專利名稱：P的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的核酸序列的用途、新啟動(dòng)子和表達(dá)單元本身、用于改變或引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄率(transcription rate)和/或表達(dá)率(expression rate)的方法、包含表達(dá)單元的表達(dá)盒、具有改變或引發(fā)的轉(zhuǎn)錄率和/或表達(dá)率的基因修飾微生物和用于通過培養(yǎng)基因修飾微生物制備生物合成產(chǎn)物的方法。
多種生物合成產(chǎn)物例如精細(xì)化學(xué)品，尤其如氨基酸、維生素和蛋白質(zhì)，通過細(xì)胞天然代謝過程產(chǎn)生，并且用于工業(yè)的眾多領(lǐng)域，包括食品、飼料、化妝品、飼料工業(yè)、食品工業(yè)和制藥工業(yè)。統(tǒng)稱為精細(xì)化學(xué)品/蛋白質(zhì)的這些物質(zhì)尤其包含有機(jī)酸、蛋白原性(proteinogenic)氨基酸和非蛋白原性(non-proteinogenic)氨基酸、核苷酸和核苷、脂類和脂肪酸、二醇、糖類、芳香化合物、維生素和輔因子以及蛋白質(zhì)和酶。它們工業(yè)規(guī)模的產(chǎn)生通過培養(yǎng)已經(jīng)開發(fā)用來產(chǎn)生并分泌大量所需要特定物質(zhì)的細(xì)菌最可取地進(jìn)行。特別適合于此目的生物是革蘭氏陽(yáng)性非病原細(xì)菌的棒狀細(xì)菌(coryneformbacteria)。
已知氨基酸通過棒狀細(xì)菌菌株、特別谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)菌株的發(fā)酵制備。由于極為重要，持續(xù)對(duì)改進(jìn)這種生產(chǎn)方法的改進(jìn)工作。方法改進(jìn)可涉及發(fā)酵技術(shù)手段，例如攪拌和供氧，或者涉及營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組成，例如發(fā)酵期間的糖濃度，或者形成產(chǎn)物的工作步驟，例如離子交換層析或噴霧干燥，或者微生物本身固有的性能特性。
此外，重組DNA技術(shù)方法通過擴(kuò)增單個(gè)基因并研究對(duì)精細(xì)化學(xué)品/蛋白質(zhì)產(chǎn)生的影響多年來已經(jīng)類似地應(yīng)用于產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品/蛋白質(zhì)的棒桿菌屬菌株的菌株改進(jìn)。
用于開發(fā)用來產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品、氨基酸或蛋白質(zhì)的方法或者用于提高或改進(jìn)用來產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品、氨基酸或蛋白質(zhì)的已有方法生產(chǎn)率的其它途徑是提高或改變一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)和/或通過合適的多核苷酸序列影響mRNA的翻譯。在本上下文中，影響可以包含基因表達(dá)的提高、降低或其他參數(shù)，如時(shí)序表達(dá)模式。
細(xì)菌調(diào)節(jié)序列中的多種成分對(duì)技術(shù)人員為已知。區(qū)分了又稱作操縱基因的用于調(diào)節(jié)物的結(jié)合位點(diǎn)、又稱作-35區(qū)和-10區(qū)的用于RNA聚合酶全酶的結(jié)合位點(diǎn)和也稱作核糖體結(jié)合位點(diǎn)或SD序列的用于核糖體16S RNA的結(jié)合位點(diǎn)。
為本發(fā)明目的，又稱作SD序列的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列意指位于翻譯起始密碼子上游直至20個(gè)堿基的多核苷酸序列。
文獻(xiàn)中(E.coli and S.typhimurium，Neidhardt F.C.1995 ASM Press)報(bào)道不但SD序列的多核苷酸序列的組成即堿基的序列串，而且SD序列中所包含的多核苷酸序列與翻譯起始密碼子的距離均顯著影響翻譯起始速率。
具有啟動(dòng)子活性的核酸序列可以多種方式影響mRNA的形成。將其活性不依賴生物生理生長(zhǎng)期的啟動(dòng)子稱為組成型啟動(dòng)子。另一些啟動(dòng)子則響應(yīng)于外部化學(xué)刺激或物理刺激，例如氧、代謝物、熱、pH等。其它啟動(dòng)子則表現(xiàn)它們強(qiáng)烈依賴于不同生長(zhǎng)期的活性。例如，文獻(xiàn)中描述了微生物的指數(shù)生長(zhǎng)期期間顯示特別顯著活性的啟動(dòng)子或微生物靜止期期間顯示恰當(dāng)活性的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的兩個(gè)特征均可有益地影響精細(xì)化學(xué)品和蛋白質(zhì)產(chǎn)生的生產(chǎn)率，這取決于代謝途徑。
例如，生長(zhǎng)期間關(guān)閉基因的表達(dá)但最佳生長(zhǎng)后開啟該基因表達(dá)的啟動(dòng)子可用于調(diào)節(jié)控制代謝物產(chǎn)生的基因。經(jīng)修飾的菌株雖然表現(xiàn)與初始菌株相同的生長(zhǎng)參數(shù)，但是每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生更多產(chǎn)物。這類修飾既可以提高升產(chǎn)量(titer)(g產(chǎn)物/升)，又可以提高碳源產(chǎn)量(C yield)(g產(chǎn)物/g碳源)。
已經(jīng)有可能分離棒桿菌屬種中能使用以提高或減弱基因表達(dá)的那些核苷酸序列。受調(diào)節(jié)的這些啟動(dòng)子可以提高或降低基因的轉(zhuǎn)錄率，這取決于細(xì)胞的內(nèi)部和/或外部條件。在某些情況下，稱作誘導(dǎo)物的特定因子的存在可以刺激自啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄率。誘導(dǎo)物可以直接或間接地影響自啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。稱作抑制物的另一類因子能夠降低或抑制來自啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。與誘導(dǎo)物類似，抑制物也能夠直接或間接地作用。不過，受溫度調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子也為已知。因此，此類啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平例如可以通過將生長(zhǎng)溫度提高至高于細(xì)胞正常生長(zhǎng)溫度而提高或降低。
