專利名稱：從羽扇豆屬植物提取的或以重組形式表達的蛋白質(zhì)，編碼它的核苷酸序列和它用于動物 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物學領域，實際可應用為屬于農(nóng)藝科學和農(nóng)業(yè)領域的殺真 菌劑、殺蟲劑、生長促進劑或肥料，并且可應用為屬于人類和動物營養(yǎng)領域 的動物々大食補充劑。
背景技術：
本發(fā)明涉及一種從羽扇豆屬(丄M內(nèi)m^)的種子、子葉或小植林提取的、 具有抗真菌、抗卵菌和植物生產(chǎn)促進劑性質(zhì)的蛋白質(zhì)，并涉及它在針對攻擊 植物的病原媒介的控制，以及作為植物生物刺激素(bio-stimulant)的應用。 這種蛋白質(zhì)可以直接施用到植物上，或者可以將植物遺傳修飾使其在其組織 中表達該蛋白質(zhì)。此外，由于該蛋白質(zhì)不同尋常的固有特性，它可以用于制 備蛋白質(zhì)濃縮物，該濃縮物可用作人和其它動物飲食中的補充劑。
本發(fā)明還描述對應于編碼所述羽扇豆屬蛋白質(zhì)的基因片段的核苷酸DN A 序列，以及它的氨基酸殘基序列，用編碼所述羽扇豆屬蛋白質(zhì)的基因片段轉 化的微生物，以及應用它作為殺真菌劑、殺蟲劑、植物生產(chǎn)促進劑或肥料或 作為人類和動物營養(yǎng)中的補充劑的方法。
本發(fā)明的另一個目的是以上述氨基酸殘基的序列為特征的蛋白質(zhì)，其中 一個或多個氨基酸殘基缺失、已被取代或添加，或者在經(jīng)受化學修飾例如糖 基化之后仍保持其生物學活性。
對于最重要的作物而言，病原媒介的控制在全世界范圍內(nèi)都構成嚴重的 問題。在有關農(nóng)產(chǎn)品貯存的方面病原性真菌、尤其重要。目前，對真菌生長的 控制一般通過大規(guī)模使用化學殺真菌劑來實現(xiàn)。目前市場上可得的植物藥物 (phytopharmaceutical)產(chǎn)品表現(xiàn)若干嚴重的缺陷。 一方面，它們產(chǎn)生高昂 的經(jīng)濟和環(huán)境代價；另一方面，許多真菌物種已經(jīng)針對某些最好的殺真菌劑
形成了抗性機制，往往使得它們在上市數(shù)年之后便遭廢棄。
雖然植物并不擁有象動物那樣的免疫系統(tǒng)，它們已經(jīng)進化出一種針對病
原性真菌的固有抗性。然而，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中使用的植物種植、收獲和貯存技術
往往有助于產(chǎn)生對病原體發(fā)生而言良好或最優(yōu)的條件。
另外，可能影響或危害植物作物的微生物病原體的數(shù)目相當大。例如，
可涉及下列屬鏈格孢屬(^/^77^7'a)、殼二孢屬(^ycoc/^")、葡萄孢 屬(5c^/^"j")、尾孑包菌屬(CWroy/ ora)、炭疽菌屬(Co〃e c^7.c/w附)、色 二孢屬(Dz>/oAa)、白4分菌屬(五o^;p/ze)、鐮孑包屬(Fwan'mw)、頂嚢殼 屬(Gaewwa"畫少cey )、 殼球孑包屬(M"cro/ /zo附/"a )、 叢赤殼屬(7Ve"n'(3 )、 莖點霉屬(尸/zcwa )、擬莖點霉屬(尸/zowo/w^ )、瘤梗孑包屬(尸/^w"to亇/c/w附)、 疫霉屬(尸/z;;啤綠ora)、霜霉屬(戶/os歸/ ara)、柄銹菌屬(Pmcc涵)、 腐霉屬(尸盧'謂)、絲核菌屬(腸'露tom'G)、鉤絲殼屬(t/腦."w/a)和輪 枝孢屬(KeW/"7/^m)。目前市場上可得的殺真菌劑的應用局限于這些屬中 的某一些，不是植物感染控制的有效解決方案。
抗擊微生物病原體的另一可選策略是鑒定和純化生物來源的、具有強抗 真菌活性的物質(zhì)。此類化合物的鑒定涉及從多種生物例如植物和微生物中搜 索物質(zhì)，然后將這些物質(zhì)在抗真菌測定中進^f亍測試，最后加以純化和表征。
通過這種方式，已經(jīng)分離了多類抗真菌蛋白，包括幾丁質(zhì)酶、強結合幾 丁質(zhì)的富半胱氨酸蛋白，|3-1，3-葡聚糖酶、permeatins、硫堇和脂質(zhì)轉移蛋白。
現(xiàn)有文獻中描述了關于利用從植物或微生物提取的抗真菌蛋白的數(shù)種方 法學，或是用于直接施用于病原媒介上，或是在表達這些蛋白質(zhì)的轉基因植 物中。最常用于這些方法學的抗真菌蛋白包括幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、滲透蛋 白(osmotin)型蛋白和溶菌酶。各項研究已經(jīng)證明，過表達這些蛋白質(zhì)的 遺傳修飾植物對多種病原體顯示增強的抗性(歐洲專利0392 225 )。
