行性。微陣列為康柏瑪其克公司 CUSTOMARRAY 12KTM。分別和依次在微陣列上檢測(cè)GDH和HRP。通過(guò)寡 核苷酸與微陣列上合成探針的雜交使GDH和HRP連接于微陣列。將GDH和 HRP連接于同一微陣列之前，將GDH本身連接于微陣列，以顯示GDH的用 途。通過(guò)雜交三種所選生物素化寡核苷酸完成連接。采用幾個(gè)步驟來(lái)制備含有GDH的微陣列。按照標(biāo)準(zhǔn)的皮爾斯生物素化方 案使GDH生物素化。為了將GDH連接于微陣列，用電化學(xué)合成法在微陣列 上原位合成與三種不同的生物素化寡核苷酸互補(bǔ)的三種探針。探針包括含有序 列15-聚體E'的aPl、含有序列15-聚體F的aP2和含有序列15-聚體G'的aP3。 靶標(biāo)長(zhǎng)度是15-聚體，且與探針互補(bǔ)。不含探針的電極上合成了隨機(jī)15-聚體序 列。通過(guò)將該微陣列接觸寡核苷酸溶液使生物素化寡核苷酸雜交于各互補(bǔ)探 針，這些寡核苷酸稱為Pl、 P5和P6。生物素連接于3'末端。溶液中Pl、 P5 和P6的濃度分別為l納摩爾、50皮摩爾和10皮摩爾。雜交時(shí)間為60分鐘， 溫度為40攝氏度。使?jié)舛葹閘微克/毫升的鏈霉親和素溶液接觸微陣列，以便 將鏈霉親和素連接于各寡核苷酸上的生物素。然后，將含有1毫摩爾CaCl2和 10微摩爾PQQ的PBS中的生物素化GDH與微陣列于25攝氏度培育15分鐘， 形成具有以下結(jié)構(gòu)的復(fù)合物雜交寡核苷酸-生物素-鏈霉親和素-生物素-GDH。在含有100微摩爾CaCl2、0.1微摩爾PQQ、 1毫摩爾2,6-二氯靛酚(DCIP)、 600微摩爾吩嗪硫酸乙酯(PES)和100微摩爾葡萄糖的PBS溶液中進(jìn)行GDH 的電化學(xué)檢測(cè)。以+300毫伏、然后+500毫伏進(jìn)行檢測(cè)，用普通ITO反電極進(jìn) 行檢測(cè)。GDH能催化葡萄糖氧化，該反應(yīng)伴隨著PES被還原。該反應(yīng)如下 葡萄糖+PES(氧化)—葡糖酸+PES(還原)按照這一反應(yīng)，還原的PES然后還原DCIP:DCIP(氧化)+PES(還原)—DCIP(還原)+PES(氧化)向電極施加正電壓能氧化DCIP的還原形式。按照以下等式，氧化反應(yīng)產(chǎn) 生可檢測(cè)的氧化電流DCIP(還原)-電子—DCIP(氧化)以300毫伏進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)圖31，它提供了含有P1、 P5或P6的電極
組電流差異的三維圖和平均電流差異的二維示意圖。深色方框表示該組中電極的平均電流較高。圖31顯示，當(dāng)靶標(biāo)寡核苷酸濃度為1納摩爾(P1)時(shí)，相對(duì)于 背景電流測(cè)定到顯著電流。不出所料，10皮摩爾(P6)和50皮摩爾(P5)的電流差 異小于1納摩爾，它們大約相等。如圖32所示，在電勢(shì)約500毫伏下測(cè)定時(shí) 重復(fù)了電流差異的圖案(pattern)。圖31和32中的二維示意圖并未顯示實(shí)際照 片中的瑕疵。為了獲得同時(shí)含有連接HRP的寡核苷酸和連接GDH的寡核苷酸的微陣 列，P1用于GDH， P6用于HRP。在微陣列(康柏瑪其克公司)上原位合成互補(bǔ) 探針(采用電化學(xué)解封的標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué))。將該微陣列與P6生物素化寡核苷 酸一起培育(O.l納摩爾，40°C， 1小時(shí))。洗滌該微陣列，然后用HRP-鏈霉親 和素偶聯(lián)物培育，以便將HRP連接于微陣列。偶聯(lián)物包含偶聯(lián)于鏈霉親和素 的80個(gè)HRP單位形成的專利聚合物。鏈霉親和素-HRP復(fù)合物購(gòu)自研究診斷 公司(Research Diagnostics, Inc)。為了制備鏈霉親和素-HRP溶液，用2xPBST 將1微升鏈霉親和素-HRP 80復(fù)合物稀釋至5000微升。接觸時(shí)間為60分鐘， 溶液溫度為25攝氏度。得到的連接是雜交的P6-生物素-鏈霉親和素-HRP。然 后在同一微陣列上對(duì)GDH重復(fù)該方法，以獲得雜交的Pl-生物素-鏈霉親和素 -GDH。在標(biāo)準(zhǔn)HRP檢測(cè)條件下，以TMB為底物，在過(guò)氧化氫存在下進(jìn)行HRP 檢測(cè)。電壓為-0.2伏。該溶液是10倍稀釋的市售TMB溶液。溫度為室溫。