專利名稱：利用血管生成素樣4蛋白的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血管生成素樣4蛋白(ANGPTL4)。本發(fā)明涉及利用ANGPTL4及其激動(dòng)劑和拮抗劑的組合物和方法，其用于疾病或病癥的診斷和治療。
背景技術(shù)：
血管生成素樣4蛋白(ANGPTL4)是分泌蛋白的血管生成素家族的成員。血管生成素家族的保守區(qū)域包括螺旋區(qū)和C末端纖維蛋白原(FBN)樣結(jié)構(gòu)域。見例如，Kim et al.，Biochem.J.346603-610(2000)。該家族的其他成員包括血管生成素1，血管生成素2和血管生成素3。血管生成素1，血管生成素2和血管生成素3/血管生成素4結(jié)合Tie2受體。見例如，Davis et al.，Cell87，1161-1169(1996)；Maisonpierre et al.，Science 277，55-60(1997)；Valenzuela et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，1904-1909(1999)；和美國(guó)專利5,521,073；5,650,490；和，5,814,464。血管生成素1和4是Tie2受體的激動(dòng)劑，而血管生成素2和3是Tie受體的拮抗劑(以及可能的激動(dòng)劑)。見例如，F(xiàn)olkman & D’Amore，Cell，871153-1155(1996)；Suri et al.，Cell，871171-1180(1996)；Masionpierre et al.，Science 27755-60(1997)；和，Ward& Dumont，Seminars in Cell & Developmental Biology，1319-27(2002)。Tie2受體屬于內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體酪氨酸激酶家族，其也包括Tie1孤兒受體。該家族另一成員血管生成素-樣3蛋白結(jié)合整合素αvβ3.見例如，US專利申請(qǐng)20030215451和Camenisch et al.，J.Biol.Chem.，277(19)17281-17290(2002)。
ANGPTL4也已知為其他術(shù)語(yǔ)。例如，ANGPTL4也已知為肝纖維蛋白原/血管生成素-相關(guān)蛋白(HFARP)(Kim et al.，Biochem.J.346603-610(2000))，PPARγ血管生成素相關(guān)蛋白(PGAR)(Yoon，et al.，Mol.Cell Biol.，205343-5349(2000))，以及禁食誘導(dǎo)的脂肪因子(fasting induced adiposefactor)(FIAF)(Kerten et al.，J.Biol.Chem.，27528488-28493(2000))。
ANGPTL4的體外和體內(nèi)研究以及定性為治療劑和/或治療提供了有價(jià)值的鑒定和發(fā)現(xiàn)，所述治療劑和/或治療可用于預(yù)防，緩解或矯正與ANGPTL4活性和/或表達(dá)相關(guān)的疾病或功能不良。例如，組織培養(yǎng)研究和遺傳改造的小鼠已被證實(shí)是與人疾病相關(guān)的生物過程的功能性深入研究的無(wú)價(jià)的工具，所述疾病包括免疫學(xué)，癌癥疾病，神經(jīng)生物學(xué)，心血管生物學(xué)疾病，肥胖以及其他疾病。需要發(fā)現(xiàn)并理解ANGPTL4的許多生物學(xué)功能。本發(fā)明涉及這些內(nèi)容以及其他需要，基于以下公開顯而易見。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及血管生成素樣4蛋白(ANGPTL4)。本發(fā)明提供ANGPTL4或其亞序列或其激動(dòng)劑或拮抗劑的用途，用于治療以異常ANGPTL4表達(dá)或活性為特征和/或與ANGPTL4表達(dá)和/或活性有關(guān)的疾病或病癥。
提供通過ANGPTL4或其激動(dòng)劑或拮抗劑調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖的方法。一些實(shí)施方案中，所述方法包括誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖。例如，所述方法包括將有效量的ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑給藥肝細(xì)胞或前肝細(xì)胞(pre-hepatocyte)由此誘導(dǎo)增殖。一方面，所述給藥步驟包括給藥編碼ANGPTL4的核酸。可選或此外，可給藥有效量的誘導(dǎo)ANGPTL4在肝細(xì)胞或前肝細(xì)胞中的產(chǎn)生的藥劑來(lái)刺激增殖。ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑可通過給藥有效量的ANGPTL4或其激動(dòng)劑來(lái)治療肝的功能不良，疾病或損傷。一方面，ANGPTL4通過編碼ANGPTL4的核酸提供。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，ANGPTL4激動(dòng)劑是αVβ5受體的激動(dòng)劑。
也提供了抑制肝細(xì)胞增殖的方法。一些實(shí)施方案中，該方法包括將有效量包含ANGPTL4拮抗劑的組合物給予肝細(xì)胞或前肝細(xì)胞的群體。一方面，ANGPTL4拮抗劑是抑制ANGPTL4蛋白產(chǎn)生的藥劑，例如，反義或核酶分子。一方面，ANGPTL4拮抗劑是抗-ANGPTL4抗體。另一方面，ANGPTL4拮抗劑是抗-αVβ5拮抗劑抗體。一個(gè)實(shí)施方案中，ANGPTL4拮抗劑是ANGPTL4-SiRNA。ANGPTL4拮抗劑可用于通過將有效量的ANGPTL4治療劑給藥肝細(xì)胞來(lái)治療，例如，肝癌或不良肝肥大。
也提供了調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的細(xì)胞粘附的方法。一些實(shí)施方案中，所述方法包括通過將有效量的包含ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑的組合物給藥肝細(xì)胞的群體來(lái)誘導(dǎo)肝細(xì)胞的細(xì)胞粘附。其他實(shí)施方案中，所述方法包括通過將有效量包含ANGPTL4拮抗劑的組合物給藥肝細(xì)胞的群體抑制肝細(xì)胞的細(xì)胞粘附，由此抑制肝細(xì)胞的細(xì)胞粘附。
除了調(diào)節(jié)與脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)的肝細(xì)胞的增殖和細(xì)胞粘附，ANGPTL4調(diào)節(jié)血清甘油三酯和膽固醇水平，并刺激也與脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)的前脂肪細(xì)胞增殖。本發(fā)明提供調(diào)節(jié)脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡的多個(gè)方面的方法。例如，本發(fā)明的方法包括通過將有效量包含ANGPTL4或ANGPTL4拮抗劑的組合物給藥前脂肪細(xì)胞的群體來(lái)刺激前脂肪細(xì)胞的增殖，由此誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞的增殖。也提供了抑制前脂肪細(xì)胞增殖的方法。例如，所述方法包括將有效量包含ANGPTL4拮抗劑的組合物給予前脂肪細(xì)胞的群體。調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞遷移的方法也包括在內(nèi)。例如，本發(fā)明的方法包括通過將有效量的ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑給藥前脂肪細(xì)胞的群體來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。也提供了抑制前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞遷移的方法，包括例如將有效量ANGPTL4拮抗劑給藥前脂肪細(xì)胞的群體，由此抑制細(xì)胞遷移。
調(diào)節(jié)受試者中的甘油三酯或膽固醇的血清水平的方法也在本發(fā)明提供。例如，所述方法包括將有效量包含ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑的組合物給藥受試者，由此調(diào)節(jié)受試者中的甘油三酯和/或膽固醇的血清水平。一個(gè)實(shí)施方案中，給予ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑，導(dǎo)致與對(duì)照相比甘油三酯和/或膽固醇在受試者的血清中累積。另一個(gè)實(shí)施方案中，將有效量的ANGPTL4拮抗劑給藥受試者，由此降低甘油三酯，游離脂肪酸和/或膽固醇中的至少一種在受試者血清中的水平。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，對(duì)照是來(lái)自治療之前的受試者或沒有接受治療或接受減輕的(reduced)治療的受試者等的血清。
ANGPTL4和ANGPTL4調(diào)節(jié)劑(其激動(dòng)劑或拮抗劑)可用于通過將有效量的該分子給藥受試者來(lái)治療脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡疾病。見本文定義部分的“脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡疾病”。例如，包括將有效量包含ANGPTL4拮抗劑的組合物給藥受試者來(lái)治療高脂血癥的方法。
也提供了治療受試者的肥胖癥和/或降低總體重的方法。例如，這樣的方法，包括給予受試者有效量的ANGPTL4調(diào)節(jié)劑，由此治療受試者的肥胖癥和/或與沒有治療或利用對(duì)照治療相比降低總體重。一個(gè)實(shí)施方案中，受試者的脂肪過多(肥胖)得以減輕。以此種方式，可治療與肥胖癥有關(guān)的疾病，例如心血管疾病，糖尿病等。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞例如肝細(xì)胞，前脂肪細(xì)胞位于受試者中。通常，受試者是人。
本發(fā)明的ANGPTL4包括全長(zhǎng)蛋白以及生物活性分子，例如對(duì)應(yīng)人ANGPTL4的N末端，N末端螺旋區(qū)，C末端，C末端纖維蛋白原樣區(qū)的殘基，或ANGPTL4(1-183)，ANGPTL4(23-183)，ANGPTL4(1到約162)，ANGPTL4(約162-406)，ANGPTL4(23-406)，或ANGPTL4(184-406)氨基酸亞序列，和/或鼠ANGPTL4的mANGPTL4(1-183)，mANGPTL4(23-183)，mANGPTL4(1到約165)，mANGPTL4(23到約165)，mANGPTL4(23-410)或mANGPTL4(184-410)氨基酸亞序列。其他序列還包括但不限于例如，hANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-406，60-406，80-406，100-406，120-406，140-406，and 160-406，以及例如，mANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-410，60-410，80-410，100-410，120-410，140-410和160-410。激動(dòng)劑ANGPTL4包括活化ANGPTL4或產(chǎn)生ANGPTL4活性的分子，例如活性多肽，小分子，以及增加ANGPTL4活性或表達(dá)的分子。ANGPTL4激動(dòng)劑也包括αVβ5激動(dòng)劑。
本發(fā)明的ANGPTL4拮抗劑是抑制或降低ANGPTL4活性的分子。ANGPTL4抑制劑包括小分子量物質(zhì)，多核苷酸，反義分子，RNA適體，針對(duì)ANGPTL4或其受體多肽的核酶，多肽，ANGPTL4的拮抗劑變體，分離的蛋白，重組蛋白，抗體，或其偶聯(lián)物或融合蛋白，所述抑制劑可直接或間接抑制ANGPTL4活性。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，拮抗劑ANGPTL4抗體是通過與ANGPTL4蛋白的特異性亞序列或區(qū)域結(jié)合來(lái)抑制或降低ANGPTL4活性的抗體，例如人ANGPTL4的N末端，N末端螺旋區(qū)，C末端，C末端纖維蛋白原樣區(qū)的殘基，或ANGPTL4(1-183)，ANGPTL4(23-183)，ANGPTL4(1到約162)，ANGPTL4(約162-406)，ANGPTL4(23-406)，或ANGPTL4(184-406)氨基酸亞序列，和/或鼠ANGPTL4的mANGPTL4(1-183)，mANGPTL4(23-183)，mANGPTL4(1到約165)，mANGPTL4(23到約165)，mANGPTL4(23-410)或mANGPTL4(184-410)氨基酸亞序列。其他序列還包括但不限于例如，hANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-406，60-406，80-406，100-406，120-406，140-406，和160-406，和例如mANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-410，60-410，80-410，100-410，120-410，140-410和160-410。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，ANGPTL4拮抗劑包括抗-αVβ5抗體，例如拮抗劑抗-αVβ5抗體。一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人源化抗體。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，ANGPTL4拮抗劑是SiRNA分子。一個(gè)實(shí)施方案中，SiRNA分子是ANGPTL4-SiRNA分子，該分子靶向DNA編碼ANGPTL4的核酸的序列(例如，GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA)(SEQ ID NO3)。ANGPTL4的免疫粘附素至少包括融合于免疫球蛋白序列的ANGPTL4的受體結(jié)合區(qū)。一些實(shí)施方案中，ANGPTL4，激動(dòng)劑或拮抗劑具有載體，例如藥學(xué)可接受的載體。
ANGPTL4轉(zhuǎn)基因和敲除動(dòng)物在此描述并提供了這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的用途。本發(fā)明還提供源自非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的分離的細(xì)胞，其基因組包含的編碼ANGPTL4的基因被破壞。一些實(shí)施方案中，分離的細(xì)胞包括鼠細(xì)胞(例如胚胎干細(xì)胞)。
ANGPTL4的突變基因破壞導(dǎo)致觀察到的表型，其與各種疾病或功能不良相關(guān)，包括心血管，內(nèi)皮或血管生成疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化；異常代謝疾病包括脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡疾?。换蛎庖吆脱仔约膊?。本發(fā)明的方法包括通過給藥受試者有效量的ANGPTL4或ANGPTL4的激動(dòng)劑或拮抗劑來(lái)治療心血管，內(nèi)皮或血管生成疾病，異常代謝疾病，免疫疾病，脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡疾?。换蚺c編碼ANGPTL4的基因的破壞有關(guān)或與ANGPTL4活性有關(guān)的腫瘤疾病，由此有效治療所述病癥或疾病。
鑒定與編碼ANGPTL4的基因的破壞有關(guān)的表型的方法也在此提供。例如，所述方法包括(a)測(cè)定其基因組中編碼ANGPTL4的基因被破壞的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生理學(xué)特征；和(b)將測(cè)定的生理學(xué)特征與性別匹配的野生型動(dòng)物的生理學(xué)特征相比較。將由該基因破壞導(dǎo)致的表型鑒定為區(qū)別于野生行動(dòng)物的生理學(xué)特征的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生理學(xué)特征。非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)于編碼ANGPTL4的基因的破壞而言可為純合或雜合的。
鑒定調(diào)節(jié)與編碼ANGPTL4的基因的破壞有關(guān)的表型的藥劑的方法也在此提供。例如，所述方法包括(a)測(cè)定其基因組中編碼ANGPTL4的基因被破壞的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生理學(xué)特征；和(b)將測(cè)定的(a)的生理學(xué)特征與性別匹配的野生型動(dòng)物的生理學(xué)特征相比較。非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中ANGPTL4基因破壞導(dǎo)致的表型是區(qū)別于野生型動(dòng)物生理學(xué)特征的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生理學(xué)特征。將受試藥劑給予(a)的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；并測(cè)定該受試藥劑是否調(diào)節(jié)所鑒定的與基因破壞有關(guān)的表型。調(diào)節(jié)該表型的受試藥劑是調(diào)節(jié)該表型的藥劑。
一些實(shí)施方案中，與ANGPTL4基因破壞有關(guān)的表型或與性別匹配的野生型同窩動(dòng)物相比非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物顯示的表型是以下的至少一種，但不限于此，例如心血管、內(nèi)皮或血管生成疾病；免疫疾??；脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡疾病；或異常代謝疾病。
鑒定調(diào)節(jié)與編碼ANGPTL4的基因的破壞有關(guān)的生理學(xué)特征的藥劑的方法也在此提供。一些實(shí)施方案中，所述方法包括(a)測(cè)定其基因組中編碼ANGPTL4的基因被破壞的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物顯示的生理學(xué)特征；和(b)將測(cè)定的(a)的生理學(xué)特征與性別匹配的野生型動(dòng)物的生理學(xué)特征相比較。非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物顯示的區(qū)別于野生型動(dòng)物所顯示生理學(xué)特征的生理學(xué)特鑒定為與ANGPTL4基因破壞相關(guān)的生理學(xué)特征。將受試藥劑給予(a)的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；并測(cè)定與基因破壞有關(guān)的生理學(xué)特征是否得到調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)該生理學(xué)特征的受試藥劑是調(diào)節(jié)該特征的藥劑。
一些實(shí)施方案中，與性別匹配的野生型同窩動(dòng)物相比該非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物顯示的表型是以下的至少一種生理學(xué)特征，例如，平均血清膽固醇水平的調(diào)節(jié)，平均血清甘油三酯水平的調(diào)節(jié)，葡萄糖耐受試驗(yàn)的調(diào)節(jié)，葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)，平均血清葡萄糖水平降低；平均血清胰島素水平升高；平均血清胰島素水平降低；平均血清IgM水平升高以及平均絕對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，平均百分比體脂增加；體重和身高減少，總組織重量和非脂肪體重(lean body mass)減少，總脂肪重量減少，生長(zhǎng)延遲伴隨體重和身高減少，和/或總體脂，總組織重量的平均百分比減少。一個(gè)實(shí)施方案中，平均血清膽固醇水平的調(diào)節(jié)是平均血清膽固醇水平降低。一個(gè)實(shí)施方案中，平均血清甘油三酯水平的調(diào)節(jié)是平均血清甘油三酯水平降低。另一實(shí)施方案中，葡萄糖耐受試驗(yàn)的調(diào)節(jié)是葡萄糖耐受增強(qiáng)。
提供了鑒定緩解以下疾病的藥劑的方法心血管、內(nèi)皮或血管生成疾?。幻庖呒膊。荒[瘤疾?。恢|(zhì)代謝疾?。换蚺c編碼ANGPTL4的基因的破壞有關(guān)的異常代謝疾病。例如，所述方法包括(a)將受試藥劑給予ANGPTL4基因中含有破壞的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；和(b)檢測(cè)所述受試藥劑是否緩解以下疾病心血管、內(nèi)皮或血管生成疾?。幻庖呒膊?；腫瘤疾病；脂質(zhì)代謝疾病；或與非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中ANGPTL4基因的破壞有關(guān)的代謝疾病。
本發(fā)明提供了評(píng)估能夠影響與編碼ANGPTL4的基因的破壞有關(guān)的疾病的治療劑的方法；例如，所述方法包括(a)測(cè)定其基因組中包含編碼ANGPTL4的基因的破壞的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生理學(xué)特征；(b)將測(cè)定的(a)的生理學(xué)特征與性別匹配的野生型動(dòng)物的生理學(xué)特征相比較；(c)將受試藥劑給藥(a)的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；和(d)評(píng)價(jià)受試藥劑對(duì)鑒定的與非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的基因破壞有關(guān)的疾病的影響。將區(qū)別于野生型動(dòng)物生理學(xué)特征的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生理學(xué)特征鑒定為由該非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的基因破壞導(dǎo)致的疾病。例如，所述疾病是心血管、內(nèi)皮或血管生成疾?。幻庖呒膊?；腫瘤疾?。恢|(zhì)動(dòng)態(tài)平衡疾??；或代謝疾病。
鑒定調(diào)節(jié)ANGPTL4表達(dá)的藥劑也在此提供。例如，所述方法包括(a)使受試藥劑與表達(dá)ANGPTL4的宿主細(xì)胞接觸；和(b)測(cè)定所述受試藥劑是否調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞對(duì)ANGPTL4的表達(dá)。
上述任何方法鑒定的藥劑也包括在本發(fā)明中。一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥劑包含激動(dòng)劑。另一實(shí)施方案中，所述藥劑包括ANGPTL4的拮抗劑。治療藥劑以及包含所述治療藥劑的藥物組合物也包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明的各種方法中，可將本發(fā)明的分子，例如ANGPTL4，ANGPTL4的激動(dòng)劑或拮抗劑，藥劑等通過系統(tǒng)性遞送系統(tǒng)給予受試者。一方面，所述系統(tǒng)性遞送系統(tǒng)包括細(xì)胞制備物，其包含表達(dá)受試藥劑的重組形式的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞)。另一方面，所述系統(tǒng)性遞送系統(tǒng)可包含緩釋制備物，其包括純化的藥劑和聚合物基質(zhì)。一些實(shí)施方案中，將所述分子與可藥用載體一同給予受試者。可選，本發(fā)明的分子可通過組織-靶向的(例如脂肪細(xì)胞，肝等)基因遞送載體給藥，所述載體包含編碼該分子的核酸。確定用于基因治療的病毒或非病毒載體可用作本發(fā)明中的組織靶向的基因遞送載體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示人ANGPTL4的核酸序列(SEQ ID NO1)。
圖2顯示人ANGPTL4的氨基酸序列(SEQ ID NO2)，其源自圖1所示的SEQ ID NO1的編碼序列。
圖3，圖A顯示純化的重組鼠ANGPTL4(23-410)，其在存在(10mM)或缺失二硫蘇糖醇(DTT)的條件下在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(4-20％)上分離。圖3，圖B顯示野生型(泳道1)和變體hANGPTL4(泳道2)，其在SDS凝膠上分離并通過western印跡檢出，其中變體hANGPTL4具有取代R162G和R164E。
圖4圖示了ANGPTL4誘導(dǎo)人肝細(xì)胞的細(xì)胞粘附。
圖5圖示了ANGPTL4誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖。
圖6，圖A和B圖示了細(xì)胞外ANGPTL4誘導(dǎo)原代人前脂肪細(xì)胞內(nèi)臟增殖(圖A)以及前脂肪細(xì)胞皮下增殖(圖B)。
圖7圖示FACS分析顯示ANGPTL4(23-406)和IgG-嵌合人ANGPTL4形式與皮下原代人脂肪細(xì)胞結(jié)合。
圖8，圖A，B和C顯示ANGPTL4誘導(dǎo)原代人皮下前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞遷移。圖A和B顯示ANGPTL4誘導(dǎo)原代前脂肪細(xì)胞的過夜(圖A)和7小時(shí)(圖B)細(xì)胞遷移。圖C圖示了以下條件下ANGPTL4誘導(dǎo)原代前脂肪細(xì)胞7小時(shí)的遷移(1)沒有添加血清，(2)10％胎牛血清(FCS)，(3)PDGF-BB，和(4)mANGPTL4。
圖9，圖A，B，C，D和E顯示ANGPTL4與整合素αVβ5的結(jié)合。圖A顯示293-1953(αVβ5)細(xì)胞對(duì)在底部以(μg/ml)顯示濃度的mANGPTL4或玻連蛋白包被的板，其中利用BSA作為對(duì)照。圖B顯示抗-αVβ5和抗-hANGPTL4抗體消除ANGPTL4細(xì)胞粘附活性，其中(1)是BSA，(2)是玻連蛋白，(c)是mANGPTL4。圖C顯示蛋白(mANGPTL4，hANGPTL4-N末端，或hANGPTL4-C末端)與αVβ5包被的板的結(jié)合，其中利用說明的量。圖D顯示抗-hANGPTL4對(duì)蛋白(mANGPTL4，hANGPTL4-N末端，或hANGPTL4-C末端)與αVβ5包被的板的結(jié)合的抑制，其中抗-down綜合征關(guān)鍵區(qū)1蛋白(Dscr)抗體對(duì)照物，5G7或介質(zhì)用作對(duì)照。圖E顯示ANGPTL4與αVβ5的結(jié)合，其中(1)是包被在板上的hANGPTL4-C末端，(2)是包被在板上并與抗-hANGPTL4保溫的hANGPTL4-C末端，(3)是包被在板上并與抗-Dscr保溫的hANGPTL4-C末端，(4)是包被在板上的玻連蛋白，(5)是包被在板上的BSA，所述情況為添加αVβ5之前的情況。
圖10顯示經(jīng)尾靜脈注射ANGPTL4和ANGPTL4變體的小鼠的甘油三酯水平，其中(1)是Ad-GFP，(2)是Ad-Gd，(3)是ANGPTL4(1-406)，(4)ANGPTL4(1-183)，(5)是ANGPTL4(184-406)，(6)是ANGPTL4變體R1162G和R164E，(7)是ANGPTL4(1-408)，(8)是對(duì)照。
詳細(xì)描述定義具體描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于具體的組合物或生物系統(tǒng)，其當(dāng)然可變化。也應(yīng)理解本文術(shù)語(yǔ)僅僅是為了描述具體的實(shí)施方案，并不用作限制。本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求中，單數(shù)形式“一”，“一種”，“該”包括復(fù)數(shù)含義，除非另外明確說明。因此，例如“一種分子”可選包括兩或多個(gè)所述分子的組合。除非另有定義，所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為與它們所述技術(shù)領(lǐng)域所用的常見含義相同。為了本發(fā)明的目的，在下文描述了以下術(shù)語(yǔ)。
術(shù)語(yǔ)“ANGPTL4或“Angptl4”指血管生成素-樣4多肽或蛋白，以及其天然存在的等位基因形式、分泌的形式以及加工的形式。例如，人ANGPTL4是406氨基酸的蛋白，而小鼠ANGPTL4是410氨基酸的蛋白。術(shù)語(yǔ)“ANGPTL4”也指該多肽的片段(例如亞序列，截?cái)嗟男问降?，包括例如N末端片段，螺旋區(qū)，C末端片段，纖維蛋白原樣區(qū)，人血管生成素樣-4蛋白的氨基酸1-183，23-183，1到約162，23到約162，23-406，184-406，約162-406，或23-184，以及鼠血管生成素樣-4蛋白的氨基酸1-183，23-183，1到約165，23到約165，23-410，或184-410。其他片段包括但不限于，例如，hANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-406，60-406，80-406，100-406，120-406，140-406，和160-406，和例如，mANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-410，60-410，80-410，100-410，120-410，140-410和160-410。ANGPTL4的任何所述形式的參考也可在本申請(qǐng)中鑒定，例如，通過“ANGPTL4(23-406)，”“ANGPTL4(184-406)，”“ANGPTL4(23-183)，”“mANGPTL4(23-410)，”“mANGPTL4(184-410)，”等，其中m表示鼠序列。天然ANGPTL4片段的氨基酸位置根據(jù)在其天然ANGPTL4中的位置編號(hào)。例如，ANGPTL4片段中的氨基酸位置22(Ser)也是天然人ANGPTL4中的位置22(Ser)。例如參見圖2?？傮w來(lái)看，天然ANGPTL4片段具有生物活性。
“天然序列”多肽包括具有與源自自然的多肽相同的氨基酸序列的多肽。所述天然序列多肽可分離自自然或可通過重組或合成手段產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“天然序列”多肽具體包括該多肽的天然存在的截短或分泌的形式(例如細(xì)胞外區(qū)序列)，天然存在的變體形式(例如可選拼接的形式)，以及天然存在的等位基因變體。
多肽“變體”指與相應(yīng)的天然序列多肽具有至少約80％氨基酸序列同一性的生物活性多肽或其片段。所述變體包括例如，在所述多肽的N和/或C末端添加或缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的多肽。通常，變體與天然序列多肽或其片段具有至少約80％氨基酸序列同一性，或至少約90％氨基酸序列同一性，或至少約95％或更高的氨基酸序列同一性。
術(shù)語(yǔ)“ANGPTL4變體”在本文中用于指上述變體和/或在天然ANGPTL4序列中包括一或多個(gè)氨基酸突變的ANGPTL4?？蛇x，所述一或多個(gè)氨基酸突變包括一或多個(gè)氨基酸取代。本發(fā)明所用的ANGPTL4及其變體可通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備。ANGPTL4的氨基酸序列變體可通過在ANGPTL4DNA中進(jìn)行突變來(lái)制備。所述變體中包括，例如，在ANGPTL4的氨基酸序列中殘基的缺失、插入或取代，例如保藏號(hào)為ATCC 209284的核酸編碼的人氨基酸序列，或如圖2所示?？蛇M(jìn)行缺失、插入和取代的任何組合以獲得具有所需活性的最終構(gòu)建體。編碼所述變體內(nèi)的突變必需不能位于讀碼框內(nèi)并優(yōu)選不產(chǎn)生可產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。EP75,444A。
ANGPTL4變體可選通過在編碼天然ANGPTL4的DNA中進(jìn)行定點(diǎn)誘變或噬菌體展示技術(shù)來(lái)制備，由此產(chǎn)生編碼所述變體的DNA，并由此在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)該DNA。
預(yù)先確定導(dǎo)入氨基酸序列變異的位點(diǎn)后，所述突變本身無(wú)需預(yù)確定。例如，為優(yōu)化突變?cè)诮o定位點(diǎn)的表現(xiàn)，可在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)誘變并篩選表達(dá)的ANGPTL4變體以獲得所需活性的優(yōu)選組合。在序列已知的DNA中的預(yù)先確定位點(diǎn)產(chǎn)生取代突變的技術(shù)是已知的，諸如例如定點(diǎn)誘變。本文所述的ANGPTL4變體的制備可通過噬菌體展示技術(shù)實(shí)現(xiàn)，諸如PCTWO 00/63380公開中描述的那些。
選出所述克隆以后，可去除突變的蛋白區(qū)域并置于適宜載體中以產(chǎn)生蛋白，通?？刹捎每捎糜谵D(zhuǎn)化適宜宿主的表達(dá)載體類型。
氨基酸序列缺失通常約1-30個(gè)殘基，優(yōu)選1-10個(gè)殘基，優(yōu)選1-5或更少個(gè)殘基，通常是連續(xù)的。
氨基酸序列缺失包括一個(gè)殘基到基本上長(zhǎng)度不受限制的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。序列內(nèi)插入(即天然ANGPTL4序列內(nèi)的插入)可從約1-10個(gè)殘基，可選1-5，或可選1-3個(gè)殘基。末端插入的實(shí)例包括單個(gè)序列與N末端的融合，而無(wú)論該單個(gè)序列是與宿主細(xì)胞異源還是同源，所述融合促進(jìn)自重組宿主的分泌。
其他ANGPTL4變體是天然ANGPTL4中的至少一個(gè)氨基酸序列被去除并在其位置插入不同的殘基的那些。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，ANGPTL4變體包括ANGPTL4的162和/或164的取代或mANGPTL4的169的取代。所述取代可根據(jù)表1中所示的那些進(jìn)行。ANGPTL4變體也可包括本文描述的非天然氨基酸。
氨基酸可根據(jù)它們側(cè)鏈性質(zhì)的相似性分組(在A.L.Lehninger，inBiochemistry，second ed.，pp.73-75，Worth Publishers，New York(1975)中)(1)非極性Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Pro(P)，Phe(F)，Trp(W)，Met(M)(2)不帶電的極性Gly(G)，Ser(S)，Thr(T)，Cys(C)，Tyr(Y)，Asn(N)，Gln(Q)(3)酸性Asp(D)，Glu(E)(4)堿性Lys(K)，Arg(R)，His(H)可選，天然存在的殘基可根據(jù)共有的側(cè)鏈特性分成幾組(1)疏水型正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性親水型cys，ser，thr；(3)酸性asp，glu；(4)堿性asn，gln，his，lys，arg；(5)影響鏈方向的殘基gly，pro；和(6)芳香基trp，tyr，phe。
表1

“天然存在的氨基酸殘基”(即遺傳密碼編碼的氨基酸殘基)可選自下組丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；組氨酸(His)；異亮氨酸(Ile)亮氨酸(Leu)；賴氨酸(Lys)；蛋氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；絲氨酸(Ser)；蘇氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和纈氨酸(Val)?！胺翘烊淮嬖诘陌被釟埢背松厦媪谐龅奶烊淮嬖诘陌被釟埢臍埢?，其能共價(jià)結(jié)合于多肽鏈內(nèi)的相鄰氨基酸殘基。非天然存在的氨基酸殘基的實(shí)例包括例如正亮氨酸，鳥氨酸，正纈氨酸，同型絲氨酸和其他氨基酸殘基同系物，諸如Ellman et al.Meth.Enzym.202301-336(1991)& US專利申請(qǐng)公開20030108885和20030082575中描述的那些。簡(jiǎn)而言之，這些方法涉及利用非天然存在的氨基酸殘基活化阻遏物tRNA然后進(jìn)行RNA的體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯。見例如，US專利申請(qǐng)公開20030108885和20030082575；Noren etal.Science 244182(1989)；和Ellman et al.，supra。
