專利名稱：大氣壓冷等離子體誘變微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物誘變技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及利用大氣壓冷等離子體誘變微生物的方法。
背景技術(shù)：
微生物育種對微生物工業(yè)的發(fā)展起了極為重要的推動作用。大量研究和生產(chǎn)實踐表明，誘變育種可克服常規(guī)育種周期長、進程慢、難以獲得突變性變異品種的缺點，可在創(chuàng)造微生物新菌種、新材料和解決育種工作中某些特殊問題取得突破和快速發(fā)展。微生物育種所取得的成就，將導(dǎo)致微生物工業(yè)發(fā)展的飛躍。
到目前為止，微生物育種仍是以使用化學(xué)誘變、物理誘變或兩者復(fù)合誘變的誘變育種作為最主要的方法?；瘜W(xué)誘變劑，如羥胺、亞硝基胍、吖啶類、亞硝酸等，這些誘變劑優(yōu)點在于具有專一性，對基因的某部位發(fā)生作用，對其余部位則無影響。但是絕大部分化學(xué)誘變劑都具有毒性，其中90％以上是致癌物質(zhì)或極毒藥品，對人體及環(huán)境均有危害，使用時須謹(jǐn)慎。物理誘變通常使用輻射誘變技術(shù)，如激光誘變技術(shù)、Co60誘變技術(shù)、太空誘變技術(shù)以及近年興起的離子注入誘變技術(shù)等，激光誘變的后代變異少、效果差；Co60誘變的后代變異大、但可操作性差，后代難以穩(wěn)定；太空誘變的后代變異類型多，但成本高，處理的品種類型和數(shù)量受嚴(yán)重限制；離子注入誘變最早用于農(nóng)業(yè)育種，目前在微生物育種上也取得一定進展，但它要求處理樣品必須是干燥的，水分起到能量反射和屏蔽作用，影響離子注入的誘變效果，不利于誘變。此外，離子注入的靶室要求一定的真空度，這些都制約了離子注入在工業(yè)微生物育種上的應(yīng)用。專利(CN 1478892A)報道用等離子體環(huán)境改性微生物，但該專利中使用的是真空高壓放電等離子體，處理對象只針對酵母菌，而且處理時間較長，數(shù)小時至數(shù)百小時。
等離子體是由大量相互作用的但仍處于非束縛狀態(tài)下的帶電粒子組成的宏觀體系，是和固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)處于同一層次的物質(zhì)第四態(tài)，自然界的物質(zhì)主要以這些狀態(tài)出現(xiàn)。這里的等離子體主要是指大氣壓冷等離子體，它是一種低溫非平衡等離子體，由于它可以在大氣壓或高于大氣壓的條件下產(chǎn)生，不需要真空設(shè)備就能在較低的溫度下獲得化學(xué)反應(yīng)所需的活性粒子，具有特殊的光、熱、聲、電等物理過程及化學(xué)過程，已經(jīng)在臭氧合成、紫外光源、高功率CO2激光器等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用。目前國內(nèi)外的很多研究表明，等離子體滅菌技術(shù)是很好的物理滅菌方法，它具有快速、低溫、操作簡便、無毒性以及殺滅效果好等優(yōu)點。而把大氣壓冷等離子體應(yīng)用于菌種的選育方面，則未見專利和文獻(xiàn)報道。據(jù)文獻(xiàn)報道，大氣壓介質(zhì)阻擋放電過程是一種物理和化學(xué)相結(jié)合的過程，物理過程主要可產(chǎn)生紫外射線，化學(xué)過程可產(chǎn)生新物質(zhì)，如O3，N2O4，H2O2，HNO3，HNO2和HO2NO2，屬于一種復(fù)合型的誘變劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種有效的微生物誘變育種技術(shù)。解決了傳統(tǒng)的物理誘變和化學(xué)誘變過程中，設(shè)備造價高、污染環(huán)境、損害人體健康，誘變效率低、誘變周期長、成本高等問題，可望為工業(yè)微生物育種提供一種可行高效的微生物誘變新技術(shù)。
本發(fā)明提供了一種有效的微生物誘變育種的新技術(shù)，首先采用大氣壓冷等離子體誘變微生物，可誘變菌懸液也可誘變固體平板上的菌細(xì)胞，然后將誘變過的菌懸液搖瓶培養(yǎng)后接到篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，最后挑取單一菌落搖瓶培養(yǎng)，或直接將誘變平板上的菌細(xì)胞培養(yǎng)后，挑取單一菌落搖瓶培養(yǎng)，檢測代謝產(chǎn)物的濃度。