用 不同溶液依次檢測(cè)GDH和HRP。用本實(shí)施例以前描述的溶液檢測(cè)GDH。圖33顯示了平均電流減去背景電流的二維示意圖。該示意圖不捕獲原始 照片中的瑕疵，原始照片中，由于蓋玻片的污染，其P1位置上顯示出一些陰 影。上方的示意圖將GDH檢測(cè)結(jié)果表示為較淺的小方塊。下方的示意圖將HRP 檢測(cè)結(jié)果表示為較淺的小方塊。在GDH檢測(cè)期間，含HRP電極的電流并未顯 著高于背景電流。相似地，在HRP檢測(cè)期間，含有GDH的電極未見(jiàn)顯著高于 背景電流的電流。因此，可以在同一電極微陣列上檢測(cè)各酶，而不干擾其它酶。 可利用這種沒(méi)有串話的情況構(gòu)建用一種以上類型的酶檢測(cè)多種分析物的微陣 列。實(shí)施例14
通過(guò)沉積產(chǎn)物進(jìn)行的氧化還原酶放大檢測(cè)在這個(gè)實(shí)施例中，用HRP作為酶，在電極微陣列上形成不溶性沉積產(chǎn)物，以檢測(cè)結(jié)合事件。將康柏瑪其克公司CUSTOMARRAY 12K 電極微陣列用作 微陣列。不溶性沉積產(chǎn)物能提高電極的電阻，從而可測(cè)定結(jié)合事件。選擇四個(gè) 子區(qū)域，在各區(qū)域上合成四種不同寡核苷酸，例如各區(qū)域含有四種寡核苷酸之 一。各區(qū)域包含16個(gè)電極(4x4)。芯片子區(qū)域含有以下寡核苷酸寡核苷酸l， 5'-20-聚體H-3';寡核苷酸2， 5'-20-聚體I-3';寡核苷酸3， 5'-20-聚體J-3';和 寡核苷酸4， 5'-20-聚體K-3'。用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)和電化學(xué)解封技術(shù)在各子 區(qū)域內(nèi)四個(gè)電極上原位合成各寡核苷酸。在其余電極上，合成了許多隨機(jī)寡核 苷酸。將該微陣列與含有生物素的寡核苷酸1-4的互補(bǔ)寡核苷酸一起37攝氏 度培育過(guò)夜。采用各種濃度的互補(bǔ)寡核苷酸。充分洗滌微陣列，在室溫下用 HRP-鏈霉親和素偶聯(lián)物培育。該偶聯(lián)物包含偶聯(lián)于鏈霉親和素的80個(gè)HRP 單元形成的專利聚合物。鏈霉親和素-HRP復(fù)合物購(gòu)自研究診斷公司。為了制 備鏈霉親和素-HRP溶液，用2xPBST將1微升鏈霉親和素-HRP 80復(fù)合物稀釋 至5000微升。接觸時(shí)間為60分鐘，溶液溫度為25攝氏度。然后再用2xPBST 洗滌，用DAB-過(guò)氧化氫溶液培育30分鐘，以便在微陣列上形成沉積層。DAB 的濃度為1毫摩爾。過(guò)氧化氫濃度為1毫摩爾。沉積層為棕色，不難在升高的 沉積物上觀察到該沉積層。最后，用不同濃度的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液 和不同施加電壓進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。圖22是電極微陣列的光學(xué)顯微照片的黑白示意圖?？稍诟?x4電極組上 觀察到沉積在微陣列子區(qū)域上的不溶性產(chǎn)物?；パa(bǔ)寡核苷酸濃度為1皮摩爾至 1納摩爾?？捎^察到在高和低濃度的捕獲的含生物素互補(bǔ)寡核苷酸存在下形成 的不溶性物質(zhì)沉積的差異。與產(chǎn)生隨機(jī)序列寡聚物的位點(diǎn)(背景電極)上獲得的 電流相比，在含有互補(bǔ)寡核苷酸的電極上電化學(xué)還原K4[Fe(CN)6]的電流顯著 降低。對(duì)高濃度的氧化還原介質(zhì)而言，這種電流差異可高達(dá)幾十納安培。圖23顯示一電極微陣列的二維圖，該電極微陣列顯示30分鐘的沉積時(shí)間 后在HRP-DAB-沉積物上以-lOO mV對(duì)2毫摩爾K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]進(jìn)行 的電化學(xué)還原。在低至10塵摩爾的互補(bǔ)寡核苷酸濃度下觀察到電流降低。在 IO皮摩爾以上，發(fā)生信號(hào)飽和；然而，如果縮短沉積時(shí)間，則可由這些電極獲