本文的“氨基酸序列相同性百分?jǐn)?shù)(％)”定義為對(duì)位排列該序列且按需要導(dǎo)入間隔以達(dá)到最大序列相同性百分?jǐn)?shù)后與Angptl3序列中氨基酸殘基相同的候選序列氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)，且任何保守取代都不作為該序列相同性的一部分。以測(cè)定氨基酸序列相同性百分?jǐn)?shù)為目的的序列對(duì)比可按本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的各種方法完成，例如，使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件，例如BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定用于測(cè)量序列對(duì)比的合適參數(shù)，包括在所比較的序列全長(zhǎng)上達(dá)到最大對(duì)位排列所需的任何算法。然而，為達(dá)到本文目的，氨基酸序列相同性值％可通過使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2按下文所述獲得，其中圖4A-Q提供了ALIGN-2程序的全部源代碼。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech，Inc.創(chuàng)作且圖4A-Q所示的源代碼在美國(guó)版權(quán)局，華盛頓區(qū)，20559以用戶文件存檔，以美國(guó)版權(quán)登記號(hào)TXU510087登記。ALIGN-2程序通過Genentech，Inc.，South San Francisco，California可公開得到或者可從圖4A-Q提供的源代碼編譯。編譯ALIGN-2程序應(yīng)基于UNIX操作系統(tǒng)平臺(tái)，優(yōu)選數(shù)字UNIX V4.0D。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不改變。
為達(dá)到本文目的，給定氨基酸序列A與，和，或者對(duì)給定氨基酸序列B的氨基酸序列相同性％(任選可表述為具有或者包含與，和，或者對(duì)給定氨基酸序列B的某一氨基酸序列相同性％的給定氨基酸序列A)計(jì)算如下100乘以分?jǐn)?shù)X/Y其中X是通過序列對(duì)比程序ALIGN-2在A和B經(jīng)該程序進(jìn)行序列對(duì)比中評(píng)分為相同性匹配的氨基酸殘基數(shù)，且其中Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。可預(yù)料到如果氨基酸序列A的長(zhǎng)度與氨基酸序列B的長(zhǎng)度不相等時(shí)，A與B的氨基酸序列相同性％不等于B與A的氨基酸序列相同性％。
分離的”多肽是指從其天然環(huán)境成份中鑒定和分離和/或回收的多肽。其天然環(huán)境的污染成份是可能干擾該多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，且可能包括酶，激素，和其它蛋白型或非蛋白型溶質(zhì)。在一些的實(shí)施方案中，該多肽可純化成(1)按勞里(Lowry)方法測(cè)定的多肽重量超過95％，且最優(yōu)選重量超過99％，(2)其純化程度足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列，或(3)在還原型或非還原型條件下進(jìn)行SDS-PAGE并使用考馬斯藍(lán)或者，優(yōu)選銀染測(cè)定具有同質(zhì)性。該分離的多肽包括在重組細(xì)胞內(nèi)的原位多肽，因?yàn)樵摱嚯奶烊画h(huán)境中的至少一種成份不存在。然而，一般來(lái)說，分離的多肽由至少一個(gè)純化步驟制備。
術(shù)語(yǔ)“ANGPTL4調(diào)節(jié)物”指可活化ANGPTL4或其表達(dá)的分子例如激動(dòng)劑或者可抑制ANGPTL4的活性或其表達(dá)的分子例如拮抗劑(或抑制劑)。ANGPTL4激動(dòng)劑包括抗體和活性片段。ANGPTL4拮抗劑指能中和、阻斷、抑制、消除，降低或干擾ANGPTL4活性(例如細(xì)胞增殖或生長(zhǎng)、遷移、粘附或代謝例如脂質(zhì))，調(diào)節(jié)或其表達(dá)包括其與ANGPTL4受體例如，αVβ5的結(jié)合的分子。ANGPTL4拮抗劑包括例如抗ANGPTL4抗體和其抗原結(jié)合片段，受體分子以及特異性結(jié)合ANGPTL4由此隔絕其與一或多個(gè)受體的結(jié)合的衍生物，抗-ANGPTL4受體抗體和ANGPTL4受體拮抗劑諸如受體的小分子抑制物。其他ANGPTL4拮抗劑也包括ANGPTL4的拮抗劑變體，反義分子(例如ANGPTL4-SiRNA)，RNA適體，以及針對(duì)ANGPTL4或其受體的核酶。一些實(shí)施方案中，拮抗劑ANGPTL4抗體是通過與ANGPTL4的特異性亞序列或區(qū)域結(jié)合而抑制或降低ANGPTL4活性的抗體，所述亞序列或區(qū)域例如N末端片段，螺旋區(qū)，C末端片段，纖維蛋白原樣區(qū)，人血管生成素樣-4蛋白的氨基酸1-183，23-183，1到約162，23到約162，23-406，184-406，約162-406或23-184，鼠血管生成素樣-4蛋白的1-183，23-183，1到約165，23到約165，23-410，或184-410。其他亞序列還包括但不限于，例如，hANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-406，60-406，80-406，100-406，120-406，140-406，和160-406，例如，mANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-410，60-410，80-410，100-410，120-410，140-410和160-410。
ANGPTL4的調(diào)節(jié)物是調(diào)節(jié)ANGPTL4活性的分子，例如激動(dòng)劑和拮抗劑。術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”指ANGPTL4的肽和非肽類似物，以及特異性結(jié)合所述ANGPTL4分子的抗體，條件是它們能給天然ANGPTL4受體(例如，αVβ5整合素)發(fā)出信號(hào)。術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”是在ANGPTL4受體(例如，αVβ5)的生物作用的背景中定義的。一些實(shí)施方案中，激動(dòng)劑具有天然ANGPTL4的生物活性，如上所定義的那樣，諸如促進(jìn)細(xì)胞增殖，遷移和/或粘附，和/或脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)。
術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”用于指能抑制ANGPTL4生物活性的分子，而不考慮它們是否能結(jié)合ANGPTL4或其受體，例如，αVβ5。例如，能結(jié)合ANGPTL4或其受體的拮抗劑包括抗-ANGPTL4和抗-αVβ5抗體。抑制ANGPTL4表達(dá)的拮抗劑包括在內(nèi)，例如，ANGPTL4-SiRNA。拮抗劑ANGPTL4可通過例如抑制ANGPTL4的活性，例如粘附、遷移、增殖和/或調(diào)節(jié)ANGPTL4的脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡活性來(lái)評(píng)估。就αVβ5整合素受體活性而言，αVβ5整合素受體的調(diào)節(jié)物可通過本領(lǐng)域抑制的方法確定。例如，可使用J.W.Smith et al.in J.Biol.Chem.26512267-12271(1990)所用的方法。
術(shù)語(yǔ)“抗-ANGPTL4抗體”是以足夠的親和力和特異性結(jié)合ANGPTL4的抗體。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗-ANGPTL4抗體可用作靶向和干預(yù)與ANGPTL4活性有關(guān)的疾病和病癥的治療劑。通常，抗-ANGPTL4抗體不結(jié)合其他ANGPTL4同系物，例如，ANGPTL3。
這里的術(shù)語(yǔ)“抗體”用其最廣泛的意義，尤其包含完整的單克隆抗體，多克隆抗體，由至少兩個(gè)完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及能顯示所需生物學(xué)活性的任何抗體片段。
除非另有說明，術(shù)語(yǔ)“多價(jià)抗體”在整個(gè)說明書中指包含三個(gè)和多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體。多價(jià)抗體通常經(jīng)改造具有三個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并通常不是天然序列IgM或IgA抗體。
“抗體片段”包括完整抗體的僅僅一部分，通常包括完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)并由此保持了結(jié)合抗原的能力。本發(fā)明定義包括的抗體片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，其具有VL，CL，VH和CH1區(qū)；(ii)Fab’片段，其為在CH1區(qū)的C末端具有一或多個(gè)半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1區(qū)；(iv)Fd’片段，其具有VH和CH1區(qū)并在CH1區(qū)的C末端具有一或多個(gè)半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，其具有抗體單個(gè)臂的VL和VH區(qū)；(vi)dAb片段(Ward et al.，Nature 341，544-546(1989))，其含有VH區(qū)；(vii)分離的CDR區(qū)；(viii)F(ab′)2片段，包括兩個(gè)通過鉸鏈區(qū)二硫橋連接的兩個(gè)Fab’片段的二價(jià)片段；(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈Fv；scFv)(Bird et al.，Science 242423-426(1988)；and Huston et al.，PNAS(USA)855879-5883(1988))；(x)“二價(jià)抗體”，其具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，包括連接于位于相同多肽鏈中的輕鏈可變區(qū)(VL)的重鏈可變區(qū)(VH)(見例如，EP 404,097；WO93/11161；and Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993))；(xi)“線性抗體”，其包括一對(duì)串聯(lián)的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，它們與互補(bǔ)輕鏈多肽在一起形成了一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)(Zapata et al.Protein Eng.8(10)1057 1062(1995)；美國(guó)專利5,641,870)。
本文中術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從實(shí)質(zhì)上均一的抗體群獲得的抗體，即包含該群體的單個(gè)抗體除了可能自然發(fā)生的很少量突變以外都相同。單克隆抗體均以高度特異性直接針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。此外，與通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的傳統(tǒng)(多克隆)抗體制劑相比，每種單克隆抗體直接針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。單克隆抗體除了具有特異性，其優(yōu)勢(shì)還在于，它們是通過雜交瘤培養(yǎng)而合成的，無(wú)其它免疫球蛋白的污染。修飾語(yǔ)“單克隆的”指抗體獲自實(shí)質(zhì)上均一的抗體群的特征，不應(yīng)理解為需要由任何具體方法產(chǎn)生抗體。例如根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以用由Kohler等，自然，256495(1975)首次描述的雜交瘤方法來(lái)制備，或用重組DNA法(如美國(guó)專利4,816,567)來(lái)制備?！皢慰寺】贵w”還可以是用Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志，222581-597(1991)所述技術(shù)從噬菌體抗體庫(kù)中分離得到。
本文中單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中所述嵌合抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分等同于或同源于來(lái)自特定物種的抗體或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體的相應(yīng)序列，鏈的其余部分等同于或同源于來(lái)自其它物種的抗體或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體的相應(yīng)序列，只要它們展示所需生物學(xué)活性(見美國(guó)專利4,816,567；Morrison等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，816851-6855(1984))。本文的目標(biāo)嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)源化(primatized)”抗體，其包含源于非人靈長(zhǎng)類可變區(qū)的抗原結(jié)合序列(如Old WorldMonkey，如狒狒，獼猴(rhesus)或恒河猴(cynomolgus monkey))和人的恒定區(qū)序列(美國(guó)專利5,693,780)。
“人源化”形式的非人(如鼠)抗體是包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在多數(shù)情況下，人源化抗體是下述人免疫球蛋白(受者(recipient)抗體)，其中受者的高變區(qū)殘基被非人物種如小鼠、大鼠、免或非人靈長(zhǎng)類(供者(donor)抗體)的具有所需特異性、親和力和容量(capacity)的高變區(qū)的殘基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。而且人源化抗體可包含未在受者抗體或供者抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾旨在進(jìn)一步改進(jìn)抗體的功能。一般情況下，人源化抗體基本上包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)完整可變區(qū)，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗體任選還包含免疫球蛋白、通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Fc)的至少一部分。詳見Jones等，自然321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
“人抗體”是一種這樣的抗體，其氨基酸序列對(duì)應(yīng)于由人產(chǎn)生的和/或已使用如本文所公開的用于制備人抗體的任何方法制備的抗體的氨基酸序列。此人抗體的定義具體地排除了含有非人抗原-結(jié)合殘基的人源化的抗體?？墒褂帽炯夹g(shù)領(lǐng)域已知的各種方法產(chǎn)生人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體選自噬菌體文庫(kù)，其中該噬菌體文庫(kù)表達(dá)人抗體(Vaughan等，NatureBiotechnology，14309-314(1996)；Sheets等，PNAS(USA)，956157-6162(1998))；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991))。人抗體也可通過將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)制備，例如，內(nèi)源的免疫球蛋白基因已被部分地或全部失活的小鼠。一旦激發(fā)，觀察到人抗體產(chǎn)生，這在各個(gè)方面十分類似于在人中所見的情況，包括基因重排、組裝和抗體庫(kù)(antibody repertoire)。此方法在，例如，美國(guó)專利Nos.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，和在Marks等，Bio/Technology，10779-783(1992)；Lonberg等，Nature，368856-859(1994)；Morrison，Nature，368812-813(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology，14845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.，1365-93(1995)中描述?？蛇x，人抗體可通過產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的抗體的人B-淋巴細(xì)胞的無(wú)限增殖(immortalization)來(lái)制備(所述B淋巴細(xì)胞可從個(gè)體回收或可在體外被免疫)。參見，例如，Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)；和US Pat No.5,750,373。
術(shù)語(yǔ)“可變的”是指不同抗體的可變區(qū)特定部分序列差異很大，且這些部分在每種抗體與其特定抗原的結(jié)合和特異性中有用。然而在抗體整個(gè)可變區(qū)中可變性的分布并不均等。它集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)的三個(gè)被稱為高變區(qū)的節(jié)段中?？勺儏^(qū)的更高度保守部分被稱為框架區(qū)(FR)。天然輕鏈和重鏈的可變區(qū)分別包含四個(gè)FR，它們大多采用β片層構(gòu)象，通過三個(gè)高變區(qū)相連，這些高變區(qū)形成環(huán)狀，有時(shí)形成β片層結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈的高變區(qū)通過FR緊密連接，并與其他鏈的高變區(qū)共同形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(見Kabat等，具有免疫學(xué)意義的蛋白的序列，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體對(duì)抗原的結(jié)合，但顯示多種效應(yīng)功能，如使抗體參與抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。
本文中術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”是指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)含有“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，重鏈可變區(qū)的殘基31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，具有免疫學(xué)意義的蛋白的序列，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))，和/或“高變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，重鏈可變區(qū)的殘基26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，分子生物學(xué)雜志196901-917(1987))。“框架區(qū)”或“FR”殘基是除本文所定義的高變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將免疫球蛋白分為不同的類型。有5種主要的免疫球蛋白類型IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，其中的一些可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，和IgA2。相應(yīng)于免疫球蛋白不同類型的重鏈恒定區(qū)分別稱為α，δ，ε，γ和μ。不同類型的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。
來(lái)自任一脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列，可稱為κ(6)和λ(8)這兩個(gè)明顯不同的類型之一。
術(shù)語(yǔ)“Fc區(qū)”用于定義可通過用木瓜蛋白酶消化完整抗體產(chǎn)生的免疫球蛋白重鏈C末端區(qū)。Fc區(qū)可為天然序列Fc區(qū)或變體Fc區(qū)。盡管免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)的范圍可變，人IgG重鏈Fc區(qū)通常定義為從大約位置Cys22或大約位置Pro2306的氨基酸殘基到Fc區(qū)的羧基末端。免疫球蛋白的Fc區(qū)通常包括兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域，CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，并可選包括CH4結(jié)構(gòu)域?！癋c區(qū)鏈”在本文意指Fc區(qū)的兩個(gè)多肽鏈之一。
人IgG Fc區(qū)的“CH2結(jié)構(gòu)域”(也稱為“Cg2″結(jié)構(gòu)域)通常從大約位置231的氨基酸殘基延伸到大約位置340的氨基酸殘基。CH2結(jié)構(gòu)域的獨(dú)特之處在于其與其他結(jié)構(gòu)域并不緊密配對(duì)。兩個(gè)N連接的分支碳水化合物鏈位于完整天然IgG分子的兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間。推測(cè)該碳水化合物提供結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的取代基并有助于穩(wěn)定CH2結(jié)構(gòu)域。Burton，Molec.Immunol.22161-206(1985)。CH2結(jié)構(gòu)域在本文可為天然序列CH2結(jié)構(gòu)域或變體CH2結(jié)構(gòu)域。
“CH3結(jié)構(gòu)域”包括Fc區(qū)中C末端殘基到CH2結(jié)構(gòu)域的片段(即從IgG大約位置341的氨基酸殘基到大約位置447的氨基酸殘基)。本文的CH3結(jié)構(gòu)域天然序列CH3結(jié)構(gòu)域或變體CH3結(jié)構(gòu)域(例如在一條鏈中具有導(dǎo)入的“突起(protroberance)”以及位于另一條鏈中的相應(yīng)的導(dǎo)入的”空腔”的CH3，見美國(guó)專利5,821,333，包含在此作為參考)。所述變體CH3結(jié)構(gòu)域可用于如本文所述制備多特異性(例如雙特異性)抗體。
“鉸鏈區(qū)”通常被定義為人IgG1中從Glu216到Pro230的區(qū)域(Burton，Molec.Immunol.22161-206(1985))。其它IgG同種型的鉸鏈區(qū)可與IgG1的序列對(duì)比排列，即對(duì)齊在相同位置形成重鏈之鏈間二硫鍵的第一個(gè)和最后一個(gè)半胱氨酸殘基。本發(fā)明的鉸鏈區(qū)可為天然序列鉸鏈區(qū)或變體鉸鏈區(qū)。變體鉸鏈區(qū)的兩個(gè)多肽鏈通常保持每個(gè)多肽鏈至少一個(gè)半胱氨酸殘基，使得變體鉸鏈區(qū)的兩條多肽鏈可形成這兩條鏈間的二硫鍵。本發(fā)明優(yōu)選的鉸鏈區(qū)是天然序列人鉸鏈區(qū)，例如天然序列人IgG1鉸鏈區(qū)。
“功能Fc區(qū)”具有天然序列Fc區(qū)的至少一種“效應(yīng)功能”。示例性“效應(yīng)功能”包括C1q結(jié)合；補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒(CDC)；Fc受體結(jié)合；抗體-依賴型細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體的下調(diào)(例如B細(xì)胞受體；BCR)等。所述效應(yīng)功能通常需要Fc區(qū)以便與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體可變結(jié)構(gòu)域)結(jié)合并可利用本領(lǐng)域已知用于評(píng)估所述抗體效應(yīng)功能的各種實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估。
“天然序列Fc區(qū)”包括與天然Fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
“變體Fc區(qū)”包括由于至少一種氨基酸修飾而與天然序列Fc區(qū)不同的氨基酸序列。優(yōu)選，變體Fc區(qū)與天然序列Fc區(qū)或親本多肽的Fc區(qū)相比在天然序列Fc區(qū)或親本多肽的Fc區(qū)中具有至少一個(gè)氨基酸取代，例如從約1-10個(gè)氨基酸取代，優(yōu)選約1-5個(gè)氨基酸取代。本文的變體Fc區(qū)通常與天然序列Fc區(qū)和/或與親本多肽的Fc區(qū)具有例如至少約80％的序列同一性，或至少約90％的序列同一性，或至少約95％或更高的序列同一性。
“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用”和“ADCC”指一種細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞(如自然殺傷(NK)細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，并隨后引起靶細(xì)胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞即NK細(xì)胞僅表達(dá)FcγR III，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγR I，F(xiàn)cγR II和FcγR III。Raveth和Kinet在免疫學(xué)年鑒9457-92(1991)，464頁(yè)的表3中總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為評(píng)估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC試驗(yàn)，如美國(guó)專利5,500,362號(hào)或5,821,337號(hào)中所述。這類試驗(yàn)中有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞。任選或另外，目的分子的ADCC活性可在體內(nèi)評(píng)估，例如在Clynes等PNAS(USA)95652-656(1998)公開的動(dòng)物模型中。
“人效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)物的功能的白細(xì)胞。優(yōu)選所述細(xì)胞表達(dá)至少FcγR III并執(zhí)行ADCC效應(yīng)物的功能。例如可介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞包括人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，自然殺傷(NK)細(xì)胞，單核細(xì)胞，細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；其中優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可分離自其天然來(lái)源，例如如本文所述分離自血液和PBMC。
術(shù)語(yǔ)“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié)合的受體(γ受體)，其包括FcγR I，F(xiàn)cγR II和FcγR III亞型，以及這些受體的等位基因變體和可替換的剪接形式。FcγR II受體包括FcγR IIA(“活化型受體”)和FcγR IIB(“抑制型受體”)，二者的氨基酸序列相似，主要區(qū)別在其胞漿結(jié)構(gòu)域?；罨褪荏wFcγR IIA在其胞漿結(jié)構(gòu)域包含基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制型受體FcγR IIB在其胞漿結(jié)構(gòu)域包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(見Daeron，免疫學(xué)年鑒15203-234(1997))。在Ravetch和Kinet，免疫學(xué)年鑒9457-92(1991)；Capel等，免疫方法(免疫學(xué)方法)425-34(1994)；和de Haas等，實(shí)驗(yàn)室及臨床醫(yī)學(xué)雜志(J.Lab.Clin.Med.)126330-41(1995)中對(duì)FcR進(jìn)行了綜述。其它FcR，包括將來(lái)被確定的，均被包含在術(shù)語(yǔ)“FcR”中。該術(shù)語(yǔ)也包括新生期的受體，F(xiàn)cRn，其負(fù)責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒(Guyer等，免疫學(xué)雜志117587(1976)和Kim等，免疫學(xué)雜志24249(1994))。
“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用”或“CDC”是指在補(bǔ)體存在時(shí)分子裂解標(biāo)靶的能力。補(bǔ)體活化途徑由補(bǔ)體系統(tǒng)第一個(gè)成分(Clq)結(jié)合至一個(gè)與同源抗原形成化合物的分子(如抗體)來(lái)啟動(dòng)。為評(píng)價(jià)補(bǔ)體活化，可如Gazzano-Santoro等，免疫學(xué)方法雜志202163(1996)所述進(jìn)行CDC試驗(yàn)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“免疫粘附素”是指結(jié)合了異源蛋白質(zhì)(“粘附素”)的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定區(qū)的效應(yīng)器功能的抗體樣分子。
在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包含氨基酸序列與免疫球蛋白恒定區(qū)序列的融合，該氨基酸序列具有除抗體的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)以外的所需結(jié)合特異性(即，是“異源性的”)。免疫粘附素分子的粘附素部分一般是至少含有受體或配體的結(jié)合位點(diǎn)的連續(xù)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定區(qū)序列可從諸如IgG-1，IgG-2，IgG-3，或IgG-4亞型，IgA(包括IgA-1和IgA-2)，IgE，IgD或IgM等任何免疫球蛋白獲得。
本發(fā)明的″活性的″或″活性″用于指這樣的ANGPTL4形式，其保持天然或天然存在的ANGPTL4的生物和/或免疫活性，其中“生物”活性指除了誘導(dǎo)針對(duì)天然或天然存在的ANGPTL4具有的抗原表位的抗體的產(chǎn)生的能力以外，天然或天然存在的ANGPTL4的生物功能(抑制性或刺激性)，“免疫”活性指誘導(dǎo)針對(duì)天然或天然存在的ANGPTL4具有的抗原表位的抗體的產(chǎn)生的能力。
“親和性-成熟的”抗體是在其一個(gè)或多個(gè)CDR中具有一或多種變化的抗體，所述變化導(dǎo)致所述抗體與對(duì)應(yīng)的不具有那些變化的親代抗體相比，前者對(duì)于抗原的親和性改進(jìn)。優(yōu)選的親和性-成熟的抗體將具有納摩爾的或甚至皮摩爾的靶抗原親和性。通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生親和性-成熟的抗體。Marks等，Bio/Technology，10779-783(1992)描述了通過VH和VL域重排的親和性成熟(affinity maturation)。CDR和/或框架殘基的隨機(jī)突變由Barbas等，Proc.Nat.Acad.Sci，USA，913809-3813(1994)；Schier等，Gene，169147-155(1995)；Yelton等，J.Immunol.，1551994-2004(1995)；Jackson等，J.Immunol.，154(7)3310-3319(1995)；和Hawkins等，J.Mol.Biol.，226889-896(1992)描述。
抗體的“功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)”是能靶向抗原的位點(diǎn)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)的抗原結(jié)合親和力不必要和該抗原結(jié)合位點(diǎn)所來(lái)源的親本抗體一樣強(qiáng)，但是結(jié)合抗原的能力必須能夠利用已知用于評(píng)估抗體與抗原的結(jié)合的多種方法之一測(cè)定。此外，本發(fā)明的多價(jià)抗體的每個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗原結(jié)合親和力無(wú)需在量上相同。對(duì)于本發(fā)明的多體抗體，功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量可利用超速離心分析來(lái)評(píng)估。根據(jù)該分析方法，靶抗原與多體抗體可以不同比例組合并且可推定不同的功能性結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量來(lái)計(jì)算復(fù)合體的平均分子量。將這些理論數(shù)值與獲得的實(shí)際試驗(yàn)數(shù)值相比較以評(píng)估功能性結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量。
具有規(guī)定抗體的“生物學(xué)特征”的抗體是具有這樣的一或多種抗體生物學(xué)特征之一的抗體，所述特征使得其與其他結(jié)合于相同抗原的抗體相區(qū)分。為了篩選結(jié)合目的抗體所結(jié)合的抗原上的表位的抗體，可進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷試驗(yàn)諸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中所述。
“多肽鏈”是其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域都通過肽鍵(與共價(jià)作用或二硫鍵不同)與其他結(jié)構(gòu)域相連的多肽。
本發(fā)明中“柔性接頭”指包含通過肽鍵相連并由此提供的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的肽，這為所連接的兩個(gè)肽(諸如兩個(gè)Fd區(qū))提供了更多的旋轉(zhuǎn)自由度。所述旋轉(zhuǎn)自由度允許該柔性接頭連接的兩個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)更有效地接近靶抗原。適宜的柔性接頭肽序列包括gly-ser，gly-ser-gly-ser，ala-ser，和gly-gly-gly-ser。