迄今已描述來自谷氨酸棒桿菌的少數(shù)啟動(dòng)子。在DE4440118中描述來了自谷氨酸棒桿菌的蘋果酸合酶基因啟動(dòng)子。將該啟動(dòng)子插入編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因上游。將這種構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至棒狀桿菌后，出現(xiàn)對(duì)該啟動(dòng)子下游結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。一旦將適宜誘導(dǎo)物添加至培養(yǎng)基則立即誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。
Reinscheid等，Microbiology 145503(1999)描述了來自谷氨酸棒桿菌的pta-ack啟動(dòng)子和報(bào)告基因(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)間的轉(zhuǎn)錄性融合。在含有乙酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的包含這種轉(zhuǎn)錄性融合的谷氨酸棒桿菌細(xì)胞表現(xiàn)報(bào)告基因提高的表達(dá)。與此相比，在葡萄糖上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞未顯示報(bào)告基因提高的表達(dá)。
Pa’tek等，Microbiology 1421297(1996)描述了能夠增強(qiáng)谷氨酸棒桿菌細(xì)胞中報(bào)告基因表達(dá)的來自谷氨酸棒桿菌的某些DNA序列。將這些序列在一起相互比較以定義谷氨酸棒桿菌啟動(dòng)子的共有序列。
能夠用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)的來自谷氨酸棒桿菌的另一些DNA序列在專利WO 02/40679中描述。這些分離的多核苷酸代表可用于提高或用于降低基因表達(dá)的來自谷氨酸棒桿菌的表達(dá)單元。該專利還描述了在其中來自谷氨酸棒桿菌的表達(dá)單元與異源基因結(jié)合的重組質(zhì)粒。本文中所述的將來自谷氨酸棒桿菌的啟動(dòng)子與異源基因融合的方法尤其可應(yīng)用于調(diào)節(jié)氨基酸生物合成的基因。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有有利特性的其它啟動(dòng)子和/或表達(dá)單元。我們發(fā)現(xiàn)通過使用這樣的具有啟動(dòng)子活性的核酸，實(shí)現(xiàn)了用于轉(zhuǎn)錄基因的目的，其中該核酸包含
A)核酸序列SEQ.ID.NO.1或B)通過替換、插入或缺失核苷酸而衍生自該序列并具有與序列SEQ.ID.NO.1在核酸水平至少90％同一性的序列，或C)嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)的序列的功能等同片段。
根據(jù)本發(fā)明，“轉(zhuǎn)錄”意指從DNA模板開始產(chǎn)生互補(bǔ)性RNA分子的過程。蛋白質(zhì)如RNA聚合酶、所謂的σ因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白參與此過程。隨后將合成的RNA用作翻譯過程中的模板，然后產(chǎn)生具有生物合成活性的蛋白質(zhì)。
產(chǎn)生具有生物合成活性的蛋白質(zhì)的形成率是轉(zhuǎn)錄率和翻譯率的結(jié)果?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明影響兩種效率，并且因此影響微生物中產(chǎn)物形成率。
根據(jù)本發(fā)明，“啟動(dòng)子”或“具有啟動(dòng)子活性的核酸”意指與待轉(zhuǎn)錄的核酸功能性連接并調(diào)節(jié)此核酸轉(zhuǎn)錄的核酸。
在本上下文中，“功能性連接”意指例如以如此方式依次排列具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸之一和待轉(zhuǎn)錄的核酸序列以及根據(jù)需要其它調(diào)節(jié)元件，例如確保轉(zhuǎn)錄核酸的核酸序列和例如終止子，以至每個(gè)調(diào)節(jié)元件能夠在轉(zhuǎn)錄核酸序列時(shí)充分行使其功能。因此，化學(xué)意義上的直接連接不是絕對(duì)必需。遺傳控制序列例如增強(qiáng)子序列能夠自更遠(yuǎn)位置甚至自其它DNA分子對(duì)靶序列執(zhí)行其功能。優(yōu)選這樣的排列，其中將待轉(zhuǎn)錄的核酸序列置于本發(fā)明啟動(dòng)子序列之后(即3’末端)以便兩種序列共價(jià)地連接在一起。在本上下文中，啟動(dòng)子序列和待轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核酸序列間的距離優(yōu)選地小于200bp、特別優(yōu)選地小于100bp、非常特別優(yōu)選地小于50bp。
根據(jù)本發(fā)明，“啟動(dòng)子活性”意指特定時(shí)間內(nèi)通過啟動(dòng)子形成的RNA的量，即轉(zhuǎn)錄率。
根據(jù)本發(fā)明，“特異啟動(dòng)子活性”意指特定時(shí)間內(nèi)對(duì)于每一啟動(dòng)子通過該啟動(dòng)子形成的RNA的量。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“野生型”意指適宜的初始微生物。
根據(jù)上下文，術(shù)語(yǔ)“微生物”意指本發(fā)明的初始微生物(野生型)或本發(fā)明的基因修飾微生物或這兩種微生物。