得數(shù)據(jù)。實(shí)施例15還原性沉積產(chǎn)物進(jìn)行的氧化還原酶放大檢測(cè)本實(shí)施例中，用HRP作為酶，使不溶性產(chǎn)物沉積在電極微陣列上，從而 將一個(gè)結(jié)合事件轉(zhuǎn)化為有限量的氧化還原活性材料。用康柏瑪其克公司 CUSTOMARRAY12K電極微陣列作為微陣列。向反電極施加電壓，以還原不 溶性沉積產(chǎn)物，從而檢測(cè)微陣列上的結(jié)合。將微陣列制備為用于復(fù)雜基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)的DNA微陣列。45攝氏度時(shí)，靶 RNA與微陣列上的互補(bǔ)探針雜交18小時(shí)。用生物素標(biāo)記靶RNA。然后利用聚 HRP鏈霉親和素偶聯(lián)物標(biāo)記雜交序列。洗滌電極微陣列后，使其接觸含0.003% 過(guò)氧化氫的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)5分鐘。不溶性物質(zhì)，即氧化的TMB與HRP 標(biāo)記的耙RNA配合(registration)沉積。去除TMB試劑并用加了 200毫摩爾的 NaCl的磷酸檸檬酸鹽緩沖液終止氧化反應(yīng)。氧化的TMB為藍(lán)色，不難觀察到 此種物質(zhì)的沉積。緩沖液無(wú)氧化還原活性；因此，該檢測(cè)步驟中觀察的電流由 電極上的氧化還原活性分子引起。電極微陣列含有無(wú)沉積、淡藍(lán)色沉積和深藍(lán)色沉積區(qū)域。圖24為代表電 極微陣列彩圖的黑白圖，顯示了藍(lán)色沉積產(chǎn)物。深藍(lán)色區(qū)域代表結(jié)合RNA和 隨后HRP的高濃度；相反地，淺藍(lán)色代表它們的低濃度。微陣列上含有未合 成探針DNA的電極。不出所料，這些電極無(wú)沉積。微陣列上藍(lán)色較深的區(qū)域 含有高濃度的與溶液中靶標(biāo)互補(bǔ)的DNA序列。起先，以-0.1伏的電壓與銦-錫氧化(ITO)反電極對(duì)微陣列上的一小部分進(jìn) 行電化學(xué)閱讀。圖25是電極微陣列的黑白轉(zhuǎn)換圖，顯示了微陣列閱讀期間每 一電極的電流。白色區(qū)域?qū)?yīng)含有探針DNA的電極，因此，由沉積產(chǎn)物還原 引起法拉第電流。黑色區(qū)域代表無(wú)沉積產(chǎn)物的電極，因此電流最小。最下面一 排電極不含合成的DNA;因此，無(wú)HRP附著也無(wú)沉積產(chǎn)物形成。無(wú)DNA電 極上的電流約為0.2納安(均值)，在圖25中這類電極表示為黑色。圖25中其余電極含有能與溶液中RNA雜交的合成探針序列。溶液中RNA 的濃度為0.375-12 pM。每一電極上觀察到的電流為法拉第電流和充電電流的
線性組合。為了辨別有酶的電極和無(wú)酶附連的電極，充電電流必須是總電流中可忽略不計(jì)的部分。特異性結(jié)合事件以及后續(xù)氧化的TMS的沉積產(chǎn)生了范圍 為0.5-12納安的電流，而陰性對(duì)照探針上的非特異性相互作用小于0.4納安。 該技術(shù)可在非特異性干擾物存在下探測(cè)DNA-RNA的特異性相互作用。當(dāng)獲取如圖26所見(jiàn)信號(hào)后，在-0.1伏再次閱讀微陣列。由于所有氧化TMB 在前次閱讀中己還原，觀察到的電流僅由電極充電所致。該電流的平均值為 0.2-0.3納安，如圖26所示。在某些情況下觀察到充電電流比所選電極的法拉 第電流小10倍以上。這是有利的，因?yàn)閳D25中觀察到的大多數(shù)電流是由感應(yīng) 過(guò)程和極少的充電干擾所致。獨(dú)立調(diào)整圖25和26的灰度以在圖像內(nèi)顯示最大 對(duì)比度；然而，圖中的黑白示意圖的灰度發(fā)生改變(loose)。 — 為了閱讀整個(gè)微陣列，如圖27所示實(shí)施該方法。在閱讀循環(huán)0中，將所 有電極設(shè)定為10毫伏。這一狀態(tài)與開(kāi)路狀態(tài)的所有電極同時(shí)發(fā)生，因?yàn)椴淮?在接地的低電阻路徑。各單獨(dú)電極依次接地(閱讀循環(huán)1-3)，而將微陣列上的其 余電極保持在IO毫伏。為了檢測(cè)電流，通過(guò)電流測(cè)定電子器件使低電阻通路 開(kāi)始接地，從而使一個(gè)電極接地，以閉合該電流。在這段時(shí)間中，監(jiān)測(cè)和記錄 電流。由于所施加的電勢(shì)，在一個(gè)方向上例如從接地單獨(dú)電極到微陣列其余電 極的方向上電流被調(diào)正。電流還原了接地電極上的物質(zhì)并氧化微陣列其余電極 上的任何物質(zhì)。此方案將整個(gè)微陣列有效用作反電極，將接地電極用作工作電 極。為了閱讀整個(gè)微陣列，使各個(gè)單獨(dú)電極依次接地，記錄電流，然后接回施 加電勢(shì)，如圖27所示。