“二聚化結(jié)構(gòu)域”通過將至少兩個(gè)氨基酸殘基(通常為半胱氨酸殘基)或至少兩個(gè)肽或多肽(其可具有相同或不同的氨基酸序列)相連而形成。所述肽或多肽可通過共價(jià)和/或非共價(jià)結(jié)合相互作用。本發(fā)明二聚化結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括Fc區(qū)；鉸鏈區(qū)；CH3結(jié)構(gòu)域；CH4結(jié)構(gòu)域；CH1-CL對(duì)；具有改造的“把手(knob)和/或突起(protruberance)的“界面”，如美國(guó)專利5,821,333所描述的那樣，該文獻(xiàn)包含在本文作為參考；亮氨酸拉鏈(例如jun/fos亮氨酸拉鏈，見Kostelney et al.，J.Immunol.，1481547-1553(1992)；或酵母GCN4亮氨酸拉鏈)；異亮氨酸拉鏈；受體二聚體對(duì)(例如，白介素-8受體(IL-8R)；以及整合素異源二聚體諸如LFA-1和GPIIIb/IIIa)，或其二聚化區(qū)；二聚體配體多肽(例如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，神經(jīng)生長(zhǎng)蛋白(neurotrophin)-3(NT-3)，白介素-8(IL-8)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，VEGF-C，VEGF-D，PDGF成員，以及腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)；見Arakawa et al.J.Biol.Chem.269(45)27833-27839(1994)和Radziejewski et al.Biochem.32(48)1350(1993))，或其二聚化區(qū)；能形成二硫鍵的半胱氨酸殘基對(duì)；肽或多肽對(duì)，每個(gè)都包含至少一個(gè)半胱氨酸殘基(例如大約1，2或3到約10個(gè)半胱氨酸殘基)使得肽或多肽之間可形成二硫鍵(此后稱為“合成鉸鏈)；和抗體可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明最優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域是Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)。
術(shù)語(yǔ)“刺激細(xì)胞增殖”包括在體外或體內(nèi)相對(duì)于未經(jīng)處理的細(xì)胞或處理程度較低的細(xì)胞而言提高細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖程度的步驟。細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞增殖的提高可通過在暴露于目的分子前后計(jì)算細(xì)胞數(shù)量來(lái)檢測(cè)。增殖的程度可通過滿底程度的顯微鏡檢來(lái)定量。細(xì)胞增殖也可利用本領(lǐng)域已知的測(cè)定法例如胸腺嘧啶摻入測(cè)定法以及商業(yè)上可獲得的測(cè)定法定量。術(shù)語(yǔ)“抑制細(xì)胞增殖”包括在體外或體內(nèi)相對(duì)于未經(jīng)處理的細(xì)胞或處理程度較低的細(xì)胞而言降低細(xì)胞生長(zhǎng)和/或增殖程度的步驟。其可通過上述方法定量。
“聯(lián)用”一或多種其他治療劑給藥包括同時(shí)(同時(shí)發(fā)生的)和/或以任何順序序貫給藥。
用于治療的“受試者”指任何動(dòng)物。通常所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。用于治療的“哺乳動(dòng)物”指任何分類為哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，包括人、家養(yǎng)動(dòng)物和農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)動(dòng)物，以及動(dòng)物園的動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)用動(dòng)物或?qū)櫸?，諸如狗、馬、貓、牛、羊、豬等。通常，所述哺乳動(dòng)物是人。
術(shù)語(yǔ)“緩解”或“減輕”用于本文指降低、減輕或消除病情、疾病、病癥或表型，包括異常情況或癥狀。
“疾病”是任何將從利用本發(fā)明的分子進(jìn)行的治療受益的疾病。這包括慢性和急性疾病或病癥，包括使得受試者易患對(duì)象疾病的病理情形。
“治療有效量”是指能有效治療受試者中的疾病或病癥的藥物的量。
“治療”是指治療方法和預(yù)防措施。需要治療者包括已經(jīng)患疾病者，以及需要對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)防者。
“肥大”在本發(fā)明中意指與腫瘤形成無(wú)關(guān)的、獨(dú)立于自然生長(zhǎng)的器官或結(jié)構(gòu)的體積增加。器官或組織的肥大是由于個(gè)體細(xì)胞的體積增加(真性肥大)和/或構(gòu)成組織的細(xì)胞數(shù)量增加(增生)。例如，脂肪細(xì)胞的肥大性生長(zhǎng)是脂質(zhì)聚集刺激的脂肪細(xì)胞體積增大。脂肪細(xì)胞的增生是脂肪組織中脂肪細(xì)胞數(shù)量增加。
術(shù)語(yǔ)“心血管和內(nèi)皮疾病”、“心血管和內(nèi)皮功能障礙”和“心血管、內(nèi)皮或血管生成疾病”可互換使用，并指疾病，通常是系統(tǒng)性的，其刺激血管生成和/或心臟血管化。這包括影響血管的疾病，以及血管本身的疾病，諸如動(dòng)脈、毛細(xì)血管、靜脈和/或淋巴的疾病。所述疾病包括但不限于例如動(dòng)脈疾病諸如動(dòng)脈粥樣硬化，糖尿病，高血壓，炎性血管病(inflammatoryvasculitides)，雷諾氏病和雷諾現(xiàn)象，動(dòng)脈瘤以及動(dòng)脈再狹窄；靜脈和淋巴疾病諸如血栓性靜脈炎，淋巴管炎和淋巴水腫；癌癥諸如血管腫瘤，例如血管瘤(毛細(xì)血管性和海綿狀的)，血管球瘤，毛細(xì)管擴(kuò)張，桿菌性血管瘤病，血管內(nèi)皮瘤，血管肉瘤，血管外皮細(xì)胞瘤，卡波西肉瘤，淋巴管瘤和淋巴管肉瘤；腫瘤血管生成；以及其他血管疾病諸如外周血管疾病，外傷諸如創(chuàng)傷、燒傷以及其他損傷的組織，植入物固定，疤痕形成，缺血再灌注損傷，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腦血管疾病，腎臟疾病諸如急性腎衰；發(fā)作綜合征，冠狀動(dòng)脈疾病，高膽固醇血癥，高甘油三酯血癥，和/或骨質(zhì)疏松癥。也包括心絞痛，心肌梗塞諸如急性心肌梗塞，心臟肥大，以及心衰諸如充血性心衰(CHF)。與血脂異常相關(guān)的心血管疾病也包括例如但不限于高血壓，動(dòng)脈粥樣硬化，心衰，發(fā)作綜合征(stroke)，各種冠狀動(dòng)脈疾病，肥胖癥，糖尿病等。
術(shù)語(yǔ)″脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡疾病“包括這樣的病癥，疾病或情況，其與脂質(zhì)代謝的異常調(diào)節(jié)有關(guān)、由其導(dǎo)致和/或相關(guān)聯(lián)。脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡疾病可由以下情況造成或與其相關(guān)異常脂解，異常脂質(zhì)吸收，異常脂質(zhì)合成和/或分泌，異常細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)釋放和/或轉(zhuǎn)化，異常細(xì)胞內(nèi)甘油三酯釋放和/或轉(zhuǎn)化，異常細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和/或甘油三酯團(tuán)塊，和/或細(xì)胞內(nèi)或來(lái)自細(xì)胞的異常分泌的脂質(zhì)和/或甘油三酯團(tuán)塊，例如肝細(xì)胞。脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡疾病包括但不限于，動(dòng)脈粥樣硬化，肥胖癥，與肥胖癥有關(guān)的疾病，糖尿病，胰島素抗性，高脂血癥，低脂血癥，血脂異常，高膽固醇血癥，低膽固醇血癥，甘油三酯儲(chǔ)存疾病，心血管疾病，冠狀動(dòng)脈疾病，高血壓，發(fā)作綜合征，超重，厭食，惡病質(zhì)，高脂蛋白血癥，低脂蛋白血癥，Niemann Pick病，高甘油三酯血癥，低甘油三酯血癥，胰腺炎，彌散性特發(fā)性骨肥大(DISH)，致動(dòng)脈粥樣硬化性脂蛋白表型(ALP)，癲癇，肝疾病，脂肪肝，脂肪性肝炎，多囊卵巢綜合征，癌等。術(shù)語(yǔ)″脂質(zhì)代謝疾病”指膽固醇和甘油三酯的異常臨床化學(xué)水平。術(shù)語(yǔ)“高脂血癥”指血清脂質(zhì)高于正常血清脂質(zhì)水平的的疾病。血清脂質(zhì)包括膽固醇(酯和游離的)，脂蛋白，甘油三酯，游離脂肪酸和其他固醇。一方面，這些脂質(zhì)的水平升高是動(dòng)脈粥樣硬化的指征。
術(shù)語(yǔ)″肥胖癥″指哺乳動(dòng)物的體重指數(shù)(BMI)，其通過體重(kg)每身高2(米2)計(jì)算，為至少25.9。通常，體重正常的人的BMI為19.9到低于25.9。本發(fā)明的肥胖癥可由于任何原因，無(wú)論是基因或環(huán)境的?？蓪?dǎo)致肥胖癥或作為肥胖癥原因的疾病的實(shí)例包括，例如，但不限于，暴食和貪食癥，多囊卵巢綜合征，顱咽管瘤，Prader-Willi綜合征，F(xiàn)rohlich′s綜合征，II型糖尿病，GH-缺乏性受試者，正常變異性身材矮小(normal variant short stature)，Turner′s綜合征以及其他顯示降低的代謝活性或靜息能量消耗作為總無(wú)脂肪體重的百分比降低的病理性情況，例如患有急性淋巴母細(xì)胞白血病的兒童?！胺逝职Y決定性特征”包括脂肪細(xì)胞和組織，諸如脂肪墊，總體重，肌肉甘油三酯水平，肝和脂肪和禁食以及非禁食leptin水平，血中的游離脂肪酸和甘油三酯。
術(shù)語(yǔ)″與肥胖癥相關(guān)的疾病″指作為肥胖癥結(jié)果或者被肥胖癥加重的疾病，諸如但不限于皮膚疾病諸如感染，靜脈曲張，黑棘皮病和濕疹，運(yùn)動(dòng)不耐受，糖尿病，胰島素抵抗，高血壓，高膽甾醇血癥，膽石病，骨關(guān)節(jié)炎，矯形損傷，血栓栓塞性疾病，癌(例如，乳腺癌，結(jié)腸癌，前列腺癌等)，和冠狀動(dòng)脈(或心血管)心臟疾病，具體是與受試者中的高甘油三酯和游離脂肪酸相關(guān)的心血管疾病。
肥胖癥是發(fā)病率最高的體重疾病，估計(jì)影響西方國(guó)家中年人群的30％-50％。其他體重疾病，諸如神經(jīng)性厭食癥和神經(jīng)性貪食癥，總共影響西方國(guó)家女性人群的大約0.2％，也對(duì)健康造成嚴(yán)重威脅。此外，所述疾病諸如厭食癥和惡病質(zhì)(消耗性疾病)也是其他疾病諸如癌癥，囊性纖維化以及AIDS的主要特征。
術(shù)語(yǔ)″消耗性″疾病(例如消耗綜合征，惡病質(zhì)，骨骼肌減少癥)指不良和/或不健康的體重降低或體細(xì)胞重量降低導(dǎo)致的疾病。在老年人和AIDS以及癌癥患者中，消耗性疾病可導(dǎo)致體重的不良減少，包括脂肪和非脂肪部分。消耗性疾病可導(dǎo)致食物的不適當(dāng)攝入和/或與疾病和/或老年化進(jìn)程相關(guān)的代謝改變。癌癥患者和AIDS患者，以及接受全面手術(shù)或患有慢性感染、免疫疾病、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、腸外克隆氏病，精神性疾病、慢性心衰或其他嚴(yán)重的外傷的患者，經(jīng)?；加邢男约膊?，有時(shí)也稱其為惡病質(zhì)，代謝性疾病，還有時(shí)稱為進(jìn)食疾病。惡病質(zhì)的特征還有代謝亢進(jìn)以及分解代謝過度。盡管惡病質(zhì)和消耗性疾病通?？苫Q使用意指消耗性情形，至少有一項(xiàng)研究將惡病質(zhì)與消耗性疾病區(qū)分開來(lái)惡病質(zhì)是非脂肪重量具體是細(xì)胞重量的丟失(Mayer，1999，J.Nutr.129(1S Suppl.)256S-259S)。骨骼肌減少癥是另一種可影響老年個(gè)體的所述疾病，通常特征在于肌肉重量減少。末期的上述消耗性疾病可見于患有惡病質(zhì)或骨骼肌減少癥的患者。
糖尿病是影響動(dòng)物中碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝的慢性疾病。糖尿病是成年人的失明、腎衰和下肢截肢的第一位原因，并且是心血管疾病和發(fā)作綜合征的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。
I型糖尿病(或胰島素依賴型糖尿病(″IDDM″)或青少年糖尿病)占所有糖尿病的大約10％。該疾病的特征在于胰腺beta細(xì)胞的胰島素分泌功能的漸進(jìn)性喪失。該特征也是病源在于胰腺的特發(fā)性或“繼發(fā)性”糖尿病的特征。I型糖尿病與以下臨床表征或癥狀有關(guān)，例如持續(xù)升高的血漿葡萄糖濃度或高血糖；多尿；多飲和/或多食；慢性微血管并發(fā)癥諸如視網(wǎng)膜疾病，腎病和神經(jīng)病；以及大血管并發(fā)癥諸如高脂血癥和高血壓，其導(dǎo)致失明，終末期腎病，截肢和心肌梗塞。
II型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病或NIDDM)是與葡萄糖代謝失調(diào)以及胰島素敏感性受損相關(guān)的代謝疾病。II型糖尿病通常出現(xiàn)在成年期，并且與機(jī)體不能利用或產(chǎn)生足夠的胰島素相關(guān)。除了在靶組織中觀察到的胰島素抗性，患有II型糖尿病的患者具有相對(duì)的胰島素缺乏，即對(duì)于給定的血漿葡萄糖濃度患者具有低于預(yù)期的胰島素水平。II型糖尿病的特征在于以下臨床表征或癥狀，例如持續(xù)升高的血漿葡萄糖濃度或高甘油三酯血癥；多尿；多飲和/或多食；慢性微血管并發(fā)癥諸如視網(wǎng)膜疾病，腎病和神經(jīng)??；以及大血管并發(fā)癥諸如高脂血癥和高血壓，其導(dǎo)致失明，終末期腎病，肢體截肢和心肌梗塞。
X綜合癥，也稱為胰島素抵抗綜合征(IRS)，代謝綜合癥或代謝綜合征X，見于大約2％的診斷性冠狀動(dòng)脈導(dǎo)管插入術(shù)。該疾病通常會(huì)使人殘疾，其表現(xiàn)出發(fā)展成II型糖尿病和心血管疾病的癥狀或危險(xiǎn)因子，包括，例如葡萄糖耐量受損(IGT)，空腹血糖受損(IFG)，高胰島素血癥，胰島素抵抗，血脂異常(例如高甘油三酯，低HDL)，高血壓和肥胖癥。
免疫疾病包括但不限于，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；青少年慢性關(guān)節(jié)炎；脊柱關(guān)節(jié)?。幌到y(tǒng)性硬化(硬皮病)；特發(fā)性炎性肌病(皮肌炎，多肌炎)；干燥綜合征；系統(tǒng)性血管炎；結(jié)節(jié)病；自身免疫性溶血性貧血(免疫性全血細(xì)胞減少癥，陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿)；自身免疫性血小板減少癥(特發(fā)性血小板減少性紫癜，免疫介導(dǎo)的血小板減少癥)；甲狀腺炎(Grave′s病，橋本甲狀腺炎，青少年淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，萎縮性甲狀腺炎)；糖尿??；免疫介導(dǎo)的腎病(腎小球性腎炎，小管間質(zhì)性腎炎)；中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病諸如多發(fā)性硬化，特發(fā)性脫髓鞘性多神經(jīng)病或Guillain-Barré綜合征，以及慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)??；肝膽管疾病諸如感染性肝炎(肝炎A，B，C，D，E以及其它非親肝的病毒)，自身免疫性慢性活性肝炎，原發(fā)性膽汁性肝硬變，肉芽腫性肝炎，和硬化性膽管炎；炎性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎克隆氏病)；谷蛋白敏感性腸病，和Whipple′s??；自身免疫性或免疫介導(dǎo)的皮膚疾病，包括大皰性皮膚病，多形性紅斑和接觸性皮炎，銀屑癬；變應(yīng)性疾病諸如哮喘，過敏性鼻炎，特應(yīng)性皮炎，食物超敏性和風(fēng)疹；肺的免疫性疾病諸如嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)性肺炎，特發(fā)性肺纖維化和過敏性肺炎；和/或移植相關(guān)的疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病。其他疾病可存在，諸如發(fā)育疾病(developmental disease)(例如，胚胎致死)，神經(jīng)疾病(例如，在開放場(chǎng)所活動(dòng)測(cè)驗(yàn)(open field activity testing)中焦慮樣反應(yīng)降低，在戀巢活動(dòng)測(cè)驗(yàn)(home cage activity testing)中的異常生理節(jié)律等)，眼部異常(例如視網(wǎng)膜異常)，和/或骨代謝異?；蚣膊?例如關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松癥，和/或骨胳石化癥)。
本文術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”指可檢測(cè)的化合物或組合物，其直接或間接偶聯(lián)于多肽。該標(biāo)記本身可為可檢測(cè)的(例如放射同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或如果是酶標(biāo)記，可催化可檢測(cè)底物化合物或組合物的化學(xué)變化。
“分離的”核酸分子，是從在多肽核酸的天然來(lái)源其通常結(jié)合的至少一種污染性核酸分子鑒定并分離出的核酸分子。分離的核酸分子并非其天然形式或在其天然環(huán)境中。分離的核酸分子因此與其存在與天然細(xì)胞中的形式不同。然而，分離的核酸分子包括包含的通常表達(dá)這樣的多肽的細(xì)胞中，其中例如所述核酸分子在染色體中的位置與天然細(xì)胞中的情況不同。
術(shù)語(yǔ)“控制序列”指在具體宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所需的DNA序列。適于原核生物的控制序列，例如包括啟動(dòng)子，可選操縱序列，以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子，多腺苷化信號(hào)以及增強(qiáng)子。
當(dāng)核酸與另一核酸序列發(fā)生功能上的關(guān)系時(shí)，該核酸即為“可操作地連接于”另一核酸。例如，如果DNA表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白，則編碼前序列或分泌型前導(dǎo)序列(例如，信號(hào)序列或信號(hào)肽)的DNA與編碼多肽的DNA可操作性地連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操作地連接于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置有利于翻譯，則該核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接于編碼序列。一般而言，“可操作地連接于”是指被鄰接的DNA序列是連續(xù)的，并且在例如分泌型前導(dǎo)序列的情況下為鄰接的并處于閱讀相。連接(linking)通過在方便的限制性位點(diǎn)進(jìn)行接合(ligation)來(lái)完成。若這樣的位點(diǎn)不存在，可依照常規(guī)實(shí)施方法使用合成的寡核苷酸接頭(adaptor)或連接體。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”，“細(xì)胞系”，和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且所有所述名稱包括子代。因此，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代受試細(xì)胞以及來(lái)自其的培養(yǎng)物，而不考慮傳代數(shù)。還應(yīng)理解所有子代的DNA含量可不精確地一致，這是由于有意或無(wú)意突變?cè)斐傻摹?duì)最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行篩選得到的具有相同功能或生物活性的突變體子代包括在本發(fā)明內(nèi)。不同名稱含義不同時(shí)，可從上下文明確看出。
術(shù)語(yǔ)″基因″指(a)含有編碼ANGPTL4的DNA序列的基因，例如，ATCC保藏號(hào)209284，或見圖1；(b)任何編碼ANGPTL4氨基酸序列的DNA序列(見例如，圖2)，和/或；(c)任何與本發(fā)明公開的編碼序列的互補(bǔ)序列雜交的DNA序列。一些實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)包括編碼以及非編碼區(qū)，優(yōu)選包括正?；虮磉_(dá)所需的所有序列。
術(shù)語(yǔ)″基因靶向(gene targeting)″指在以下情形出現(xiàn)的同源重組類型當(dāng)基因組DNA片段被引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并且該片段定位并與內(nèi)源同源序列同源重組時(shí)。通過同源重組進(jìn)行的基因靶向采用重組DNA技術(shù)來(lái)用特定設(shè)計(jì)的外源DNA取代特異性基因組序列。
術(shù)語(yǔ)″同源重組″指兩個(gè)DNA分子或染色單體在同源核苷酸序列位點(diǎn)的DNA片段的交換。
術(shù)語(yǔ)″靶基因″(可選稱作“靶基因序列”或“靶DNA序列”)指任何將通過同源重組修飾的核酸分子，多核苷酸或基因。靶序列包括完整基因，外顯子或內(nèi)含子，調(diào)節(jié)序列或基因間的任何區(qū)域。靶基因可包括個(gè)體的基因組DNA中具體基因或基因座的一部分。
ANGPTL4基因的“破壞”出現(xiàn)于基因組DNA的片段定位并與內(nèi)源同源序列重組的情況，其中所述破壞是天然序列或其一部分的缺失，或天然基因中的突變，或其中所述突變是天然基因的功能失活。可選，序列破壞可利用基因捕獲載體(即非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其含有并表達(dá)隨機(jī)插入的轉(zhuǎn)基因；參見例如2002-8-20公開的美國(guó)專利6,436,707)通過非特異性插入失活來(lái)產(chǎn)生。這些序列破壞或修飾可包括DNA序列的插入，錯(cuò)義，移碼，缺失或取代或置換，或其任意組合。插入包括整個(gè)基因的插入，其可為動(dòng)物，植物，真菌，昆蟲，原核或病毒來(lái)源的。破壞，例如可通過部分或完全抑制正?；虍a(chǎn)物的產(chǎn)生或提高正常基因產(chǎn)物的活性來(lái)改變?cè)撜；虍a(chǎn)物。一個(gè)實(shí)施方案中，所述破壞是消除(null)破壞，其中沒有ANGPTL4基因的有意義的表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)″天然表達(dá)″指ANGPTL4基因編碼的全長(zhǎng)多肽的表達(dá)，其為在野生型小鼠中存在的表達(dá)水平。因此，其中內(nèi)源ANGPTL4基因“無(wú)天然表達(dá)“的破壞指部分或完全減少單個(gè)細(xì)胞、所選細(xì)胞或哺乳動(dòng)物的所有細(xì)胞的內(nèi)源ANGPTL4基因編碼的至少部分多肽的表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)″敲除″指ANGPTL4基因的破壞，其中該破壞導(dǎo)致天然基因的功能失活；天然基因或其部分的缺失；或天然基因中的突變。
術(shù)語(yǔ)″敲入(knock-in)″指用編碼ANGPTL4編碼基因或其變體的人cDNA取代小鼠同系物(或其他小鼠基因)(即該破壞導(dǎo)致天然人基因?qū)μ烊恍∈蠡虻娜〈?。
術(shù)語(yǔ)″構(gòu)建體″指待轉(zhuǎn)入靶組織、細(xì)胞系或動(dòng)物的人工合成的DNA片段。通常，所述構(gòu)建體將包括目的基因或核酸序列，標(biāo)記基因和適宜的控制序列。如本發(fā)明提供的，靶向型ANGPTL4構(gòu)建體包括與ANGPTL4基因的至少一部分同源的DNA序列并能在宿主的ANGPTL4基因中產(chǎn)生破壞。
術(shù)語(yǔ)″轉(zhuǎn)基因細(xì)胞″指其基因組中含有的ANGPTL4基因已經(jīng)通過基因靶向方法被完全或部分破壞、修飾、改變或取代的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)″轉(zhuǎn)基因動(dòng)物″指其基因組中含有的具體基因已經(jīng)通過本發(fā)明描述的方法或本領(lǐng)域已知的方法被破壞或修飾或突變的動(dòng)物。一些實(shí)施方案中，所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物諸如大鼠或小鼠。此外，“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”可為雜合動(dòng)物(即一條缺陷的等位基因和一條野生型等位基因)或純合動(dòng)物(即兩條缺陷的等位基因)。胚胎被認(rèn)為落入動(dòng)物的定義范圍內(nèi)。提供動(dòng)物包括提供子宮內(nèi)的胚胎或胎兒，無(wú)論是通過交配或其他方式，也無(wú)論該胚胎是否將被娩出。
本文術(shù)語(yǔ)“選擇標(biāo)記”和“位置選擇標(biāo)記”指編碼僅僅能使得攜帶該基因的細(xì)胞在具體條件下生存和/或生長(zhǎng)的產(chǎn)物的基因。例如，表達(dá)導(dǎo)入的新霉素抗性(Neor)基因的植物和動(dòng)物細(xì)胞對(duì)化合物G418抵抗。不攜帶Neor基因標(biāo)記的細(xì)胞被G418殺死。其他陽(yáng)性選擇標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，或在其知識(shí)范圍內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)″調(diào)節(jié)″在本文指減少、抑制、降低、緩解、增加或增強(qiáng)ANGPTL4基因功能、表達(dá)、活性或可選與ANGPTL4基因相關(guān)的表型。
術(shù)語(yǔ)″異常″指任何與ANGPTL4有關(guān)的疾病、病癥、情形或表型，包括病理性情形和行為觀察。
ANGPTL4本發(fā)明是意圖進(jìn)一步說明ANGPTL4的生物功能以及其在疾病狀態(tài)中的作用的結(jié)果。ANGPTL4表達(dá)主要見于胎盤，脂肪，肝和腎組織。本發(fā)明還提供ANGPTL4以及ANGPTL4調(diào)節(jié)物在肝細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡領(lǐng)域中的應(yīng)用。本發(fā)明還描述其ANGPTL4基因中包含破壞的轉(zhuǎn)基因或敲除小鼠，以及其應(yīng)用。
血管生成素樣4蛋白(ANGPTL4)是分泌蛋白并且是血管生成素家族的成員。其還已知為肝纖維蛋白原/血管生成素-相關(guān)蛋白(HFARP)(Kim et al.，Biochem.J.346603-610(2000))，PGAR(PPARγ血管生成素相關(guān)蛋白)(Yoon，et al.，Mol.Cell Biol.，205343-5349(2000))，禁食誘導(dǎo)的脂肪因子(FIAF)(Kerten et al.，J.Biol.Chem.，27528488-28493(2000))；血管生成素-相關(guān)蛋白(ARP-4)；NL2(見美國(guó)專利6,348,350；6,372,491；和6,455,496)；以及Ang6。
人ANGPTL4蛋白是406個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(例如，美國(guó)專利6,348,350，6,372,491 & 6,455,496)，鼠ANGPTL4是410個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(Kim et al.，Biochem.J.346603-610(2000))。鼠和人ANGPTL4蛋白在氨基酸水平共享大約75％同一性。Kim et al.，Biochem.J.346603-610(2000)。ANGPTL4具有信號(hào)肽，三個(gè)可能的N糖基化位點(diǎn)，以及四個(gè)可參與分子間二硫鍵的半胱氨酸。ANGPTL4形成高級(jí)的分子結(jié)構(gòu)，例如，圖3的圖A所示。也見，例如，Ge et al.，J.Biol.Chem.，279(3)2038-2045(2004)；Ge et al.，J.Lipid Res.452071-2079(2004)；和Mandard et al.，J.of Biol.Chem.，279(33)34411-34420(2004)。ANGPTL4也可經(jīng)蛋白水解加工，例如ANGPTL4的取代R162G和R164E導(dǎo)致變體ANGPTL4在SDS凝膠上的分子量高于野生型蛋白的分子量(見圖3，圖B).也見，例如，Ge et al.，J.Biol.Chem.，279(3)2038-2045(2004)；和Mandard et al.，J.of Biol.Chem.，279(33)34411-34420(2004)。
血管生成素家族的保守區(qū)包括螺旋區(qū)和C末端纖維蛋白原(FBN)樣結(jié)構(gòu)域。見例如，Kim et al.，Biochem.J.346603-610(2000)。這表明ANGPTL4以常規(guī)方式經(jīng)蛋白水解加工釋放C末端纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域。見例如，Ge etal.，J.Biol.Chem.，279(3)2038-2045(2004)。
ANGPTL4結(jié)合整合素αvβ5.見例如，圖9，圖A-E。該家族的另一成員，血管生成素-樣3蛋白(ANGPTL3)是結(jié)合整合素αvβ3的血管生成因子。見例如，US專利申請(qǐng)20030215451，其公開于2003-11-20，以及Camenisch etal.，J.Biol.Chem.，277(19)17281-17290(2002)。ANGPTL3不結(jié)合受體Tie2。Camenish et al.，Journal of Biol.Chem.277(19)17281-17290(2002)。ANGPTL3也是血漿脂質(zhì)水平調(diào)節(jié)物。見例如，Koishi et al.，Nat.Genetics30151-157(2002)。
整合素αVβ5是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白包括玻連蛋白和Del-1的受體(見例如，Stupack and Cheresh，Journal of Cell Science 1153729-3738(2002))。Alpha v-整合素參與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。見例如，Marshall，J F and Hart，I R Semin.Cancer Biol.7(3)129-38(1996)。此外，alpha v-整合素在血管生成中的作用也已經(jīng)顯示。見例如，Eliceiri，B P and Cheresh，D A Molecular Medicine 4741-750(1998)。例如，αVβ5的單克隆抗體抑制兔角膜和雞絨毛膜尿囊膜模型中VEGF誘導(dǎo)的血管生成作用。見例如，M.C.Friedlander，et al.，Science2701500-1502(1995)。αVβ3和αVβ5的拮抗劑以抑制生長(zhǎng)因子和腫瘤誘導(dǎo)的血管生成作用。見例如，Eliceiri and Cheresh，Current Opinion in Cell Biology，13563-568(2001)。
ANGPTL4的用途以及ANGPTL4的調(diào)節(jié)物本發(fā)明提供了ANGPTL4或其激動(dòng)劑或拮抗劑的用途，用于調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活性和過程，例如肝細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞粘附，以及前脂肪細(xì)胞增殖和/或前脂肪細(xì)胞遷移。ANGPTL4參與調(diào)節(jié)甘油三酯和膽固醇的血清水平。此外，ANGPTL4也可為炎性反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)物。ANGPTL4調(diào)節(jié)物可用于治療與這些活性相關(guān)的疾病或病癥。
肝ANGPTL4刺激肝細(xì)胞的增殖以及肝細(xì)胞的粘附。肝是膽固醇動(dòng)態(tài)平衡的主要器官。也見本發(fā)明的“脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡”部分。肝合成并分泌極低密度脂蛋白(VLDL)。在循環(huán)中，VLDL將代謝稱為低密度脂蛋白(LDL)，其為血漿中的主要膽固醇攜帶脂蛋白。
肝的作用是消化道和機(jī)體其它部分之間的衛(wèi)士。肝主要的功能涉及對(duì)大量諸如碳水化合物、脂質(zhì)、氨基酸、微生物和微量元素的有效的吸收、存儲(chǔ)、代謝以及將其分配到血液和膽汁中。肝的另一功能是通過階段I(氧化/還原)和階段II(偶聯(lián))機(jī)制對(duì)異型生物質(zhì)污染物、藥物和內(nèi)源代謝物的解毒作用。
肝是人體的主要代謝控制器官，其包括上千個(gè)微小的小葉(小葉性肝炎)，這些小葉是肝這個(gè)器官的功能單元。肝組織含有兩種主要的分化的細(xì)胞類型實(shí)質(zhì)細(xì)胞(即肝細(xì)胞)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。肝的復(fù)雜功能在很大程度上是肝細(xì)胞執(zhí)行的，而非實(shí)質(zhì)細(xì)胞諸如Kupffer細(xì)胞，Ito細(xì)胞和肝竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)在對(duì)肝細(xì)胞的支持和提供供給上起重要作用。Mochida et al.Biochem.Biophy.Res.Comm.226176-179(1996).
除了早期發(fā)育過程中的正常生長(zhǎng)，肝組織還具有在成年階段再生的獨(dú)特能力。肝組織損失后的肝再生是響應(yīng)于各種形式的肝損傷的恢復(fù)過程的基本組成部分，所述肝損傷諸如肝中毒，病毒感染，血管損傷和部分肝切除。部分肝切除之后，例如肝的體積通常在大約6天之內(nèi)恢復(fù)到其原來(lái)的大小。肝生長(zhǎng)和再生涉及肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞諸如竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。通常，肝細(xì)胞首先增殖，之后約24小時(shí)肝的其它細(xì)胞進(jìn)入DNA合成階段。Michalopoulos and DeFrances Science 27660-65(1997)。
本發(fā)明提供了通過給藥有效量的ANGPTL4或其激動(dòng)劑促進(jìn)肝生長(zhǎng)和/或肝細(xì)胞增殖的方法。本發(fā)明的促進(jìn)效應(yīng)可利用本領(lǐng)域已知的方法在體外或體內(nèi)評(píng)估。見例如，Drakes et al.J.Immunol.1594268(1997)；Omori et al.Hepatology 26720(1997)；美國(guó)專利5,227,158。例如，利用本領(lǐng)域已知的以下方法在培養(yǎng)過程中評(píng)估細(xì)胞增殖測(cè)定DNA合成速率(見例如，Nakamuraet al.Biochem.Biophy.Res.Comm.1221450(1984)，錐蟲藍(lán)染色排除(exclusion)/血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)(見例如，Omiri et al.(1997)supra)，或流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(見例如，Drakes(1997)supra).