現(xiàn)代分子生物學技術為重組DNA技術的發(fā)展創(chuàng)造了條件，從而為使用編 碼抗真菌蛋白的基因轉化植物提供了可能。該方法通常涉及將編碼目的蛋白 的基因插入植物組織，然后從遺傳修飾的植物組織再生整個植林。
然而，離子，尤其是鉀、鈉或4丐的存在，會降低這些蛋白質(zhì)中的某一些 的活性。由于這個原因，雖然這些蛋白質(zhì)可能在體外測定中表現(xiàn)強抗真菌活
性，但它們在體內(nèi)由于轉化植物組織中可能天然存在高生理濃度的離子而可 能沒有效力。
總之，在針對影響植物的病原體的對抗中，越來越急需鑒定和純化生物 來源的、表現(xiàn)抗病原體性質(zhì)的新化合物。尤其必須將重點放在對廣譜病原體
人們已經(jīng)對農(nóng)業(yè)實踐進行了長期的優(yōu)化，以促進植物生長和發(fā)育并增加 作物產(chǎn)量。另一方面，可以預計在未來中至長期，全球的許多地方將出現(xiàn)食 物短缺。在受控環(huán)境條件下控制植物生長的現(xiàn)有技術昂貴并需要復雜的設
作用的天然或合成生理活性物質(zhì)。但是，這些物質(zhì)中只有少數(shù)已經(jīng)在真實農(nóng) 業(yè)條件下得到了實際應用。因此，發(fā)現(xiàn)或開發(fā)環(huán)保的、對人類、動物和環(huán)境 無毒性的植物生長促進劑，也日益具有重要性。
植物豆類(legumes),或者具體地說，它們的種子，故認為是供人類和 動物營養(yǎng)的世界性主要蛋白質(zhì)來源。就此方面而言，大豆充當著突出的角色， 這不但是由于其種子的高蛋白含量和質(zhì)量，還由于其富含油。但是，從農(nóng)業(yè) 觀點看，大豆需要肥沃的土壤和充足的水供應。與大豆相比，屬于羽扇豆屬 的植物在近數(shù)十年來已經(jīng)占據(jù)了強有力并富有潛力的位置。如果， 一方面， 它們的種子具有與大豆相近的蛋白質(zhì)和油水平，另一方面，它們這些物種對 貧瘠土壤和缺水條件適應良好。因此，有些時候人們把羽扇豆類看作大豆的 "窮表親"。
常規(guī)野生型羽扇豆種子中天然存在的、對動物有毒的高水平生物堿，長 期阻礙了羽扇豆屬物種的普遍種植和它們的種子供人類和動物消費的用途。 這是羽扇豆種植遠遠滯后于大豆的主要原因。例如，在葡萄牙，傳統(tǒng)的羽扇 豆種子消費長期與啤酒的攝取相關聯(lián)。首先將這些種子在水中煮沸(IO(TC 加熱破壞種子發(fā)芽的能力但并不阻斷吸漲的過程)，然后在流水中浸沒數(shù)天 以去除有毒的生物堿。但是，近來育種技術的應用，為所謂甜羽扇豆品種的 開發(fā)提供了可能；這些品種的特征是，相對于常規(guī)苦味品種(生物堿含量 〉0.004% w/w)，它們含有低的種子生物堿含量(<0.004% w/w)。因此， 甜羽扇豆種子可以安全地用作人類和動物伺料。
因此，可以預計，用于人類和動物營養(yǎng)的、源自羽扇豆的食物產(chǎn)品將得
到越來越大的發(fā)展，正如數(shù)十年前在大豆身上所發(fā)生過的那樣。在羽扇豆植 物蛋白質(zhì)一一或是白蛋白，或是球蛋白一一的情況下，這是尤其重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明期待解決鑒定和純化生物來源的化合物的相關技術問題，其中所 述化合物能夠控制多種影響植物作物的病原媒介，并且在體內(nèi)條件下維持它 們生物學活性的同時起植物生長促進劑的作用。
本解決方案是基于本發(fā)明者對一種存在于屬于羽扇豆屬的植物中的蛋白
質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和筌定，該蛋白質(zhì)表現(xiàn)下述不尋常的特性(i)強的抗真菌和抗卵 菌活性，使其具有作為殺真菌劑的巨大潛力；(ii)強的植物生長促進劑活性， 對非健康或天然弱化的植物尤為顯著；(iii)對變性的極端抗性，使其可用于 田間條件；(iv)對蛋白酶解的極高敏感性，使其對環(huán)境無害，并對人類和動 物無毒；和(v)比例均勻的氨基酸組成。