優(yōu)選地，并且尤其在不能清楚規(guī)定微生物或野生型微生物的情況下，“野生型”在任何情況下意指用于啟動(dòng)子活性或轉(zhuǎn)錄率的改變或引發(fā)、表達(dá)活性或表達(dá)率的改變或引發(fā)和提高生物合成產(chǎn)物的含量的參考生物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種參考生物是谷氨酸棒桿菌ATCC13032。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的初始微生物已經(jīng)能夠產(chǎn)生需要的精細(xì)化學(xué)品。在本上下文中，在棒桿菌屬(Corynobacterium)細(xì)菌的特別優(yōu)選的微生物和特別優(yōu)選的精細(xì)化學(xué)品L-賴氨酸、L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸中，特別優(yōu)選已經(jīng)能夠產(chǎn)生L-賴氨酸、L-甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸的那些初始微生物。它們特別優(yōu)選是其中例如編碼天冬氨酸激酶的基因(ask基因)下調(diào)或者反饋抑制取消或降低的棒桿菌。這類細(xì)菌具有例如導(dǎo)致ask基因中反饋抑制下降或取消的突變，例如突變T311I。
在關(guān)于與野生型相比基因的“引發(fā)的啟動(dòng)子活性”或轉(zhuǎn)錄率情況下，因此與野生型相比，引發(fā)了不以這種方式存在于野生型中的RNA形成。
在關(guān)于與野生型相比基因的改變的啟動(dòng)子活性或轉(zhuǎn)錄率情況下，因此與野生型相比，改變了特定時(shí)間所產(chǎn)生的RNA的量。
在本上下文中，“改變”優(yōu)選地意指提高或降低。
例如，這可以通過提高或降低本發(fā)明內(nèi)源性啟動(dòng)子的特異啟動(dòng)子活性，例如通過突變啟動(dòng)子或通過刺激或抑制啟動(dòng)子進(jìn)行。
另一種可能是例如通過具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸或通過具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)提高的啟動(dòng)子活性或轉(zhuǎn)錄率，其中所述基因相對(duì)于具有啟動(dòng)子活性的核酸為異源。
通過具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸或通過具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄優(yōu)選地由如下方式實(shí)現(xiàn)將本發(fā)明具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的一個(gè)或多個(gè)核酸導(dǎo)入微生物基因組，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在導(dǎo)入的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸控制下進(jìn)行，或?qū)⒁粋€(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锘蚪M，以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄在具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明內(nèi)源性核酸控制下進(jìn)行，或?qū)⒁粋€(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸，以及功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待轉(zhuǎn)錄核酸。
具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1或B)通過替換、插入或缺失核苷酸而衍生自該序列并具有與序列SEQ.ID.NO.1在核酸水平至少90％同一性的序列，或C)嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)的序列的功能等同片段。
核酸序列SEQ.ID.NO.1代表來自谷氨酸棒桿菌的推定性膜蛋白(P180)的啟動(dòng)子序列。SEQ.ID.NO.1與野生型的啟動(dòng)子序列對(duì)應(yīng)。
本發(fā)明還涉及這樣的具有啟動(dòng)子活性的核酸，其包含通過替換、插入或缺失核苷酸而衍生自該序列并具有與序列SEQ.ID.NO.1在核酸水平至少90％同一性的序列。
用于本發(fā)明啟動(dòng)子的本發(fā)明其它天然實(shí)例能夠例如自基因組序列已知的多種生物通過同一性比較來自數(shù)據(jù)庫(kù)的核酸序列與如上所述的序列SEQ.ID.NO.1輕易地找到。
本發(fā)明的人工啟動(dòng)子序列可自序列SEQ.ID.NO.1開始通過人工變異和突變輕易地找到，例如通過替換、插入或缺失核苷酸。
術(shù)語(yǔ)“替換”意指一個(gè)或多個(gè)核苷酸替換一個(gè)或多個(gè)核苷酸的描述?！叭笔А币庵竿ㄟ^直接連接替換核苷酸?！安迦搿币庵笇⒑塑账岵迦牒塑账嵝蛄校梢粋€(gè)或多個(gè)核苷酸形式上替換直接連接。
兩種核酸間的同一性在所有情況下意指遍及核酸全部長(zhǎng)度的核苷酸的同一性，尤其借助Informax(USA)的軟件Vector NTI Suite 7.1，使用如下所設(shè)定參數(shù)的Clustal方法(Higgins DG，Sharp PM.Fast and sensitivemultiple sequence alignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989 Apr；5(2)151-1)，通過比較而計(jì)算的同一性多重比對(duì)參數(shù)缺口開放罰分(Gap opening penalty) 10缺口延伸罰分(Gap extension penalty) 10缺口分離罰分范圍(Gap separation penalty range) 8缺口分離罰分(Gap separation penalty)關(guān)閉比對(duì)延遲的同一性(identity for alignment delay)％ 40殘基特異性缺口 關(guān)閉疏水殘基缺口關(guān)閉轉(zhuǎn)換權(quán)重(Transition weighing) 0配對(duì)比對(duì)參數(shù)FAST算法 開啟K-tuple大小 1缺口罰分 3窗口大小 5最佳對(duì)角線數(shù)(Number of best diagonals) 5具有與序列SEQ.ID.NO.1至少90％同一性的核酸序列因此意指與序列SEQ.ID.NO.1比較后，特別是根據(jù)具有以上參數(shù)設(shè)置的以上程序性算法比較顯示至少90％同一性的核酸序列。