通過(guò)單獨(dú)閱讀各電極，依次閱讀微陣列。更詳細(xì)說(shuō)，使各電極連接于多路開(kāi)關(guān)。最初將該開(kāi)關(guān)接入電壓源(約10 mV)。然后，在閱讀該電流之前的很短時(shí)間，將電極真實(shí)接地一段時(shí)間(時(shí)間可 變)。這段時(shí)間可以是0-10毫秒，然后將該電極接到放大器輸入端。將該放大 器的輸入端保持在接近地電勢(shì)的水平(lmV以內(nèi))，但并不真實(shí)接地。在大多數(shù) 情況下，調(diào)整放大器輸入端，以盡量接近接地電勢(shì)，但也能夠調(diào)整到不等于接 地電勢(shì)?？捎么朔椒?例如)消除背景電流。在實(shí)踐中，使電壓維持盡可能接近 接地電勢(shì)?？刹捎貌煌姆糯笃?，包括積分放大器(這是所用的類型)、互阻 抗放大器和電壓放大器。圖28是描述用上述方法閱讀微陣列時(shí)電極微陣列上各電極的電流的黑白 轉(zhuǎn)換圖。白色區(qū)域?qū)?yīng)于含有探針DNA的電極，由于沉積產(chǎn)物被還原而產(chǎn)生 法拉第電流。黑色區(qū)域代表沒(méi)有沉積產(chǎn)物，因此電流很小。在24秒內(nèi)閱讀整 個(gè)CUSTOMARRAY 12K芯片，對(duì)未合成DNA的電極和含有陰性對(duì)照序列的 電極而言平均背景充電電流為0.2納安。由不同濃度的標(biāo)記RNA靶標(biāo)產(chǎn)生的 電流見(jiàn)圖29。電流顯著增加與對(duì)應(yīng)溶液中RNA濃度線性提高基本呈指數(shù)關(guān)系。 這一試驗(yàn)說(shuō)明，此方法能夠區(qū)分不同濃度的RNA溶液，而受充電電流或非特 異性RNA-DNA相互作用引起的其它電流的干擾。數(shù)據(jù)表明可通過(guò)電化學(xué)還原在過(guò)氧化氫存在下制備的固定的HRP/TMB 反應(yīng)產(chǎn)物而觀察DNA/RNA雜交。這一閱讀方法能夠終止酶反應(yīng)，并在隨后的 時(shí)間閱讀微陣列。采用低過(guò)電勢(shì)，以便最大程度減小充電引起的背景電流，從 而提高信噪比。這種閱讀方法不一定需要分離的微陣列外電極。所有電極均用 作反電極，所有電極均可用于試驗(yàn)?zāi)康?。此外，發(fā)現(xiàn)溶液中的靶標(biāo)濃度與電流 成正比，而充電電流的干擾可忽略不計(jì)。實(shí)施例16通過(guò)固體沉積產(chǎn)物的電導(dǎo)率進(jìn)行氧化還原酶放大檢測(cè)在本實(shí)施例中，用HRP作為酶、吡咯和過(guò)氧化氫作為底物，電化學(xué)檢測(cè) 寡核苷酸雜交結(jié)合事件。將HRP附連于寡核苷酸靶標(biāo)，并催化聚合吡咯(氧化)， 以形成聚吡咯，聚吡咯沉積在附連有HRP的電極上。聚吡咯是導(dǎo)電性聚合物， 因此提高沉積有聚吡咯的電極的電導(dǎo)率。在沉積后測(cè)定是否存在聚吡咯。在恒 定電壓下測(cè)定時(shí)，與含聚吡咯的電極相比，不含聚吡咯的電極的電流較低。在本實(shí)施例中，通過(guò)測(cè)定發(fā)生雜交的電極上電導(dǎo)率的增加，檢測(cè)生物素化 擴(kuò)增RNA(aRNA)轉(zhuǎn)錄物的雜交。電導(dǎo)測(cè)定為在PBS溶液中設(shè)定為-300 mV時(shí) 通過(guò)電極的電流量增量。通過(guò)導(dǎo)電性聚合物聚吡咯的HRP酶學(xué)沉積增加電極 上的電導(dǎo)。雜交aRNA轉(zhuǎn)錄物后，使鏈霉親和素-HRP結(jié)合于生物素化aRNA。 然后，HRP氧化底物吡咯，形成聚吡咯，發(fā)生雜交時(shí)它沉積在單個(gè)電極上。聚 吡咯形成量與HRP量成正比，HRP量與雜交于電極位點(diǎn)的生物素化aRNA的 量成正比。而且，在設(shè)定為-300mV的電極上檢測(cè)的電流量與電極上沉積的聚 吡咯量成正比。用PCR由XDNA構(gòu)建含有T7啟動(dòng)子的六種不同的1000堿基對(duì)(bp)DNA