因此，本發(fā)明的第一個方面涉及權利要求1中定義的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的 第二個方面涉及編碼該蛋白質(zhì)的DNA片段(權利要求3)。本發(fā)明還涉及 所述蛋白質(zhì)或者任何含有它的制備物作為殺真菌劑、殺蟲劑、生長促進劑或 肥料的用途，或者通過直接施用，或者以重組形式，或者通過在遺傳修飾生 物中表達。最后，本發(fā)明考慮所述蛋白質(zhì)或者任何含有它的制備物作為人類 或動物營養(yǎng)中的補充劑的用途。


圖l-對嚴重感染了白粉病的葡萄藤葉子，用水(右邊的葉)或從羽扇豆 提^l的蛋白(左邊的葉)噴灑。(A)噴灑后24小時；(B)噴灑后2個月。
圖2-導致葡萄藤中白粉病的真菌的孢子萌發(fā)的光學顯微鏡觀察結果。小 心地將真菌孢子從年幼的染病葡萄藤葉子表面移出，接種到水瓊脂0.6(w/v) 中。(A)、 (B)和(C)-對照；(D)和(E)加入來自成熟葡萄的總蛋白級分200jig， 其含有發(fā)病相關(PR)蛋白；(F)和(G)-加入從羽扇豆屬提取的蛋白質(zhì)200嗎。 每個測定均在24和48h后進行觀察。使用相差顯微術，所用的放大率是125 X。
圖3-葡萄藤葉的金相顯微鏡觀察結果。(A)健康的葉；(B)感染白粉病
的葉；(C)感染白粉病的葉，用從羽扇豆屬提取的蛋白質(zhì)噴灑后經(jīng)12小時。
所用的放大率在每張照片中示出。
圖4-大腸桿菌中以重組形式表達的來自羽扇豆屬的蛋白質(zhì)對于白粉病 致病媒^i---葡萄白粉病菌(Uncinula necator)孢子的萌發(fā)和發(fā)育的影響。
圖5-對處于相同發(fā)育階段的玫瑰植抹，用水(右邊的玫瑰植株)或含有 從羽扇豆屬提取的蛋白質(zhì)的溶液(200嗎蛋白/ml;左邊的玫瑰植林)噴灑。 該照片顯示兩抹植抹在噴灑后經(jīng)過3周的發(fā)育階段。
圖6-苗圃中生產(chǎn)的西瓜植林。萌發(fā)開始6周后，用水(對照；A)、含 100 pg蛋白/ml的羽扇豆屬粗提取物(B)、 一種市場上可商購的植物生長 促進劑(制造商推薦的濃度)(C )和含200嗎蛋白/ml的羽扇豆屬粗提取 物(D)噴灑。在2周時間內(nèi)對實驗進行監(jiān)測，并對植抹拍照。
圖7
-來自羽扇豆屬植物的球蛋白的不溶性作為鈣和鎂濃度的函數(shù)的典型曲 線。該曲線用來例示這些陽離子對從羽扇豆屬提取的蛋白質(zhì)(■)和來自羽扇 豆屬的P-羽扇豆球蛋白(O)的自聚集的影響。p-羽扇豆球蛋白(0.5mg.ml"; O)和從羽扇豆屬提取的蛋白質(zhì)(0.5 mg.ml"; ■)分別自千種子而純化， 或自從萌發(fā)并生長了 8天的小植林上分離的子葉而純化。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及一種具有強抗真菌性質(zhì)的新蛋白質(zhì)，其對來自植物真菌和卵 菌病原體的孢子的萌發(fā)和發(fā)育表現(xiàn)強有力的活性，并且具有植物生長促進劑 活性，對于非健康或天然弱化的植物尤為顯著。本發(fā)明還考慮所述蛋白質(zhì)或 任何含有它的制備物作為人類或動物營養(yǎng)的補充劑的用途。編碼所述來自羽 扇豆屬的蛋白質(zhì)的基因片段的DNA核苷酸序列不與任何其它已自植物分離 的抗真菌蛋白共有任何顯著的同源性。所述來自羽扇豆屬的蛋白質(zhì)構成植物 中已描述的抗真菌蛋白中的一個新類型。
本發(fā)明涉及的蛋白質(zhì)是從子葉中純化的，所述子葉是從羽扇豆屬萌發(fā)的 幼苗提取的。本發(fā)明包括從植物組織分離蛋白質(zhì)使用的方法學的描述，編碼 它的基因片段(A)的DNA核苷酸序列，和相應的氨基酸殘基序列(B)。 (A)
AACCAGAAGCTTA-GAGTAGTCAAGCTCGCAATACCCATCAACAATCC
TACTTCAGTG-GCTTCAGCAGGAACACTTTAGAGGCCACCTTCAATACT
LQNYRIVEFQ SKPNTLILPK HSDADYVLVV LNGRA TITIV NPDRRQAYNL EYGDALRIPA GSTSYILNPD DNQKLRVVKL AIPINNPGYF YDFYPSSTKD QQSYFSGFSR NTLEATFNTR YEEIQRIILG NED 3'