特別優(yōu)選的啟動(dòng)子顯示與核酸序列SEQ.ID.NO.1 91％，更優(yōu)選地92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，特別優(yōu)選地99％的同一性。
啟動(dòng)子的其它天然實(shí)例能夠從以上所述核酸序列開始，特別從序列SEQ.ID.NO.1開始通過雜交技術(shù)以本身已知的方式自基因組序列未知的多種生物更輕易找到。
因此，本發(fā)明的又一方面涉及具有啟動(dòng)子活性的核酸，其包含嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的的核酸序列。該核酸序列包含至少10個(gè)，更優(yōu)選地多于12個(gè)、15個(gè)、30個(gè)、50個(gè)或特別優(yōu)選地多于150個(gè)核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，雜交在嚴(yán)格條件下發(fā)生。雜交條件在例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.的Molecular Cloning(A Laboratory Manual)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989第9.31-9.57頁(yè)中或在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述。
嚴(yán)格雜交條件特別意指在由50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt雜交溶液、10％硫酸葡聚糖和20g/ml變性和剪切的鮭精DNA組成的溶液中在42℃溫育過夜，隨后在65℃以0.1×SSC洗滌濾膜。
“功能等同的片段”對(duì)具有啟動(dòng)子活性的核酸序列意指具有基本相同或高于初始序列的特異啟動(dòng)子活性的片段。
“基本相同的”意指表現(xiàn)初始序列特異啟動(dòng)子活性至少50％、優(yōu)選地60％、更優(yōu)選地70％、更優(yōu)選地80％、更優(yōu)選地90％、特別優(yōu)選地95％的特異啟動(dòng)子活性。
“片段”意指具有由實(shí)施方案A)、B)或C)所述啟動(dòng)子活性的核酸的部分序列。這些片段優(yōu)選地具有核酸序列SEQ.ID.NO.1的多于10個(gè)、但更優(yōu)選地多于12個(gè)、15個(gè)、30個(gè)、50個(gè)或特別優(yōu)選地多于150個(gè)連接的核苷酸。
特別優(yōu)選地使用核酸序列SEQ.ID.NO.1作為啟動(dòng)子，即用于轉(zhuǎn)錄基因。
SEQ.ID.NO.1已在Genbank登錄號(hào)AP005283中描述而未注明其功能。因此，本發(fā)明還涉及具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的新核酸序列。
本發(fā)明特別涉及具有啟動(dòng)子活性的核酸，其包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1或B)通過替換、插入或缺失核苷酸而衍生自該序列并具有與序列SEQ.ID.NO.1在核酸水平至少90％同一性的序列，或C)嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)的序列的功能等同片段，條件是排除具有序列SEQ.ID.NO.1的核酸。
以上所提及具有啟動(dòng)子活性的全部核酸還可以自核苷酸結(jié)構(gòu)單元以本身已知的方式通過化學(xué)合成制備，例如通過雙螺旋的重疊互補(bǔ)的各個(gè)核酸結(jié)構(gòu)單元的片段縮合。寡核苷酸的化學(xué)合成可以例如通過亞磷酰胺法(phosphoramidite method)(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York第896-897頁(yè))以已知方式進(jìn)行。添加合成性寡核苷酸并使用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段填補(bǔ)缺口及連接反應(yīng)以及常用的克隆方法在Sambrook等(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press中描述。
本發(fā)明還涉及表達(dá)單元用來表達(dá)基因的用途，其中所述表達(dá)單元包含具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸之一和額外地功能性連接的確保翻譯核糖核酸的核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)單元意指具有表達(dá)活性的核酸，即與基因或待表達(dá)核酸功能性連接，調(diào)節(jié)該基因或該核酸的表達(dá)即轉(zhuǎn)錄和翻譯的核酸。
“功能性連接”在本上下文中意指例如以如此方式依次排列本發(fā)明的表達(dá)單元之一和待轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核酸序列以及根據(jù)需要其它調(diào)節(jié)元件例如終止子，以至每個(gè)調(diào)節(jié)元件能夠在轉(zhuǎn)基因表達(dá)該核酸序列時(shí)充分行使其功能。因此化學(xué)意義的直接連接不是絕對(duì)必需。遺傳控制序列例如增強(qiáng)子序列能夠自更遠(yuǎn)位置甚至自不同DNA分子對(duì)靶序列執(zhí)行其功能。優(yōu)選這樣的排列，在其中將待轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核酸序列置于本發(fā)明表達(dá)單元序列之后(即3’末端)以便兩種序列共價(jià)地連接在一起。此時(shí)，表達(dá)單元序列和待轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核酸序列間的距離優(yōu)選地少于200bp、特別優(yōu)選地少于100bp、非常特別優(yōu)選地少于50bp。