序列。這六種序列稱為sp-12、 sp-09、 sp-08、 sp-06、 sp-05和sp-03。通過(guò)T7 擴(kuò)增產(chǎn)生這些轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增RNA，在此擴(kuò)增過(guò)程中通過(guò)摻入生物素化UTP進(jìn) 行標(biāo)記。用由mRNA線性擴(kuò)增反義aRNA所用的埃伯溫法(Eberwine method) (Phillips J， Eberwine J H.(1996)反義RNA擴(kuò)增由單個(gè)活細(xì)胞分析mRNA群 體的線性擴(kuò)增方法(Antisense RNA Amplification: A Linear Amplification Method for Analyzing the mRNA Population from Single Living Cells), Methods. 10(3):283-288)由K562(人CML細(xì)胞系)mRNA產(chǎn)生非特異性aRNA 群體，并通過(guò)與六種轉(zhuǎn)錄物相同的方式用許可試劑標(biāo)記上生物素。用鎂2+誘 導(dǎo)的金屬水解使所有aRNA片段化成50-200 bp長(zhǎng)度。在含有0.1Q/。吐溫tm和25%甲酰胺的6xSSPE溶液中，使六種轉(zhuǎn)錄物sp-12、 sp-09、 sp-08、 sp-06、 sp-05和sp-03以及5微克片段化K562 aRNA于45攝氏 度雜交于康柏瑪其克公司CUSTOMARRAY 12kDNA電極微陣列16小時(shí)。 該微陣列含有K562特異性基因的探針以及對(duì)六種轉(zhuǎn)錄物中每一種特異的三種 不同探針。所有探針的長(zhǎng)度均為35-40 bp。六種轉(zhuǎn)錄物sp-12、 sp-09、 sp-08、 sp-06、 sp-05和sp-03分別以下述濃度雜交3000、 1000、 300、 100、 10和1 皮摩爾。雜交后，洗滌微陣列，用鏈霉親和素-HRP培育15分鐘。洗滌該微陣列， 在含有0.1%吡咯和0.03%過(guò)氧化氫的50毫摩爾磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH 5)(西格瑪(Sigma)弁P-4809)中培育1小時(shí)。用lxPBS洗滌該微陣列3次。將微 陣列保留在lxPBS中，電化學(xué)檢測(cè)聚吡咯。為了測(cè)定電流，讀數(shù)電極設(shè)定為接 地，而微陣列外電極設(shè)定為300毫伏。電流測(cè)定值取作傳入地的電流量(I)。電流通過(guò)量與聚吡咯存在量成正比。在圖35中，提供了不同電極上電流 通過(guò)量的二維圖。該圖是各電極中通過(guò)電流的灰度圖(表示為方塊)。較高電流 對(duì)應(yīng)于方塊中較亮的圖像。此圖顯示了六種雜交轉(zhuǎn)錄物各自的三種探針(每種 轉(zhuǎn)錄物一列)以及溶液中雜交轉(zhuǎn)錄物的濃度(最下面一行)。也有在溶液中沒(méi)有雜 交物的九種陰性對(duì)照探針。在圖36中，提供了各雜交轉(zhuǎn)錄物在電極上的電流 數(shù)值。該值是各轉(zhuǎn)錄物濃度下三種不同探針的平均值。在圖37中，通過(guò)九種 零濃度探針計(jì)算得到相對(duì)于平均背景的增量。該圖顯示，最低濃度下電流增加 l倍，至最高濃度下電流增加4.5倍。
權(quán)利要求
1. 一種用酶檢測(cè)電極微陣列上的結(jié)合事件的方法，所述方法包括(a)提供一微陣列，該微陣列含有多個(gè)電極和多種捕獲復(fù)合物，所述捕獲復(fù)合物至少有兩種不同類型，且連接在對(duì)應(yīng)于所述電極的位點(diǎn)上，其中第一捕獲復(fù)合物類型與第一分析物類型具有親和力，后續(xù)的捕獲復(fù)合物類型與后續(xù)的分析物類型具有親和力，其中所述電極是可電學(xué)尋址的電極；(b)將至少一種類型的多種分析物施加到捕獲復(fù)合物上，形成對(duì)應(yīng)于捕獲復(fù)合物捕獲的各分析物類型的結(jié)合類型復(fù)合物；(c)將酶連接于結(jié)合復(fù)合物，形成報(bào)道復(fù)合物，其中報(bào)道復(fù)合物的類型對(duì)應(yīng)于捕獲復(fù)合物捕獲的各分析物類型；(d)使多種底物溶液依次接觸微陣列，用電信號(hào)確定位點(diǎn)上是否存在酶產(chǎn)物，其中各底物溶液對(duì)應(yīng)于報(bào)道復(fù)合物類型，其中存在電信號(hào)是結(jié)合事件的衡量。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述捕獲復(fù)合物由多種寡核 苷酸探針組成，所述分析物由多種寡核苷酸靶標(biāo)組成，所述寡核苷酸靶標(biāo)與寡 核苷酸探針的雜交形成結(jié)合復(fù)合物，通過(guò)附連法使酶結(jié)合于寡核苷酸耙標(biāo)，其 中附連法包括通過(guò)選自下組的分子基團(tuán)連接酶(a)抗體、抗-抗體和抗-獨(dú)特型 抗體組合，(b)生物素和鏈霉親和素或親和素組合，和(c)寡核苷酸和互補(bǔ)寡核苷 酸組合，和它們的組合。