這種蛋白似乎僅僅天然出現(xiàn)于羽扇豆屬小植林的生存期中非常短的 一段 時期。本發(fā)明人已經(jīng)證實，(3羽扇豆球蛋白——來自羽扇豆屬的主要種子貯 藏蛋白——是所述來自羽扇豆屬的蛋白質(zhì)的生物合成前體。事實上，所述羽 扇豆屬蛋白質(zhì)是一種高度加工的蛋白質(zhì)，接受了數(shù)個水平的化學修飾。這大 大增加了對它研究的困難性，包括對氨基酸殘基和相應核香酸的測序的難 度。在種子形成過程中，編碼|3羽扇豆球蛋白的基因被轉錄為相應的mRNA, mRNA的翻譯導致(3羽扇豆球蛋白的生物合成前體的合成。然后該前體受到 大量加工，包括糖基化，從而產(chǎn)生構成卩羽扇豆球蛋白的數(shù)十種不同類型的 亞基。在接下來的營養(yǎng)生長循環(huán)中，在萌發(fā)開始后數(shù)天，(3羽扇豆球蛋白分 解代謝的最初步驟涉及對其全部或大部分組成亞基的蛋白酶切割，導致本發(fā) 明中描述的蛋白質(zhì)的積累。由于它固有的抗真菌性質(zhì)(該性質(zhì)被宿主植物天 然地利用)，這種蛋白質(zhì)在植物對真菌和昆蟲攻擊最為敏感的生命階段中， 在發(fā)育中的植物的子葉中維持很高的濃度。數(shù)天以后，這種蛋白質(zhì)被降解，
它的氨基酸被用于幼植物的生長。
本發(fā)明描述的羽扇豆屬蛋白質(zhì)表現(xiàn)某些將其與文獻中描述的其它抗真菌 蛋白區(qū)分開來的性質(zhì)。這使它成為一種有前景的靶標，具有開發(fā)控制影響植
物和/或動物的真菌的高效方法的巨大潛力
(i) 強的抗真菌和抗卯菌活性，使其具有作為殺真菌劑的巨大潛力；
(ii) 強的植物生長促進劑活性，對非健康或天然弱化的植物尤為顯著； (m)對變性的極端抗性，使其可用于田間條件；
(iv) 對蛋白酶解的極高敏感性，使其對環(huán)境無害，并對人類和動物無毒； 和
(v) 比例均勻的氨基酸組成。
該蛋白質(zhì)也可以用作殺蟲劑、生長促進劑或肥料，以及作為人類或動物 營養(yǎng)中的食物補充劑。
當今農(nóng)業(yè)中的兩個實際問題是可見于非健康或天然弱化的植物中的生長
降低或抑制，以及通常與現(xiàn)有生物刺激劑相關的毒性。所述從羽扇豆屬植物 組織提取的蛋白質(zhì)對植物的生長和發(fā)育表現(xiàn)出強的生長促進劑活性。事實 上，含有所述蛋白質(zhì)的羽扇豆屬制備物或提取物對所有被測的植物，包括例 如葡萄藤、玫瑰、西瓜和西紅柿，均具有強的生物刺激活性。對等于或高于 200嗎/ml的蛋白質(zhì)濃度而言，該效應是顯著的。所述羽扇豆屬蛋白質(zhì)的非 純提取物中存在的其它組分增加了制備物的價值，因為它們起葉面肥料的作 用。該羽扇豆屬蛋白質(zhì)對人類、動物和環(huán)境沒有毒性，提示它在農(nóng)業(yè)中的應 用對環(huán)境沒有任何^C壞性影響。
本發(fā)明的另 一個方面涉及在細菌中重組產(chǎn)生所述羽扇豆屬蛋白質(zhì)所用的 方法學，目標在于在遺傳修飾的植物中組成性地表達它。最終，這些植物將 會表現(xiàn)對病原性真菌的高水平抗性，其中病原性真菌是指難以控制的(所謂 木材疾病的致病真菌即是如此)、外源施用的傳統(tǒng)殺真菌劑對其完全無效的 真菌。
所述蛋白質(zhì)是從8日齡的白羽扇豆LeBlanc品種(丄甲/m^ "/Zws cv. LeBlanc)小植抹提取的。將種子置于恒溫室內(nèi)(日間25°C,夜間20°C )， 光周期為16h光/8h暗。
收獲之后，將子葉冷凍在液氮中。蛋白質(zhì)提取在含有10% (w/v) NaCl、
10 mM EDTA (乙二胺四乙酸)和10 mM EGTA (乙二醇雙(卩-氨基乙基醚) -N,N,N'，N'-四乙酸)的100 mM Tris-HCl緩沖液，pH 7.5中進行。在4°C 30 分鐘的溫育期之后，將提取物在30,000 g4。C離心1 h。將上清液脫鹽，然后 通過FPLC (快速蛋白和肽液相色i普，F(xiàn)ast Protein and Peptide Liquid Chromatography)-陰離子交換色譜對從羽扇豆屬提取的蛋白質(zhì)進行純化。
從羽扇豆屬提取的蛋白質(zhì)的N末端測序通過Edman降解來完成。使用所 得的氨基酸殘基序列設計簡并引物。在發(fā)生最大P羽扇豆球蛋白前體合成的 階段，從發(fā)育中的白羽扇豆種子提取總mRNA 。使用從植物材料純化mRNA 的規(guī)程/試劑盒來進行mRNA提取。使用先前設計的簡并引物，通過PCR(聚 合酶鏈式反應)擴增編碼所述從羽扇豆屬提取的蛋白質(zhì)的基因片段的相應 cDNA。使用所得的核苷酸序列作為模板，設計新的引物，通過3，和5， RACE (cDNA末端快速擴增)技術獲得編碼所述從羽扇豆屬提取的蛋白質(zhì)的基因 片段的完整核苷酸序列。
