專利名稱：血清中肌酸激酶同工酶的化學(xué)發(fā)光測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)用試劑檢測方法，特別涉及血清中肌酸激酶同工酶的化學(xué)發(fā)光測定方法。
背景技術(shù)：
利用現(xiàn)代生物技術(shù)所開發(fā)的超微量測定方法，極大的推動了生物和醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的各項(xiàng)臨床和科研工作的快速發(fā)展，為人類的科學(xué)事業(yè)和社會進(jìn)步作出了非凡的貢獻(xiàn)。
上世紀(jì)七十年代由Arakawa首先發(fā)表了應(yīng)用魯米諾——過氧化物酶的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行酶免分析的技術(shù)，這一技術(shù)由于靈敏度高達(dá)10-18mol，可在20分鐘內(nèi)快速測定出結(jié)果，可簡便實(shí)現(xiàn)完全自動化，有效期長達(dá)一年以上，無放射性和致畸物質(zhì)，利于環(huán)保而受到普遍歡迎，是目前發(fā)展最迅速的檢測技術(shù)。
目前，化學(xué)發(fā)光技術(shù)在免疫分析中已得到相當(dāng)普及的程度，已發(fā)展為能檢測多種生物活性物質(zhì)的常規(guī)監(jiān)床檢測方法，從免疫反應(yīng)方式分，該方法有兩種基本類型，即化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)和免疫化學(xué)發(fā)光分析(ICMA)；從發(fā)光方式上看，一是將發(fā)光物質(zhì)直接標(biāo)記到抗體或抗原上，免疫反應(yīng)后，在起動劑的作用下而發(fā)光，另一種是用酶標(biāo)記抗體或抗原，免疫反應(yīng)后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在酶催作用下而發(fā)光。
該方法雖有突出的優(yōu)點(diǎn)，但目前僅限于免疫分析，而在生化分析中還是空白。
肌酸激酶同工酶(CK-MB)主要存在于心肌中，檢測CK-MB活力對急性心肌梗塞、甲狀腺功能低下、骨骼肌損傷和休克具有重要價值。
現(xiàn)在普遍使用的測定血清中CK-MB的方法為比色法，先進(jìn)行電泳或離子交換層析等分離，再進(jìn)行酶促顯色測定。該法是利用CK催化磷酸肌酸(CrP)與二磷酸腺苷(ADP)反應(yīng)生成三磷酸腺苷(ATP)與肌酸(Cr)，己糖激酶(HK)催化葡萄糖與ATP反應(yīng)，形成葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化葡萄糖-6-磷酸氧化，形成6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯及NADPH，NADPH生成的速率代表CK-MB活力。該法的不足之處主要有1、線性范圍窄。由于檢測光吸收，其分辨率不像化學(xué)發(fā)光那么敏感，線性范圍不能完全滿足臨床檢測的需要，對高濃度的樣品需要經(jīng)稀釋后測定，帶來一定不便。
2、靈敏度不如化學(xué)發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光是測定光信號，靈敏度要比測光吸收高出許多。