本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將ANGPTL4或其激動(dòng)劑給藥以誘導(dǎo)肝細(xì)胞的細(xì)胞粘附。肝細(xì)胞的粘附可通過本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定，包括例如結(jié)晶紫測(cè)定法。也見Landegren，U.J.Immunological Methods，67379-388(1984)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將肝細(xì)胞和其它非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞從靶肝分離并重懸于適宜的組織培養(yǎng)基中，其中含有ANGPTL4和ANGPTL4激動(dòng)劑以誘導(dǎo)細(xì)胞粘附。如果有必要，可進(jìn)一步通過在不同速度進(jìn)行不同時(shí)間的離心來(lái)分離不同的細(xì)胞部分(例如分離實(shí)質(zhì)細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞)。
另一實(shí)施方案中，ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑對(duì)肝細(xì)胞和整個(gè)肝器官的增殖效應(yīng)在體內(nèi)利用例如肝組織樣品的組織化學(xué)測(cè)定法來(lái)測(cè)定。一方面，肝細(xì)胞的體內(nèi)增殖效應(yīng)通過抗體針對(duì)已知在增殖細(xì)胞中的濃度高于在非增殖細(xì)胞中的濃度的蛋白質(zhì)的反應(yīng)性來(lái)測(cè)定，諸如增殖細(xì)胞核抗原(PCNA或細(xì)胞周期蛋白)。Rodgers et al.J.Burn Care Rehabil.18381-388(1997)。另一方面，也可如Gerber et al.Development 1261149-1159(1999)所述使用BrdU免疫組織化學(xué)測(cè)定法。
由于其對(duì)于生命的重要作用，肝功能不良和疾病通常使人衰弱并威脅生命。多種急性或慢性病理疾病與肝的結(jié)構(gòu)和/或功能異常相關(guān)。這些包括，但不限于，肝衰竭，肝炎(急性，慢性和酒精性)，肝硬變，毒性肝損傷，藥物性肝損傷，肝性腦病，肝昏迷或肝壞死?？赏ㄟ^促進(jìn)肝細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)治療肝疾病。本發(fā)明的化合物和方法可修復(fù)肝損傷。不受理論限制，據(jù)信這可直接和間接通過刺激肝細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂來(lái)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供通過給藥有效量的本發(fā)明的ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑來(lái)治療受試者中的病理性肝疾病的方法。
術(shù)語(yǔ)“病理性肝疾病”可與“肝疾病”或“肝病癥”互換使用，意指任何結(jié)構(gòu)性和/或功能性肝異常。病理性肝疾病的非限制性實(shí)例包括與肝衰竭、肝炎(急性、慢性或酒精性)、肝硬變、中毒性肝損傷、藥物性肝損傷、肝性腦病，肝昏迷或肝壞死。
一方面中，本發(fā)明提供保護(hù)對(duì)導(dǎo)致肝損傷的疾病或因素敏感的受試者中的肝免受損傷。術(shù)語(yǔ)“肝損傷”在本發(fā)明以最廣泛的意義使用，指任何直接或間接由內(nèi)部或外部因素或它們的組合導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)或功能性肝損傷。肝損傷可通過多種因素誘導(dǎo)，所述因素包括但不限于暴露于肝毒性化合物，放射暴露，機(jī)械性肝損傷，遺傳傾向，病毒感染，自身免疫疾病，諸如自身免疫性慢性肝炎，結(jié)果導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)升高，諸如肌動(dòng)蛋白和TGF-β。肝毒性化合物誘導(dǎo)的肝損傷包括直接細(xì)胞毒性，包括藥物超敏反應(yīng)，膽汁郁積，以及血管內(nèi)皮損傷。
許多化學(xué)和生物藥劑，無(wú)論是治療性的還是純有害的，可誘導(dǎo)肝損傷并由此是肝毒性的。肝毒性化合物也可以是慢性肝疾病包括脂肪肝、肝炎、肝硬化以及肝的血管和腫瘤形成損傷的重要原因。(Sinclair et al.，Textbook ofInternal Medicine，569-575(1992)(editor，Kelley；Publisher，J.B.LippincottCo.)。本發(fā)明提供了保護(hù)受試者的肝免受暴露于肝毒性藥劑導(dǎo)致的損傷的方法，包括給藥受試者ANGPTL4和其激動(dòng)劑，其中所述ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑可有效保護(hù)肝免受損傷。一方面，ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑在將所述受試者暴露于肝毒性藥劑之前或同時(shí)給藥，所述肝毒性藥劑是治療劑諸如用于治療癌癥的化療劑或放射劑。由此，所述方法通過允許受試者耐受更高劑量的治療劑提高治療的效力。另一方面，ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑的給藥在將受試者暴露于肝毒性藥劑之后但在受試者中出現(xiàn)任何可檢測(cè)的肝損傷之前。所述方法可用于治療由于受試者意外暴露于肝毒性藥劑導(dǎo)致的肝損傷。
肝毒性藥劑可通過對(duì)肝的細(xì)胞毒性直接誘導(dǎo)肝損傷，或通過以下方式誘導(dǎo)毒性代謝物的生成(這一種類包括類似藥物過敏癥的超敏反應(yīng))；膽汁郁積，膽管堵塞導(dǎo)致的膽汁流動(dòng)停滯；以及血管損傷，諸如靜脈閉塞性疾病(veno occlusive disease)(VOD)中的，其中血管內(nèi)皮的損傷導(dǎo)致肝靜脈血栓形成。個(gè)體對(duì)肝毒性藥劑誘導(dǎo)的肝損傷的易感性受遺傳因素、年齡、性別、營(yíng)養(yǎng)狀況、對(duì)其他藥物的暴露情況以及系統(tǒng)性疾病的影響(Sinclair etal.，Textbook of Internal Medicine，supra)。
許多肝毒性化合物出人意料地在小部分受試者中產(chǎn)生肝損傷。一些患者中，肝損傷被稱為超敏反應(yīng)并且像藥物反應(yīng)一樣，其中患者患有發(fā)熱，出疹以及紅細(xì)胞增多癥，并且在用藥物再攻擊時(shí)出現(xiàn)癥狀的復(fù)發(fā)。其他情況中，受傷的機(jī)制未知并且可代表敏感患者中的異常代謝，其允許肝毒性代謝物的產(chǎn)生或積累。
那些通過直接化學(xué)攻擊誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的藥物包括以下這些麻醉劑，諸如安氟醚，氟乙烯醚，氟烷，和甲氧氟烷；Neuropsychotropics，諸如可卡因，酰肼，哌甲酯和三環(huán)抗抑郁藥物；抗痙攣藥物，諸如苯妥營(yíng)和丙戊酸；止痛藥，諸如，對(duì)乙酰氨基酚，氯唑沙宗，丹曲林，雙氯芬酸，布洛芬，茚甲新，唾液酸鹽/酯，托美汀，和氯苯惡唑胺；激素，諸如，乙酰苯磺酰環(huán)己脲，氨磺丁脲，格列吡嗪，氨甲磺環(huán)己脲，丙硫氧嘧啶，他莫昔芬，已烯雌酚；抗微生物藥物，諸如，兩性霉素B，氯林可霉素，酮康唑，甲苯咪唑，滅滴靈，苯甲異噁唑青霉素，對(duì)氨基水楊酸，青霉素，利福平，磺酰胺，四環(huán)素，和疊氮胸苷；心血管藥物，諸如，胺碘酮，Dilitiazem，a-甲基多巴，美西律，Hydrazaline，煙酸，罌粟堿，哌克昔林，普魯卡因胺，奎納定，和Tocainamide；以及免疫抑制劑和抗腫瘤藥劑，諸如天冬酰胺酶，順鉑，環(huán)磷酰胺，氮烯咪胺，阿霉素，氟尿嘧啶，甲氨喋呤，光輝霉素，6-MP，亞硝基脲，他莫昔芬，硫鳥嘌呤，和長(zhǎng)春新堿；以及其他藥物，諸如，諸如，雙硫侖，碘離子，酚丁，維生素A和對(duì)氨苯甲酸。
那些在肝中產(chǎn)生過敏反應(yīng)的肝毒性化合物包括以下物質(zhì)苯妥英，對(duì)氨基水楊酸，氯丙嗪，磺酰胺，依托紅霉素(Erythromycin estolate)，異煙肼，氟烷，甲基多巴，和丙戊酸。肝毒性化合物包括膽汁郁積，膽汁流動(dòng)停滯，可有多種形式。中心小葉型膽汁郁積(Centribular cholestasis)伴有膽管炎性改變(portal inflammatory changes)。據(jù)報(bào)道一些藥物可導(dǎo)致膽管改變，所述藥物諸如紅霉素，而純小管(canalicular)型膽汁郁積是其他藥物諸如促蛋白合成性類固醇的特征。慢性膽汁郁積與藥物諸如甲睪酮和雌二醇有關(guān)。
誘導(dǎo)膽汁郁積性疾病的那些肝毒性化合物包括避孕用類固醇，雄性類固醇，促合成的類固醇，乙酰水楊酸，硫唑嘌呤，地西泮，鵝脫氧膽酸(Chenodeoxycholic acid)，甲氨二氮草(Chlordiazepoxide)，依托紅霉素，氟非那嗪，速尿，灰黃霉素，氟哌丁苯，丙咪嗪，6-巰基嘌呤，甲巰基咪唑，甲氨蝶呤，甲基多巴，亞甲基二胺(Methylenediamine)，甲基睪酮，萘普生，呋喃妥英，青霉胺，羥哌氯丙嗪，氯吡嗪，普馬嗪，硫苯噠唑，甲硫噠嗪，甲苯磺丁脲，Trimethoprimsulfamethoxazole，砷，銅，和百草枯(Paraquat)。
一些藥物，盡管本來(lái)是致膽汁郁積型的，也可產(chǎn)生肝毒性，并由此它們導(dǎo)致的肝損傷是混合的。導(dǎo)致混合型肝損傷的藥物包括例如以下藥物氯丙嗪，苯基丁氮酮，氟烷，甲氨二氮草(Chlordiazepoxide)，安定，別嘌呤醇，苯巴比妥，萘普生，丙基硫尿嘧啶，氯霉素，Trimethoprimsulfamethoxazxole，氨吡酮，吡二丙胺，硫唑嘌呤，西米替丁和雷尼替丁。
肝的血管損傷包括肝靜脈血栓形成，肝小靜脈或靜脈閉塞疾病(VOD)，和肝炎性紫癜，可由藥物誘導(dǎo)。此外，損傷包括竇狀隙擴(kuò)張，竇狀隙周纖維化以及肝門脈硬化可出現(xiàn)。中間區(qū)和中心周圍竇狀隙擴(kuò)張作為口服避孕治療的并發(fā)癥首先報(bào)道。肝炎性紫癜包括大的充血空腔，其是紅細(xì)胞漏出內(nèi)皮屏障的結(jié)果，然后是竇狀隙周纖維化。這已經(jīng)在服用口服避孕藥、促合成類固醇、硫唑嘌呤和達(dá)那唑的患者中描述。肝中心靜脈的損傷和阻塞也已知與吡咯聯(lián)啶生物堿(Pyrriolizidine alkaloid)諸如bush teas的攝入有關(guān)。最初的損傷是中心硬化伴有小靜脈徑的漸進(jìn)性減小。當(dāng)藥物被停用時(shí)所有這些損傷可以僅僅是部分可逆的并且可發(fā)展成硬化。
多種類型的良性和惡性腫瘤可以是肝毒性化合物給藥的結(jié)果。腺瘤是限制于懷孕期婦女的損傷，與避孕性類固醇的使用相關(guān)并且其風(fēng)險(xiǎn)隨使用的持續(xù)時(shí)間而增加。肝細(xì)胞癌也可見于服用雄性激素來(lái)治療再生障礙性貧血或垂體機(jī)能減退的患者中。
已知導(dǎo)致肝損傷的肝毒性化合物包括以下物質(zhì)避孕用類固醇，吡咯聯(lián)啶生物堿，烏拉坦，硫唑嘌呤，6-巰基嘌呤，6-硫鳥嘌呤，絲裂霉素，BCNU，長(zhǎng)春新堿，阿霉素，靜脈內(nèi)維生素E，促合成性雄性激素，硫唑嘌呤，醋酸甲羥孕酮，硫酸雌酮，他莫昔芬，無(wú)機(jī)砷，二氧化釷，維生素A，甲氨蝶呤，鹽酸去氧麻黃堿，維生素A，皮質(zhì)類固醇，二氧化釷，和鐳治療。
其他因素導(dǎo)致的肝損傷通常也形式相似。肝損傷(無(wú)論是化合物、放射療法、遺傳傾向、機(jī)械損傷和任何所述因素以及其他因素的組合導(dǎo)致的)可通過多種方法檢出。在臨床上已經(jīng)使用生化檢測(cè)作為肝毒性的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)多年。大多數(shù)生化檢測(cè)通常分為兩類測(cè)定特異性肝標(biāo)記物，例如凝血酶原凝結(jié)時(shí)間，和/或肝血流，或分析血清標(biāo)記的檢測(cè)，用于檢測(cè)硬化、膽汁郁積、進(jìn)展性纖維生成或肝細(xì)胞瘤的檢測(cè)(Cornelius，C.in Hepatotoxicology，Meeks et al.eds.，pgs.181-185(1991))。所述檢測(cè)的重要性在于它們的簡(jiǎn)單性以及它們是非入侵性的事實(shí)。在評(píng)估肝損傷中使用血清酶的基本原理在于這些酶，通常包含在細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)進(jìn)入全身循環(huán)。
升高的血清酶活性提示硬化和/或膽汁郁積。血清膽紅素水平升高提示肝內(nèi)或肝外膽汁郁積。但是，使用血清酶水平作為診斷肝損傷的單個(gè)指標(biāo)有一定的局限性。血清酶水平的升高可以是藥劑的系統(tǒng)性作用使得細(xì)胞通透性改變導(dǎo)致其從細(xì)胞漏出而不是化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的特定肝損傷的結(jié)果。肝的組織病理學(xué)檢查是鑒定和定量肝損傷的性質(zhì)和程度的下一個(gè)合理步驟。
血清酶作為肝損傷的標(biāo)記可基于對(duì)肝損傷的特異性和敏感性分成四組(Kodavanti et al.，Toxicologic Pathology 20(4)556-69(1992)；Kodavanti et al.，Archives of Toxicology 63(5)367-75(1989)。
組I這些酶的升高指示選擇性較高的肝膽汁郁積，例如堿性磷酸酶(AP)，5′-核苷酸酶(5′-ND)，和a-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(G-GT)以及亮氨酸氨肽酶(LAP)。組II這些酶的升高指示實(shí)質(zhì)的損傷，例如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(ALD)，乳酸脫氫酶(LDH)，異檸檬酸脫氫酶(ICDH)，鳥氨酸-氨基甲酰-轉(zhuǎn)移酶(OCT)，以及山梨醇脫氫酶(SDH)精氨酸酶和鳥嘌呤酶。組III這些酶的升高代表其他組織的損傷例如，肌酸磷酸激酶(CPK)。組IV這些酶在肝損傷中受到抑制，例如，膽堿脂酶(ChE)。
其他血清標(biāo)記包括，原骨膠原III型肽水平(PIIIP)用來(lái)評(píng)價(jià)肝纖維生成是否活躍；肝性腦病中的血氨水平；硬化和肝細(xì)胞瘤中配體的水平；由于肝內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的透明質(zhì)酸鹽水平；a-1-胎蛋白(AFP)水平用于檢測(cè)肝細(xì)胞瘤；癌胚抗原(CEA)水平用于檢測(cè)向肝的癌轉(zhuǎn)移；抗多種細(xì)胞成分諸如線粒體，細(xì)胞核以及特異性肝細(xì)胞膜蛋白抗體的升高；以及蛋白諸如白蛋白，球蛋白，氨基酸，膽固醇以及其他脂質(zhì)的檢測(cè)。此外，獲自肝活檢的多種礦物質(zhì)、代謝物以及酶的生化分析可用于研究先天性、獲得性和試驗(yàn)誘導(dǎo)性肝疾病中的特異性生化缺陷。
可檢測(cè)肝功能來(lái)評(píng)估肝損傷。肝功能檢測(cè)包括組I評(píng)估有機(jī)離子的肝清除，諸如膽紅素，靛青綠(ICG)，磺溴酞(BSP)和膽酸；組II通過測(cè)定半乳糖和ICG清除率評(píng)估肝血流；和組III，通過利用氨基比林呼吸測(cè)定法和咖啡因清除率測(cè)定法評(píng)估肝微粒體功能。例如，可測(cè)定血清膽紅素來(lái)證實(shí)黃疸的存在和嚴(yán)重性以及測(cè)定高膽紅素血癥的程度，如在實(shí)質(zhì)性肝疾病中所見的。氨基轉(zhuǎn)移酶(轉(zhuǎn)氨酶)升高表明活性肝細(xì)胞損傷的嚴(yán)重性，而堿性磷酸酶升高見于膽汁郁積和肝浸潤(rùn)(Isselbacher，K.and Podolsky，D.inHarrisson′s Principles of Internal Medicine，12th edition，Wilson et al.eds.，21301-1308(1991))。進(jìn)行血清酶分析的方法是本領(lǐng)域已知的，并例如在Kodavanti et al.supra中描述。
由于大面積肝損傷可導(dǎo)致白蛋白、凝血酶原、纖維蛋白原以及其他只由肝細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)在血中的水平降低，這些蛋白質(zhì)水平可作為肝損傷的指示物來(lái)測(cè)定。與血清酶測(cè)定相反，血清蛋白測(cè)定反應(yīng)了肝的合成功能而不僅僅是細(xì)胞損傷(Podolsky，D.Harrison’s Principles of Internal Medicine，12th edition，Wilson et al.eds.，21308-1311(1991))。
許多患者中，需要計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)(CT)，超聲，閃爍掃描或肝活檢來(lái)測(cè)定肝疾病的性質(zhì)(Isselbacher，K，and Friedman，L.and Needleman，L.inHarrison′s Principles of Internal Medicine，12th edition，Wilson et al.eds.，21303-1307(1991))。
本發(fā)明提供提高受試者中治療效果的方法，所述方法包括在治療之前或同時(shí)以能有效保護(hù)受到肝毒性化合物損傷的受試者的肝的方式給予所述受試者ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑，由此增加受試者對(duì)治療的耐受性。例如，在化療過程中所用的化療劑對(duì)肝細(xì)胞具有細(xì)胞毒性效應(yīng)，由此限制該化療劑給予患者的劑量和/或持續(xù)時(shí)間。通過將肝暴露于包含ANGPTL4或ANGPTL4拮抗劑的組合物，所述毒性效應(yīng)可被預(yù)防或減輕。由此，化療劑的劑量可減少，由此提高癌癥治療的效力。
ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑可與其他藥劑在本發(fā)明所述的方法中聯(lián)用。例如，多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子據(jù)稱可誘導(dǎo)肝再生，特別是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，上皮生長(zhǎng)因子(EGF)，轉(zhuǎn)化性生長(zhǎng)因子-(TGF-)，白介素-6(IL-6)，腫瘤壞死因子-(TNF-α)，堿性和酸性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子，CTGF，HB-EGF，和去甲腎上腺素。Fujiwara et al.Hepatol.181443-9(1993)；Baruchet al.J.Hepatol.23328-32(1995)；Ito et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.19825-31(1994)；Suzuma et al.J.Biol.Chem.27540725-31(2000)；and，Michalopoulos and DeFrances(1997)supra。這些可與ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑聯(lián)用。
最有效的肝有絲分裂原之一HGF，首先被鑒定為能刺激培養(yǎng)的肝細(xì)胞中的DNA合成的因子，但是現(xiàn)在已知其對(duì)多種上皮細(xì)胞具有多重不同的功能。Nakamura et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.1221450(1984)；and，Russell et al.J.Cell.Physiol.119183-192(1984).HGF也已知為分散因子(SF)，導(dǎo)致HGF/SF這樣的稱謂。Stoker and Perryman J.Cell Sci.77209-223(1985)；and，Gherardi and Stoker Nature 346228(1990)。HGF的生物效應(yīng)通過信號(hào)酪氨酸激酶受體，Met，Met原癌基因的產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)。在肝中，HGF在非肝細(xì)胞中表達(dá)，諸如Ito細(xì)胞和LSEC，而met轉(zhuǎn)錄物在肝細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)。Hu et al.Am.J.Pathol.1421823-1830(1993)?；瘜W(xué)或機(jī)械肝損傷之后，HGF水平劇增，導(dǎo)致肝細(xì)胞強(qiáng)增生。Horimoto et al.J.Hepatol.23174-183(1995)。轉(zhuǎn)基因小鼠的肝(其中的HGF在肝特異性過表達(dá))是對(duì)照動(dòng)物的大小的兩倍并且它們?cè)诓糠指吻谐笤偕靡斓枚?。Sakata et al.(1996)CellGrowth Differ.71513-1523；Shiota et al.(1994)Hepatol.19962-972。
血管生成是重要的細(xì)胞事件，其中內(nèi)皮細(xì)胞增殖，修剪，并重新組織從已經(jīng)存在的血管網(wǎng)絡(luò)形成新的血管。存在強(qiáng)有力的證據(jù)表明血管供給的發(fā)展對(duì)于正常和病理性增殖過程是必不可少的(Folkman and Klagsbrun(1987)Science 235442-447)。再生性肝，與快速生長(zhǎng)的腫瘤相似，必須合成新的基質(zhì)和血管。見例如，WO03/103581；Yamane et al.Oncogene 92683-2690(1994)；Mochida et al.Biochem.Biophy.Res.Comm.226176-179(1996)；Ajioka et al.Hepatology 29396-402(1999)；and，Assy et al.J.Hepatol.30911-915(1999).Michalopoulos and DeFrances(1997)supra；Mochida et al.(1996).本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，將ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑與血管生成藥劑例如，VEGF或VEGFR的激動(dòng)劑聯(lián)合給藥?！把苌梢蜃踊蛩巹笔谴碳ぱ馨l(fā)育的生長(zhǎng)因子，例如促進(jìn)血管生成，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，血管穩(wěn)定，和/或脈管生成(vasculogenesis)等。例如，血管生成因子包括但不限于，例如，VEGF和VEGF家族(A，B，C，D，和E)成員，PlGF，PDGF家族，纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(FGFs)，TIE配體(血管生成素s)，ANGPTL3，ephrins等。其也包括加速傷口愈合的因子，諸如生長(zhǎng)激素，胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)，VIGF，上皮生長(zhǎng)因子(EGF)，CTGF及其家族成員，和TGF-α及TGF-β。見例如，Klagsbrun and D’Amore，Annu.Rev，Physiol.，53217-39(1991)；Streit and Detmar，Oncogene，223172-3179(2003)；Ferrara & Alitalo，NatureMedicine 5(12)1359-1364(1999)；Tonini et al.，Oncogene，226549-6556(2003)(例如，表1列出已知的血管生成因子)；和，Sato Iht.J.Clin.Oncol.，8200-206(2003)。
脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡除肝以外，ANGPTL4對(duì)于調(diào)節(jié)的能量動(dòng)態(tài)平衡的其它方面有用。ANGPTL4與脂質(zhì)分化，全身脂質(zhì)代謝以及血管生成有關(guān)。見例如，Yoon et al.，Molecular and Cellular Biology，20(14)5343-5349(2000)；Le Jan et al.，American Journal of Pathology，162(5)1521-1528(2003)；和EP 1403367。ANGPTL4表達(dá)也由脂肪組織中的PPARgamma和alpha誘導(dǎo)，并由饑餓誘導(dǎo)。見例如，Yoon et al.，Mol.Cell.Biol.，205343-5349(2000)；and，Kersten etal.，J.Biol.Chem.，27528488-28493(20000)。ANGPTL4的表達(dá)在禁食過程中上調(diào)，并且血漿中蛋白質(zhì)的豐度隨高脂肪飲食而降低。
此外，ANGPTL4抑制脂蛋白酯酶(LPL)活性。見例如，EO1403367.脂蛋白酯酶(LPL)是分泌的糖蛋白，通過水解乳糜微滴和極低密度脂蛋白(VLDL)中的甘油三酯來(lái)介導(dǎo)脂蛋白的代謝產(chǎn)生游離脂肪酸和磷脂。
如本發(fā)明所述，ANGPTL4敲除小鼠的膽固醇和血清甘油三酯水平與它們性別匹配的野生型同窩動(dòng)物相比降低。見本文“轉(zhuǎn)基因敲除動(dòng)物”部分以及實(shí)施例4。此外，ANGPTL4的靜脈內(nèi)注射增加小鼠中循環(huán)血漿脂質(zhì)水平以及極低密度脂蛋白的水平。見例如，Yoshida et al.，Journal of LipidResearch，431770-1772(2002)，見圖10。
調(diào)節(jié)受試者中甘油三酯和膽固醇血清水平的方法在本發(fā)明提供。例如，所述方法包括給藥受試者有效量包含ANGPTL4和ANGPTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑的組合物，由此調(diào)節(jié)受試者中甘油三酯和膽固醇的血清水平。一個(gè)實(shí)施方案中，給藥ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑，其導(dǎo)致甘油三酯或膽固醇在血清中累積。另一實(shí)施方案中，給藥受試者有效量的ANGPTL4拮抗劑，由此與治療之前、沒有接受治療或接受減量治療的受試者相比，降低受試者血清中甘油三酯、游離脂肪酸和/或膽固醇中至少一項(xiàng)的水平。平均血清膽固醇和甘油三酯水平可如本領(lǐng)域已知那樣測(cè)定。
ANGPTL4也可調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞。例如，ANGPTL4可刺激前脂肪細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞遷移。脂肪組織主要由脂肪細(xì)胞構(gòu)成，其也在能量動(dòng)態(tài)平衡中起重要作用。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)重組時(shí)脂肪細(xì)胞合成并存儲(chǔ)脂質(zhì)，并在需要營(yíng)養(yǎng)時(shí)將游離脂肪酸釋放進(jìn)入循環(huán)。白色脂肪組織(WAT)和棕色脂肪組織(BAT)見于脊椎動(dòng)物。根據(jù)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需要WAT存儲(chǔ)并釋放脂肪。WAT存儲(chǔ)脂肪用于(1)熱量隔離(例如皮下脂肪)，(2)機(jī)械緩沖(例如周圍內(nèi)部器官)，和(3)作為能量來(lái)源。BAT燃燒脂肪，其應(yīng)答于低溫通過熱生成作用釋放脂肪作為能量以通過增加熱生成來(lái)維持熱量動(dòng)態(tài)平衡以及應(yīng)答于熱量攝入的增加通過增加能量消耗維持能量平衡。見例如，Sears，I.B.et al.(1996)Mol.Cell.Biol.16(7)3410-3419(1996)。通常，BAT隨年齡減少，但可在特定條件下再活化，例如長(zhǎng)期暴露于寒冷，保持高脂肪飲食以及存在產(chǎn)生去甲腎上腺素的腫瘤。
脂肪生成涉及形態(tài)改變，生長(zhǎng)停滯，產(chǎn)脂酶的表達(dá)，脂質(zhì)聚積以及對(duì)多種激素例如胰島素敏感。本發(fā)明提供的方法包括通過給藥有效量的ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑刺激脂肪細(xì)胞增殖。細(xì)胞增殖可在培養(yǎng)過程中利用本領(lǐng)域已知的方法評(píng)估，包括但不限于測(cè)定DNA合成速率(見例如，Nakamura et al.Biochem.Biophy.Res.Comm.1221450(1984)，錐蟲蘭排除/紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(見例如，Omiri et al.(1997)supra)，或流式細(xì)胞分析法(見例如，Drakes(1997)supra)。ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑可用于在額外的脂肪細(xì)胞有益的疾病中誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的增殖，例如包括但不限于消耗性疾病(例如諸如癌癥，免疫受損的患者(例如AIDS患者等)，老年個(gè)體)等。提供的方法包括通過給藥有效量ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞遷移。
ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑可與其他促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化的因子結(jié)合。這些因子包括但不限于，例如，IGF-1，胰島素，糖皮質(zhì)激素，3，3’，5-三碘甲狀腺氨酸，類維生素A，PGF2α，PGI2.等。其他因子也可與ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑結(jié)合。例如，脂肪生成受到激素和轉(zhuǎn)錄控制。例如，脂肪生成可由轉(zhuǎn)錄因子的級(jí)聯(lián)介導(dǎo)，包括例如過氧物酶體增殖物活化的受體(PPAR)的成員，例如，(PPARα，γ)家族，CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)家族，和堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈(bHLH)家族，例如，ADD1/SREBP1。見例如，Wu et al.Current Opin.Cell Biol 11689-694(1999)；Rosen and Spiegelman Annu Rev Cell Dev Biol 16145-171(2000)；Gregoire etal.，Physiological Reviews 78(3)(1998)；和，Kim and Spiegehman Genes Devel101096-1107(1996))。PPARγ在脂肪組織中起作用并促進(jìn)脂肪生成和脂質(zhì)存儲(chǔ)。見例如，Rosen et al.，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，16145-171(2000)；Rosen et al.，Mol.Cell.4611-617(1999)；Ren et al.，Genes Dev.1627-32(2002)；Rosen et al.，Genes Dev.，1622-26(2002)；and，F(xiàn)ukumura et al.，Circ.Res.93e88-e97(2003)。PPAR也介導(dǎo)脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞中的脂蛋白酯酶mRNA和蛋白水平(見例如，Gbaguidi et al.，F(xiàn)EBS Letters 51285-90(2002))，PPAR還與癌癥有關(guān)(見例如，Yoshimura et al.，Int.J.Cancer 104597-602(2003)；and，Kubota et al.，Cancer Research 583344-52(1998))。
但是，脂肪組織的生長(zhǎng)和/或形成通常不是所需的。例如，肥胖癥通常時(shí)熱量攝入超過熱量消耗導(dǎo)致的，通過肥大性和增殖性生長(zhǎng)導(dǎo)致脂肪組織的生長(zhǎng)和/或形成。肥大性生長(zhǎng)是脂質(zhì)累積刺激的脂肪細(xì)胞體積增大。增生性生長(zhǎng)定義為脂肪組織中脂肪細(xì)胞的數(shù)目增加。
肥胖癥是慢性疾病，高度流行于現(xiàn)代社會(huì)并與社會(huì)難題以及壽命縮短和各種醫(yī)學(xué)問題有關(guān)，包括不良的心理發(fā)育，生殖疾病諸如多囊卵巢疾病，皮膚疾病諸如感染，靜脈曲張，黑棘皮癥和濕疹，運(yùn)動(dòng)不耐受，胰島素抵抗，高血壓，高膽固醇血癥，膽石病，骨關(guān)節(jié)炎，矯形損傷，血栓栓塞性疾病，癌癥和冠狀動(dòng)脈心臟病。Rissanen et al.，British Medical Journal，301835-837(1990)。肥胖癥的治療涉及利用食欲抑制劑和其他減肥誘導(dǎo)劑，飲食改變等，但類似胰島素抵抗患者，大多數(shù)肥胖癥患者都經(jīng)歷最初的飲食失敗，因此不能獲得理想體重。ANGPTL4拮抗劑可用于治療肥胖癥和/或減少受試者的總體重，其中利用有效量的ANGPTL4拮抗劑。肥胖癥可通過BMI和/或肥胖癥確定性特征來(lái)測(cè)定，這是本領(lǐng)域已知的并在本文描述。例如，肥胖癥的治療通常指降低哺乳動(dòng)物BMI到約25.9以下，并保持該體重至少6個(gè)月。該治療適宜導(dǎo)致動(dòng)物的食物或熱量攝入減少。此外，本發(fā)明的治療指在肥胖情形開始之前給藥治療的情況下防止肥胖發(fā)生。治療包括抑制和/或完全抑制肥胖動(dòng)物中的脂質(zhì)生成，即脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)的過量累積或脂肪細(xì)胞的累積，其是人和動(dòng)物肥胖癥的主要特征之一，以及總體重減輕。總體重的減輕可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如天平)來(lái)測(cè)定。一個(gè)實(shí)施方案中，受試者的肥胖(脂肪)減輕。在這種方式中，與肥胖癥有關(guān)的疾病也可得到治療，例如心血管疾病，糖尿病等。
ANGPTL4也與脂肪細(xì)胞來(lái)源的激素leptin的調(diào)節(jié)有關(guān)。Leptin，在結(jié)構(gòu)上與細(xì)胞因子相關(guān)，作用于屬于細(xì)胞因子受體超家族的受體。見例如，ZhangF，et al.，Nature 387206-209(1997)；Tartaglia L A，et al.，Cell 831263-1271(1995)；and，Lee G-H，et al.，Nature 379632-635(1996)。Leptin由肥胖(ob)突變中受影響的基因編碼(Zhang F，et al.，Nature 387206-209(1997))。Leptin受體的長(zhǎng)型由在糖尿病(db)突變中受影響的基因編碼(Tartaglia L A，et al.，Cell 831263-1271(1995))。Leptin受體，其具有多種同種型，與gp130和通過細(xì)胞因子諸如IL-6，LIF和CNTF活化的LIFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞基以及生長(zhǎng)激素諸如促紅細(xì)胞生成素的激素受體緊密相關(guān)。見例如，Tartaglia L A，et al.，supra。缺乏功能性leptin或其受體導(dǎo)致嚴(yán)重的肥胖癥。見例如，Zhang et al.，supra；Lee et al.，supra；and，Chen H et al，Cell 84491-495(1996)。已知Lepti在腦的一些區(qū)域中起作用(例如，下丘腦)以調(diào)節(jié)食物攝入，能量消耗和神經(jīng)內(nèi)分泌功能，例如顯示其為脂肪儲(chǔ)存的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，而leptin水平隨脂肪儲(chǔ)存的水平增加而增加。見例如，Zhang Y，et al.，Nature 372425-432(1994)；Halaas J Let al.，Science 269543-546(1995)；Campfield L A，et al.，Science269546-549(1995)；和，Pellymounter M A，et al.，Science 269540-543(1995)。
也發(fā)現(xiàn)Leptin是血管生成因子。見例如，Sierra-Honigmann et al.，“Biological Action of Leptin as an Angiogenic Factor”Science 2811683-1686(1998)；and，Bouloumie et al.，Circ.Res.831059-1066(1998)。脂肪組織生長(zhǎng)有賴于新生血管化。見例如，Rupnick et al.，PNAS USA 99(16)10730-10735(2002)。Leptin也在免疫中起作用。見例如，La Cava and Matarese，“The Weightof Leptin in Immunity”Nature Reviews 4371-379(2004)。leptin其它活性包括調(diào)節(jié)生殖，調(diào)節(jié)造血作用，調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，以及調(diào)節(jié)促炎免疫反應(yīng)。見例如，Chelab et al.，Nature Genetics 12318-320(1996)；Stroebel et al.，NatureGenetics 18213-215(1998)；Clement et al.，Nature 392398-401(1998)；Cioffiet al.，Nature Medicine 2585-589(1996)；Gainsford et al.，PNAS USA，9314564-14568(1996)；Kamohara et al.，Nature 389374-377(1997)；Loffredaet al.，F(xiàn)ASEB J.1257-65(1998)；and，Lord et al.，Nature 394897-901(1998)。
ANGPTL4在ob/ob(leptin敲除)和db/db(leptin受體敲除)小鼠中上調(diào)。本發(fā)明提供調(diào)節(jié)leptin和/或leptin活性的方法，其通過給藥有效量的ANGPTL4，ANGPTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑進(jìn)行。Leptin水平可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定，例如SDS-PAGE，免疫印跡等。
ANGPTL4，ANGPTL4激動(dòng)劑和/或ANGPTL4拮抗劑可用于治療與脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡以及脂肪代謝的破壞有關(guān)的疾病和病癥，其包括但不限于，例如代謝疾病諸如心臟疾病，心血管、內(nèi)皮或血管生成疾病，血脂異常，高血壓，動(dòng)脈粥樣硬化，冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)，冠狀動(dòng)脈心臟病，高膽固醇血癥，心衰，發(fā)作綜合征，糖尿病，胰腺功能異常，骨關(guān)節(jié)炎，膽石癥，癌癥，青光眼，肥胖癥，以及相關(guān)疾病諸如脂肪過多(adipositas)，飲食疾病，消耗綜合征(惡病質(zhì))，睡眠呼吸暫停等。例如多種人疾病的特征在于組織、細(xì)胞、膜以及細(xì)胞外區(qū)或結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)組成不同。例如，在動(dòng)脈粥樣硬化中，膽固醇(未酯化的，酯化的和氧化的形式)和其它脂質(zhì)在細(xì)胞以及動(dòng)脈壁的細(xì)胞外區(qū)以及其它位點(diǎn)累積。這些脂質(zhì)可能具有有害的生物作用，例如通過改變細(xì)胞功能，包括基因表達(dá)，以及通過使管腔變窄，阻斷血流。脂質(zhì)水平的調(diào)節(jié)將提供多種實(shí)質(zhì)益處。給藥ANGPTL4，其激動(dòng)劑或拮抗劑的效應(yīng)可通過暴露于已知的多種測(cè)定法測(cè)定，包括分析脂肪細(xì)胞和組織，諸如脂肪墊，總體重，肌肉、肝和脂肪中的甘油三酯水平，以及l(fā)eptin的非禁食水平，以及血液中游離脂肪酸和甘油三酯的水平。ANGPTL4拮抗劑可通過給藥有效量的ANGPTL4拮抗劑而抑制前脂肪細(xì)胞的遷移。
在本發(fā)明的一些方面中，需要結(jié)合ANGPTL4，ANGPTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑和其它治療方案。ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑可與其它因子的給藥結(jié)合，例如諸如本文所述的那些。對(duì)于拮抗劑，ANGPTL4拮抗劑可與例如治療劑結(jié)合以治療高脂血癥(以及與高脂血癥相關(guān)的疾病，例如肥胖政，高膽固醇血癥，動(dòng)脈粥樣硬化，心血管疾病，糖尿病，甲狀腺機(jī)能減退，Cushing綜合征)，例如，包括但不限于，例如煙酸，消膽胺，考來(lái)替泊(colestipol)，吉非貝齊(gemfibrozil)，氯貝特(clofibrate)，他汀類藥物(statins)，氟伐地汀(fluvastatin)(來(lái)適可(Lescol))，帕伐他丁(pravastatin)，辛伐他汀(simvastatin)，rosuvastin calcium(ZD-4522)，匹伐他汀(pitavastatin)(NK104)，普雷馬林(premarin)/普拉固(pravachol)(雌激素/帕伐他丁)，依澤替米貝(ezetimbe)/辛伐他汀(simvastatin)，superstatin，立普妥(Lipitor)，CETi-1疫苗，抗CETP抗體(膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白)，BMS-201038(微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，F(xiàn)M-VP4(膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)抑制物)，phyostanol，降血糖藥，胰島素，普蘭林肽(pramlintide)，糊精，AC2993合成exendin-4，Xenical(奧利斯特orlistat)，毛狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neutrophic factor)，Axokine，Metformin XT，Merformin，Glucovance(二甲雙胍/格列本脲)，dexlipotam(R+/-α硫辛酸)，PPAR激動(dòng)劑，beta-3-腎上腺能受體激動(dòng)劑，脂酶抑制劑，ATL-962，leptin，致厭食藥物(anorectics)或食欲抑制劑，苯丁胺，西布曲明Meridia(silbutramine)，安非他酮(Wellbutrin)(buproion)，氨甲酸環(huán)己丙酯(Procyglem)(氯甲苯噻嗪(diazoxide))，Tenuate(安非拉酮(diethylpropion))，Revia(納曲酮)，Bontril(苯甲曲秦)，Zoloft(舍曲林)，毛狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophicfactor)(CNTF)，Axokine，CB1-大麻素受體拮抗劑，SR 141716，phytopharm，AOD9604，hGH 177-191，減肥藥劑，及其衍生物(例如，鹽，PEG化的形式等)。也見，WO96/04260(治療II型糖尿病的化合物)，WO94/01420，WO95/17394，WO97/36579，WO97/25042，WO99/08501，WO99/19313，和WO99/16758。生活方式的改變也可與本發(fā)明的治療藥劑結(jié)合。它們包括但不限于，例如飲食，運(yùn)動(dòng)，限制膽固醇攝入，停止吸煙等。也見WO91/19702(降血糖和降血脂藥物)。一些方面中，ANGPTL4拮抗劑可與例如細(xì)胞因子和其它促炎分子以及多種可抑制脂肪生成的生長(zhǎng)因子聯(lián)用。這些包括但不限于，例如腫瘤壞死因子I(TNF)-α，IL-1，PDGF，F(xiàn)GF，EGF，轉(zhuǎn)化性生長(zhǎng)因子(TGF)-α，-β，前脂肪細(xì)胞因子1(pref-1)，等。見例如，Gregoire et al.，Physiological Reviews 78(3)783-809(1998)。