實現(xiàn)本發(fā)明方法的步驟如下1、細(xì)胞培養(yǎng)1)培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基中必須具備微生物生長所需的營養(yǎng)成分，如葡萄糖或甘油等碳源，尿素、蛋白胨、銨鹽、酵母浸膏或酵母粉等氮源以及磷酸鹽(磷源)和硫酸鹽(硫源)等。另外還需要鈉、鉀、鎂、鈣等陽離子以及鋅、鐵、錳、銅、鈷、硼和鉬等微量元素，每種微量元素的含量大約在0.01mg/L～50mg/L的范圍內(nèi)。培養(yǎng)基須在115～121℃下滅菌15～20分鐘方能使用。
2)培養(yǎng)條件在搖瓶中進行，接種量為0.5～2％，搖床轉(zhuǎn)速為100～300r/min，溫度為27～40℃，培養(yǎng)時間為9～30h。
2、菌種預(yù)處理菌種以0.5～2％接種量接入種子培養(yǎng)液中，在27～40℃，100～300r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)至對數(shù)期，一是將菌液在無菌條件下8000～10000r/min，0～4℃，離心20～30min，沉淀用0.05M、pH 7.0的磷酸鉀緩沖液洗滌兩次后，再離心，將沉淀制成菌懸液，菌懸液中菌體干重為0.1～2g/L；二是將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液稀釋至10-4～10-6倍，取50～100μL均勻涂布于固體平板上。
3、菌種誘變用于誘變的等離子體是大氣壓介質(zhì)阻擋放電冷等離子體，電極介質(zhì)是石英玻璃，放電氣體采用空氣、氮氣或氦氣，外加電壓1～100kV，頻率0～15MHz，誘變時間從10s～10min，誘變對象是菌懸液或平板上的菌細(xì)胞。
4、菌種分離和篩選將誘變過的菌懸液搖瓶培養(yǎng)后，分別涂布于梯度篩選平板上避光培養(yǎng)；或直接將平板誘變菌避光培養(yǎng)，如克雷伯氏菌的篩選培養(yǎng)基分為甘油梯度(含甘油質(zhì)量比2％～10％)培養(yǎng)基，1，3-丙二醇梯度(含1，3-PD質(zhì)量比4％～9％)培養(yǎng)基，以及顯色培養(yǎng)基(含剛果紅質(zhì)量比1％～3％)；釀酒酵母的篩選培養(yǎng)基分為葡萄糖梯度(含葡萄糖質(zhì)量比3％～30％)培養(yǎng)基和乙醇梯度(乙醇體積比10％～18％)培養(yǎng)基。
5、搖瓶培養(yǎng)和產(chǎn)物測定挑選耐受高濃度底物和產(chǎn)物的單菌落進行搖瓶培養(yǎng)，氣相色譜或液相色譜檢測產(chǎn)物濃度。
本發(fā)明方法的優(yōu)點和益處在于充分發(fā)揮了大氣壓冷等離子體在放電過程中的物理及化學(xué)效應(yīng)，通過復(fù)合誘變菌種，提高了誘變效率，縮短了誘變時間，并且實驗操作簡單、安全、無污染，實驗成本低，為工業(yè)微生物的誘變育種奠定了基礎(chǔ)。
具體實施例方式
以下結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實施例。
原核微生物以克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)為實驗材料，真核微生物以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)為實驗材料。
實施例一菌懸液誘變克雷伯氏菌1)實驗菌種為克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，是一種兼性厭氧菌。購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，菌種保藏號是1.1736。
培養(yǎng)基成分如下(1L)甘油20g K2HPO4·3H2O4.454gKH2PO41.3g (NH4)2SO42.0gMgSO4·7H2O0.2g酵母粉1.0g