在細菌大腸桿菌中，以重組形式產(chǎn)生所述來自羽扇豆屬的蛋白質(zhì)。將編 碼所述來自羽扇豆屬的蛋白質(zhì)的基因片段克隆到合適的載體中，使目的基因 與啟動子r7/ac關聯(lián)。該啟動子是誘導性的，因此，與之相關聯(lián)的基因的表 達僅在糖類異丙基硫代-(3-半乳糖苷存在時發(fā)生。最后，轉化感受態(tài)大腸桿菌 細胞。
如上文所述，所述來自羽扇豆屬的蛋白質(zhì)是以重組形式從細菌中獲得的。 但是，為測試其抗真菌活性，必須將所述來自羽扇豆屬的重組蛋白從其它所 有細菌蛋白中分離出來。為此目的，先以帶有組氨酸殘基標簽(His-Tag) 的重組形式產(chǎn)生所述來自羽扇豆屬的蛋白質(zhì)。其純化所使用的方法學是基于 His-Tag對鎳離子的高親和力。在此方式下，鎳離子結合瓊脂糖基質(zhì)，已知 細菌總提取物中存在的所有蛋白質(zhì)中，只有所述來自羽扇豆屬的蛋白質(zhì)與瓊 脂糖基質(zhì)結合，從而實現(xiàn)重組蛋白的純化。然后，經(jīng)過一組合適的沖洗和 洗脫之后，回收所述來自羽扇豆屬的蛋白質(zhì)，并在用合適的蛋白水解酵處理 之后去除His-Tag。
仔細地選擇合適的啟動子是植物遺傳修飾的先決條件。文獻中描述了數(shù) 種可供相關基因表達的啟動子。為了表達編碼本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的基因片 段，所選的啟動子可以是誘導性或組成性的，取決于需要的表達類型。啟動
子的選擇對于將合成后的蛋白質(zhì)導向所選擇的組織或細胞區(qū)室也是重要的 (翻譯后修飾)。
植物轉化可以通過不同的方法學來實現(xiàn)，例如，通過土壤桿菌
(v4grak^en'wm)的植物轉化，原生質(zhì)體轉化，針對花粉粒的基因轉移，向 生殖器官或未成熟胚胎中的直接注射，以及粒子轟擊。這些方法中的每一種 都具有其獨特的優(yōu)點和缺點。但是，它們都已被用于不同類型的植物中。
為了用編碼所述來自羽扇豆屬的蛋白質(zhì)的基因片段轉化植物，所選擇的 方法是通過土壤桿菌進行轉化，使用含有目的基因的編碼區(qū)域及與之關聯(lián)的 合適標記基因的合適表達載體(Fraley等，1983 )。植物再生、植物發(fā)育和 植物從單個原生質(zhì)體向培養(yǎng)基的轉移可以根據(jù)文獻中已有的數(shù)種方法學來 實現(xiàn)。該過程包括選擇轉化細胞和通過胚發(fā)生培養(yǎng)物的發(fā)育所用的常規(guī)方法 培養(yǎng)這些細胞的數(shù)個步驟。最終將再生的小植抹培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基質(zhì)，通 常是土壤中。
本發(fā)明的另一個目的是包含根據(jù)權利要求1或2的蛋白質(zhì)，或根據(jù)權利 要求9獲得的該蛋白質(zhì)的重組形式作為活性成分的任何農(nóng)用制劑，特征在于 用于防止、控制或?qū)共≡哉婢蛎蚶ハx引起的疫病，或作為生長促 進劑或肥料。
本發(fā)明的另 一 個方法涉及人類和動物飲食中經(jīng)常降低的植物蛋白水平以 及，在某些情況下，涉及低下的蛋白質(zhì)可消化性和不平衡的氨基酸組成。事 實上，含有所述羽扇豆屬蛋白質(zhì)的粗制備物不但含有主要的球蛋白(所述本 發(fā)明的目的的羽扇豆屬蛋白質(zhì))，還含有蛋白質(zhì)提取中所用的植物材料中天 然存在的多種白蛋白。因此，這些所述羽扇豆屬蛋白質(zhì)的粗制備物尤其富含 蛋白質(zhì)，可以在豆腐(用鈣和鎂沉淀球蛋白后)或乳清干酪(熱沉淀白蛋白 后)等動物或人類營養(yǎng)中用作蛋白質(zhì)補充劑。
所述羽扇豆屬蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析及其對所有被測蛋白酶(包括胰 蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K和鏈霉蛋白酶)的分 析結果，提示該蛋白質(zhì)對動物具有較高的營養(yǎng)價值。但是，本發(fā)明中考慮的 蛋白質(zhì)是球蛋白。由于這個原因，該羽扇豆屬蛋白質(zhì)在水和稀鹽溶液中不溶， 但易溶于高離子強度的溶液。但是，豆類球蛋白僅在鈣、鎂和其它堿土金屬 陽離子存在下不可溶(Ferreira et al., 1999)。這些二價陽離子在中性pH值帶