“減肥藥劑”指用于治療或預(yù)防肥胖癥的分子，所述分子包括例如，激素(兒茶酚胺，高血糖素，ACTH，以及生長(zhǎng)激素與IGF-1的組合；Ob蛋白；氯貝特；鹵化物；辛可卡因；氯丙嗪；作用于去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)的食欲抑制藥物，諸如氯苯咪吲哚和苯乙胺的衍生物，例如苯乙胺，安非拉酮，苯丁胺，苯甲曲秦，芐非他明，苯丙胺，去氧麻黃堿和芬美曲秦；作用于5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)的藥物，諸如苯氟拉明，色氨酸，5-羥色氨酸，氟西汀和舍曲林；中樞活性藥物諸如納洛酮，神經(jīng)肽-Y，促生長(zhǎng)激素神經(jīng)肽，促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素，和縮膽囊素；膽堿能激動(dòng)劑諸如吡啶斯的明，神經(jīng)鞘脂諸如溶血神經(jīng)鞘脂(lysosphingolipid)或其衍生物；生熱藥物諸如甲狀腺激素；麻黃素；beta-腎上腺素能激動(dòng)劑；影響胃腸道的藥物諸如酶抑制劑，例如tetrahydrolipostatin，可攝入的食物諸如蔗糖聚酯，以及胃排空抑制劑諸如氯吩嗪酸(threo-chlorocitric acid)或其衍生物；β-腎上腺素能激動(dòng)劑諸如異丙腎上腺素和育亨賓；氨茶堿以增加育亨賓的beta-腎上腺素能樣效果，α2-腎上腺素能阻斷藥物諸如單獨(dú)的氯壓定或與生長(zhǎng)激素釋放肽聯(lián)用；干擾腸吸收的藥物諸如雙胍諸如二甲雙胍和苯乙雙胍；體積填充物(bulkfillers)諸如甲基纖維素；代謝阻斷藥物諸如羥基檸檬酸鹽(hydroxycitrate)；黃體酮；縮膽囊素激動(dòng)劑；模擬酮酸的小分子；促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素的激動(dòng)劑；麥角癥相關(guān)的催乳素抑制化合物，其用于減少脂肪存儲(chǔ)(U.S.Pat.No.4,783,469公開于1988-11-8)；beta-3-激動(dòng)劑；溴麥角環(huán)肽；類阿片活性肽拮抗劑；神經(jīng)肽Y拮抗劑；糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑；生長(zhǎng)激素激動(dòng)劑；其組合等。
其它用途ANGPTL4也是炎性反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)物。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑可用于抑制免疫反應(yīng)，例如在不良的或有害的免疫反應(yīng)中，例如在移植物排斥或移植物-抗-宿主疾病中。ANGPTL4拮抗劑可用于刺激免疫系統(tǒng)。例如，刺激免疫系統(tǒng)在白血病、其它類型的癌癥，免疫受損的患者(例如AIDS患者等)等中是需要的。
ANGPTL4也與癌癥有關(guān)。在體外和體內(nèi)，當(dāng)ANGPTL4在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)時(shí)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖(見與本發(fā)明一同提交的臨時(shí)申請(qǐng)60/589,782和Attorney Docket number P2144R1，其包含在此作為參考)。當(dāng)ANGPTL4在利用抗血管生成因子例如，抗-VEGF抗體治療的腫瘤中表達(dá)時(shí)，該腫瘤仍然保持生長(zhǎng)的能力。還顯示ANGPTL4在腎癌中上調(diào)。見例如，attorney docketnumber P5032R1；WO 02/07941；and，Le Jan et al.，American Journal ofPathology，162(5)1521-1528(2003)。此外，ANGPTL4是促血管生成因子(proangiogenic factor)(見例如，S.Le Jan et al.，Am.J.Pathol.，162(5)1521-1528(2003))，其為癌癥治療的靶，并且是內(nèi)皮細(xì)胞凋亡存活因子(見例如，Kim et al.，Biochem K.346603-610(2000)。和VEGF一樣(Shweiki et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 92768-772(1995)，ANGPTL4表達(dá)應(yīng)答于低氧而增加。見例如，Le Jan et al.，American Journal of Pathology，162(5)1521-1528(2003)。研究人員報(bào)道了血管生成和脂肪生成或脂肪組織生長(zhǎng)之間的聯(lián)系。見例如，Sierra-Honigmann et al.，“Biological Action ofLeptin as an Angiogenic Factor”Science 2811683-1686(1998)；Rupnick et al.，“Adipose tissue mass can be regulated through the vasculature”Proc.Nat.Acad.Sci.USA，99(16)10730-10735(2002)；Kolonin et al.，“Reversal of obesity bytargeted ablation of adipose tissue”Nature Medicine Advance Online publicationMay 9，20041-8；和Fukumura et al.，“Paracrine Regulation of Angiogenesisand Adipocyte Differentiation During In Vivo Adipogenesis.”Circ.Res.93e88-e97(2003)。
ANGPTL4也可用于診斷實(shí)驗(yàn)中。許多不同的實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ娇捎糜跈z測(cè)相對(duì)于對(duì)照樣品ANGPTL4在樣品中的量。這些模式，可用于本發(fā)明的診斷實(shí)驗(yàn)中，其可用于檢測(cè)受試者中本文所述疾病的存在或開始。
本領(lǐng)域已知的任何用于測(cè)定可溶性分析物的方法可用于本發(fā)明的實(shí)踐。所述方法包括但不限于競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定系統(tǒng)，其利用諸如放射免疫測(cè)定法，酶聯(lián)免疫測(cè)定法(EIA)例如ELISA，“夾心“免疫測(cè)定法，沉淀素反應(yīng)，凝膠擴(kuò)散反應(yīng)，免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，凝集實(shí)驗(yàn)，補(bǔ)體固定實(shí)驗(yàn)，放射免疫測(cè)定，熒光免疫測(cè)定，蛋白A免疫測(cè)定，以及免疫電泳測(cè)定法。見例如，U.S.Pat.Nos.4,845,026和5,006,459。
NGPTL4的轉(zhuǎn)基因敲除動(dòng)物編碼ANGPTL4或其修飾的形式的核酸也可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或“敲除”動(dòng)物，其可用于開發(fā)和篩選治療有用的藥劑。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)是具有這樣的細(xì)胞的動(dòng)物，所述細(xì)胞含有轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因在出生以前例如胚胎期被導(dǎo)入動(dòng)物或被導(dǎo)入動(dòng)物的祖先。轉(zhuǎn)基因是整合入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生的細(xì)胞的基因組的DNA。本發(fā)明提供編碼ANGPTL4的cDNA，其可用于將編碼ANGPTL4的基因組DNA根據(jù)確定的技術(shù)，還提供用于產(chǎn)生含有表達(dá)編碼ANGPTL4的DNA的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因組序列。
本領(lǐng)域已知任何技術(shù)可用于將靶基因轉(zhuǎn)基因?qū)雱?dòng)物產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的奠基者系。所述技術(shù)包括但不限于，原核顯微注射(U.S.Pat.Nos.4,873,191，4,736,866和4,870,009)；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因向生殖細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移(Vander Putten，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，826148-6152(1985))；胚胎干細(xì)胞中的基因靶向(Thompson，et al.，Cell，56313-321(1989))；利用基因捕獲載體的非特異性插入失活(U.S.Pat.No.6,436,707)；胚胎電穿孔(Lo，Mol.Cell.Biol.，31803-1814(1983))；以及精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano，et al.，Cell，57717-723(1989))；等。
通常，可靶向具體的細(xì)胞利用組織特異性增強(qiáng)子摻入ANGPTL4轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用于檢驗(yàn)編碼ANGPTL4多肽的DNA的表達(dá)增加的效果，其中所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括在胚胎期導(dǎo)入動(dòng)物生殖細(xì)胞系的ANGPTL4編碼型轉(zhuǎn)基因的拷貝。所述動(dòng)物可用作被認(rèn)為針對(duì)例如與其過表達(dá)相關(guān)的病理性疾病產(chǎn)生保護(hù)作用的藥劑的檢測(cè)動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明的這方面，可利用該藥劑治療動(dòng)物，并且與攜帶該轉(zhuǎn)基因的未經(jīng)治療的動(dòng)物相比病理性疾病的發(fā)生率降低表示對(duì)該病理性疾病的有效治療性干預(yù)。
可選，ANGPTL4的非人同系物可用于構(gòu)建ANGPTL4“敲除”動(dòng)物，其具有缺陷或改變的編碼ANGPTL4蛋白的基因，這是由于編碼ANGPTL4的內(nèi)源基因和導(dǎo)入動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的編碼ANGPTL4的改變的基因組DNA之間的同源重組造成的。一些實(shí)施方案中，該敲除動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，例如嚙齒類諸如大鼠或小鼠。例如，編碼ANGPTL4的cDNA可用于根據(jù)確立的技術(shù)克隆編碼ANGPTL4的基因組DNA。編碼ANGPTL4的基因組DNA的一部分可缺失或被另一基因取代，諸如編碼可用于監(jiān)測(cè)整合的可選標(biāo)記物的基因。通常，未改變的側(cè)翼DNA(5’和3’末端)的數(shù)千個(gè)堿基包含在載體內(nèi)(見例如，Thomas and Capecchi，Cell，51503(1987)中對(duì)同源重組載體的描述)。
載體被導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞系(例如通過電穿孔)并選擇其中導(dǎo)入的DNA與內(nèi)源DNA發(fā)生同源重組的細(xì)胞(見例如，Li et al.，Cell，69915(1992))。所選的細(xì)胞隨后被注入動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)的胚泡中形成聚集嵌合體(見例如，Bradley，in Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA PracticalApproach，E.J.Robertson，ed.(IRL，Oxford，1987)，pp.113-152)。嵌合胚胎可隨后植入適宜的假孕雌性養(yǎng)育動(dòng)物，娩出胚胎產(chǎn)生“敲除”動(dòng)物。生殖細(xì)胞中攜帶同源重組的DNA的子代可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定并用于產(chǎn)生其所有細(xì)胞都含有同源重組的DNA的動(dòng)物。敲除動(dòng)物的特征可為例如，它們抵御一些病理性疾病以及它們由于缺乏編碼ANGPTL4的基因而產(chǎn)生病理性疾病的能力。
此外，敲除小鼠對(duì)于發(fā)現(xiàn)基因功能以及藥物靶的藥物用途以及確定與給定靶有關(guān)的可能的on-target副作用非常有用。基因功能和生理學(xué)在小鼠和人之間相當(dāng)保守，這是由于它們都是哺乳動(dòng)物并含有相似數(shù)目的基因，其在物種之間相當(dāng)保守。最近發(fā)現(xiàn)，例如小鼠染色體16上的大部分基因具有人直向同系物(Mural et al.，Science 2961661-71(2002))。
盡管胚胎干細(xì)胞(ES)中的基因打靶已經(jīng)使得在許多與人疾病相關(guān)的基因中具有空突變的小鼠的構(gòu)建成為可能，并非所有遺傳疾病是由于空突變?cè)斐傻摹？赏ㄟ^確定基因取代(敲入)的方法建立有用的人疾病的小鼠模型，其將破壞小鼠基因座并導(dǎo)入具有突變的人對(duì)應(yīng)物。隨后，可在體內(nèi)進(jìn)行靶向人蛋白的藥物研究(Kitamoto et.Al.，Biochemical and BiophysicalRes.Commun.，222742-47(1996))。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的用途一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括篩選化合物鑒定模擬ANGPTL4(激動(dòng)劑)和阻止ANGPTL4的效應(yīng)(拮抗劑)的方法。模擬ANGPTL4的激動(dòng)劑在誘導(dǎo)ANGPTL4活性中特別有治療價(jià)值，例如本發(fā)明所述的，并且在基于利用基因組包含ANGPTL4編碼基因的破壞的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)現(xiàn)觀察到負(fù)性表型的情況中特別有治療價(jià)值。阻止ANGPTL4效應(yīng)的拮抗劑在阻止ANGPTL4活性中特別有治療價(jià)值，例如本文所述的，以及基于利用非人轉(zhuǎn)基因敲除動(dòng)物的觀察觀察到陽(yáng)性表型的情況中特別有治療價(jià)值。設(shè)計(jì)拮抗劑藥物的篩選實(shí)驗(yàn)以鑒定與本發(fā)明鑒定的基因編碼的ANGPTL4結(jié)合或復(fù)合或干擾編碼的多肽與其它細(xì)胞蛋白的相互作用的化合物，例如ANGPTL4受體(例如αVβ5)，脂酶蛋白等。
例如，ANGPTL4拮抗劑的效應(yīng)可通過將ANGPTL4拮抗劑給藥野生型小鼠以模擬已知的敲除表型來(lái)評(píng)估。因此，可先敲除目的ANGPTL4基因并觀察敲除或破壞ANGPTL4基因?qū)е碌谋硇?。隨后，可通過將ANGPTL4拮抗劑給藥野生型小鼠評(píng)估ANGPTL4拮抗劑的效力。預(yù)期有效的拮抗劑可模擬在敲除小鼠中最初觀察到的表型效應(yīng)。
同樣，可通過將ANGPTL4激動(dòng)劑給藥非人轉(zhuǎn)基因小鼠以緩解已知的負(fù)性敲除表型來(lái)評(píng)估ANGPTL4激動(dòng)劑的效應(yīng)。因此，可先敲除目的ANGPTL4基因并觀察敲除或破壞ANGPTL4基因?qū)е碌谋硇?。隨后，可通過將ANGPTL4激動(dòng)劑給藥非人轉(zhuǎn)基因小鼠評(píng)價(jià)ANGPTL4激動(dòng)劑的效果。有效的激動(dòng)劑預(yù)期可緩解最初在敲除動(dòng)物中觀察到的負(fù)性表型效果。
拮抗劑的另一實(shí)驗(yàn)中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞或表達(dá)該受體的膜制備物與標(biāo)記的ANGPTL4在候選化合物的存在下保溫。隨后測(cè)定化合物提高或阻斷該反應(yīng)的能力。
抗體本發(fā)明的抗體包括抗-ANGPTL4抗體或ANGPTL4的抗原結(jié)合片段，抗-αVβ5抗體或本文所述的其它抗體。示例性抗體包括，例如多克隆，單克隆，人化的，片段，多特異性，異源偶聯(lián)的，多價(jià)的，效應(yīng)功能等抗體?？贵w可為激動(dòng)劑或拮抗劑。
多克隆抗體本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，抗ANGPTL4的多克隆抗體通過多次給動(dòng)物皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑而產(chǎn)生。用雙功能試劑或衍生試劑，如馬來(lái)酰亞氨苯甲?；虼牾啺孵?通過半胱氨酸殘基結(jié)合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基)，將所述相關(guān)抗原與在所免疫的物種中具有免疫原性的蛋白(如匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)進(jìn)行偶聯(lián)是有效的。
用ANGPTL4、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動(dòng)物，方法是，將100μg或5μg蛋白或偶聯(lián)物(分別針對(duì)兔或鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合，在多位點(diǎn)皮內(nèi)注射該溶液。1個(gè)月后，多位點(diǎn)皮下注射起始量的1/5-1/10的肽或與弗氏完全佐劑中的偶聯(lián)物來(lái)加強(qiáng)免疫。7-14天后，對(duì)動(dòng)物采血，測(cè)定血清中的抗體滴度。對(duì)動(dòng)物的加強(qiáng)免疫直到滴度達(dá)到平臺(tái)期為止。通常給動(dòng)物加強(qiáng)注射相同抗原的偶聯(lián)物，但也可以是偶聯(lián)至不同蛋白和/或通過不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)。偶聯(lián)物還可以是重組細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的融合蛋白。此外，可用明礬等聚集劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
單克隆抗體例如，單克隆抗體可用由Kohler等，自然(1975)首次描述的雜交瘤技術(shù)制備，或用重組DNA方法制備(美國(guó)專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適合的宿主動(dòng)物如倉(cāng)鼠，以激發(fā)那些產(chǎn)生或能產(chǎn)生與用于免疫之蛋白特異性結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞。另外，可體外免疫淋巴細(xì)胞。然后用適當(dāng)融合劑，如聚乙二醇，使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，單克隆抗體原理及應(yīng)用，pp.59-103(Academic Press，1986))。
將如此制備的雜交瘤細(xì)胞接種至適當(dāng)培養(yǎng)基中并培養(yǎng)，優(yōu)選該培養(yǎng)基含有一或多種能抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養(yǎng)基通常將包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。
優(yōu)選骨髓瘤細(xì)胞是那些能有效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體，并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基等類似培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute Cell DistreibutionCenter，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤細(xì)胞和由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。也有報(bào)道稱人骨髓瘤以及小鼠-人異質(zhì)性骨髓瘤細(xì)胞系可用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，免疫學(xué)雜志1333001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體制備技術(shù)及應(yīng)用，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))可在含有生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中分析針對(duì)所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選，雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合試驗(yàn)，如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)來(lái)分析。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過如Muson等，Anal.Biochem.，107220(1980)所述Scatchard分析來(lái)測(cè)定。
一旦鑒定出能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，將這些克隆通過有限稀釋法進(jìn)一步克隆并用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，單克隆抗體原理及應(yīng)用，pp.59-103(Academic Press，1986))。適于此目的的培養(yǎng)基包括如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可作為腹水中腫瘤的形式在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)。
由亞克隆分泌的單克隆抗體可用常規(guī)免疫球蛋白純化方法如蛋白-A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基、腹水或血清中適宜地分離。
單克隆抗體也可卡通過重組DNA方法制備，諸如美國(guó)專利4,816,567中描述的那些。編碼單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法很容易地分離和測(cè)序(如利用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞是這類DNA的優(yōu)選來(lái)源。DNA分離后，可將其插入表達(dá)載體中，然后用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，以便在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體?？贵w的重組產(chǎn)生在下文詳細(xì)描述。
在另一實(shí)施方案中，可從用McCafferty等，自然，348552-554(1990)所述技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫(kù)中分離抗體或抗體片段。Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志222581-597(1991)分別描述了用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人的抗體。后來(lái)的文獻(xiàn)描述了通過鏈改組制備高親和力(nM范圍)的人型抗體(Marks等，生物/技術(shù)10779-783(1992))，以及用于構(gòu)建大規(guī)模噬菌體文庫(kù)的組合感染和體內(nèi)重組方法(Waterhouse等，核酸研究212265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)都可取代傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)來(lái)分離克隆抗體。
DNA也可通過例如用人類重鏈和輕鏈的恒定區(qū)編碼序列取代小鼠同源序列來(lái)修飾(美國(guó)專利4,816,567；Morrison等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)816851(1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價(jià)結(jié)合來(lái)修飾。
通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗體恒定區(qū)，或取代抗體的一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)的可變區(qū)，形成二價(jià)嵌合抗體，其中一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異于一種抗原而另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異于另一種抗原。
人源化和人抗體本發(fā)明的抗體可包括人源化的或人抗體。人源化抗體中已導(dǎo)入一或多個(gè)源自非人類的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常稱為“引進(jìn)的”殘基，它們通常來(lái)自“引進(jìn)的”可變區(qū)。人源化過程基本如Winter及其同事(Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科學(xué)，2391534-1536(1988))所述，用高變區(qū)序列取代人類抗體的相應(yīng)序列來(lái)進(jìn)行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利4,816,567)，其中完整人類可變區(qū)的很少一部分被非人類物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中高變區(qū)殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代。
對(duì)用于制備人源化抗體的人類可變區(qū)包括重鏈和輕鏈的選擇，對(duì)降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂“最適應(yīng)”方法，針對(duì)已知人類可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)篩選嚙齒類抗體可變區(qū)序列。將與嚙齒類的序列最相似的人類序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims等，免疫學(xué)雜志，1512296(1993)；Chothia等，分子生物學(xué)雜志，196901(1987))。另一種方法是用人類輕鏈或重鏈特定亞型的所有抗體的共有序列作為特定框架區(qū)。相同的框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，894285(1992)；Presta等，免疫學(xué)雜志，1512623(1993))。
更重要的是，將抗體人源化后保留了對(duì)抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達(dá)到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物來(lái)制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象的計(jì)算機(jī)程序。通過觀察這些展示結(jié)果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基，通過這種方法，可從受者和引進(jìn)序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對(duì)靶抗原的親和力增加。總之，高變區(qū)殘基直接并且最主要涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。
可選可制備如下轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)，它們通過免疫能產(chǎn)生人類抗體的所有成分而不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白。例如，有報(bào)道稱，嵌合及種系(germ-line)突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源抗體的產(chǎn)生被完全抑制。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這類種系突變小鼠中將導(dǎo)致因抗原攻擊而誘導(dǎo)人類的抗體產(chǎn)生。見例如，Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immuno.，733(1993)；and Duchosal et al.Nature355258(1992).Human antibodies can also be derived from phage-displaylibraries(Hoogenboom et al.，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)；Vaughan et al.Nature Biotech 14309(1996))。
人抗體也可利用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)，包括噬菌體展示文庫(kù)(Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581(1991))。據(jù)此技術(shù)，將抗體V區(qū)基因克隆在與絲狀噬菌體(如M13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因相同的框架內(nèi)，并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體的功能特點(diǎn)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致對(duì)顯示這些性質(zhì)的抗體的編碼基因進(jìn)行選擇。因此，噬菌體模仿了B細(xì)胞的部分特點(diǎn)。噬菌體展示可以以多種形式進(jìn)行；這些綜述見Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的最新觀點(diǎn)(Current Opinion in Structural Biology)3564-571(1993)?？墒褂肰基因片段的多個(gè)來(lái)源進(jìn)行噬菌體展示。Clackson等，自然，352624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來(lái)源的V基因的隨機(jī)組合小文庫(kù)中分離了抗-惡唑酮抗體的多樣性陣列?？苫救鏜arks等，分子生物學(xué)雜志222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)所述構(gòu)建未免疫人類供者的V基因所有組成成分，并分離針對(duì)抗原多樣性陣列(包括自身抗原)的抗體。亦參見美國(guó)專利5565332和5573905。Cole等和Boerner等的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R Liss，p 77(1985)和Boerner et al.，J.Immunol.，147(1)86-95(1991))。人類抗體也可通過體外活化的B細(xì)胞而產(chǎn)生(見美國(guó)專利5,567,610和5,229,275)。
抗體片段抗體片段也包括在本發(fā)明中。已開發(fā)了生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段通過對(duì)完整抗體的蛋白水解性消化獲得(見Morimoto等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法雜志(Journal of Biochemical and BiophysicalMethods)24107-117(1992))和Brennan等，科學(xué)，22981(1985))。但現(xiàn)在可直接通過重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體庫(kù)分離抗體片段。另外，可從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，并經(jīng)化學(xué)連接形成F(ab’)2片段(Carter等，生物/技術(shù)10163-167(1992))。依據(jù)另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)中分離F(ab’)2片段。其它產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在其它實(shí)施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見WO 93/16185；美國(guó)專利5,571,894；和美國(guó)專利5,587,458。Fv和sFv是與缺乏恒定區(qū)的完整結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)的唯一種類；因此它們適于降低體內(nèi)使用過程中的非特異性結(jié)合。SFv融合蛋白可構(gòu)建成在sFv的氨基或羧基末端產(chǎn)生效應(yīng)蛋白的融合。見，Antibody Engineering，cd.Borrebacck，supra?？贵w片段也可以是“線性化抗體”，如美國(guó)專利5,641,870所述。這類線性化抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
多特異性抗體(例如雙特異性)本發(fā)明的抗體也包括，例如，多特異抗體，其對(duì)至少兩種不同的抗原具有結(jié)合特異性。盡管此種分子通常只結(jié)合兩種抗原(即雙特異抗體，BsAbs)，具有附加特異性的抗體例如三特異抗體也包含在文中所用的術(shù)語(yǔ)中。BsAbs的實(shí)例包括具有針對(duì)腫瘤抗原的一條臂和針對(duì)細(xì)胞毒作用觸發(fā)分子(cytotoxic trigger molecule)的另一條臂的那些抗體，例如抗-FcγRI/抗-CD15，抗-p185HER2/FcγRIII(CD16)，抗-CD3/抗-惡性B-細(xì)胞(1D10)，抗-CD3/抗-p185HER2，抗-CD3/抗-p97，抗-CD3/抗-腎細(xì)胞癌，抗-CD3/抗-OVCAR-3，抗-CD3/L-D1(抗-結(jié)腸癌)，抗-CD3/抗-黑色素細(xì)胞刺激激素類似物，抗-EGF受體/抗-CD3，抗-CD3/抗-CAMA1，抗-CD3/抗-CD19，抗-CD3/MoV18，抗-神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)/抗-CD3，抗-葉酸結(jié)合蛋白(FBP)/抗-CD3，抗-泛癌相關(guān)抗原(AMOC-31)/抗-CD3；一條臂特異地結(jié)合腫瘤抗原而另一條臂結(jié)合毒素的BsAbs例如抗-皂草素/抗-1d-1，抗-CD22/抗-皂草素，抗-CD7/抗-皂草素，抗-CD38/抗-皂草素，抗-CEA/抗-蓖麻毒素A鏈，抗-干擾素-α(IFN-α)/抗-雜交瘤獨(dú)特型，抗-CEA/抗-長(zhǎng)春花堿；轉(zhuǎn)化酶活化的前體藥物的BsAbs例如抗-CD30/抗-堿性磷酸酶(催化磷酸絲裂霉素前藥物向絲裂霉素醇的轉(zhuǎn)化)；可用作纖維蛋白溶解劑的例如抗-纖維蛋白/抗-組織纖溶酶原激活物(tPA)，抗-纖維蛋白/抗-尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)；將免疫復(fù)合物靶向細(xì)胞表面受體的BsAbs例如抗-低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受體(例如FcγRI，F(xiàn)cγRII或FcγRIII)；用于治療感染性疾病的BsAbs例如抗-CD3/抗-單純皰疹病毒(HSV)，抗-T-cell受體CD3復(fù)合物/抗-流感病毒，抗-FcγR/抗-HIV；體外或體內(nèi)檢測(cè)腫瘤的BsAbs例如抗-CEA/抗-EOTUBE，抗-CEA/抗-DPTA，抗-p185HER2/抗-hapten；作為疫苗佐劑的BsAbs；和作為診斷工具的BsAbs例如抗-兔IgG/抗-鐵蛋白，抗-辣根過氧化物酶(HRP)/抗-激素，抗-生長(zhǎng)抑素/抗-物質(zhì)P，抗-HRP/抗-FITC，抗-CEA/抗-β-半乳糖苷酶。三特異抗體的實(shí)例包括抗-CD3/抗-CD4/抗-CD37，抗-CD3/抗-CD5/抗-CD37和抗-CD3/抗-CD8/抗-CD37。雙特異抗體可被制備為全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)。
制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。完整雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備方法是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中這兩條鏈具有不同特異性(Millstein等，自然，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機(jī)分配，這些四交瘤(quadroma)可能產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對(duì)所述正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來(lái)進(jìn)行)非常復(fù)雜，且產(chǎn)量很低。類似的方法見WO93/08829和Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)。
依據(jù)另一種方法，可將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)的至少一部分、CH2及CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少在一種融合中。可將編碼免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時(shí)，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染至適當(dāng)宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進(jìn)行構(gòu)建的實(shí)施方案中，能夠非常靈活地調(diào)整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產(chǎn)量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達(dá)而獲得高產(chǎn)時(shí)或所述比例無(wú)特別意義時(shí)，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達(dá)載體。
在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的帶有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)有利于從非必要免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因?yàn)橹挥性撾p特異性分子的一半上存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開于WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，見Suresh等，酶學(xué)方法，121210(1986)。
根據(jù)WO96/27011所述的另一種方法，可改造一對(duì)抗體分子之間的界面，使得從重組細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的異源二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在該方法中，源于第一抗體分子的界面上的一條或多條氨基酸小側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側(cè)鏈大小相同或相近的互補(bǔ)“溝”可通過將氨基酸大側(cè)鏈用小側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這使得異二聚體的產(chǎn)量比其它不需要的終產(chǎn)物如同型二聚體的高。
從抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)已有文獻(xiàn)。例如，雙特異性抗體可利用化學(xué)連接制備。Brennan等，科學(xué)22981(1985)中描述了將完整抗體經(jīng)蛋白水解制備F(ab’)2片段的方法。這些片段在二巰基復(fù)合劑亞砷酸鈉存在時(shí)被還原，從而穩(wěn)定相鄰的巰基，并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab′片段被轉(zhuǎn)化為硫硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。其中一種Fab′-TNB衍生物經(jīng)巰基乙胺還原成Fab′-硫醇，再與等分子量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產(chǎn)生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。
近期的進(jìn)展促進(jìn)了Fab′-SH片段從大腸桿菌的直接回收，該片段可經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，175217-225(1992)中描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab′)2分子的產(chǎn)生。每一Fab′片段分別從大腸桿菌中分泌出來(lái)，經(jīng)體外直接化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過表達(dá)Erbt32受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞結(jié)合，還能引發(fā)人類細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞對(duì)人乳腺腫瘤靶的裂解活性。
直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學(xué)雜志，148(5)1547-1553(1992))。將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過基因融合而連接。使抗體的同型二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同型二聚體。由Hollinger等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，906444-6448(1993))描述的“二價(jià)抗體”技術(shù)提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(qū)(VH)，其通過接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間無(wú)法配對(duì)。因此，同一片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。此外還報(bào)道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來(lái)制備雙特異性抗體的策略。見Gruber等，免疫學(xué)雜志，1525368(1994)。
還考慮了二價(jià)以上的抗體。如可制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學(xué)雜志，14760(1991)。
異源偶聯(lián)的抗體雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可使異源偶聯(lián)物中的抗體之一與親和素偶聯(lián)，使另一抗體與生物素偶聯(lián)。有觀點(diǎn)認(rèn)為，這類抗體可用于將免疫細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利4676980)，也可用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可通過任何適當(dāng)?shù)慕宦?lián)方法制備。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)制劑和多種交聯(lián)技術(shù)為本領(lǐng)域已知，可在美國(guó)專利4676980號(hào)中獲得。