根據(jù)本發(fā)明，“表達(dá)活性”意指特定時(shí)間內(nèi)由表達(dá)單元所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量，即表達(dá)率。
根據(jù)本發(fā)明，“特異表達(dá)活性”意指對(duì)于每一表達(dá)單元特定時(shí)間內(nèi)由所述表達(dá)單元所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量在關(guān)于與野生型相比基因的“引發(fā)的表達(dá)活性”或表達(dá)率情況下，因此與野生型相比，引發(fā)了不以這種方式存在于野生型中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。
在關(guān)于與野生型相比基因的“改變的表達(dá)活性”或表達(dá)率情況下，因此與野生型相比，改變了特定時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量。
在本上下文中，“改變”優(yōu)選地意指提高或降低。
這可以通過提高或降低內(nèi)源性表達(dá)單元的特異活性例如通過將表達(dá)單元突變或通過刺激或抑制表達(dá)單元而進(jìn)行。
還可以例如通過本發(fā)明表達(dá)單元或通過具有提高的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)提高的表達(dá)活性或表達(dá)率，其中所述基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
通過本發(fā)明表達(dá)單元或通過具有提高的特異表達(dá)活性的本發(fā)明表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)優(yōu)選地由如下方式實(shí)現(xiàn)將一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)在導(dǎo)入的本發(fā)明表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，或?qū)⒁粋€(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锘蚪M，以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的表達(dá)在本發(fā)明的內(nèi)源性表達(dá)單元控制下進(jìn)行，該內(nèi)源性表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，或?qū)⒁粋€(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，該核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的表達(dá)單元，其根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待表達(dá)的核酸。
本發(fā)明的表達(dá)單元包含如上所述具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸和額外地功能性連接的確保翻譯核糖核酸的核酸序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的表達(dá)單元包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2或
F)通過替換、插入或缺失核苷酸而衍生自該序列并具有與序列SEQ.ID.NO.2在核酸水平至少90％同一性的序列，或G)嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.2雜交的核酸序列，或H)E)、F)或G)的序列的功能等同片段。
核酸序列SEQ.ID.NO.2代表來自谷氨酸棒桿菌的推定性膜蛋白(P180)表達(dá)單元的核酸序列。SEQ.ID.NO.2與野生型表達(dá)單元的序列對(duì)應(yīng)。
本發(fā)明還涉及這樣的表達(dá)單元，其包含通過替換、插入或缺失核苷酸而衍生自該序列并具有與序列SEQ.ID.NO.2在核酸水平至少90％同一性的序列。
用于本發(fā)明表達(dá)單元的本發(fā)明其它天然實(shí)例能夠自基因組序列已知的多種生物通過同一性比較來自數(shù)據(jù)庫(kù)的核酸序列與如上所述序列SEQ.ID.NO.2輕易地找到。
表達(dá)單元的本發(fā)明人工序列可自序列SEQ.ID.NO.2開始通過人工變異和突變輕易地找到，例如通過替換、插入或缺失核苷酸。
具有與序列SEQ.ID.NO.2至少90％同一性的核酸序列因此意指與序列SEQ.ID.NO.2比較后，特別是根據(jù)具有以上參數(shù)設(shè)置的以上程序性算法比較后顯示至少90％同一性的核酸序列。
特別優(yōu)選的表達(dá)單元顯示與核酸序列SEQ.ID.NO.2的91％，優(yōu)選地92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，特別優(yōu)選地99％同一性。
表達(dá)單元的其它天然實(shí)例能夠從基因組序列未知的多種生物自以上所述的核酸序列、特別是自序列SEQ.ID.NO.2開始通過雜交技術(shù)以本身已知的方式更輕易地找到。
因此，本發(fā)明又一方面涉及表達(dá)單元，其包含嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.2雜交的核酸序列。該核酸序列包含至少10個(gè)、更優(yōu)選地多于12個(gè)、15個(gè)、30個(gè)、50個(gè)或特別優(yōu)選地多于150個(gè)核苷酸。