正電，在帶負電的球蛋白分子之間充當靜電橋，促進或者誘使它們自聚集成
復合物，這些復合物是如此巨大，以至于不可溶解(Ferreira等，1999; Ferreira 等，2003)。例如，豆腐，是一種類似于乳酪或松軟干酪(cottage cheese)的 凝結物，它是通過向經(jīng)過加熱的大豆提取物中加入鈣和鎂離子而制備的。這 兩種陽離子均是在豆腐的制備中常規(guī)使用的，并且可以Nigari 的形式商購。 這樣，在羽扇豆屬球蛋白濃縮物的制備中，在使用鈣和/或鎂將它們沉淀后， 可以使用同時含有球蛋白和白蛋白的所述羽扇豆屬蛋白粗制備物。例如，圖 7顯示了所述羽扇豆屬蛋白(B)的沉淀特征曲線，作為所加的鈣和鎂濃度的 函數(shù)。為了比較的目的，還給出了它的前體蛋白——(3-羽扇豆球蛋白(羽扇 豆屬種子中存在的主要貯藏蛋白；O)的沉淀曲線。對于所得乳清(serum) 中保留的白蛋白，也利用例如熱沉淀，通過與乳清干酪制備中所用的類似的 工藝(對乳酪制備中去除酪蛋白后對保留在乳清中的乳白蛋白進行熱沉淀) 來加以回收。這樣，含有所述羽扇豆屬蛋白質(zhì)的制備物可以用作人類或動物 飲食中的蛋白質(zhì)補充劑。
為了理解本發(fā)明的潛力，下面是數(shù)個實施例。但是，在利用所述來自羽 扇豆屬的蛋白質(zhì)作為控制真菌和卯菌劑、作為殺蟲劑、作為生長促進劑、作 為肥料或作為人類或動物飲食中的蛋白質(zhì)補充劑的過程中，可以使用其它方 法學。在此意義上，這些實施例不是限制性的。
實施例
實施例1和2-向感染了真菌葡萄白粉病菌(葡萄白粉病的致病媒介)的 葡萄藤葉表面上噴灑所述來自羽扇豆屬的蛋白質(zhì)的效果
向葡萄藤葉表面噴灑含有200 mg純蛋白/ml的溶液之后，評估所述來自 羽扇豆屬的蛋白質(zhì)的抗真菌活性。作為對照，在同樣條件下對相似的葉噴灑 水。所得結果示于圖l中，其顯示，噴灑該蛋白質(zhì)兩個月后，葡萄藤葉保持 健康，沒有真菌存在的跡象，即使被噴灑的葡萄藤葉一直且長期保持與重度 感染的葉密切接觸。
另 一試驗根據(jù)相同的方法學進行，但是對接受處理的葡萄藤葉表面的觀 察是使用金相顯微鏡(圖3)。
實施例3-所述來自羽扇豆屬的蛋白質(zhì)對來自葡萄白粉病菌的孢子的萌發(fā)
和發(fā)育的影響
將來自真菌葡萄白粉病菌的孢子從感染的葡萄藤葉表面移出，并接種在
0,6% (w/v)的水瓊脂中，其中該水瓊脂每ml含有200 mg來自羽扇豆屬的純 蛋白，或者每ml含有200mg來自成熟葡萄的總蛋白級分(含PR蛋白)。 在24和48小時內(nèi)，通過使用相差透鏡系統(tǒng)的光學顯微術對芽管的孢子萌 發(fā)和發(fā)育進行跟蹤監(jiān)測。所得的結果示于圖2，其顯示，在含有所述來自羽 扇豆屬的蛋白質(zhì)的基質(zhì)的存在下，不但萌發(fā)孢子的數(shù)目發(fā)生了顯著的減少， 芽管的長度也明顯降低。與存在PR蛋白質(zhì)時觀察到的結果相比，該影響是 顯著的。
實施例4-所述來自羽扇豆屬的蛋白質(zhì)對于來自葡萄擬莖點霉(Phomopsis viticola)(葡萄藤excoriosis的致病媒介)的孢子的萌發(fā)和發(fā)育的影響
將來自真菌葡萄擬莖點霉的孢子接種在PDA (馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng) 基中。15分鐘后，移出孢子，并與含所述來自羽扇豆屬的蛋白質(zhì)的溶液混 合，終體積為25 ml。將這些小滴置于培養(yǎng)皿中，上面覆以蓋玻片，然后密 封，形成濕盒。通過光學顯微鏡觀察對孢子發(fā)育進行跟蹤監(jiān)測。明顯可見， 孢子萌發(fā)受到了清楚的抑制。發(fā)育24h后菌絲分解。
實施例5-所述來自羽扇豆屬的重組蛋白對來自真菌葡萄白粉病菌的孢子 萌發(fā)的影響
對在細菌中表達的來自羽扇豆屬的重組蛋白純化后，測試其抗真菌活性。 這些測定按照前面實施例2和3所述進行。所得的結果如圖4所示，顯示該 重組蛋白表現(xiàn)與從羽扇豆屬植物提取的所述蛋白觀察到的相同的抗真菌性 質(zhì)。在所述來自羽扇豆屬的重組蛋白的存在下溫育48 h后，觀察到孢子細 胞壁的破壞。
實施例6-所述來自羽扇豆屬的重組蛋白對來自卵菌葡萄霜霉(Plasmopara viticola)(霜霉病的致病媒介)的孢子萌發(fā)的影響。