多價(jià)抗體本發(fā)明的抗體包括多價(jià)抗體。多價(jià)抗體比二價(jià)抗體可更快地被表達(dá)與該抗體結(jié)合的抗原的細(xì)胞內(nèi)化(和/或異化)。本發(fā)明的抗體可以是具有三個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的多價(jià)抗體(例如四價(jià)抗體)(它們不是IgM類)，通過使編碼所述抗體多肽鏈的核酸重組表達(dá)可輕易制備該抗體。多價(jià)抗體可以包含二聚體化結(jié)構(gòu)域和三個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的二聚體化結(jié)構(gòu)域包括Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)，或由它們組成。在本文中，抗體包含一個(gè)Fc區(qū)和三個(gè)或更多個(gè)位于Fc區(qū)氨基端的抗原結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的多價(jià)抗體在此包括三到約八個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，但優(yōu)選四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，或由它們組成。多價(jià)抗體包括至少一條多肽鏈(并優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個(gè)或多個(gè)可變區(qū)。例如，多肽鏈可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可變區(qū)，VD2是第二可變區(qū)，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，X1和X2代表氨基酸或多肽，n是0或1。例如，多肽鏈可包括VH-CH1-柔韌接頭(flexible linker)-VH-CH1-Fc區(qū)鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區(qū)鏈。本文的多價(jià)抗體優(yōu)選進(jìn)一步包含至少二個(gè)(優(yōu)選四個(gè))輕鏈可變區(qū)多肽。例如本文的多價(jià)抗體可包含從約二個(gè)到約八個(gè)輕鏈可變區(qū)多肽。本文的輕鏈可變區(qū)多肽包含輕鏈可變區(qū)以及可選地進(jìn)一步包含CL結(jié)構(gòu)域。
效應(yīng)物功能改造也需要修飾本發(fā)明抗體的效應(yīng)物功能，以提高抗體在例如癌癥治療中的有效性。例如，可在Fc區(qū)引入半胱氨酸殘基，使得在此區(qū)形成鏈間二硫鍵。由此產(chǎn)生的同型二聚體抗體可提高內(nèi)在化能力和/或增強(qiáng)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用和抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)。見Caron等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1761191-1195(1992)和Shopes，B.免疫學(xué)雜志1482918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的靶向活性的同型二聚體抗體也可用Wolffe等，癌癥研究532560-2565(1993)所述異源雙功能交聯(lián)劑制備?；蛘?，可通過工程改造產(chǎn)生具有雙FC區(qū)并因此具有增強(qiáng)的補(bǔ)體裂解效應(yīng)及ADCC能力的抗體。見Stevenson等，抗癌藥物的設(shè)計(jì)(Anti-Cancer drug design)3219-230(1989)。為了提高拮抗劑的血清半衰期，一種方法是在拮抗劑(尤其抗體片段)中摻入補(bǔ)救受體結(jié)合表位，如美國(guó)專利5,739,277所述。本文中術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”是指IgG(例如IgG1，IgG2、IgG3、或IgG4)Fc區(qū)中負(fù)責(zé)延長(zhǎng)該IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的表位。
免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還涉及免疫偶聯(lián)物，所述免疫偶聯(lián)物包含與細(xì)胞毒性藥劑結(jié)合的抗體，細(xì)胞毒性藥劑例如化學(xué)治療劑、毒素(例如，細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射偶聯(lián)物)。多種放射性核素可用于制備放射偶聯(lián)抗體。實(shí)例包括但不限于，例如，212Bi，131I，131In，90Y和186Re。
用于產(chǎn)生所述免疫偶聯(lián)物的化療劑已經(jīng)在上文描述。例如，BCNU，鏈脲菌素(streptozoicin)，長(zhǎng)春新堿和5-氟尿嘧啶，美國(guó)專利5,053,394，5,770,710所述的已知統(tǒng)稱為L(zhǎng)L-E33288復(fù)合物的藥劑家族，以及esperamicins(美國(guó)專利5,877,296)等(也參見本文的化療劑的定義)可偶聯(lián)于抗-ANGPTL4或抗-血管生成抗體或其片段。
為了選擇性破壞細(xì)胞，抗體可包括高度放射活性的原子。多種放射活性同位素可用于產(chǎn)生放射偶聯(lián)的抗-ANGPTL4或其片段。實(shí)例包括但不限于211At，131I，125I，90Y，186Re，188Re，153Sm，212Bi，32P，212Pb，111In以及Lu的放射性同位素等。當(dāng)所述偶聯(lián)物是用于診斷時(shí)，其可以包含用于閃爍成像研究的放射性原子，例如Tc99或I123、或用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，mri)的自旋標(biāo)記物，例如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可以用已知的方法將放射標(biāo)記物或其它標(biāo)記物摻入到所述偶聯(lián)物中。例如，可以利用包含，例如適當(dāng)位置的氟-19或氫的適合的氨基酸前體，通過化學(xué)的氨基酸合成來(lái)生物合成或化學(xué)合成所述肽。Tc99或I123、Re186、Re188和In111標(biāo)記物可以通過肽中的半胱氨酸殘基附著上。釔-90可以通過賴氨酸殘基附著。IODOGEN法(Fraker等，Biohem.Biophys.Res.Commun.8049-57(1978)可用于摻入碘-123。在″Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy″(Chatal，CRC Press 1989)中描述了結(jié)合放射性核素的其它方法。
可以應(yīng)用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolacca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑，白樹毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。例見1993年10月28日公開的WO93/21232。
拮抗劑與細(xì)胞毒制劑的偶聯(lián)物可通過多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來(lái)連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來(lái)酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(如亞氨基己二酸二甲酯鹽酸鹽)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對(duì)-疊氮基苯甲?；?己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對(duì)-重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科學(xué)2381098(1987)所述制備。C14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯(lián)至拮抗劑的示例性偶聯(lián)劑。見WO94/11026。這種接頭可能是有利于細(xì)胞毒藥物在細(xì)胞內(nèi)釋放的“可斷開的接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定型接頭，肽酶敏感型接頭，二甲基接頭或含二硫鍵的接頭(Chari等，癌癥研究52127-131(1992))。
可選，可制備包含抗-ANGPTL4和細(xì)胞毒劑的融合蛋白，例如通過重組技術(shù)或肽合成。DNA的長(zhǎng)度可包括編碼偶聯(lián)物的兩個(gè)部分的分別的區(qū)域，其或者相鄰或者通過編碼不破壞偶聯(lián)物所需性質(zhì)的接頭肽的區(qū)域分隔。
在一些實(shí)施方案中，拮抗劑可與腫瘤預(yù)靶向中應(yīng)用的“受體”(如鏈霉親和素)偶聯(lián)，將該拮抗劑-受體偶聯(lián)物給予患者，之后用清除劑除去循環(huán)中未結(jié)合的偶聯(lián)物，再給予已偶聯(lián)了細(xì)胞毒制劑(如放射性核苷酸)的“配體”(如親和素)。一些實(shí)施方案中，抗體和具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸內(nèi)切酶諸如脫氧核糖核酸酶；Dnase)形成免疫偶聯(lián)物。
美登木素和美登木素生物堿本發(fā)明還提供偶聯(lián)于一或多個(gè)美登木素生物堿分子的本發(fā)明的抗體。美登木素生物堿是有絲分裂抑制物，通過抑制微管蛋白的聚合起作用。美登素最早自東非灌木齒葉美登木(美國(guó)專利3,896,111)分離。隨后，發(fā)現(xiàn)特定的微生物也可產(chǎn)生美登木素生物堿，例如美登木醇(maytansinol)和C-3美登木醇酯(美國(guó)專利4,151,042)。本領(lǐng)域人員熟悉合成美登木醇和美登木醇類似物，并在例如美國(guó)專利4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中公開，其公開內(nèi)容在此包含作為參考。
例如，抗-ANGPTL4抗體或抗-αVβ5抗體偶聯(lián)物美登木素生物堿分子而不明顯降低抗體或美登木素生物堿分子的生物活性。偶聯(lián)于每個(gè)抗體分子的平均3-4個(gè)美登木素生物堿分子顯示可有效增強(qiáng)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性而不會(huì)對(duì)抗體的功能或溶解性造成不利影響，但預(yù)期即使一個(gè)毒素/抗體分子將相對(duì)于裸抗體的使用提高細(xì)胞毒性。美登木素生物堿是本領(lǐng)域已知的并可通過已知技術(shù)合成并分離自自然來(lái)源。適宜的美登木素生物堿公開于例如美國(guó)專利5,208,020以及上文所述的其他專利和非專利文獻(xiàn)。一個(gè)實(shí)施方案中，美登木素生物堿是美登醇(maytansinol)和在芳香環(huán)或美登醇的其他位置修飾的美登醇類似物，諸如各種美登醇的酯。
本領(lǐng)域已知多種制造抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物的連接基團(tuán)，包括例如美國(guó)專利5,208,020或歐洲專利EP 0 425 235 B1，和Chari等CancerResearch 52127-131(1992)公開的那些。連接基團(tuán)包括二硫基，硫醚基，酸不穩(wěn)定基團(tuán)，光不穩(wěn)定基團(tuán)，肽酶不穩(wěn)定基團(tuán)，或酯酶不穩(wěn)定基團(tuán)，如上述專利所公開，優(yōu)選二硫基和硫醚基。
抗體和美登木素生物堿的偶聯(lián)物可通過多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來(lái)連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，亞胺基硫烷(iminothiolane)(IT)，亞胺酸酯的雙功能衍生物(如鹽酸二甲基己二酸亞氨酯(dimethyladipimidate HCl))，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對(duì)-疊氮基苯甲?；?己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對(duì)-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。尤其優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173723-737 )和N-琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)來(lái)提供二硫連接。
接頭可附著于美登木素生物堿分子的不同位點(diǎn)，這取決于連接的類型。例如，使用傳統(tǒng)的偶聯(lián)技術(shù)通過與羥基反應(yīng)形成酯連接。該反應(yīng)可出現(xiàn)在含有羥基的C-3位置，經(jīng)羥甲基修飾的C-14位置，經(jīng)羥基修飾的C-15位置，以及含羥基的C-20位置。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在美登木醇或美登木醇類似物的C-3位置形成連接。
加利車霉素(calicheamicin)另一種目的免疫偶聯(lián)物包括抗-ANGPTL4抗體或偶聯(lián)于一或多個(gè)加利車霉素分子的抗-αVβ5抗體?？贵w的加利車霉素家族能在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。加利車霉素家族的偶聯(lián)物的制備見美國(guó)專利5,712,374，5,714,586，5,739,116，5,767,285，5,770,701，5,770,710，5,773,001，5,877,296均屬于American Cyanamid Company)可使用的加利車霉素的結(jié)構(gòu)類似物包括但不限于，γ1I，α2I，o3I，N-acetyl-γ1I，PSAG和θI1(Hinman et al.，CancerResearch 533336-3342(1993)，Lode et al.，Cancer Research 582925-2928(1998)以及前述屬于American Cyanamid的美國(guó)專利)。另一種可與抗體偶聯(lián)的抗腫瘤藥物是QFA，其為抗葉酸素。加利車霉素和QFA具有細(xì)胞內(nèi)作用位點(diǎn)并不容易透過胞質(zhì)膜。因此，通過抗體介導(dǎo)的內(nèi)化進(jìn)行的這些藥劑的細(xì)胞吸收大大提高它們的細(xì)胞毒效應(yīng)。
其他抗體修飾涉及其他抗體修飾。例如，抗體可連接于各種非蛋白性聚合物，例如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯，或聚乙二醇以及聚丙二醇的共聚物。抗體也可包埋在通過例如凝聚技術(shù)或界面聚合在膠質(zhì)藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體，白蛋白微球體，微乳液，納米顆?；蚣{米膠囊)或粗乳液中制備的微膠囊中(例如分別為羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊以及聚-(甲基丙烯酸酯(methylmethacylate))微膠囊。所述技術(shù)公開于Remington’s PharmaceuticalSciences，16th edition，Oslo，A.，Ed.，(1980)。
脂質(zhì)體和納米顆粒本文公開的抗體還可在脂質(zhì)體中配制。例如，本發(fā)明的抗體也可配制成免疫脂質(zhì)體。含有所述抗體的脂質(zhì)體可通過本領(lǐng)域已知方法制備，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.774030(1980)；美國(guó)專利4,485,045和4,544,545。在美國(guó)專利5,013,566中公開了循環(huán)時(shí)間已增加了的脂質(zhì)體。通常，脂質(zhì)體的配制和使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
特別有用的脂質(zhì)體可利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物經(jīng)反相蒸發(fā)法產(chǎn)生。通過使脂質(zhì)體在擠壓之下穿過指定孔徑大小的濾膜，可獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab’片段可如Martin等，J.Biol.Chem.，257286-288(1982)所述，經(jīng)二硫鍵交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。納米顆?；蚣{米膠囊也可用于包埋本發(fā)明的多肽。一個(gè)實(shí)施方案中，可生物降解的多聚烷基(polyalky)-氰基丙烯酸酯納米顆?？膳c本發(fā)明的多肽一起使用。
其他用途抗-ANGPTL4抗體具有多種用途。例如，抗-ANGPTL4抗體可用于ANGPTL4或ANGPTL4片段的診斷實(shí)驗(yàn)中，例如，檢測(cè)其在特定細(xì)胞、組織或血清中的表達(dá)，從而檢測(cè)疾病，例如檢測(cè)本發(fā)明所述的疾病等。一個(gè)實(shí)施方案中，ANGPTL4抗體可用于選擇可利用本發(fā)明提供的方法治療的患者群。本領(lǐng)域已知的各種診斷試驗(yàn)技術(shù)可使用，諸如，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，直接或間接夾心試驗(yàn)以及在異質(zhì)或同質(zhì)期進(jìn)行的免疫沉淀測(cè)定(Zola，Monoclonal AntibodiesA Manual of Techniques，CRC Press，Inc.(1987)pp.147-158)。診斷實(shí)驗(yàn)中使用的抗體可用可檢測(cè)部分標(biāo)記。所述可檢測(cè)部分應(yīng)能直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。例如，所述可檢測(cè)部分可為放射同位素，諸如3H，14C，32P，35S，或125I，熒光或化學(xué)發(fā)光化合物，諸如熒光素異硫氰酸酯，若丹明，或螢光素，或酶，諸如堿性磷酸酶，beta-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。本領(lǐng)域已知的任何將抗體與可檢測(cè)部分偶聯(lián)的方法可使用，包括Hunter et al.，Nature，144945(1962)；David et al.，Biochemistry，131014(1974)；Pain et al.，J.Immunol.Meth.，40219(1981)；and Nygren，J.Histochem.AndCytochem.，30407(1982)描述的方法。
抗-ANGPTL4抗體可用于對(duì)來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物或天然來(lái)源的ANGPTL4進(jìn)行親和純化。在該過程中，使用本領(lǐng)域已知的方法將抗ANGPTL4抗體固定于適宜支持物上，諸如Sephadex樹脂或?yàn)V紙。然后使該固定的抗體與含有待純化的ANGPTL4的樣品接觸，然后用可基本去除樣品中除外ANGPTL4的所有物質(zhì)的適宜溶劑洗滌支持物，其中的ANGPTL4結(jié)合于固定的抗體。最后，利用另一種適宜的溶劑洗滌支持物，將ANGPTL4從抗體釋放。
B.載體，宿主細(xì)胞和重組方法本發(fā)明所述多肽可利用輕易可得的技術(shù)和材料重組制備。
為進(jìn)行本發(fā)明多肽的重組生產(chǎn)，分離編碼它的核酸并把核酸插入可復(fù)制的載體中進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)。編碼糖蛋白的DNA易于利用傳統(tǒng)方法分離和測(cè)序(例如，通過使用能夠與編碼糖蛋白的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)?？衫迷S多載體。載體的組分通常包括，但不限于，以下物質(zhì)中的一種或多種信號(hào)序列，復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因，增強(qiáng)子，啟動(dòng)子，和轉(zhuǎn)錄終止序列。
信號(hào)序列成分本發(fā)明的多肽不僅可直接被重組生產(chǎn)，也可以作為與異源多肽的融合蛋白被生產(chǎn)，該異源多肽優(yōu)選是信號(hào)序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定切割位點(diǎn)的其它多肽。選定的異源信號(hào)序列優(yōu)選是可由宿主細(xì)胞識(shí)別和加工(即，由信號(hào)肽酶切割)的序列。對(duì)于不識(shí)別和加工天然多肽信號(hào)序列的原核細(xì)胞，信號(hào)序列由以下原核信號(hào)序列取代，例如選自堿性磷酸酶，青霉素酶，lpp，或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列。對(duì)于酵母分泌物，天然信號(hào)序列可由例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列，α因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母(Saccharomyces)和克魯維酵母(Kluyveromyces)α-因子前導(dǎo)序列)，或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列，白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列，或WO 90/13646中所述的信號(hào)序列。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可利用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌性前導(dǎo)序列，例如，單純皰疹gD信號(hào)。
在閱讀框架中，此種前體區(qū)的DNA連接于編碼所述抗體的DNA。
復(fù)制成分的起點(diǎn)表達(dá)載體和克隆載體都包含能使該載體在一或多種選定的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。一般情況下，在克隆載體中，這種序列是能使該載體獨(dú)立于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，包括復(fù)制起點(diǎn)或自我復(fù)制序列。這樣的序列在各種細(xì)菌、酵母和病毒中都是眾所周知的。質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2μ質(zhì)粒起點(diǎn)適合酵母菌，多種病毒起點(diǎn)(SV40，多瘤病毒(Polyoma)，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。復(fù)制組分的起點(diǎn)一般不是哺乳動(dòng)物表達(dá)載體所必需的(SV40起點(diǎn)的使用通常僅僅是由于其包含早期啟動(dòng)子)。
選擇基因成分表達(dá)載體和克隆載體應(yīng)該包含選擇基因，也稱選擇標(biāo)記。典型的選擇基因編碼具有以下性質(zhì)的蛋白(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素(如氨芐青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四環(huán)素)的抗性，(b)彌補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷，或(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基不能供給的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
選擇方案的一個(gè)實(shí)例是利用藥物限制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。那些被異源基因成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生一種賦予藥物抗性的蛋白，從而在該選擇環(huán)境中存活。這種顯性選擇可以采用的藥物有新霉素，霉酚酸和潮霉素。
適合于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的另一例選擇標(biāo)記是允許鑒定能攝取多肽核酸的細(xì)胞的那些標(biāo)記，如DHFR或胸苷激酶，金屬硫蛋白-I和-II，優(yōu)選靈長(zhǎng)類金屬硫蛋白基因，腺苷脫氨酶，鳥氨酸脫羧酶等。
例如，用DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞首先通過將所有轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在包含氨甲蝶呤(Mtx，為DHFR的一種競(jìng)爭(zhēng)型拮抗劑)的培養(yǎng)基中來(lái)進(jìn)行鑒定。當(dāng)采用野生型DHFR時(shí)，合適的宿主細(xì)胞包括DHFR活性有缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。
或者，宿主細(xì)胞(尤其包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)被編碼Bv8的DNA序列，野生型DHFR蛋白，以及另一種選擇標(biāo)記如氨基糖苷3’-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化以后，可以通過在含有針對(duì)該選擇標(biāo)記的選擇試劑如氨基糖苷類抗生素(如卡那霉素，新霉素或G418)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)進(jìn)行選擇。參見美國(guó)專利4,965,199。
適用于酵母的合適選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，28239(1979))。Trp1基因?yàn)椴荒茉谏彼嶂猩L(zhǎng)的酵母突變株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了選擇標(biāo)記(Jones，Genetics，8512(1977))。此后，酵母宿主細(xì)胞基因組中trp1損傷的存在提供了通過在缺乏色氨酸的條件中生長(zhǎng)而檢測(cè)轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似地，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)可以由攜帶Leu2基因的已知質(zhì)粒來(lái)補(bǔ)充。
此外，源自1.6μm環(huán)狀質(zhì)粒pKDl的載體可以用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母(Kluyveromyces)。Bianchi等，Curr.Genet.，12185(1987)?？蛇x地，Van den Berg，Bio/Technology，8135(1990)報(bào)道了一種用于在乳克魯維酵母(K.lactis)中大規(guī)模制備重組小牛凝乳酶的表達(dá)系統(tǒng)。已公開由克魯維酵母的工業(yè)生產(chǎn)菌株產(chǎn)生分泌重組人血清白蛋白的穩(wěn)定的多拷貝表達(dá)載體。Fleer等，Bio/Technology，9968-975(1991)。
啟動(dòng)子成分表達(dá)載體和克隆載體通常包含能被宿主生物識(shí)別的啟動(dòng)子，它與多肽核酸可操作相連。適用于原核宿主的啟動(dòng)子，包括phoA啟動(dòng)子，β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)，和雜化啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子。然而，也可以使用其它已知的細(xì)菌啟動(dòng)子。適用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還包含與編碼多肽的DNA可操作相連的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
真核生物的啟動(dòng)子序列也是已知的。幾乎所有的真核基因在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約25-30個(gè)堿基處具有AT-富集區(qū)。很多基因在其轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游70-80個(gè)堿基處有另一種序列CNCAAT，其中X可以是任何核苷酸。大多數(shù)真核基因的3’端是AATAAA序列，它可以作為一種信號(hào)用于將poly-A尾添加到編碼序列3’端。所有這些序列都適合于插入真核表達(dá)載體中。
適用于酵母宿主的啟動(dòng)序列的實(shí)例包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.，2552073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7149(1968)；Holland，Biochemistry，174900(1978))的啟動(dòng)子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶。
其它的酵母啟動(dòng)子，即那些還具有由生長(zhǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，是下述基因的啟動(dòng)子區(qū)醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73,657中進(jìn)一步描述了適用于酵母表達(dá)系統(tǒng)的載體和啟動(dòng)子。酵母增強(qiáng)子與酵母啟動(dòng)子聯(lián)合使用也是有利的。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，從載體轉(zhuǎn)錄抗體可以受啟動(dòng)子調(diào)控，所述啟動(dòng)子例如來(lái)自病毒基因組，如多形瘤病毒、雞痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的啟動(dòng)子，或者來(lái)自異源哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子，如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子等，來(lái)自熱休克蛋白的啟動(dòng)子，前提是這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子可以作為還包含SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)的SV40限制性片段而方便地獲得。人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子可以作為Hind III E限制性片段方便地獲得。美國(guó)專利4,419,446中公開了在哺乳動(dòng)物宿主中用牛乳頭瘤病毒作為載體來(lái)表達(dá)DNA的系統(tǒng)。美國(guó)專利4,601,978中敘述了對(duì)這個(gè)系統(tǒng)的改進(jìn)。另見Reyes等，Nature，297598-601(1982)中關(guān)于在單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子控制下在小鼠細(xì)胞中表達(dá)人β干擾素cDNA?？蛇x地，可將勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列作為啟動(dòng)子。
增強(qiáng)子成分編碼本發(fā)明多肽的DNA在高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄常常通過將增強(qiáng)子序列插入載體中來(lái)增加。目前已知很多哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列。但通常使用真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括在其復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)(late side)的SV40增強(qiáng)子(bp100-270)，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，在其復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)的多形瘤增強(qiáng)子，和腺病毒增強(qiáng)子。也可參見Yaniv，Nature，29717-18(1982)所述用于活化真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件。所述增強(qiáng)子可以剪接插入載體中抗體編碼序列的5’或3’位置，但優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5’位置。
轉(zhuǎn)錄終止成分用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人或來(lái)自其它多細(xì)胞生物的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體，還包括對(duì)轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。這些序列通常來(lái)自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶爾為3’)非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄為編碼抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止元件是牛生長(zhǎng)激素多腺苷化區(qū)。見WO94/11026和其中公開的表達(dá)載體。
宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化克隆或表達(dá)本文所述載體中DNA的適宜宿主細(xì)胞，包括原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞。適于此目的的原核生物包括真細(xì)菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌屬(Escherichia)，例如，大腸桿菌(E.coli)，腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文菌屬(Erwinia)，克雷白菌屬(Klebsiella)，變形菌桿屬(Proteus)，沙門菌屬(Salmonella)(如鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium))，沙雷菌屬(Serratia)(如粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescans))和志賀菌屬(Shigella)等，以及芽孢桿菌屬(Bacilli)如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬(Pseudomonas)如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，及鏈霉菌(Streptomyces)。優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446)，但其它菌株，如大腸桿菌B，大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)也是合適的。這些實(shí)例是用于說明，并非限制。
除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適合于抗體編碼載體的克隆或表達(dá)的宿主。釀酒酵母或常見的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。還有多個(gè)其它屬、種和株已有商品供應(yīng)，并且可以用于本發(fā)明，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，例如乳克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克斯克魯維氏酵母(K.marxianus)等；yarrowia(EP402,226)；巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)(EP 183,070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28265-278(1988))；念珠菌屬；Trichoderma reesia(EP244,234)；粗糙鏈孢霉；許旺氏酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)等；和絲狀真菌，例如鏈孢霉屬、青霉屬、Tolypocladium以及曲霉屬宿主如構(gòu)巢曲霉和黑曲霉。
適合于表達(dá)糖基化多肽的宿主細(xì)胞來(lái)自多細(xì)胞生物。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括植物和昆蟲細(xì)胞。目前已經(jīng)從下述宿主中鑒定了大量的桿狀病毒株和變體以及相應(yīng)的許可型昆蟲宿主細(xì)胞草地夜蛾(SpodopteraFrugiperda，毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，蚊子)、白紋伊蚊(Aedesalbopictus，蚊子)、Drosophila melanogaster(果蠅)和家蠶蛾(Bombyx mori)等。用于轉(zhuǎn)染的各種病毒株公眾可以獲得，例如加利福尼亞Y級(jí)夜蛾(Autographa california)NPV的L-1變體和家蠶蛾NPV的Bm-5株，并且這些病毒可以在此用作本發(fā)明的病毒，尤其是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛、西紅柿和煙草等的植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。
然而，關(guān)注最多的是脊椎動(dòng)物細(xì)胞，而且在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中繁殖脊椎動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)成為常規(guī)方法。有效哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細(xì)胞系(293細(xì)胞或經(jīng)過再克隆以便能在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的293細(xì)胞，Graham等，J.Gen Virol.3659(1977))；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.774216(1980))；小鼠足細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))；猴腎細(xì)胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細(xì)胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法羅(buffalo)大鼠肝細(xì)胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI細(xì)胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68(1982))；MRC 5細(xì)胞；FS4細(xì)胞；小鼠骨髓瘤細(xì)胞，例如NSO(如RCB0213，Bebbington等，Bio/Technology 10169(1992))和SP2/0細(xì)胞(例如SP2/0-Ag14細(xì)胞，ATCCCRL 1581)；大鼠骨髓瘤細(xì)胞，例如YB2/0細(xì)胞(例如YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細(xì)胞，ATCC CRL 1662)；和人肝癌細(xì)胞系(HepG2)。
利用上述表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以進(jìn)行抗體制備并培養(yǎng)在經(jīng)改進(jìn)的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化體，或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。
培養(yǎng)宿主細(xì)胞可在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞。作為商品提供的培養(yǎng)基例如Ham’s F10(Sigma)，極限必需培養(yǎng)基(Minimal EssentialMedium)((MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco’s改良的Eagle培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)適宜培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此外，Ham等，Meth.Enzym.5844(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102255(1980)，美國(guó)專利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國(guó)專利Re.30,985中所述的任何培養(yǎng)基可用作宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。在需要時(shí)均可向這些培養(yǎng)基的任何一種補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(例如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，或表皮生長(zhǎng)因子)，鹽(例如氯化鈉，鈣，鎂，和磷酸鹽)，緩沖液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷酸和胸腺嘧啶)，抗生素(例如GENTAMYCINTM藥物)，微量元素(定義為無(wú)機(jī)化合物，通常終濃度在微摩爾范圍內(nèi))，和葡萄糖或?qū)Φ鹊哪茉础Ｒ部砂ū绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知的適當(dāng)濃度的任何其它必需添加劑。培養(yǎng)條件，例如溫度，pH，等是此前選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的條件，并且是本領(lǐng)域普通熟練技術(shù)人員顯而易見的。培養(yǎng)條件諸如溫度，pH等，是被選用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的那些條件，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。
多肽純化使用重組技術(shù)時(shí)，本發(fā)明的多肽例如ANGPTL4，抗-ANGPTL4抗體或抗-αvβ5抗體可在細(xì)胞內(nèi)，壁膜間隙產(chǎn)生，或直接分泌到培養(yǎng)基中。本發(fā)明的多肽可收集自培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞裂解物。如果是膜結(jié)合的，其可利用適宜洗滌溶液(例如Triton-X 100)或通過酶促裂解釋放自膜。用于表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞可通過各種物理或化學(xué)方法破壞，諸如凍-干循環(huán)，超聲波降解法，機(jī)械破壞或細(xì)胞裂解劑。