3、試劑成份復(fù)雜，操作煩瑣，容易造成誤差，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是一種提供能克服上述缺陷、且靈敏度高、線性范圍寬、方便、安全的血清中肌酸激酶同工酶的化學(xué)發(fā)光測定方法。解決該技術(shù)問題采用的主要技術(shù)方案血清中肌酸激酶同工酶的化學(xué)發(fā)光測定方法，其特征在于在CK-M單體抗體存在下，標(biāo)本中的全部CK-MM和50％CK-MB活性被抑制，而CK-MB中的B亞基活性不受影響，將CK-B活性測定值乘以2即得CK-MB活性；利用CK催化磷酸肌酸(CrP)與二磷酸腺苷(ADP)反應(yīng)生成三磷酸腺苷(ATP)與肌酸(Cr)；再用甘油激酶(GK)催化三磷酸腺苷(ATP)及甘油生成3-磷酸甘油(G-3-P)；3-磷酸甘油(G-3-P)被磷酸甘油氧化酶(GPO)氧化，并產(chǎn)生過氧化氫；再經(jīng)過氧化物酶作用，過氧化氫使化學(xué)發(fā)光物氧化而發(fā)光；光信號的大小與肌酸激酶的濃度呈正相關(guān)，即肌酸激酶濃度越大發(fā)出的光信號越強(qiáng)；記錄這種光信號即可推測肌酸激酶的濃度；用已知濃度的肌酸激酶與測出的光信號，作出劑量-反應(yīng)曲線；未知樣品的肌酸激酶含量可從該曲線推算出來；所述的化學(xué)發(fā)光物為魯米諾。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)用化學(xué)發(fā)光物代替顯色物，達(dá)到更靈敏、更穩(wěn)定、范圍寬、更安全的目的。用該方法可以制備相應(yīng)的定量測定血清中肌酸激酶的商品試劑盒。具體優(yōu)點(diǎn)是①靈敏度更高。傳統(tǒng)方法是檢測顏色深淺，而化學(xué)發(fā)光是測光信號，可一個一個光子計(jì)數(shù)，所測的最低限更小，因而靈敏度更高。②線性范圍寬。測顏色的深淺的分辨率比光子計(jì)數(shù)的精度要低得多，化學(xué)發(fā)光的檢測范圍高達(dá)105。③安全適用?；瘜W(xué)發(fā)光物如魯米諾等很安全，整個檢測過程無有害物出現(xiàn)，無論是檢測或處理廢物都很安全，有利于環(huán)境保護(hù)。④便于普及。本發(fā)明所制備的試劑盒，可用于全自動測量，也可用于手工或半自動測量，適宜大、中、小各層次的醫(yī)療和研究機(jī)構(gòu)使用。⑤巨大的社會效益。用化學(xué)發(fā)光法測定生化指標(biāo)或免疫物質(zhì)，可同用一臺化學(xué)發(fā)光儀，不再需要進(jìn)口昂貴的生化儀，節(jié)省大量資金，不只降低了成本，對醫(yī)療機(jī)構(gòu)、患者及社會均大有益處。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)舉例說明本發(fā)明的實(shí)施例。血清中肌酸激酶同工酶的化學(xué)發(fā)光測定方法，其特征在于在CK-M單體抗體存在下，標(biāo)本中的全部CK-MM和50％CK-MB活性被抑制，而CK-MB中的B亞基活性不受影響，將CK-B活性測定值乘以2即得CK-MB活性；利用CK催化磷酸肌酸(CrP)與二磷酸腺苷(ADP)反應(yīng)生成三磷酸腺苷(ATP)與肌酸(Cr)；再用甘油激酶(GK)催化三磷酸腺苷(ATP)及甘油生成3-磷酸甘油(G-3-P)；3-磷酸甘油(G-3-P)被磷酸甘油氧化酶(GPO)氧化，并產(chǎn)生過氧化氫；再經(jīng)過氧化物酶作用，過氧化氫使化學(xué)發(fā)光物氧化而發(fā)光；光信號的大小與肌酸激酶的濃度呈正相關(guān)，即肌酸激酶濃度越大發(fā)出的光信號越強(qiáng)；記錄這種光信號即可推測肌酸激酶的濃度；用已知濃度的肌酸激酶與測出的光信號，作出劑量-反應(yīng)曲線；未知樣品的肌酸激酶含量可從該曲線推算出來；所述的化學(xué)發(fā)光物為魯米諾；這便是本發(fā)明的血清中肌酸激酶同工酶的化學(xué)發(fā)光測定方法。
本發(fā)明的反應(yīng)原理用式子表示如下
一、試劑包括混合酶液(含抗-CK-M)；肌酸激酶(或替代品)標(biāo)準(zhǔn)單一或系列濃度；底物液二、測定程序，按下表進(jìn)行，加樣單位為μl。


三、用適當(dāng)方法處理作出劑量-反應(yīng)曲線，根據(jù)樣品的RLU值從該曲線求出其血清中肌酸激酶的濃度。或直接由公式求出CK-MB濃度＝(樣品RLU/標(biāo)準(zhǔn)RLU)×標(biāo)準(zhǔn)濃度×2四、也可用雙試劑測定。