將來自卵菌葡萄霜霉的孢子從葡萄藤的感染葉表面移出，并置于0.6% (w/v)水瓊脂中，其中該水瓊脂每ml含有200 mg來自羽扇豆屬的重組純蛋 白。在48 h內(nèi)通過光學顯微鏡觀察跟蹤監(jiān)測孢子萌發(fā)。使用水瓊脂中的孢 子萌發(fā)作為對照。24h后，孢子細胞壁被破壞，伴隨著細胞內(nèi)容物的釋放。
實施例7-噴灑所述從羽扇豆屬提取的蛋白質(zhì)對玫瑰植林的影響 用含有200嗎蛋白質(zhì)/ml的羽扇豆屬粗提取物噴灑玫瑰植林葉表面之后，
對所述羽扇豆屬蛋白的生物刺激活性進行評估。作為對照，用水噴灑處于相 同發(fā)育階段并在相同環(huán)境條件下溫育的玫瑰植林。所得結果(照片攝于噴灑
后3周)示于圖5，顯示用所述羽扇豆屬蛋白噴灑的植抹生長更好，明顯可 見最先的花蕾提前出現(xiàn)。
實施例8-噴灑所述從羽扇豆屬提取的蛋白質(zhì)對苗圃西瓜植抹的影響 用含200昭蛋白質(zhì)/ml的羽扇豆屬粗提取物噴灑六周齡苗圃西瓜植株葉 表面之后，對所述羽扇豆屬蛋白質(zhì)的生物刺激劑活性進行了評估。測定在溫 室條件下進行，用水(對照；A)、含100 [ig蛋白質(zhì)/ml的羽扇豆屬粗提取 物(B)、 一種市場上可商購的植物生長促進劑(制造商推薦的濃度)(C); 和含200 i!g蛋白質(zhì)/ml的羽扇豆屬粗提取物(D)噴灑植抹。每次測定使用 24林植抹。在接下來的兩周中對測定進行跟蹤監(jiān)測，所得的結果示于圖6。
嗎蛋白質(zhì)/ml; D)的所述羽扇豆屬蛋白質(zhì)噴灑的植株顯示最大程度的發(fā)育 和更好的葉生長。用最低濃度的所迷羽扇豆屬蛋白(100嗎蛋白質(zhì)/ml; B) 噴灑的植抹表現(xiàn)的發(fā)育水平較低，但仍高于僅噴灑水的植株觀察到的發(fā)育水 平。因此，推薦的施用水平是以含200 jig蛋白質(zhì)/ml的所述羽扇豆屬粗制 備物噴灑4直才朱。
實施例9-用所述從羽扇豆屬提取的蛋白質(zhì)噴灑感染了葡萄白粉病菌(白 粉病——世界范圍內(nèi)經(jīng)濟上最重要的葡萄藤疾病——的真菌致病媒介)的葡 萄藤植林的作用
制備了每ml含有200昭所述羽扇豆屬蛋白質(zhì)的羽扇豆屬粗制備物。將 感染了葡萄白粉病菌的葡萄藤植林保持在溫室條件下，并對其噴灑所述提取 物或水(對照)。施用24小時后，觀察凈皮噴灑的植4朱一相對于對照，噴灑 了所述羽扇豆屬蛋白質(zhì)的植林表現(xiàn)更高的活力，并出現(xiàn)新枝條。這種狀態(tài)維 持了至少一周，在這之后，這些先前由于真菌的存在而被弱化的植抹枝繁葉 茂，長出了許多新葉，并沒有任何該疾病的癥狀。
實施例10-制備豆腐型羽扇豆屬蛋白濃縮物所需的最優(yōu)鈣和鎂濃度的確
定
用5 mM 4丐+鎂沉淀所述羽扇豆屬蛋白質(zhì)粗制備物中的球蛋白后制得的羽
扇豆屬蛋白質(zhì)濃縮物(見圖7)具有很高的營養(yǎng)潛力，突出表現(xiàn)為所述羽扇 豆屬蛋白的比例均勻的氨基酸組成及其優(yōu)良的可消化性(在人消化道蛋白酶 的作用下，該蛋白質(zhì)被容易地消化為其組成氨基酸)。
參考文獻
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權利要求
1.一種從羽扇豆屬植物中提取的蛋白質(zhì)，其特征在于 (a)(B)中所示的氨基酸殘基序列； 5′RRQRNPYHFS SQRFQTLYKN RNGKIRVLER FDQRTNRLEN LQNYRIVEFQ SKPNTLILPK HSDADYVLVV LNGRATITIV NPDRRQAYNL EYGDALRIPA GSTSYILNPD DNQKLRVVKL AIPINNPGYF YDFYPSSTKD QQSYFSGFSR NTLEATFNTR YEEIQRIILG NED 3′ (b)(B)中所示的氨基酸殘基序列，其中一個或多個氨基酸殘基缺失、已被取代、添加或修飾，且該蛋白質(zhì)表現(xiàn)抗真菌和抗卵菌活性、植物生長促進劑活性和/或維持其生物學性質(zhì)。
2. 權利要求1的從羽扇豆屬植物中提取的蛋白質(zhì)，其特征在于其是糖基 化、磷酸化、烷基化和/或異戊二烯化的。