需要從重組細(xì)胞蛋白或多肽純化本發(fā)明的多肽。以下步驟是適宜純化步驟的實(shí)例在離子交換柱上分級(jí)；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅膠上層析，在陰離子或陽(yáng)離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱，DEAE等)上進(jìn)行肝素SEPHAROSETM層析；色層焦集法；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；利用例如Sephadex G-75的凝膠過濾；蛋白A瓊脂糖凝膠柱以去除污染物諸如IgG；以及金屬螯合柱以結(jié)合本發(fā)明多肽的表位標(biāo)記的形式。各種蛋白純化方法可使用，諸如本領(lǐng)域已知的那些以及在以下文獻(xiàn)中描述的那些Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein PurificationPrinciplesand Practice，Springer-Verlag，New York(1982)。所選純化步驟有賴于例如使用的制備過程的性質(zhì)以及產(chǎn)生的具體的本發(fā)明的多肽。
例如，由細(xì)胞制備的抗體組合物可使用例如如下方法純化例如，羥磷灰石層析，凝膠電泳，透析和親和層析，優(yōu)選親和層析作為常用的純化技術(shù)。蛋白A作為親和配體的適宜性有賴于存在于糖蛋白中的任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人(γ1，γ2，或γ4重鏈的糖蛋白(Lindmark等，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。蛋白G用于所有小鼠同種型和人γ3(Guss等，EMBO J.515671575(1986))。親和配體附著的基質(zhì)通常是瓊脂糖，但也可用其它基質(zhì)。機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)例如孔徑被控制的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)比使用瓊脂糖獲得更快的流率而且加工時(shí)間更短。對(duì)于含有CH3區(qū)的抗體，Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于純化。根據(jù)待回收的抗體，也可利用其它蛋白純化技術(shù)，例如上文所述那些。也見Carter et al.，Bio/Technology10163-167(1992)，其描述用于分離分泌入大腸桿菌胞質(zhì)周隙的抗體的方法。
本發(fā)明多肽的共價(jià)修飾本發(fā)明多肽例如ANGPTL4或多肽激動(dòng)劑或多肽拮抗劑的共價(jià)修飾包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如果可以，它們可通過化學(xué)合成或酶或化學(xué)裂解所述多肽來(lái)制備。其他類型的多肽共價(jià)修飾通過使靶向的多肽氨基酸殘基與能與選定的側(cè)鏈或N-或C-末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生化藥劑反應(yīng)或?qū)⑿揎椀陌被峄蚍翘烊话被釗饺肷L(zhǎng)中的多肽鏈來(lái)導(dǎo)入分子，例如，Ellmanet al.Meth.Enzym.202301-336(1991)；Noren et al.Science 244182(1989)；和，& US專利申請(qǐng)20030108885和20030082575。
半胱氨酰殘基通常與α-鹵代乙酸酯(以及相應(yīng)的胺)諸如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)產(chǎn)生羧甲基或羧基氨基甲基衍生物。半胱氨酸殘基也通過與溴代三氟丙酮，α-溴代-β-(5-咪唑基(imidozoyl))丙酸，氯代乙酰磷酸(chloroacetylphosphate)，N-烷基馬來(lái)酰亞胺，3-硝基-2-吡啶基二硫化物，甲基2-吡啶基二硫化物，p-對(duì)氯汞苯甲酸，2-氯汞基-4-硝基酚，或氯代-7-硝基苯基-2-氧代(oxa)-1，3-二唑。組氨酰殘基通過在pH 5.5-7.0與焦碳酸二乙酯反應(yīng)衍生化，這是因?yàn)樵撍巹?duì)于組氨酰側(cè)鏈的相對(duì)特異性。對(duì)-溴苯酰甲基溴也有用；該反應(yīng)通常在pH6.0在0.1mM二甲胂酸鈉中進(jìn)行。
賴氨酰和氨基末端殘基與琥珀酸或其它羧酸酐反應(yīng)。利用這些試劑進(jìn)行衍生化對(duì)于反轉(zhuǎn)賴氨酰殘基的電荷有效。其它適宜衍生化含有α-氨基的殘基的藥劑包括亞氨酸酯，諸如甲代吡啶基亞氨酸甲酯(methylpicolinimidate)，磷酸吡哆醛，吡哆醛，氯代氫硼化物，三硝基苯磺酸，O-甲基異脲，2，4-戊二酮，和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸鹽的反應(yīng)。
精氨酰殘基通過與一或多種常規(guī)藥劑反應(yīng)來(lái)修飾，其中包括苯乙二醛，2，3-丁二酮，1，2-肌醇和水合茚三酮。精氨酸殘基的衍生化需要在堿性條件中進(jìn)行反應(yīng)，因?yàn)殡夜δ芑鶊F(tuán)可pKa較高。此外，這些藥劑可與賴氨酸的基團(tuán)以及精氨酸epsilon-氨基基團(tuán)反應(yīng)。
酪氨酰殘基的具體修飾具體可通過與芳香重氮化合物或四硝基甲烷反應(yīng)而將光譜標(biāo)記導(dǎo)入酪氨酰殘基。通常，N-乙酰咪唑(acetylimidizole)和四硝基甲烷可使用以分別形成O-乙酰酪氨酰種類和3-硝基衍生物。酪氨酰殘基利用125I或131I碘化以制備用于放射免疫測(cè)定的標(biāo)記的蛋白。
羧基側(cè)鏈(天冬氨?；蚬劝滨；?通過與碳化二亞胺(R-N＝C＝N-R’)反應(yīng)選擇性修飾，其中R和R’是不同的烷基基團(tuán)，諸如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-azonia-4，4-甲己胺)碳化二亞胺。此外，天冬氨酰和谷氨酰殘基通過與銨離子反應(yīng)轉(zhuǎn)化成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰殘基。
谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基經(jīng)常被脫去酰胺基分別成為相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基。這些殘基在中性或堿性條件下脫去酰胺基。這些殘基的脫酰胺基形式在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥化形式，絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))，N末端胺的乙?；?，以及任意C末端羧基酰胺化。
另一種類型的共價(jià)修飾涉及通過化學(xué)或酶的方法將苷類偶聯(lián)于本發(fā)明的多肽。這些方法的優(yōu)勢(shì)在于它們不需要在具有N或C-連接的糖基化的糖基化能力的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽。根據(jù)所用偶聯(lián)模式，糖可連接于(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基諸如半胱氨酸的，(d)游離羥基諸如絲氨酸、蘇氨酸或羥基脯氨酸的那些，(e)芳香殘基，諸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基團(tuán)。這些方法在1987-9-11公開的WO 87/05330以及Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)中描述。
去除本發(fā)明多肽上存在的碳水化物部分可通過化學(xué)或酶的方法實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)去糖基化需要將多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。該處理導(dǎo)致除外連接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖被裂解，而保持多肽完整。化學(xué)糖基化由Hakimuddin，et al.Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)and by Edge et al.Anal.Biochem.，118131(1981)描述。碳水化合物部分(例如抗體上的)的酶裂解可通過利用各種內(nèi)切和外切糖苷酶如Thotakura et al.Meth.Enzymol.138350(1987)所述實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明多肽的另一種共價(jià)修飾包括將多種非蛋白聚合物中的一種與多肽相連，所述聚合物例如聚乙二醇或聚氧乙烯，其方式如美國(guó)專利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述。
藥物組合物可以制備根據(jù)本發(fā)明使用的本發(fā)明的分子，ANGPTL4，ANGTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑的治療配制劑用于保存，方法是將具有適當(dāng)純度的所需分子例如多肽與可選的藥用載體，賦形劑，或穩(wěn)定劑(Remington′sPharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.ed.(1980))混合形成凍干配制劑或水溶液?？山邮艿妮d體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對(duì)受者無(wú)毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化芐烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少于10個(gè)殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如鋅-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM，PLURONICSTM或乙二醇(PEG)。
活性組分也可包埋在微膠囊中，所述微膠囊例如通過凝聚計(jì)數(shù)或通過界面聚合化，例如羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基methacylate)微膠囊，分別在膠體給藥系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體，白蛋白微球體，促乳液，納米顆?；蚣{米膠囊)或粗乳液中制備。所述技術(shù)公開于Remington’sPharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。也見Johnson et al.，Nat.Med.，2795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，271221-1223(1993)；Horaet al.，Bio/Technology，8755-758(1990)；Cleland，″Design and Production ofSingle Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide MicrosphereSystems，″in Vaccine DesignThe Subunit and Adjuvant Approach，Powell andNewman，eds，(Plenum PressNew York，1995)，pp.439-462；WO 97/03692，WO 96/40072，WO 96/07399；和U.S.Pat.No.5,654,010。
一些實(shí)施方案中，用于體內(nèi)給藥的配制品必須是無(wú)菌的。在凍干和重建之前或之后通過除菌濾膜過濾可容易地實(shí)現(xiàn)無(wú)菌。
可制備緩釋制備物。緩釋制劑的適當(dāng)實(shí)例包括具有一定形狀且含有本發(fā)明化合物的固體疏水聚合物半通透基質(zhì)，如膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)實(shí)例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國(guó)專利3773919，EP 58,481)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。雖然聚合物諸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羥乙酸使得能夠釋放分子100天以上，一些水凝膠釋放蛋白的時(shí)間持續(xù)較短。當(dāng)包被的抗體在體內(nèi)保持較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，它們由于在37℃暴露于潮濕環(huán)境而發(fā)生變性和聚集，導(dǎo)致生物活性的喪失以及免疫原性的可能的改變。可根據(jù)涉及的機(jī)制設(shè)計(jì)合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是細(xì)胞間通過硫代二硫化物交換形成S-S鍵，穩(wěn)定化可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液凍干、控制適度含量、使用適宜的添加劑以及開發(fā)具體的聚合物基質(zhì)組合物實(shí)現(xiàn)。也見，例如，US Patent No.6,699,501，其描述具有聚合電解質(zhì)覆蓋物的膠囊。
還涉及本發(fā)明的治療蛋白藥劑(ANGPTL4，ANGPTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑)可通過基因治療導(dǎo)入受試者?；蛑委熤竿ㄟ^將核酸給藥受試者進(jìn)行的治療。在基因治療應(yīng)用中，基因?qū)爰?xì)胞以實(shí)現(xiàn)治療有效的基因產(chǎn)物的體內(nèi)合成，例如通過取代有缺陷的基因?！盎蛑委煛卑ǔＲ?guī)基因治療，其中可通過單次治療實(shí)現(xiàn)持續(xù)效應(yīng)，還包括給藥基因治療藥劑，其涉及一次或重復(fù)給藥治療有效的DNA或mRNA。反義RNA和DNA可用作阻斷一些基因在體內(nèi)表達(dá)的治療劑。見例如，本文描述的Ad-ANGPTL4-SiRNA。已經(jīng)顯示盡管短的反義寡核苷酸的細(xì)胞內(nèi)低濃度導(dǎo)致其細(xì)胞膜吸收有限，可將它們引入細(xì)胞，它們?cè)诩?xì)胞中作為抑制劑。(Zamecnik et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834143-4146(1986))。可修飾寡核苷酸提高它們的吸收，例如通過用不帶電的基團(tuán)取代它們帶負(fù)電的磷酸二酯基?；蛑委煼椒ǖ暮?jiǎn)述參見例如Goldspiel et al.Clinical Pharmacy12488-505(1993)；Wu and Wu Biotherapy 387-95(1991)；Tolstoshev Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan Science 260926-932(1993)；Morgan and Anderson Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；and MayTIBTECH 11155-215(1993)。本領(lǐng)域通常已知的可用的重組DNA技術(shù)描述于Ausubel et al.eds.(1993)Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，NY；and Kriegler(1990)Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY。
存在多種技術(shù)可用于將核酸導(dǎo)入存活細(xì)胞。所述技術(shù)根據(jù)核酸轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的細(xì)胞，或在體內(nèi)轉(zhuǎn)入目的宿主的細(xì)胞而不同。適合將核酸導(dǎo)入體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)包括脂質(zhì)體，電穿孔，顯微注射，細(xì)胞融合，DEAE-葡聚糖，磷酸鈣沉淀法等。例如，體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)包括但不限于例如，用病毒(通常是逆轉(zhuǎn)錄病毒)載體的轉(zhuǎn)染和病毒包膜蛋白-脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Dzau et al.，Trends in Biotechnology 11，205-210(1993))。例如，體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括利用病毒載體(諸如腺病毒，I型單純皰疹病毒，慢病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺伴隨病毒)以及基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(用于基因的脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移的有用的脂質(zhì)是例如DOTMA，DOPE和DC-Chol)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在基因治療中使用病毒載體的實(shí)例可見于Clowes et al.J.Clin.Invest.93644-651(1994)；Kiem et al.Blood 831467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg Human GeneTherapy 4129-141(1993)；Grossman and Wilson Curr.Opin.in Genetics andDevel.3110-114(1993)；Bout et al.Human Gene Therapy 53-10(1994)；Rosenfeld et al.Science 252431-434(1991)；Rosenfeld et al.Cell 68143-155(1992)；Mastrangeli et al.J.Clin.Invest.91225-234(1993)；and Walsh et al.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300(1993)。
一些情況中，需要對(duì)核酸來(lái)源提供靶向靶細(xì)胞的藥劑，諸如，特異于細(xì)胞表面膜蛋白或靶細(xì)胞的抗體，靶細(xì)胞受體的配體等。使用脂質(zhì)體的情況中，結(jié)合于內(nèi)吞相關(guān)的細(xì)胞表面膜蛋白的蛋白可用于靶向和/或促進(jìn)吸收，例如對(duì)特定細(xì)胞類型具有向性的衣殼蛋白或其片段，在周期中經(jīng)過內(nèi)化的蛋白的抗體，靶向細(xì)胞內(nèi)定位并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)半壽期的蛋白。受體介導(dǎo)的胞內(nèi)吞作用的技術(shù)在例如Wu et al.，J.Biol.Chem.262，4429-4432(1987)；andWagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414(1990)中描述?；驑?biāo)記和基因治療方案的簡(jiǎn)述參見Anderson et al.，Science 256，808-813(1992)。
劑量和給藥本發(fā)明的藥用組合物的劑量和所需藥物濃度可根據(jù)預(yù)想的具體用途變化。確定合適的劑量或給藥途徑是普通醫(yī)師技術(shù)內(nèi)熟知的。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可為測(cè)定人類治療的有效量提供可靠的指導(dǎo)。按照Mordenti，J.和Chappell，W.“The use of interspecies scaling in toxicokinetics”，見Toxicokinetics and NewDrug Development，Yacobi等，編，Pergamon Press，New York 1989，第42-96頁(yè)制訂的原則可進(jìn)行有效量的種間比例縮放。
根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度，大約1μg/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的ANGPTL4，ANGPTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑是給藥患者的初始候選劑量，給藥方式可為一或多次分開的給藥或連續(xù)輸注。當(dāng)體內(nèi)給藥ANGPTL4或其激動(dòng)劑或拮抗劑時(shí)，根據(jù)給藥途徑，正常的劑量可根據(jù)給藥途徑從每天大約10ng/kg到高達(dá)100mg/kg哺乳動(dòng)物體重或更多，優(yōu)選大約1.g/kg/天到10mg/kg/天。關(guān)于具體劑量和給藥方法的指導(dǎo)在文獻(xiàn)中提供，參見，例如，美國(guó)專利號(hào)4,657,760；5,206,344；或5,225,212?？深A(yù)期不同的配制品對(duì)不同的治療化合物和不同的疾病有效，例如，針對(duì)一種器官或組織的給藥必須以不同于另一種器官或組織的方式給藥。對(duì)于在數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的重復(fù)給藥，治療持續(xù)到對(duì)疾病癥狀的理想的抑制出現(xiàn)。但是，也可采用其它劑量方案。通常，臨床醫(yī)師將給藥本發(fā)明的分子直到達(dá)到提供所需生物效應(yīng)的劑量。本發(fā)明治療的過程容易通過常規(guī)技術(shù)或測(cè)定法監(jiān)測(cè)。
本發(fā)明的治療組合物可通過任何適宜方法給藥，包括但不限于，胃腸外，皮下，腹腔內(nèi)，，肺內(nèi)，腦脊髓內(nèi)，皮下，關(guān)節(jié)內(nèi)，滑膜內(nèi)，鞘內(nèi)，口服，局部，以及鼻內(nèi)給藥。胃腸外輸注包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹腔內(nèi)或皮下給藥。此外，治療組合物可通過脈沖輸注適宜給藥，具體利用遞減的量的抗體。一些實(shí)施方案中，治療組合物通過注射給藥，例如靜脈內(nèi)或皮下注射，根據(jù)給藥是短暫的還是長(zhǎng)期的而不同。
如本發(fā)明所述，ANGPTL4，ANGPTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑，可與一或多種治療劑組合。組合的給藥包括共給藥，其利用分離的配制劑或單個(gè)藥物配制劑，還包括以任何順序的連續(xù)給藥。多種藥劑的使用也包括在本發(fā)明中。例如，ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑可在其它治療劑之前、之后或交替給藥，或可同時(shí)給藥。一個(gè)實(shí)施方案中，存在兩種(或所有)活性藥劑同時(shí)顯示它們的生物活性的時(shí)間段。
一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療涉及ANGPTL4拮抗劑以及一或多種治療劑的聯(lián)合給藥。本發(fā)明還涉及給藥多種抑制劑。聯(lián)合給藥包括共給藥，其利用分離的配制劑或單個(gè)藥物配制劑，還包括以任何順序的連續(xù)給藥。多種藥劑的使用也包括在本發(fā)明中。例如，ANGPTL4或ANGPTL4激動(dòng)劑可在其它治療劑之前、之后或交替給藥，或可同時(shí)給藥。一個(gè)實(shí)施方案中，存在兩種(或所有)活性藥劑同時(shí)顯示它們的生物活性的時(shí)間段。
為預(yù)防或治療疾病，適宜劑量的ANGPTL4，ANGPTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑，有賴于待治療疾病的類型，如上所述，疾病的嚴(yán)重性和病程，給藥是為了預(yù)防還是為了治療，以前的治療，病人的臨床病史以及對(duì)藥劑的反應(yīng)，以及主治醫(yī)師的判斷?？稍谝淮魏瓦B續(xù)多次的治療中將藥劑適宜得給藥患者。在聯(lián)用治療方案中，本發(fā)明的組合物以治療有效量或治療協(xié)同量給藥。如本發(fā)明所述，治療有效量是這樣的量，其使得ANGPTL4，ANGPTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑以及一或多種其它治療劑的聯(lián)合給藥，或者本發(fā)明組合物的給藥導(dǎo)致靶疾病或病癥的減輕或抑制。治療協(xié)同量是ANGPTL4，ANGPTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑以及一或多種其它治療劑(例如本文所述的那些)協(xié)同或明顯減輕或消除具體疾病相關(guān)的情形或癥狀所需的量。
制品在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了含有用于所述方法以及疾病治療的上述物質(zhì)的制品。該制品包含容器，標(biāo)簽和包裝插入物。合適的容器包括，例如，瓶子，小瓶，注射器等。容器可由諸如玻璃或塑料等各種材料制成。該容器內(nèi)含有有效治療疾病的組合物且可以具有無(wú)菌入口(例如，該容器可以是具有通過皮下注射針頭可刺入的塞子的靜脈內(nèi)用溶液袋或小瓶)。組合物中的至少一種活性藥劑是ANGPTL4，ANGPTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑。容器上的或者與其相連的標(biāo)簽指示該組合物用于治療選定的疾病。該產(chǎn)品還可包含第二個(gè)容器，該容器中含有藥用上可接受的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液，林格(Ringer′s)溶液和葡萄糖溶液。它還包含從商業(yè)和用戶角度需要的其它材料，包括其它緩沖液，稀釋劑，過濾器，針頭，和注射器?？蛇x，一組說明，通常是書面說明，包含在其中，其涉及ANGPTL4，其激動(dòng)劑或拮抗劑針對(duì)本文所述疾病的使用和劑量。試劑盒內(nèi)包含的說明通常包括治療疾病的劑量，給藥方案以及給藥途徑的信息。ANGPTL4，ANGPTL4激動(dòng)劑或ANGPTL4拮抗劑的容器可為單位劑量，大包裝(例如，多劑量包裝)，或亞單位劑量。
材料的保藏如前所述，下列材料保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，10801UniversityBoulevard，Manassas，VA.20110-2209，，USA(ATCC)

按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定在國(guó)際上認(rèn)可的用于專利程序的微生物保藏機(jī)構(gòu)并按其實(shí)施細(xì)則(布達(dá)佩斯條約)進(jìn)行這些保藏。這樣保證了該保藏物的活培養(yǎng)物從保藏日起維持30年。按布達(dá)佩斯條約的條款該保藏物由ATCC使其可獲得且按Genentech，Inc.與ATCC之間的協(xié)議進(jìn)行，該協(xié)議保證在相關(guān)美國(guó)專利頒發(fā)時(shí)或在任何美國(guó)或外國(guó)專利申請(qǐng)公開提供給公眾時(shí)，無(wú)論哪一個(gè)在先，該保藏物的培養(yǎng)物后代可持久和無(wú)限制地為公眾獲得，且保證按照35USC§122和依據(jù)其委員會(huì)規(guī)定(包括具體參考886 OG 683的37C.F.R.§1.14)對(duì)其授權(quán)的美國(guó)專利和商標(biāo)委員認(rèn)定的個(gè)人獲得其子代。
本申請(qǐng)的受讓人同意如果保藏的該材料的培養(yǎng)物在合適條件下培養(yǎng)時(shí)如果死亡導(dǎo)致丟失或破壞時(shí)，該材料將在通知時(shí)用另一相同材料迅速替換。該保藏材料的可獲得性不應(yīng)解釋為允許違反任何政府機(jī)構(gòu)按其專利法批準(zhǔn)的權(quán)利來(lái)實(shí)施本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1ANGPTL4誘導(dǎo)人肝細(xì)胞的細(xì)胞粘附和增殖腺病毒載體的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒構(gòu)建體已經(jīng)基本上按照生產(chǎn)商所述，將Not1-Not1 cDNA插入物克隆入Stratagene(LaJolla，CA)的Ad-easy載體構(gòu)建試劑盒的多接頭位點(diǎn)來(lái)構(gòu)建。見例如，Hesser et al.，Blood，104(1)149-158(2004)。
hAngptl4(23-406)(PUR9384)，mAngptl4(184-410)-IgG(PUR9388)和mAngptl4(23-410)(PUR9452)單Flag標(biāo)記的蛋白的產(chǎn)生使收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物液體在抗-flag M2樹脂(Sigma#A-2220)上過夜。用PBS洗滌柱子到基線然后用50mM檸檬酸鈉pH3.0洗脫。該體積在Amicon-15 10,000MWCO(Millipore #UFC901024)上濃縮。最后的步驟是透析入1mM HCl/Super QH2O和0.2um過濾。利用4-20％tris/甘氨酸(Invitrogen#EC6028box)SDS page凝膠+/-10mM DTT確定純度。通過質(zhì)譜或Edman’s n-末端測(cè)序鑒定正確的蛋白質(zhì)。
hAngptl4(184-406)-IgG(PUR 9441)n-末端標(biāo)記的產(chǎn)生以及隨后的n-末端hu Fc標(biāo)記的產(chǎn)生收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物液體在ProSep A(Amersham#113111835)上過柱過夜。用PBS洗滌柱子到基線。然后進(jìn)行四倍柱體積的0.5M TMAC/PBS pH 7.5洗滌步驟，之后利用PBS洗滌到基線。洗脫步驟利用50mM Na Citrate pH 3.0泵。該體積在Amicon-15 10,000MWCO(Millipore#UFC901024)上濃縮。最終的步驟是透析入1mM HCl/Super Q H2O以及0.2um過濾。利用4-20％tris/甘氨酸(Invitrogen#EC6028box)SDS page凝膠+/-10mM DTT確定純度。通過質(zhì)譜或Edman’s n-末端測(cè)序鑒定正確的蛋白質(zhì)。重組蛋白也可利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。
Ad--ANGPTL4-SiRNA的產(chǎn)生基于完整長(zhǎng)度hANGPTL4序列，產(chǎn)生4個(gè)可能的ANGPTL4-SiRNA分子(Qiagen)?；趕iRNA抑制hANGPTL4表達(dá)的能力選擇一個(gè)ANGPTL4-SiRNA。其靶向ANGPTL4的以下DNA靶序列GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA(SEQ ID NO3)，例如，r(GGCCAAGCCUGCCCGAAGAUU)(SEQ ID NO4)和/或r(UCUUCGGGCAGGCUUGGCCAC)(SEQ ID NO5)。利用RNA啟動(dòng)子將該SiRNA克隆入CMVpShuttle-H1.1轉(zhuǎn)移載體，所述啟動(dòng)子例如，H1啟動(dòng)子(GenScript)。SiRNA表達(dá)盒隨后被克隆以產(chǎn)生腺病毒AdhANGPTL4-SiRNA構(gòu)建體。腺病毒構(gòu)建體已經(jīng)基本上按照生產(chǎn)商的描述，通過將Not1-Not1cDNA插入物克隆入Stratagene(LaJolla，CA)的Ad-easy載體構(gòu)建試劑盒的多接頭位點(diǎn)中來(lái)構(gòu)建。見例如，Hesser et al.，Blood，104(1)149-158(2004)。
ANGPTL4的表達(dá)通過利用抗FLAG抗體進(jìn)行Western印跡分析來(lái)確認(rèn)。選擇一個(gè)強(qiáng)表達(dá)的克隆并根據(jù)生產(chǎn)商說明擴(kuò)大滴度。病毒制備物利用CsCl離心純化并通過PCR檢測(cè)回復(fù)體。病毒滴度通過96孔細(xì)胞裂解試驗(yàn)根據(jù)生產(chǎn)商說明測(cè)定。這些載體，以及提供的pShuttleCMV-lacZ在BJ5183 electro感受態(tài)細(xì)菌中利用含有E1和E3區(qū)缺失的Ad5基因組的AdEasy載體進(jìn)行重組。原代病毒母液通過將重組的AdEasy質(zhì)粒瞬間轉(zhuǎn)染到宿主HEK293細(xì)胞中制備。腺病毒母液進(jìn)一步在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增，并利用CsCl梯度純化方法如生產(chǎn)商所述進(jìn)行純化。腺病毒的工作滴度通過Elisa測(cè)定法獲得。
mANGPTL4的產(chǎn)生293細(xì)胞利用含有編碼全長(zhǎng)mANGPTL4(1-410)的核酸的構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。從上清純化上清并用于試驗(yàn)。
肝細(xì)胞的細(xì)胞粘附ANGPTL4誘導(dǎo)原代肝細(xì)胞的細(xì)胞粘附的能力在96孔板中進(jìn)行評(píng)價(jià)。該板用小鼠Angptl4亞序列23-410、纖連蛋白或?qū)φ盏鞍譔L4以各種濃度包被，例如無(wú)包被，0.3μg/ml，3.0μg/ml或30μg/ml、60μl，4℃過夜。去除過量蛋白并用200μl3％BSA的PBS溶液在37℃包被1/2小時(shí)。保溫后，吸出上清并利用PBS洗滌一次。
原代人肝細(xì)胞經(jīng)制備在正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Cambrex)中生長(zhǎng)。細(xì)胞利用PBS洗滌3次。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶然后用胰蛋白酶中和溶液(Clonetics)處理。細(xì)胞隨后重懸于正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Cambrex)中。然后將細(xì)胞重懸于正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。細(xì)胞以1.5×104細(xì)胞/孔接種在200Lμl總體積中。細(xì)胞在5％血清中分裂24小時(shí)然后定量給藥。細(xì)胞在孔中于37℃保溫2小時(shí)。去除上清。利用結(jié)晶紫測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞粘附。在孔中加入50μl 10％甲醛溶液并固定10分鐘。細(xì)胞利用PBS仔細(xì)洗滌一次。加入使用前經(jīng)過過濾的50Lμl 0.5％結(jié)晶紫溶液。在孔中于室溫保溫溶液30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。用PBS洗孔3-5次。從孔中去除PBS并干燥。在OD550對(duì)96孔板進(jìn)行讀數(shù)。見圖4。也可使用Landegren的PNAG法。見Landegren，U.(1984)J.Immunol.Methods67379-388。如圖4中所見，重組mAngptl4(23-410)誘導(dǎo)原代肝細(xì)胞在體外的細(xì)胞粘附。
肝細(xì)胞的增殖檢驗(yàn)了Angptl4對(duì)原代人肝細(xì)胞的增殖效應(yīng)。制備Ad-人(h)Angptl4，Ad-LacZ和Ad-Angptl3的腺病毒構(gòu)建體。見例如，Hesser et al，Blood 104(1)149-158(2004)。原代人肝細(xì)胞利用包含腺病毒-Angptl4構(gòu)建體(Ad-Angptl4)、作為對(duì)照的腺病毒-LacZ構(gòu)建體(Ad-LacZ)或腺病毒-Angptl3構(gòu)建體(Ad-Angptl3)的結(jié)構(gòu)，以感染復(fù)數(shù)(MOI)10，100和1000進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。肝細(xì)胞在正常肝細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Cambrex)中生長(zhǎng)5天后，計(jì)數(shù)細(xì)胞。如圖5所示，Ad-Angptl4在MOI 10誘導(dǎo)肝細(xì)胞體外增殖。
實(shí)施例2ANGPTL4誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞增殖前脂肪細(xì)胞增殖評(píng)估了ANGPTL4誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞增殖的能力。通過將細(xì)胞以30,000個(gè)細(xì)胞/孔分入3ml含有血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Cambrex))中使人前脂肪細(xì)胞(內(nèi)臟或皮下)生長(zhǎng)在6孔皿(Falcon，Primaria)中。接種細(xì)胞后，直接加入來(lái)自COS細(xì)胞的500μl COS細(xì)胞調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，所述COS細(xì)胞用腺病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如，Ad-LacZ(4)，Ad-human(h)Angptl4(23-406)(5)或Ad-human(h)Angptl3(全長(zhǎng)蛋白)(6)或重組蛋白(重組鼠Angptl4(23-410)(2)；IgG-mAngptl4(184-410)(3)或未添加任何物質(zhì)(1)，其中濃度為(rmAngptl4(23-410)(5μg/ml)；IgG-mAngptl4(5μg/ml))。使細(xì)胞在37℃、5％CO2保溫箱中生長(zhǎng)5天。用500μl 1x胰蛋白酶消化細(xì)胞3-5分鐘。吸取細(xì)胞混合物(0.5ml)到9.5ml的等張緩沖液中并在細(xì)胞計(jì)數(shù)小瓶中計(jì)數(shù)(稀釋因子為20)。如圖6的圖A所示，重組鼠Angptl4(23-410)(2)和經(jīng)調(diào)節(jié)含有hAngptl14(23-406)(5)的COS細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)原代人內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞增殖。圖6的圖B顯示重組鼠Angptl4(23-410)(2)和經(jīng)調(diào)節(jié)含有hAngptl4(23-406)(5)的COS細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)原代人皮下前脂肪細(xì)胞增殖。
Angptl4與人原代脂肪細(xì)胞結(jié)合的FACS分析ANGPTL4與人原代脂肪細(xì)胞的結(jié)合通過FACS分析檢測(cè)。以500,000-1×106細(xì)胞/樣品孔將原代人皮下脂肪細(xì)胞鋪于10cm培養(yǎng)皿中。細(xì)胞在FACS分析前一天分裂。細(xì)胞利用PBS洗滌一次，然后加入10ml 20mM EDTA的PBS溶液并保溫10-20分鐘。20分鐘后，從板刮出細(xì)胞。加入10ml 5％FCS的PBS溶液并將細(xì)胞轉(zhuǎn)入50ml Falcon管。細(xì)胞在4℃、1.8K rpm旋轉(zhuǎn)5min。去除上清并將細(xì)胞重懸于1ml 5％FCS的PBS溶液。將100μl細(xì)胞懸液分入含有1μg蛋白的5ml FACS管并在冰上保溫30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。使用以下蛋白mAngptl4(23-410)，PUR 9452，0.428mg/ml(2μl/樣品)；hAngptl4(23-406)，PUR 9384，+/-90μg/ml(10μl/樣品)；mAngptl4(184-410)-Ig G，PUR 9388，8.5mg/ml(0.2μl/樣品)；hAngptl4(184-406)-IgG，PUR 9441，1.5mg/ml(1μl/樣品)；和對(duì)照FLAG-BAP(Sigma)0.1mg/ml(2μl/樣品)。保溫后，管中充滿5ml 5％FCS的PBS溶液并置于冰上。在2K rpm離心細(xì)胞5分鐘。去除上清。加入抗-FLAG-FITC抗體(Sigma)(2μl抗體(100μg/ml母液)并在冰上保溫5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。最終的抗體濃度為1μg/ml。加入5ml 5％FCS的PBS溶液并在4℃、1.8K rpm離心細(xì)胞5分鐘。去除上清并將細(xì)胞重懸于含有5％FCS的0.25ml PBS，置于冰上。也可存在0.05％疊氮化鈉以防止受體內(nèi)化。每份樣品中加入1μl 1∶50稀釋的碘化丙啶(PI)。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行FACS。如圖7所示，在這些條件下，人ANGPTL4形式，rhAngptl4(23-406)，和rhIgG-hAngptl4(184-406)與小鼠同系物相比更為有效地結(jié)合皮下脂肪細(xì)胞。
實(shí)施例3Angptl4誘導(dǎo)原代人皮下前脂肪細(xì)胞的遷移Angptl4誘導(dǎo)細(xì)胞遷移我們檢驗(yàn)了Angptl4誘導(dǎo)原代人皮下前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞遷移的能力。細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性如所述(見例如，Camenish et al.，J.Biol.Chem.，277(19)17281-17290(2002))利用具有3μm孔徑的HTS Multiwell組織培養(yǎng)物插入物(Becton Dickinson，NJ)測(cè)定。將hANGPTL4(1-406)在50/50/0.1％BSA中稀釋到5,1和0.2μg/ml。作為陽(yáng)性對(duì)照，將膜與含有10％胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基或0.1μg/ml重組人PDGF-BB(R&D Systems)一起保溫。將PBM/0.1％BSA用作陰性對(duì)照。原代人脂肪細(xì)胞利用PBS洗滌三次，經(jīng)收獲以大約2-5×105細(xì)胞/ml重懸于PBM/0.1％BSA。檢測(cè)以下細(xì)胞制備物，其中ANGPTL4表示為NL2。

將制備物加入底部小室并將制備物在37℃保溫19小時(shí)。
將細(xì)胞懸液(250μl)加入上方小室并允許細(xì)胞在37℃、5％CO2加濕的保溫箱中遷移過夜。保溫后，吸出上方和下方小室中的培養(yǎng)基，并用甲醇固定(4℃、400μl MeOH固定30分鐘，去除MeOH并風(fēng)干40分鐘)，并用YO-PRO-1碘化物(Molecular Probes，OR)(400μl YO-PRO-1碘化物，濃度10μm(1∶100自1mM母液稀釋獲得))染色。遷移結(jié)果利用Openlab軟件(Improvision，MA)在20倍放大率定量為細(xì)胞平均數(shù)/顯微鏡視野。如圖8的圖A所示，加入原代人皮下前脂肪細(xì)胞的hAngptl4誘導(dǎo)它們遷移。圖8的圖B顯示7小時(shí)的遷移。圖8的圖C圖示了脂肪細(xì)胞在用以下方式處理7小時(shí)之后的遷移無(wú)血清(1)，10％胎牛血清(FCS)(2)，PDGF-BB(3)，mANGPTL4(4)。
實(shí)施例4Angptl4的變體變體ANGPTL4利用標(biāo)準(zhǔn)誘變?cè)噭┖?例如，QuikChange XLSite-Directed Mutagenesis Kit(Invitrogen，Carlsbad，Califomia))根據(jù)生產(chǎn)商的方案制備。在人ANGPTL4序列中產(chǎn)生兩個(gè)氨基酸取代(見例如圖2)。取代位于位置162和164(R162G和R164E)，導(dǎo)致PKR變?yōu)镚KE。ANGPTL4蛋白(L280質(zhì)粒，aa 1-406)或變體ANGPTL4分離自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的上清。為了純化，將上清加載到鎳柱上。蛋白質(zhì)通過Western印跡利用抗-FLAG-HRP抗體進(jìn)行檢測(cè)。見圖3，圖B。進(jìn)行取代并將變體ANGPTL4與天然或野生型ANGPTL4蛋白進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)通過Western印跡測(cè)定的該變體ANGPTL4的分子量高于天然ANGPTL4。天然蛋白中位置162和164由RKR到GKE的取代防止的ANGPTL4的蛋白水解降解。
實(shí)施例5Angptl4結(jié)合整合素αVβ5血管生成素是分泌型因子，其通過經(jīng)由它們的纖維蛋白原(FBN)-樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞特異性酪氨酸激酶受體Tie2調(diào)節(jié)血管生成。發(fā)現(xiàn)分泌的配體的家族中存在的螺旋區(qū)對(duì)于配體寡聚化是必需的(見例如，Procopio etal.，J.Biol.Chem.，27430196-201(1999)).