“雜交”意指嚴(yán)格條件下多核苷酸或寡核苷酸與基本互補(bǔ)的序列結(jié)合的能力，同時(shí)在這些條件下不出現(xiàn)非互補(bǔ)性對(duì)象間的非特異性結(jié)合。為此，序列應(yīng)該優(yōu)選地具有90-100％互補(bǔ)性。例如將互補(bǔ)序列能夠與另一個(gè)互補(bǔ)性序列特異性結(jié)合的特性用于DNA或RNA印跡技術(shù)或者用于PCR或RT-PCR的引物結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明，雜交在嚴(yán)格條件下發(fā)生。此類雜交條件在例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.的Molecular Cloning(A Laboratory Manual)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989第9.31-9.57頁(yè)中或在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述。
嚴(yán)格雜交條件特別意指在由50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt雜交溶液、10％硫酸葡聚糖和20g/ml變性和剪切的鮭精DNA組成的溶液中在42℃溫育過夜，隨后在65℃以0.1×SSC洗滌濾膜。
本發(fā)明的核苷酸序列還可能產(chǎn)生可用于鑒定和/或克隆其他細(xì)胞類型和生物中同源序列的探針和引物。這類探針和引物通常包含這樣的核苷酸序列的區(qū)域，其在嚴(yán)格條件下雜交至本發(fā)明核酸序列的有義鏈或相應(yīng)反義鏈的至少大約12個(gè)、優(yōu)選地至少大約25個(gè)連續(xù)核苷酸，例如大約40、50或75個(gè)連續(xù)核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明還包含了含有所謂的沉默突變或與具體提到的序列比較根據(jù)特定來源或宿主生物的密碼子使用得到修飾的核酸序列以及天然存在的變體，例如其剪接變體或等位基因變體。
“功能等同的片段”對(duì)表達(dá)單元意指具有基本相同于或高于初始序列的特異表達(dá)活性的片段。
“基本相同的”意指表現(xiàn)初始序列特異表達(dá)活性至少50％、優(yōu)選地60％、更優(yōu)選地70％、更優(yōu)選地80％、更優(yōu)選地90％、特別優(yōu)選地95％的特異表達(dá)活性。
“片段”意指由實(shí)施方案E)、F)或G)所描述的表達(dá)單元的部分序列。這些片段優(yōu)選地具有核酸序列SEQ.ID.NO.2的多于10個(gè)，但更優(yōu)選地多于12個(gè)、15個(gè)、30個(gè)、50個(gè)或特別優(yōu)選地多于150個(gè)連接的核苷酸。
特別優(yōu)選使用核酸序列SEQ.ID.NO.2作為表達(dá)單元，即用于表達(dá)基因。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的新表達(dá)單元。
本發(fā)明特別地涉及這樣的表達(dá)單元，其包含具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸和額外地功能性連接的確保翻譯核糖核酸的核酸序列。
本發(fā)明特別優(yōu)選地涉及表達(dá)單元，其包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2或F)通過替換、插入或缺失核苷酸而衍生自該序列并具有與序列SEQ.ID.NO.2在核酸水平至少90％同一性的序列，或G)嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.2雜交的核酸序列，或H)E)、F)或G)的序列的功能等同片段，條件是排除具有序列SEQ.ID.NO.2的核酸。
本發(fā)明的表達(dá)單元包含一個(gè)或多個(gè)如下遺傳元件負(fù)10(“-10”)序列；負(fù)35(“-35”)序列；轉(zhuǎn)錄序列開始、增強(qiáng)子區(qū)；和操縱基因區(qū)。
這些遺傳元件優(yōu)選地對(duì)棒狀菌的種呈特異性，尤其對(duì)谷氨酸棒桿菌是特異的。
以上提及的全部表達(dá)單元還可以自核苷酸結(jié)構(gòu)單元以本身已知的方式通過化學(xué)合成制備，例如通過雙螺旋的各個(gè)重疊性互補(bǔ)的核酸結(jié)構(gòu)單元的片段縮合。寡核苷酸的化學(xué)合成可以例如通過亞磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York第896-897頁(yè))以已知方式進(jìn)行。添加合成性寡核苷酸并使用DNA聚合酶Klenow片段填補(bǔ)缺口及連接反應(yīng)以及常用的克隆方法在Sambrook等(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述。
本專利中用于本發(fā)明的方法和技術(shù)對(duì)受過微生物學(xué)技術(shù)和重組DNA技術(shù)訓(xùn)練的技術(shù)人員為已知。此類技術(shù)和方法的實(shí)例是用于生長(zhǎng)細(xì)菌細(xì)胞、將分離的DNA分子插入宿主細(xì)胞、以及分離、克隆和測(cè)序分離的核酸分子等的方法和技術(shù)。這些方法描述于如下眾多標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)來源中Davis等，Basic Methods In Molecular Biology(1986)；J.H.Miller，Experiments inMolecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(1972)；J.H.Miller，A Short Course in BacterialGenetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1992)；M.Singer和P.Berg，Genes&Genomes，University ScienceBooks，Mill Valley，California(1991)；J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；P.B.Kaufmann等，Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biologyand Medicine，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1995)；Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，編者B.R.Glick和J.E.Thompson，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1993)和P.F.Smith-Keary，MolecularGenetics of Escherichia coli，The Guilford Press，New York，NY(1989)。