3. —種編碼權利要求1的蛋白質(zhì)的DNA片段，其特征在于 (a) (A)中所示的核苷酸序列；(A)CTCTTTACAAAAATAGGAATGGCAAAATCCGTG AACTACCGCATTGTTGAGTTCCAATCAAAACCT GTACTCAATGGTAGAGCCACAATCACGATAGT TCAGAATCCCAGCTGGCTCAACTTCATATATC ACCCATCAACAATCCTGGCTACTTTTATGATTTCAGGAACACTTTAGAGGCCACCTTCAATACTC(b)(A)中所示的核苷酸序列，其中一個或多個核苷酸缺失，已被取代、添加或修飾，并且編碼具有抗真菌和抗卵菌活性、植物生長促進劑活性，和/ 或維持其生物學性質(zhì)的蛋白質(zhì)。
4. 一種重組載體，其特征在于其含有權利要求3的DNA片段。
5. —種轉化細胞，其特征在于其是用權利要求4的重組載體轉化的。
6. 根據(jù)權利要求5轉化的細胞，其特征在于其源自大腸桿菌。
7. 根據(jù)權利要求5轉化的細胞，其特征在于其源自植物、動物或微生物。
8. —種轉基因植物，其特征在于其含有權利要求5的轉化細胞并且表現(xiàn) 針對病原性真菌、卵菌或昆蟲所致疫病的抗性，它是通過所述轉化細胞的再 生而獲得的。
9. 一種產(chǎn)生權利要求1的蛋白質(zhì)的方法，其特征是包括培養(yǎng)權利要求5、 6、 7的轉化細胞，以及從細胞培養(yǎng)物或細胞提耳又物中回收具有抗真菌活性 的蛋白質(zhì)。
10. —種蛋白質(zhì)制劑或粗制備物，其特征是包括權利要求1或2的蛋白 質(zhì)或者根據(jù)權利要求9獲得的它的重組形式作為活性成分。
11. 權利要求10的蛋白質(zhì)制劑或粗制備物，其特征是用于預防、控制或 對抗病原性或非病原性真菌和卵菌、昆蟲所致的疫病，作為植物生長促進劑 和肥料。
12. 權利要求1或2的蛋白質(zhì)或者根據(jù)權利要求9獲得的它的重組形式 在制備制劑中的用途，其特征是以預防、控制或?qū)共≡曰蚍遣≡哉婢?和卵菌、昆蟲，作為植物生長促進劑和肥料為目的。
13. 權利要求1或2的蛋白質(zhì)或者根據(jù)權利要求9獲得的它的重組形式 用于預防、控制或?qū)共≡曰蚍遣≡哉婢吐丫?、昆蟲所致的疫病，用 作植物生長促進劑和肥料的用途，其特征是通過向植物施用全部或部分羽扇 豆屬提取物，所述提取物含有權利要求1或2的蛋白質(zhì)或者根據(jù)權利要求9 獲得的它的重組形式。
14. 根據(jù)權利要求1或2的蛋白質(zhì)、或根據(jù)權利要求9獲得的它的重組 形式、或含有它的粗制備物的用途，其特征是作為生物刺激劑或植物生長發(fā) 育的促進劑來施用，在對天然被弱化或感染了病原媒介的植林的葉進行噴灑 后尤其可觀察到這種生物刺激劑活性。
15.根據(jù)權利要求1或2的蛋白質(zhì)、或根據(jù)權利要求9獲得的它的重組形式、或含有它的粗制備物的用途，其特征是供人類或動物營養(yǎng)的高營養(yǎng)價 值蛋白質(zhì)濃縮物的制備中應用，在用鈣鹽和鎂鹽沉淀球蛋白之后'或者有或 沒有物理處理，例如加熱沉淀白蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及從羽扇豆屬的種子、子葉或小植株提取蛋白質(zhì)，還涉及以重組形式表達該蛋白質(zhì)，以及在遺傳修飾植物中表達該蛋白質(zhì)的方式。該蛋白質(zhì)表現(xiàn)下述不尋常的特性(1)強的抗真菌和抗卵菌活性，使其具有作為殺真菌劑的巨大潛力；(2)強的植物生長促進劑活性，對非健康或天然弱化的植物尤為顯著；(3)對變性的極端抗性，使其可用于田間條件；(4)對蛋白酶解的極高敏感性，使其對環(huán)境無害，并對人類和動物無毒；和(5)比例均勻的氨基酸組成。并要求所述蛋白質(zhì)、或保持所述蛋白質(zhì)生物活性的任一修飾形式，或者通過在遺傳修飾生物中表達的形式，作為人或動物飲食中的補充劑、和殺真菌劑、殺蟲劑、植物生產(chǎn)促進劑或肥料的用途。
文檔編號C12N15/82GK101365793SQ200680034618
公開日2009年2月11日 申請日期2006年7月13日 優(yōu)先權日2005年7月21日
發(fā)明者維爾吉利奧·博爾熱斯·洛雷羅, 薩拉·亞歷山德拉·瓦拉達斯·達席爾瓦·蒙泰羅, 里卡多·曼努埃爾·德·賽沙斯·博阿維達·費雷拉, 阿圖爾·理查多·納西門托·特謝拉 申請人:農(nóng)學高等教育學院;里卡多·曼努埃爾·德·賽沙斯·博阿維達·費雷拉;薩拉·亞歷山德拉·瓦拉達斯·達席爾瓦·蒙泰羅;維爾吉利奧·博爾熱斯·洛雷羅;阿圖爾·理查多·納西門托·特謝拉