本發(fā)明的靈敏度更高因?yàn)閭鹘y(tǒng)方法是檢測顏色深淺，而本發(fā)明是測光信號，可一個一個光子計(jì)數(shù)，所測的最低限更小，因而靈敏度更高。線性范圍寬這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)的測顏色的深淺的分辨率比光子計(jì)數(shù)的精度要低得多，本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光檢測范圍高達(dá)105。安全適用本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光物如魯米諾等很安全，整個檢測過程無有害物出現(xiàn)，無論是檢測或處理廢物都很安全，有利于環(huán)境保護(hù)。便于普及本發(fā)明所制備的試劑盒，可用于全自動測量，也可用于手工或半自動測量，適宜大、中、小各層次的醫(yī)療和研究機(jī)構(gòu)使用。社會效益巨大用本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光測定方法測定生化指標(biāo)或免疫物質(zhì)，可同用一臺化學(xué)發(fā)光儀，不再需要進(jìn)口昂貴的生化儀，節(jié)省大量資金，不只降低了成本，對醫(yī)療機(jī)構(gòu)、患者及社會均大有益處。本發(fā)明方法簡單，適于大、中、小醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.血清中肌酸激酶同工酶的化學(xué)發(fā)光測定方法，其特征在于在CK-M單體抗體存在下，標(biāo)本中的全部CK-MM和50％CK-MB活性被抑制，而CK-MB中的B亞基活性不受影響，將CK-B活性測定值乘以2即得CK-MB活性；利用CK催化磷酸肌酸(CrP)與二磷酸腺苷(ADP)反應(yīng)生成三磷酸腺苷(ATP)與肌酸(Cr)；再用甘油激酶(GK)催化三磷酸腺苷(ATP)及甘油生成3-磷酸甘油(G-3-P)；3-磷酸甘油(G-3-P)被磷酸甘油氧化酶(GPO)氧化，并產(chǎn)生過氧化氫；再經(jīng)過氧化物酶作用，過氧化氫使化學(xué)發(fā)光物氧化而發(fā)光；光信號的大小與肌酸激酶的濃度呈正相關(guān)，即肌酸激酶濃度越大發(fā)出的光信號越強(qiáng)；記錄這種光信號即可推測肌酸激酶的濃度；用已知濃度的肌酸激酶與測出的光信號，作出劑量-反應(yīng)曲線；未知樣品的肌酸激酶含量可從該曲線推算出來。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清中肌酸激酶同工酶的化學(xué)發(fā)光測定方法，其特征在于所述的化學(xué)發(fā)光物為魯米諾。
全文摘要
本發(fā)明血清中肌酸激酶同工酶的化學(xué)發(fā)光測定方法，涉及一種在生化分析中醫(yī)用試劑的化學(xué)發(fā)光測定方法?，F(xiàn)有的方法檢測范圍窄、靈敏度低等技術(shù)問題。解決該技術(shù)問題的主要技術(shù)方案其特征在于在CK－M單體抗體存在下，全部CK－MM和50％CK－MB活性被抑制；利用CK催化磷酸肌酸與二磷酸腺苷反應(yīng)生成三磷酸腺苷與肌酸；三磷酸腺苷及甘油經(jīng)催化生成3－磷酸甘油；后者酶氧化，產(chǎn)生的過氧化氫經(jīng)過氧化物酶作用，使化學(xué)發(fā)光物氧化而發(fā)光；肌酸激酶濃度越大發(fā)出的光信號越強(qiáng)；用已知濃度的肌酸激酶與測出的光信號，作出劑量－反應(yīng)曲線；未知樣品的肌酸激酶含量可從該曲線推算出來。它靈敏度更高、線性范圍寬，適于各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/50GK1908628SQ20061011499
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月10日
發(fā)明者王京, 高淑舫 申請人:福建省洪誠生物藥業(yè)有限公司