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，通過(guò)原位電化學(xué)合成方法合 成所述寡核苷酸探針。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕獲復(fù)合物由雜交于含 有抗體標(biāo)簽的寡核苷酸靶標(biāo)的寡核苷酸探針組成，通過(guò)抗體標(biāo)簽捕獲分析物， 從而形成結(jié)合復(fù)合物，通過(guò)附連法使酶結(jié)合于分析物，其中所述附連法包括附 連于分析物的報(bào)道抗體和通過(guò)選自下組的分子基團(tuán)附連于報(bào)道抗體的酶(a) 抗體、抗-抗體和抗-獨(dú)特型抗體組合，(b)生物素和鏈霉親和素或親和素組合， 和(c)寡核苷酸和互補(bǔ)寡核苷酸組合，和它們的組合。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，通過(guò)原位電化學(xué)合成方法合 成所述寡核苷酸探針。
6. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述捕獲復(fù)合物通過(guò)選自下 組的方法制備原位電化學(xué)合成、打點(diǎn)、噴墨打印、電場(chǎng)沉積和原位光刻合成。
7. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述捕獲復(fù)合物由選自下組 的分子組成寡核苷酸、多肽、抗體、糖基化多肽、多糖、肽核酸和含有多個(gè) 上述分子單體的混合分子。
8. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述分析物由選自下組的分 子組成抗原、半抗原、病毒、細(xì)菌、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、多糖、生物聚合物分子、 脂質(zhì)、糖蛋白(a-l-酸糖蛋白)、蓖麻毒蛋白、M13噬菌體、球形芽孢桿菌(BG) 芽孢、熒光素、兔IgG、山羊IgG、 DNA、 RNA、單鏈DNA、核糖體RNA、 線粒體DNA、細(xì)胞受體、糖基化的膜結(jié)合蛋白、非糖基化的膜結(jié)合蛋白、多 肽、糖基化多肽、抗體、細(xì)胞抗原決定簇、有機(jī)分子、金屬離子、鹽陰離子和 陽(yáng)離子以及有機(jī)金屬和它們的組合。
9. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述酶選自辣根過(guò)氧化物 酶、漆酶、(3-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、 過(guò)氧化氫酶、乳酸氧化酶和過(guò)氧化物酶，以及它們的組合。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物溶液由含有緩沖液、 鹽和酶底物溶液的水溶液組成，其中所述酶底物溶液含有能與該酶發(fā)生反應(yīng)的 底物。
11. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述酶產(chǎn)物包含可以通過(guò)電 化學(xué)方式還原或氧化的分子。
12. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述電信號(hào)包括差異反應(yīng)， 其中差異反應(yīng)是產(chǎn)物反應(yīng)與基礎(chǔ)反應(yīng)之間差異的衡量，其中在含有酶的位點(diǎn)上 測(cè)得所述產(chǎn)物反應(yīng)，在不含酶的位點(diǎn)上測(cè)得所述基礎(chǔ)反應(yīng)，其中產(chǎn)物反應(yīng)和基 礎(chǔ)反應(yīng)選自電流、電壓和電阻，其中差異反應(yīng)是分析物與捕獲復(fù)合物結(jié)合的 衡量。