CaCO32.0g 微量元素2mL2％CaCl2溶液1mL 0.5％FeSO4溶液1mL微量元素組成(1L)飽和鹽酸0.9mL ZnCl270mgMnCl2·4H2O100mgH3BO360mgCoCl2·6H2O200mgNiCl2·6H2O25mgNaMoO4·2H2O35mgCuCl2·2H2O20mg2)菌種預(yù)處理菌種以1％接種量接入種子培養(yǎng)液中，在37℃，150r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)至對數(shù)期，將菌液在無菌條件下8000r/min，0℃，離心30min，沉淀用0.05M、pH 7.0的磷酸鉀緩沖液洗滌兩次后，再離心，將沉淀制成菌懸液，菌懸液OD值為2.7。
3)菌種誘變大氣壓介質(zhì)阻擋放電冷等離子體兩個平板電極的距離為3mm，放電氣體采用空氣，外加電壓13kV，頻率7kHz，誘變時間30s～5min，每次處理的菌液量為3mL。
4)發(fā)酵過程將誘變的菌液分別接250mL的三角瓶中，裝液量為100mL，培養(yǎng)液含甘油2％，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，培養(yǎng)溫度為37℃，避光培養(yǎng)時間為12h。
經(jīng)梯度篩選培養(yǎng)基分離和篩選，搖瓶培養(yǎng)，氣相色譜檢測結(jié)果如下等離子體處2min時，誘變菌株1，3-丙二醇產(chǎn)量為7.241g/L，比對照菌株(5.426g/L)提高33.45％；誘變菌株1，3-丙二醇的摩爾轉(zhuǎn)化率較對照菌株提高31.83％。
實施例二平板誘變克雷伯氏菌
1)實驗菌種、發(fā)酵過程及培養(yǎng)基同實施例一。
2)菌種預(yù)處理將實施例一的高產(chǎn)菌株經(jīng)等離子體二次誘變4min后，以1％接種量接入種子培養(yǎng)液中，在37℃，150r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)至對數(shù)期，測其OD值為2.79，用0.05M、pH 7.0的磷酸鉀緩沖液稀釋菌液10-5倍后，取50μL菌懸液均勻涂布于含有8％甘油的固體培養(yǎng)基上，平板直徑為6cm。
3)菌種誘變大氣壓介質(zhì)阻擋放電冷等離子體兩個平板電極的距離為3mm，放電氣體采用空氣，外加電壓8kV，頻率6kHz，誘變時間30s～150s。
4)誘變菌的培養(yǎng)將經(jīng)第三次誘變的克雷伯氏菌避光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時間為24h。
5)發(fā)酵過程將平板中的單一菌落分別接入250mL的三角瓶中，裝液量為100mL，種子培養(yǎng)液含甘油8％，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時間為24h。
經(jīng)篩選和搖瓶培養(yǎng)，氣相色譜檢測結(jié)果如下等離子體處理時間在90s時，篩得一高產(chǎn)菌株，其1，3-丙二醇產(chǎn)量為26.36g/L，比未經(jīng)誘變的菌株(7.24g/L)高出2.6倍；誘變菌株1，3-丙二醇的摩爾轉(zhuǎn)化率較二次誘變菌株摩爾轉(zhuǎn)化率提高17.22％，較未經(jīng)誘變的菌株摩爾轉(zhuǎn)化率提高39.96％。
實施例三菌懸液誘變釀酒酵母1)實驗菌種為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，屬真菌類，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，菌種保藏號為CICC 1001。
培養(yǎng)基成分如下(1L)葡萄糖30g；蛋白胨3g；酵母粉3.85g2)菌種預(yù)處理菌種首先進行一次活化即在無菌操作下，將酵母菌接種于葡萄糖-蛋白胨-酵母粉斜面固體培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中28℃，培養(yǎng)24h；再進行二次活化即取活化一次的酵母菌一環(huán)接入250mL的三角燒瓶中，內(nèi)裝葡萄糖-蛋白胨-酵母粉液體培養(yǎng)基100mL，于28℃，150r/min培養(yǎng)24h；將菌液在無菌條件下8000r/min，0℃，離心30min，沉淀用0.05M、pH 7.0的磷酸鉀緩沖液洗滌兩次后，再離心，將沉淀制成菌懸液，其OD值為3.2。
3)菌種誘變將裝有菌液的容器放入等離子體發(fā)生裝置的腔室里，兩個平板電極的距離為3mm，放電介質(zhì)為空氣，放電電壓為1.3kV，頻率7000Hz，放電時間1～5min，處理樣品量為3mL。