本發(fā)明的全部核酸分子優(yōu)選地為分離的核酸分子形式?！胺蛛x的”核酸分子與該核酸存在的天然來源中的其它核酸分子分離，并且若該分子通過重組技術(shù)制備，還可以基本不含其他細(xì)胞性物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者若該分子通過化學(xué)方式合成，還可以基本不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。
本發(fā)明還包含與已經(jīng)具體描述的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子或其部分。
本發(fā)明的啟動(dòng)子和/或表達(dá)單元特別有利地可例如用于通過如下所述的發(fā)酵制備生物合成產(chǎn)物的改進(jìn)的方法中。
本發(fā)明的啟動(dòng)子和/或表達(dá)單元特別具有的優(yōu)勢(shì)是在微生物中它們通過應(yīng)激誘導(dǎo)。有可能通過合適地控制發(fā)酵過程以便為提高所需基因的轉(zhuǎn)錄率/表達(dá)率特異性地控制這種應(yīng)激誘導(dǎo)。特別在產(chǎn)生L-賴氨酸時(shí)，這種應(yīng)激期很早地達(dá)到以至此時(shí)可以很早地實(shí)現(xiàn)所需基因的提高的基因轉(zhuǎn)錄率/表達(dá)率。
具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸可用于改變即提高或降低，或者用于引發(fā)與野生型比較微生物中基因的轉(zhuǎn)錄率。
本發(fā)明的表達(dá)單元可用于改變即提高或降低，或者用于引發(fā)與野生型比較微生物中基因的表達(dá)率。
具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸和本發(fā)明的表達(dá)單元還能起到調(diào)節(jié)和增強(qiáng)微生物尤其棒桿菌屬諸種中多種生物合成產(chǎn)物如精細(xì)化學(xué)品、蛋白質(zhì)、尤其氨基酸產(chǎn)生的作用。
本發(fā)明因此涉及通過如下方式改變或引發(fā)與野生型比較微生物中基因的轉(zhuǎn)錄率的方法a)改變與野生型比較微生物中具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明內(nèi)源性核酸的特異啟動(dòng)子活性，其中所述內(nèi)源性核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄，或b)通過具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中所述基因相對(duì)于具有啟動(dòng)子活性的核酸為異源。
根據(jù)實(shí)施方案a)，改變或引發(fā)與野生型比較微生物中基因的轉(zhuǎn)錄率可通過改變即提高或降低微生物中特異啟動(dòng)子活性進(jìn)行。這可以通過將具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸序列定向突變即通過定向替換、缺失或插入核苷酸進(jìn)行。提高或降低的啟動(dòng)子活性通過替換RNA聚合酶全酶結(jié)合位點(diǎn)(也即技術(shù)人員所知的-10區(qū)和-35區(qū))內(nèi)的核苷酸實(shí)現(xiàn)。此外，還通過缺失核苷酸或插入核苷酸縮減或擴(kuò)大所述RNA聚合酶全酶結(jié)合位點(diǎn)彼此間的距離而實(shí)現(xiàn)。此外還通過將用于調(diào)節(jié)蛋白(也即技術(shù)人員所知的阻抑蛋白和激活蛋白)的結(jié)合位點(diǎn)(也即技術(shù)人員所知的操縱基因)在接近RNA聚合酶全酶結(jié)合位點(diǎn)的空間安置，以至這些調(diào)節(jié)蛋白與啟動(dòng)子序列結(jié)合后減弱或增強(qiáng)RNA聚合酶全酶的結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄活性，或?qū)⒋嗣钢糜谛抡{(diào)節(jié)性影響下。
相對(duì)于“特異啟動(dòng)子活性”，與野生型比較提高或降低意指特異活性與本發(fā)明具有啟動(dòng)子活性的野生型核酸比較，即例如與SEQ.ID.NO.1比較提高或降低。
根據(jù)實(shí)施方案b)，改變或引發(fā)與野生型比較微生物中基因的轉(zhuǎn)錄率可通過具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸或通過實(shí)施方案a)的具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄而進(jìn)行，其中所述基因相對(duì)于具有啟動(dòng)子活性的核酸為異源。
這優(yōu)選地由如下方式實(shí)現(xiàn)b1)將一個(gè)或多個(gè)具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸導(dǎo)入微生物基因組，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在所導(dǎo)入的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸控制下進(jìn)行，或b2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄在具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明內(nèi)源性核酸控制下進(jìn)行，或b3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待轉(zhuǎn)錄核酸。