類似血管生成素，ANGPTL3和ANGPTL4是分泌型糖蛋白，每種都由N末端信號(hào)肽然后是螺旋區(qū)和C末端FBN樣結(jié)構(gòu)域組成。確定了ANGPTL3通過FBN樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合αVβ3。我們確定了ANGPTL4結(jié)合αVβ5。檢測(cè)αVβ5整合素穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293-1953細(xì)胞系結(jié)合或粘附ANGPTL4包被的板的能力。收獲細(xì)胞并在不含血清、包含以下物質(zhì)的培養(yǎng)基中稀釋到105細(xì)胞/mlPBS，1％BSA，1mM CaCl2和1mM MgCl2。細(xì)胞與抗-整合素αVβ5抗體(MAB1961(Chemicon，Temecula，CA))或肽或不與上述物質(zhì)一起37℃預(yù)保溫15分鐘。將重組mANGPTL4，BSA或玻連蛋白(1μg，3μg，10μg，或30μg/ml)包被在Nunc Maxisorp 96-孔平底微量滴定板上，4℃過夜，并用含200μl 3％BSA的磷酸緩沖液(PBS)，pH 7.4，37℃封閉1.5小時(shí)。將細(xì)胞懸液(5×104細(xì)胞/100μl/孔(5×105/ml))加入包被的板并將板在37℃保溫5.5小時(shí)。未粘附的細(xì)胞用PBS洗滌去除，通過加入200μl CyQuant GD Dye(Molecular Probes(Invitrogen detection Technologies(Carlsbad，California))(1∶400)/細(xì)胞裂解緩沖液并保溫2-5分鐘來(lái)測(cè)定細(xì)胞粘附。樣品熒光度利用480nm最大激發(fā)和520nm最大發(fā)射來(lái)測(cè)定。可使用Lanndegren的PNAG法(見例如，Landegren，J.Immunol.Methods，67379-388(1984))。與陰性對(duì)照BSA相比，表達(dá)αVβ5的細(xì)胞顯示與ANGPTL4和陽(yáng)性對(duì)照玻連蛋白粘附(USBiological，Swampscott，Massachusetts)。見圖9，圖A。
為測(cè)定αVβ5整合素是否足以介導(dǎo)ANGPTL4細(xì)胞粘附，在細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)封閉型抗體抑制粘附的能力。將功能性封閉型抗體(抗-αVβ5抗體(MAB1961(Chemicon，Temecula，CA))或抗-hANGPTL4抗體)加入293-1953細(xì)胞然后與蛋白(BSA(1)，vitronectrin(2)或ANGPTL4(3))包被的孔保溫。圖9，圖B?？?αVβ5和抗-ANGPTL4抗體消除了ANGPTL4細(xì)胞粘附活性。
進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)確定ANGPTL4結(jié)合αVβ5。進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端(1-183)和/或IgG-hANGPTL4-C末端(184-406)是否結(jié)合αVβ5(USBiological，37K，Swampscott，Massachusetts)包被的板。100μl/孔整合素αVβ5稀釋液(1μg/ml包被型緩沖液(50mM碳酸鹽/重碳酸鹽，pH 9.6))和包被緩沖液一起在4℃保溫過夜。用洗滌緩沖液(PBS，pH 7.4，0.05％Tween-20)洗板三次，并加入100μl/孔封閉緩沖液(PBS，pH 7.4，0.5％BSA)，在室溫輕輕攪拌1小時(shí)。各種量(0，0.070μg，0.22μg，0.66μg，2μg，或6μg)的樣品，mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端(1-183)和/或IgG-hANGPTL4-C末端(184-406)在樣品緩沖液(0.5％BSA，50mM Tris，pH7.4，0.05％Tween 20，1mM MnCl2，50μMCaCl2，50μMMgCl2，100mM NaCl)中進(jìn)行準(zhǔn)備并保溫30分鐘。將樣品加入板(100μl/孔，按照上文所示的量)并在室溫保溫2小時(shí)同時(shí)輕輕攪拌。用緩沖液洗滌板，以100μl/孔加入含有抗-Flag-辣根過氧化物酶(HRP)(100ng/ml)(Jackson，#109-036-098)的測(cè)定緩沖液(PBS，pH7.4，0.5％BSA，0.05％Tween 20)，并在室溫保溫1小時(shí)同時(shí)輕輕攪拌。洗滌板。加入100μl/孔四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(Moss，Inc.)，室溫在板中保溫直到出現(xiàn)好的顏色。加入100μl/孔終止溶液(1M H3PO4)終止反應(yīng)。在630nm讀板。mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端和IgG-hANGPTL4-C-末端結(jié)合αVβ5包被的板，但與板結(jié)合的IgG-hANGPTL4-C末端稍多。見圖9，圖C。
抗-ANGPTL4抗體抑制ANGPTL4與αVβ5包被的板結(jié)合。進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。4℃保溫100μl/孔的整合素αVβ5稀釋液(1μg/ml包被型緩沖液(50mM碳酸鹽/重碳酸鹽，pH 9.6))和包被緩沖液過夜。用洗滌緩沖液(PBS，pH 7.4，0.05％Tween-20)洗板三次，并加入100μl/孔的封閉緩沖液(PBS，pH 7.4，0.5％BSA)在室溫輕輕攪動(dòng)1小時(shí)。將0.6μg-6.0μg樣品，mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端(1-183)和/或IgG-hANGPTL4-C末端(183-406)，在樣品緩沖液中(0.5％BSA，50mM Tris，pH 7.4，0.05％Tween 20，1mM MnCl2，50μMCaCl2，50μMMgCl2，100mM NaCl)與抗-ANGPTL4抗體(1.5μg)或抗-Dscr(1.5μg)一同保溫30分鐘。保溫后，將100μl/孔樣品+/-抗體與板在室溫一起保溫2小時(shí)，同時(shí)輕輕攪動(dòng)。板用緩沖液洗滌并加入實(shí)驗(yàn)緩沖液(PBS，pH7.4，0.5％BSA，0.05％Tween 20)中的100μl/孔抗-Flag-HRP(100ng/ml)，在室溫保溫1小時(shí)，同時(shí)輕輕攪動(dòng)。洗滌板并加入100μl/孔的TMB，室溫在板中保溫直到出現(xiàn)良好的顏色。加入100μl/孔終止溶液(1M H3PO4)來(lái)終止反應(yīng)。在630nm讀板。與抗-Dscr抗體，5G7單克隆抗體或培養(yǎng)基相比，抗-ANGPTL4抗體降低結(jié)合于αVβ5包被的板的mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端和IgG-hANGPTL4-C末端的量。見，圖9，圖D。
另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，ANGPTL4與整合素αVβ5的結(jié)合通過ELISA顯示。在該實(shí)驗(yàn)中，將80μl/孔的hANGPTL4-C末端，玻連蛋白或BSA(5μg/ml)加入板的包被緩沖液中(50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽，pH 9.6)，4℃保溫過夜。洗滌該板(洗滌緩沖液PBS，pH 7.4，0.05％Tween-20)，加入100μl/孔的封閉緩沖液(PBS，pH 7.4，0.5％BSA)以及培養(yǎng)基或抗-hANGPTL4抗體(15μg/100μl)或抗-Dscr抗體(15μg/100μl)，室溫保溫1小時(shí)，同時(shí)輕輕攪動(dòng)。洗滌板，加入αVβ5100μl(3-9μg/ml)，室溫保溫2小時(shí)同時(shí)輕輕攪動(dòng)。洗滌板，加入實(shí)驗(yàn)緩沖液(PBS，pH7.4，0.5％BSA，0.05％Tween 20)中的1μg/ml(1∶1000)抗-αVβ5抗體(Chemicon)(5μg/100μl)，室溫保溫1小時(shí)，同時(shí)輕輕攪動(dòng)。保溫后，洗滌板，將100μl/孔辣根過氧化物酶(HRP)抗-小鼠(1∶5000)加入實(shí)驗(yàn)緩沖液。洗滌板，加入100μl/孔四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，室溫保溫直到出現(xiàn)良好的顏色。利用100μl/孔1M H3PO4終止反應(yīng)，在630nm讀板。αVβ5結(jié)合ANGPTL4(泳道1)和玻連蛋白(泳道4)包被的板。結(jié)合被抗-ANGPTL4抗體(泳道2)阻斷，但除外使用對(duì)照抗體抗-Dscr(泳道3)或?qū)φ盏鞍装辉诎迳?泳道5)的情況。見，圖9，圖E。
因此，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)重組ANGPTL4特異性結(jié)合αVβ5整合素。
實(shí)施例6靜脈注射Angptl4增加小鼠中的甘油三酯測(cè)定注射了各種包含ANGPTL4的腺病毒構(gòu)建體的C57B1-6小鼠中的甘油三酯水平。在C57B1-6小鼠尾部靜脈注入(1)腺病毒GFP構(gòu)建體，(2)腺病毒Gd構(gòu)建體，(3)腺病毒ANGPTL4(1-406)構(gòu)建體，(4)腺病毒ANGPTL4(1-183)構(gòu)建體，(5)腺病毒ANGPTL4(184-406)構(gòu)建體，(6)腺病毒ANGPTL4變體構(gòu)建體；(7)腺病毒ANGPTL4(1-408)構(gòu)建體和(8)腺病毒對(duì)照構(gòu)建體。注射后7天測(cè)定小鼠血液樣品的甘油三酯水平(mg/dl)。如圖10中所示，ANGPTL4N-末端構(gòu)建體(1-183)對(duì)甘油三酯水平的影響最為明顯，全長(zhǎng)ANGPTL4構(gòu)建體和ANGPTL4變體構(gòu)建體也如此。
實(shí)施例7包含ANGPTL4基因破壞的小鼠的產(chǎn)生和分析為了研究ANGPTL4的作用，通過同源重組產(chǎn)生ANGPTL4基因中的破壞。具體地，包含ANGPTL4基因中的破壞的轉(zhuǎn)基因小鼠(即敲除小鼠)通過基因打靶和基因捕獲來(lái)產(chǎn)生。通過southern印跡分析證實(shí)突變，以證實(shí)對(duì)5’和3’的正確靶向。基因特異性基因分型也通過基因組PCR來(lái)進(jìn)行，以證實(shí)如使用與側(cè)接插入位點(diǎn)的外顯子退火的引物進(jìn)行的RT-PCR所示的內(nèi)源天然轉(zhuǎn)錄物的丟失。將靶向型載體電穿孔入129菌株ES細(xì)胞，鑒定靶向的克隆。將靶向的克隆顯微注射到宿主胚泡中產(chǎn)生嵌合體。嵌合體與C57動(dòng)物雜交產(chǎn)生F1雜合體。使雜合體進(jìn)行雜交產(chǎn)生F2野生型，雜合體和純合體隊(duì)列，其用于基因分型分析。罕見的是，如果沒有產(chǎn)生足夠的F1雜合體，使F1子代與野生型C57小鼠雜交以產(chǎn)生足夠的雜合體從而產(chǎn)生足夠的用于基因分型的隊(duì)列。所有基因分型分析在出生后12-16周進(jìn)行。
結(jié)果包含ANGPTL4基因的小鼠的產(chǎn)生和分析在這些敲除試驗(yàn)中，編碼ANGPTL4的基因(PRO197多肽，稱為DNA 22780-1078；UNQ171)被破壞。這些研究的基因特異性信息如下突變的小鼠基因?qū)?yīng)核苷酸參照物NM 020581.ACCESSIONNM_020581 NID10181163；或小鼠(Musmusculus)血管生成素-樣4(Angptl4)；蛋白參照物Q9Z1P8.ACCESSIONQ9SZ1P9 NID；或小鼠(Mus musculus(小鼠(Mouse)).NG27(肝血管生成素-相關(guān)蛋白)HEPATIC ANGIOPOEITIN-RELATED PROTEIN)(假想蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)425O18-1)(纖維蛋白原/血管生成素相關(guān)蛋白)(血管生成素-樣蛋白)(血管生成素-樣4).MOUSESTRNRDB；人基因序列參照NM 139314.ACCESSIONNM 139314 NID21536397人血管生成素-樣4(ANGPTL4)；人蛋白序列對(duì)應(yīng)參照物Q9BY76.ACCESSIONQ9BY78NID或Homo sapiens(人)。血管生成素-相關(guān)蛋白3受體(血管生成素-樣4)(肝纖維蛋白原/血管生成素-相關(guān)蛋白)(HFARP)(血管生成素-樣蛋白PP1158).HUMANSTRNRDB。
破壞的小鼠基因是Angptl4(血管生成素-like 4)，其為人ANGPTL4的直向同系物。其他名稱包括本文描述的那些以及BK89，Bk89，F(xiàn)IAF，NG27，Ng27，HFARP，F(xiàn)arp-pending，纖維蛋白原/血管生成素-相關(guān)蛋白，主要組織相容復(fù)合體區(qū)NG27，ARP4，PGAR，PPARG，PP1158，ANGPTL2，禁食誘導(dǎo)的脂肪因子，PPARG血管生成素相關(guān)蛋白，肝血管生成素-相關(guān)蛋白，和肝纖維蛋白原/血管生成素-相關(guān)蛋白。
靶向的或基因捕獲突變?cè)诰?29SvEVBrd-來(lái)源的胚胎細(xì)胞(ES)中產(chǎn)生。使嵌合小鼠與C57BL/6J albino小鼠雜交產(chǎn)生F1雜合動(dòng)物。這些子代經(jīng)交配產(chǎn)生F2野生型、雜合和純合突變子代。在罕見的情況中，例如從嵌合體獲得的F1小鼠非常少，使F1雜合小鼠交配產(chǎn)生F2小鼠。表型分析對(duì)下文所示的來(lái)自該代的小鼠進(jìn)行。
wt het hom 總數(shù)觀察的18 38 11 67預(yù)期的16.75 33.5 16.7567
Chi-Sq.＝2.76顯著性＝0.26294(hom/n)＝0.16平均同窩幼鼠數(shù)目＝7出現(xiàn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒插入(OST)破壞編碼型外顯子2和3(NCBI登記號(hào)NM_020581.1)之間的基因。
在胚胎干細(xì)胞(ES)和所有成人組織樣品(除外尾部)中通過RT-PCT檢測(cè)到靶基因的野生型表達(dá)。RT-PCR分析揭示轉(zhuǎn)錄物在分析的(-/-)小鼠中缺失。
1.表型分析總體表型總結(jié)編碼人血管生成素-樣4(ANGPTL4)的直向同系物的基因的突變導(dǎo)致(-/-)小鼠中膽固醇和甘油三酯水平降低。此外，雄性(-/-)小鼠在葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)中顯示葡萄糖耐量提高。突變(-/-)小鼠也顯示免疫異常，包括平均血清IgM水平和平均絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)相對(duì)于其(+/+)同窩幼鼠而言升高。通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物缺失。
心血管表型分析/代謝-血液化學(xué)在心血管生物學(xué)領(lǐng)域，進(jìn)行表型檢測(cè)來(lái)鑒定心血管、內(nèi)皮或血管生成疾病的治療的可能靶，所述疾病諸如高血壓，動(dòng)脈粥樣硬化，心衰，發(fā)作綜合征，各種冠狀動(dòng)脈疾病，血脂異常諸如高膽固醇(高膽固醇血癥)和升高的血清甘油三酯(高甘油三酯血癥)，癌癥和/或肥胖癥。表型檢測(cè)包括測(cè)定血清膽固醇和甘油三酯。此外，血化學(xué)表型分析也包括葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)以測(cè)定胰島素敏感性和血糖代謝的改變。異常葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果指示但不限于以下疾病或病癥1型和2型糖尿病，X綜合征。
這種情況中的表型檢測(cè)包括測(cè)定血清膽固醇和甘油三酯。
血脂方法4只野生型和8只純合雄性小鼠的隊(duì)列用于這些研究。測(cè)定平均血清膽固醇和甘油三酯水平并與性別匹配的(+/+)同窩動(dòng)物進(jìn)行比較。同時(shí)進(jìn)行葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)，這是由于該實(shí)驗(yàn)是確定哺乳動(dòng)物中受損的葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡的標(biāo)準(zhǔn)。葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)利用Lifescan血糖計(jì)(glucomter)進(jìn)行。對(duì)動(dòng)物IP注入2g/kg D-葡萄糖，其作為20％的溶液遞送，注射后1，30，60和90分鐘之后測(cè)定血糖水平。使用COBAS Integra 400(Roche)對(duì)小鼠進(jìn)行血化學(xué)檢驗(yàn)。
結(jié)果當(dāng)與性別匹配的野生型同窩動(dòng)物以及歷史平均值相比時(shí)，雄性和雌性純合突變小鼠顯示明顯降低的甘油三酯水平。這些突變體在與它們的野生型同窩動(dòng)物相比時(shí)也顯示降低的平均血清膽固醇水平。同時(shí)，當(dāng)與它們的性別匹配(+/+)的同窩動(dòng)物和歷史平均值相比時(shí)，在存在正常禁食葡萄糖時(shí)在所有3個(gè)受試時(shí)間段，雄性(-/-)小鼠顯示葡萄糖耐量增加，但雌性(-/-)小鼠顯示平均血清葡萄糖水平降低?？傊@些敲除小鼠就脂質(zhì)和/葡萄糖代謝方面而言顯示陽(yáng)性表型。因此，ANGPTL4基因缺陷的突變小鼠可作為心血管疾病治療的模型。ANGPTL4拮抗劑或其編碼基因?qū)⒃谡{(diào)節(jié)血脂具體是保持正常膽固醇和甘油三酯代謝中起重要作用。ANGPTL4的所述抑制劑或拮抗劑可用于治療與血脂異常相關(guān)的所述疾病，諸如；高血壓，動(dòng)脈粥樣硬化，心衰，發(fā)作綜合征，各種冠狀動(dòng)脈心臟病，肥胖癥和/或糖尿病。
免疫表型分析免疫相關(guān)的和炎性疾病是較為復(fù)雜、通常多重相互聯(lián)系的生物途徑的表現(xiàn)或結(jié)果，其在正常生理中對(duì)干擾或損傷的應(yīng)但是重要的，啟動(dòng)對(duì)干擾或損傷的修復(fù)，并發(fā)動(dòng)內(nèi)在和獲得的對(duì)抗生物體的防御。疾病和病理在這些正常生理過程導(dǎo)致附加干擾和損傷時(shí)出現(xiàn)，無(wú)論與反應(yīng)強(qiáng)度直接相關(guān)，作為異常調(diào)節(jié)或過度刺激的后果，作為自體反應(yīng)，或這些的組合。
盡管這些疾病的發(fā)生通常涉及多個(gè)步驟，并通常涉及多種不同生物系統(tǒng)/途徑，對(duì)一或多種這些途徑中的關(guān)鍵點(diǎn)的干預(yù)可具有緩解或治療效果。治療性干預(yù)可通過拮抗有害過程/途徑或刺激有益過程/途徑而出現(xiàn)。
T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)是哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的重要組分。T細(xì)胞識(shí)別與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)中的基因編碼的自體分子相關(guān)的抗原。所述抗原可與MHC分子一同展示在抗原呈遞分子、病毒感染的細(xì)胞、癌細(xì)胞、移植物等的表面。T細(xì)胞系統(tǒng)消除這些改變的細(xì)胞，其對(duì)宿主動(dòng)物的健康造成威脅。T細(xì)胞包括輔助T細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞。輔助T細(xì)胞在識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞上的抗原-MHC復(fù)合體之后大量增殖。輔助T細(xì)胞也分泌各種細(xì)胞因子，例如淋巴因子，其在B細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和參與免疫反應(yīng)的各種其它細(xì)胞的活化中起核心作用。
在許多炎性反應(yīng)中，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)損傷或感染位點(diǎn)。遷移型細(xì)胞可為中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞，可通過對(duì)受影響的組織進(jìn)行組織學(xué)檢查測(cè)定。見例如，Current Protocols in Immunology，ed.JohnE.Coligan，1994，John Wiley & Sons，Inc。
許多免疫相關(guān)的疾病是已知的，并被廣泛研究。所述疾病包括免疫介導(dǎo)的炎性疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，免疫介導(dǎo)的腎疾病，肝膽疾病，炎性腸病(IBD)，銀屑病和哮喘)，非免疫介導(dǎo)的炎性疾病，感染性疾病，免疫缺陷疾病，腫瘤和移植物排斥等。在免疫學(xué)領(lǐng)域，鑒定靶來(lái)治療炎癥和炎性疾病。
在免疫學(xué)領(lǐng)域，鑒定靶來(lái)治療炎癥和炎性疾病。免疫相關(guān)的疾病，在一種情況中，可通過抑制免疫反應(yīng)來(lái)治療。利用具有免疫刺激活性的中和型抗體將在免疫介導(dǎo)的和炎性疾病的治療中有益。抑制免疫反應(yīng)的分子可使用(蛋白質(zhì)直接和經(jīng)由使用抗體激動(dòng)劑)，以抑制免疫反應(yīng)由此緩解免疫相關(guān)疾病。
進(jìn)行以下檢驗(yàn)血清免疫球蛋白同種型實(shí)驗(yàn)血清免疫球蛋白同種型實(shí)驗(yàn)利用Cytometric Bead Array(CBA)試劑盒進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)用于快速鑒定單個(gè)樣品中小鼠單克隆抗體的同種型的重鏈和輕鏈。值表達(dá)為“相對(duì)熒光蛋白”并基于kappa輕鏈的檢測(cè)。任何＜6的值是不顯著的。
結(jié)果血清免疫球蛋白同種型測(cè)定揭示了突變(-/-)小鼠與它們性別匹配(+/+)的同窩動(dòng)物相比顯示IgM血清免疫球蛋白升高。IgM免疫球蛋白首先在體液免疫反應(yīng)中產(chǎn)生，用于中和細(xì)菌毒素，并且在補(bǔ)體系統(tǒng)的活化中尤其重要。同樣，IgG免疫球蛋白具有中和效應(yīng)，對(duì)于補(bǔ)體系統(tǒng)活化的重要性程度較小。此外，(-/-)小鼠顯示平均絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與其同窩動(dòng)物(+/+)和歷史平均值相比增加。觀察到的表型提示ANGPTL4是炎性反應(yīng)的負(fù)向調(diào)節(jié)物。這些免疫異常提示ANGPTL4抑制物(拮抗劑)是刺激免疫系統(tǒng)的重要藥劑(諸如T細(xì)胞增殖)，并可用于該效應(yīng)對(duì)于個(gè)體有益的疾病，諸如白血病，和其它類型的癌癥，以及免疫受損的患者，諸如AIDS患者。因此，ANGPTL4或其激動(dòng)劑在抑制免疫反應(yīng)中起作用，并可用作抑制有害免疫反應(yīng)的候選物，例如在移植物排斥或移植物抗宿主疾病中。
實(shí)施例8制備結(jié)合Angptl4的抗體制備多克隆抗體和單克隆抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并在本發(fā)明描述?？墒褂玫目乖?或免疫原)包括本發(fā)明純化的蛋白，蛋白片段，含有所述蛋白的融合蛋白，以及在細(xì)胞表面表達(dá)重組蛋白和/或蛋白片段的細(xì)胞。抗原的選擇可由本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)需不恰當(dāng)?shù)脑囼?yàn)進(jìn)行。
小鼠，諸如Balb/c，利用在完全Freund佐劑中乳化的抗原來(lái)免疫，并以1-100mg的量經(jīng)靜脈或腹腔注入?？蛇x，抗原在MPL-TDM佐劑(RibiImmunochemical Research，Hamilton，Mont.)中乳化并注入動(dòng)物后腿的足墊中。隨后，在10-12天后利用附加的在所選佐劑中乳化的抗原對(duì)免疫的小鼠進(jìn)行增強(qiáng)。幾周之后，也可用額外的免疫注射對(duì)小鼠進(jìn)行增強(qiáng)。通過眶后取血定期從小鼠獲得血清樣品，用于ELISA測(cè)定檢測(cè)抗體。
檢測(cè)到適宜抗體滴度之后，可向抗體“陽(yáng)性”動(dòng)物最后經(jīng)靜脈注入給定的配體。3-4天后，處死小鼠并收獲脾細(xì)胞。然后將脾細(xì)胞融合(利用35％聚乙二醇)到選定的鼠骨髓瘤細(xì)胞系諸如P3X63AgU.1，其可獲自ATCC，No.CRL 1597。融合產(chǎn)生可隨后鋪于96孔組織培養(yǎng)板的雜交瘤細(xì)胞，其中含有HAT(次黃嘌呤，氨基蝶呤，和胸苷)培養(yǎng)基以抑制非融合細(xì)胞、骨髓瘤雜合子和脾細(xì)胞雜合子的增殖。
在ELISA中篩選雜交瘤細(xì)胞針對(duì)抗原的反應(yīng)性。確定本發(fā)明分泌所需單克隆抗ANGPTL4抗體的“陽(yáng)性”雜交瘤細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞可經(jīng)腹腔注入同基因Balb/c小鼠產(chǎn)生含有抗ANGPTL4單克隆抗體的腹水?？蛇x，雜交瘤細(xì)胞可生長(zhǎng)在組織培養(yǎng)燒瓶或搖瓶中。腹水中產(chǎn)生的單克隆抗體的純化可利用硫酸銨沉淀然后利用凝膠排阻層析來(lái)實(shí)現(xiàn)?？蛇x，可采用基于抗體與蛋白A或蛋白G的結(jié)合的親和層析。
例如，多克隆兔抗體可通過利用在第1、40和70天在大腸桿菌中產(chǎn)生的500μg重組人ANGPTL4蛋白(23-406)免疫兔子產(chǎn)生。免疫后80和120天收獲血清，并通過蛋白交聯(lián)葡聚糖柱純化抗體。
實(shí)施例9封閉或中和型抗體本文所述針對(duì)抗原例如，ANGPTL4的抗體可通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)例如ELISA鑒定。例如，板可利用目的多肽例如ANGPTL4或其片段包被，并與針對(duì)該多肽例如，ANGPTL4產(chǎn)生的抗體一起保溫(見例如，美國(guó)專利6,348,350，6,372,491和6,455,496中的描述)。結(jié)合的抗體可通過各種方法檢測(cè)。
拮抗劑(例如封閉或中和型)抗體可通過競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)和/或活性測(cè)定來(lái)鑒定。例如，ANGPTL4的表達(dá)刺激肝細(xì)胞或前脂肪細(xì)胞的增殖，脂肪細(xì)胞遷移，調(diào)節(jié)甘油三酯量，或結(jié)合αVβ5整合素。封閉或中和型ANGPTL4抗體的確定可通過抗體阻斷這些活性的能力顯示，例如，(見例如，圖9，圖B，D和E)。例如，肝細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞可鋪板并利用由Ad-hAngptl4轉(zhuǎn)導(dǎo)的COS7細(xì)胞的上清以及抗-ANGPTL4抗體，或?qū)φ湛贵w或PBS保溫。幾天之后，用胰蛋白酶處理細(xì)胞并計(jì)數(shù)。降低細(xì)胞數(shù)的抗體鑒定為封閉型或中和型抗體。ANGPTL4也顯示誘導(dǎo)肝細(xì)胞粘附和前脂肪細(xì)胞遷移，由此ANGPTL4的封閉型或中和型抗體的確定可通過抗體封閉肝細(xì)胞粘附和/或前脂肪細(xì)胞遷移的能力顯示。也顯示ANGPTL4為促血管生成因子。見例如，Le Jan et al.，American Journal of Pathology，164(5)1521-1528(2003)。因此，封閉型或中和型抗ANGPTL4抗體可利用抗體和ANGPTL4在血管生成實(shí)驗(yàn)例如CAM實(shí)驗(yàn)中測(cè)定。
本說明書認(rèn)為足以使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。本發(fā)明不限于保藏的構(gòu)建體限定的范圍，因?yàn)楸２匚锏膶?shí)施方案是用作對(duì)本發(fā)明某些方面的單一例證且功能上等同的任何構(gòu)建體都在本發(fā)明范圍內(nèi)。本文的材料保藏不構(gòu)成承認(rèn)文字形式的描述不足以使得本發(fā)明的任一方面，包括其最佳的更多方面能夠?qū)嵤?，也不?yīng)解釋為將權(quán)利要求書的范圍局限于所提供的具體例證。事實(shí)上，除了本文所示和所述之外，對(duì)本發(fā)明的各種修飾根據(jù)前面的描述對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的且落在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.刺激肝細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括將有效量的血管生成素樣4蛋白(ANGPTL4)給藥肝細(xì)胞或前肝細(xì)胞的群體，由此刺激增殖。
2.權(quán)利要求1的方法，其中肝細(xì)胞在受試者中。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述受試者是人。
4.權(quán)利要求1的方法，其中ANGPTL4包括人ANGPTL4的氨基酸殘基23-406。
5.權(quán)利要求1的方法，其中ANGPTL4包括人ANGPTL4的氨基酸殘基184-406。
6.權(quán)利要求1的方法，其中給藥步驟包括給藥編碼ANGPTL4的核酸序列。
7.刺激肝細(xì)胞增殖的方法，包括給藥有效量的刺激ANGPTL4在肝細(xì)胞或前肝細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生的藥劑，由此刺激增殖。
8.抑制肝細(xì)胞增殖的方法，包括將有效量的ANGPTL4拮抗劑給藥肝細(xì)胞或前肝細(xì)胞的群體。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述拮抗劑是抑制肝細(xì)胞內(nèi)的ANGPTL4蛋白產(chǎn)生的藥劑。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述藥劑是反義或核酶分子。
11.權(quán)利要求8的方法，其中ANGPTL4拮抗劑是抗-ANGPTL4抗體。
12.權(quán)利要求8的方法，其中ANGPTL4拮抗劑是抗-αVβ5抗體。
13.誘導(dǎo)肝細(xì)胞細(xì)胞粘附的方法，所述方法包括將有效量的包含ANGPTL4的組合物給藥肝細(xì)胞的群體，由此誘導(dǎo)肝細(xì)胞的細(xì)胞粘附。
14.權(quán)利要求13的方法，其中ANGPTL4包括人ANGPTL4的氨基酸殘基23-406。
15.權(quán)利要求13的方法，其中ANGPTL4包括人ANGPTL4的氨基酸殘基185-406。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述組合物包含ANGPTL4和載體。
17.抑制肝細(xì)胞細(xì)胞的粘附的方法，包括將有效量的包含ANGPTL4拮抗劑的組合物給藥肝細(xì)胞的群體，由此抑制肝細(xì)胞的細(xì)胞粘附。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述拮抗劑是抗-ANGPTL4抗體。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述拮抗劑是抗-αVβ5抗體。
20.刺激前脂肪細(xì)胞增殖的方法，包括將有效量的包含ANGPTL4或其激動(dòng)劑的組合物給藥前脂肪細(xì)胞的群體，由此誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞的增殖。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述前脂肪細(xì)胞在受試者中。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述受試者是人。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述組合物包含ANGPTL4和載體。
24.權(quán)利要求20的方法，其中ANGPTL4包括人ANGPTL4的氨基酸殘基23-406。
25.權(quán)利要求24的方法，ANGPTL4包括人ANGPTL4的氨基酸殘基約23-約162。
26.抑制前脂肪細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括將有效量的包含ANGPTL4拮抗劑的組合物給藥前脂肪細(xì)胞的群體。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述ANGPTL4拮抗劑是抗-ANGPTL4抗體。
28.抑制ANGPTL4生物活性的方法，包括給藥結(jié)合ANGPTL4C末端的ANGPTL4拮抗劑。
29.權(quán)利要求28的方法，其中ANGPTL4拮抗劑是抗-ANGPTL4抗體。
30.權(quán)利要求28的方法，其中ANGPTL4拮抗劑是抗-αVβ5抗體。
31.權(quán)利要求28的方法，其中ANGPTL4拮抗劑阻斷Angptl4與αvβ5結(jié)合。
32.權(quán)利要求28的方法，其中所述生物活性包括誘導(dǎo)細(xì)胞增殖或細(xì)胞分化。
33.結(jié)合ANGPTL4的C末端的抗體。
34.權(quán)利要求32的抗體，其中所述抗體是中和型抗體。
35.包含ANGPTL4變體的組合物，其中變體ANGPTL4沒有經(jīng)過蛋白水解加工。
36.權(quán)利要求35的組合物，其中ANGPTL4的變體包括氨基酸162和/或164的改變。
37.權(quán)利要求36的組合物，其中所述改變是取代。
38.權(quán)利要求37的組合物，其中所述取代位于位置162和位置164。
全文摘要
本文涉及ANGPTL4組合物以及使用所述組合物的方法，ANGPTL4激動(dòng)劑和拮抗劑，其用于疾病或病癥的治療，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，細(xì)胞粘附以及細(xì)胞遷移的方法。
文檔編號(hào)C12N15/00GK101080419SQ200580031686
公開日2007年11月28日 申請(qǐng)日期2005年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月20日
發(fā)明者斯圖爾特·邦廷, 漢斯-彼得·格伯, 梁小浣 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司