4)發(fā)酵過程將誘變的菌液分別接入500mL的三角瓶中，裝液量為200mL，培養(yǎng)液含葡萄糖3％，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，溫度28℃，搖床培養(yǎng)24h。
經(jīng)梯度篩選培養(yǎng)基分離和篩選，搖瓶培養(yǎng)，氣相色譜檢測結(jié)果如下等離子體處理時間在3min時，誘變菌株乙醇含量為5.59g/L，比對照菌株(4.02g/L)提高39.05％；誘變菌株的乙醇摩爾轉(zhuǎn)化率較對照菌株提高16.63％。
權(quán)利要求
1.一種大氣壓冷等離子體誘變微生物的方法，包括細(xì)胞培養(yǎng)、菌種預(yù)處理和菌種誘變，其特征是用于菌種誘變的是冷等離子體。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種大氣壓冷等離子體誘變微生物的方法，其特征是菌種分離和篩選采用如下步聚(1)菌種分離和篩選將誘變過的菌懸液搖瓶培養(yǎng)后，分別涂布于梯度篩選平板上避光培養(yǎng)；或直接將平板誘變菌避光培養(yǎng)，如克雷伯氏菌的篩選培養(yǎng)基分為甘油梯度(含甘油質(zhì)量比2％～10％)培養(yǎng)基，1，3-丙二醇梯度(含1，3-PD質(zhì)量比4％～9％)培養(yǎng)基，以及顯色培養(yǎng)基(含剛果紅質(zhì)量比1％～3％)；釀酒酵母的篩選培養(yǎng)基分為葡萄糖梯度(含葡萄糖質(zhì)量比3％～30％)培養(yǎng)基和乙醇梯度(乙醇體積比10％～18％)培養(yǎng)基；(2)搖瓶培養(yǎng)和產(chǎn)物測定挑選耐受高濃度底物和產(chǎn)物的單菌落進行搖瓶培養(yǎng)，氣相色譜或液相色譜檢測產(chǎn)物濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種大氣壓冷等離子體誘變微生物的方法，其特征是誘變時間從10s～10min。
4.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種大氣壓冷等離子體誘變微生物的方法，其特征是誘變對象是菌懸液或平板上的菌細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大氣壓冷等離子體誘變微生物的方法，其特征是所述微生物是原核微生物或真核微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大氣壓冷等離子體誘變微生物的方法，其特征是大氣壓冷等離子體處理微生物菌懸液的濃度范圍是菌體干重0.1～2g/L.。
7.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種大氣壓冷等離子體誘變微生物的方法，其特征是用于菌種誘變的是大氣壓冷等離子體。
8.根據(jù)權(quán)利要求書7所述的大氣壓冷等離子體，其特征是大氣壓冷等離子體產(chǎn)生條件為放電氣體采用空氣、氮氣或氦氣，外加電壓1～100kV，頻率0～15MHz。
全文摘要
本發(fā)明大氣壓冷等離子體誘變微生物的方法屬于微生物誘變技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的特征在于將微生物菌種經(jīng)冷等離子體誘變，以改變菌種的性質(zhì)。所述微生物菌種是原核微生物或真核微生物，所述的大氣壓冷等離子體的放電介質(zhì)可以是空氣、氮氣、氦氣，放電時間10s～10min，外加電壓1～100kV，頻率0～15MHz，誘變的微生物可以是菌懸液，也可是固體平板上的菌細(xì)胞。本發(fā)明與其它的物理和化學(xué)誘變方法相比，大氣壓冷等離子體放電設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單、系統(tǒng)造價低，操作安全，誘變效果遠(yuǎn)較傳統(tǒng)的理化因子誘變效果好，在工業(yè)微生物育種中有較大的推廣價值。
文檔編號C12N13/00GK1888063SQ20061004721
公開日2007年1月3日 申請日期2006年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月14日
發(fā)明者修志龍, 董曉宇, 李爽, 侯英敏, 于紅, 張代佳, 任春生 申請人:大連理工大學(xué)