13. —種用酶檢測(cè)電極微陣列上的結(jié)合事件的方法，所述方法包括(a)提供含有多個(gè)電極和連接于所述電極對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上的多種捕獲復(fù)合物的微陣列，其中所述電極是可電學(xué)尋址的電極；(b) 將多種分析物施加到捕獲復(fù)合物上，以形成結(jié)合復(fù)合物，其中捕獲復(fù) 合物與分析物具有親和力；(c) 將酶連接于所述結(jié)合復(fù)合物，形成報(bào)道復(fù)合物；(d) 使底物溶液接觸所述微陣列，所述底物溶液中含有能與酶反應(yīng)的底物， 其中固體酶產(chǎn)物沉積在含酶位點(diǎn)上；和(e) 用測(cè)定溶液和電信號(hào)測(cè)定該位點(diǎn)上是否存在固體酶產(chǎn)物，其中存在電信 號(hào)是結(jié)合事件的衡量。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述捕獲復(fù)合物由多種寡 核苷酸探針組成，所述分析物由多種寡核苷酸靶標(biāo)組成，所述核苷酸靶標(biāo)與寡 核苷酸探針雜交形成結(jié)合復(fù)合物，通過(guò)附連法使所述酶結(jié)合于寡核苷酸靶標(biāo)， 其中附連法包括通過(guò)選自下組的分子基團(tuán)連接酶(a)抗體、抗-抗體和抗-獨(dú)特 型抗體組合，(b)生物素和鏈霉親和素或親和素組合，和(c)寡核苷酸和互補(bǔ)寡核 苷酸組合，和它們的組合。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，通過(guò)原位電化學(xué)合成方法 合成所述寡核苷酸探針。
16. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述捕獲復(fù)合物由雜交于 含有抗體標(biāo)簽的寡核苷酸靶標(biāo)的寡核苷酸探針組成，通過(guò)抗體標(biāo)簽捕獲分析 物，從而形成結(jié)合復(fù)合物，通過(guò)附連法使所述酶結(jié)合于分析物，其中所述附連 法包括通過(guò)選自下組的分子基團(tuán)連接酶(a)抗體、抗-抗體和抗-獨(dú)特型抗體組 合，(b)生物素和鏈霉親和素或親和素組合，和(c)寡核苷酸和互補(bǔ)寡核苷酸組合， 和它們的組合。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，通過(guò)原位電化學(xué)合成方法 合成所述寡核苷酸探針。
18. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述捕獲復(fù)合物通過(guò)選自 下組的方法制備原位電化學(xué)合成、打點(diǎn)、噴墨打印、電場(chǎng)沉積和原位光刻合 成。
19. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述捕獲復(fù)合物由選自下組的分子組成寡核苷酸、多肽、抗體、糖基化多肽、多糖和含有多個(gè)上述分子單體的混合分子。
20. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述分析物由選自下組的 分子組成抗原、半抗原、病毒、細(xì)菌、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、多糖、生物聚合物分 子、脂質(zhì)、糖蛋白(a-l-酸糖蛋白)、蓖麻毒蛋白、M13噬菌體、球形芽孢桿菌 (6ad//^ g/oWg/f)(BG)芽孢、熒光素、兔IgG、山羊IgG、 DNA、 RNA、單鏈 DNA、核糖體RNA、線粒體DNA、細(xì)胞受體、糖基化的膜結(jié)合蛋白、非糖基 化的膜結(jié)合蛋白、多肽、糖基化多肽、抗體、細(xì)胞抗原決定簇、有機(jī)分子、金 屬離子、鹽陰離子和陽(yáng)離子以及有機(jī)金屬和它們的組合。
21. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述酶選自辣根過(guò)氧化 物酶，漆酶，P-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，堿性磷酸酶或葡萄糖脫氫酶，或 其組合。
22. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述底物溶液由含有緩沖 液、鹽和酶底物溶液的水溶液組成，其中酶底物溶液含有能與該酶發(fā)生反應(yīng)的 底物。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述酶是辣根過(guò)氧化物酶，所述底物是過(guò)氧化氫和和選自下組的化學(xué)物質(zhì)可氧化的芳香劑、二茂鐵衍生 物和可氧化的無(wú)機(jī)物，以及它們的組合。
24. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述固體酶產(chǎn)物是為非反 應(yīng)性產(chǎn)物，所述測(cè)定溶液是含有電子介質(zhì)的水溶液。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述電子介質(zhì)為氰化鉀亞 鐵和氰化鉀鐵的混合物，其混合比約為10:90-90:10，濃度為約0.1-1000毫摩爾。
26. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述固體酶產(chǎn)物是可還原 或可氧化的，所述測(cè)定溶液是含有緩沖液和鹽的水溶液。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述緩沖液是磷酸鹽-檸檬 酸鹽緩沖液，所述鹽是氯化鈉。
28. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述固體酶產(chǎn)物是導(dǎo)電物質(zhì)。
29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述導(dǎo)電物質(zhì)是聚吡咯。
30. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述電信號(hào)包括差異反應(yīng)， 其中差異反應(yīng)是產(chǎn)物反應(yīng)與基礎(chǔ)反應(yīng)之間差異的衡量，其中在含有酶的位點(diǎn)上 測(cè)得所述產(chǎn)物反應(yīng)，在不含酶的位點(diǎn)上測(cè)得所述基礎(chǔ)反應(yīng)，其中產(chǎn)物反應(yīng)和基 礎(chǔ)反應(yīng)選自電流、電壓、電導(dǎo)率或電阻，其中差異反應(yīng)是分析物與捕獲復(fù)合 物結(jié)合的衡量。
31. —種用酶檢測(cè)電極微陣列上的結(jié)合事件的方法，所述方法包括(a) 提供含有多個(gè)電極的微陣列，其中所述電極是可電學(xué)尋址的電極；(b) 向所述電極施加恒定起始電壓，同時(shí)保持該電極為開(kāi)路；和 (C)在測(cè)定時(shí)間內(nèi)使各電極在約為接地電壓或顯著不同于恒定初始電壓的電壓下依次切換，記錄測(cè)定時(shí)間內(nèi)各電極的電流，使各電極返回恒定初始電壓， 然后將下一個(gè)電極設(shè)定為接地電壓或顯著不同于恒定初始電壓的電壓，從而測(cè) 定各電極的電反應(yīng)。
32. 如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述恒定起始電壓的絕對(duì) 值為約0.1毫伏到5伏。
33. 如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述測(cè)定時(shí)間為約0.1毫 秒到1秒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)電極微陣列上結(jié)合事件的方法。本發(fā)明提供了含有可尋址電極和電極對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上兩種或多種不同類型的捕獲復(fù)合物的微陣列。捕獲復(fù)合物能捕獲分析物。連接酶形成報(bào)道復(fù)合物。依次接觸底物溶液，以制備可通過(guò)含有酶產(chǎn)物的電極和不含酶產(chǎn)物的電極上的電反應(yīng)差異而可在電極上進(jìn)行檢測(cè)的酶產(chǎn)物。所述酶產(chǎn)物可能是固體沉積產(chǎn)物。通過(guò)將保持在恒定電壓的各電極依次切換至接地、然后回到恒定電壓，而閱讀微陣列上電極的電學(xué)特性，以確定酶產(chǎn)物的存在。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK101400800SQ200680042699
公開(kāi)日2009年4月1日 申請(qǐng)日期2006年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月21日
發(fā)明者A·吉尼蒂利斯, J·J·庫(kù)珀, K·M·羅斯, K·迪爾 申請(qǐng)人:康比麥崔克斯有限公司