因此還有可能通過如下方式改變，即提高或降低野生型內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄率根據(jù)實(shí)施方案b1)，將一個(gè)或多個(gè)具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸導(dǎo)入微生物基因組，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在所導(dǎo)入具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行，或根據(jù)實(shí)施方案b2)，將一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因?qū)胛⑸锘蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明內(nèi)源性核酸控制下進(jìn)行，或根據(jù)實(shí)施方案b3)，將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待轉(zhuǎn)錄的內(nèi)源性核酸。
還有可能通過如下方式引發(fā)與野生型比較外源性基因的轉(zhuǎn)錄率根據(jù)實(shí)施方案b2)，將一個(gè)或多個(gè)外源性基因?qū)胛⑸锘蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入外源性基因的轉(zhuǎn)錄在具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明內(nèi)源性核酸控制下進(jìn)行，或根據(jù)實(shí)施方案b3)，將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待轉(zhuǎn)錄外源性核酸。
根據(jù)實(shí)施方案b2)的基因插入還可以通過將基因整合至編碼區(qū)或非編碼區(qū)進(jìn)行。插入優(yōu)選地在非編碼區(qū)內(nèi)進(jìn)行。
根據(jù)實(shí)施方案b3)的核酸插入還可以以染色體或染色體外方式進(jìn)行。核酸構(gòu)建體優(yōu)選地進(jìn)行染色體性插入。染色體性整合是指外源DNA片段插入宿主細(xì)胞的染色體。此術(shù)語(yǔ)還用于外源DNA片段和宿主細(xì)胞染色體相應(yīng)區(qū)域間的同源重組。
在實(shí)施方案b)中，還優(yōu)選地使用根據(jù)實(shí)施方案a)的具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸。在實(shí)施方案b)中，如實(shí)施方案a)所述，這些核酸可以在微生物中存在或產(chǎn)生，或以分離的形式導(dǎo)入微生物。
“內(nèi)源性”意指野生型基因組內(nèi)已經(jīng)存在的遺傳信息，例如基因。
“外源性”意指野生型基因組內(nèi)不存在的遺傳信息，例如基因。
對(duì)于通過具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)而言，術(shù)語(yǔ)“基因”優(yōu)選地意指包含待轉(zhuǎn)錄的區(qū)域，即例如調(diào)節(jié)翻譯的區(qū)域，和編碼區(qū)以及根據(jù)需要其它調(diào)節(jié)元件例如終止子的核酸。
對(duì)于此后所描述通過本發(fā)明的表達(dá)單元對(duì)表達(dá)的調(diào)節(jié)而言，術(shù)語(yǔ)“基因”優(yōu)選地意指包含編碼區(qū)和根據(jù)需要其它調(diào)節(jié)元件例如終止子的核酸。
“編碼區(qū)”意指編碼蛋白質(zhì)的核酸序列。
對(duì)于基因和具有啟動(dòng)子活性的核酸而言，“異源性”意指在具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸調(diào)節(jié)下所用的基因在野生型中不轉(zhuǎn)錄，但是產(chǎn)生野生型中不存在的新功能性聯(lián)系，并且具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸和特異性基因的功能性組合在野生型中不存在。
對(duì)于基因和表達(dá)單元而言，“異源性”意指在本發(fā)明的表達(dá)單元調(diào)節(jié)下所用的基因在野生型中不表達(dá)，但是產(chǎn)生在野生型中不存在的新功能性聯(lián)系，并且本發(fā)明表達(dá)單元和特異性基因的功能性組合在野生型中不存在。
本發(fā)明在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中還涉及通過如下方式用于提高或引發(fā)與野生型比較微生物中基因的轉(zhuǎn)錄率的方法ah)提高與野生型比較微生物中具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明內(nèi)源性核酸的特異啟動(dòng)子活性，其中所述內(nèi)源性核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄，或bh)通過具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中所述基因相對(duì)于具有啟動(dòng)子活性的核酸為異源。
通過具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案ah)的具有提高的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄優(yōu)選地由如下方式實(shí)現(xiàn)bh1)將一個(gè)或多個(gè)具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸導(dǎo)入微生物基因組，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在所導(dǎo)入具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸控制下進(jìn)行，或bh2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄在具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明內(nèi)源性核酸控制下進(jìn)行，或bh3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待轉(zhuǎn)錄核酸。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及通過如下方式用于降低與野生型比較微生物中基因的轉(zhuǎn)錄率的方法ar)降低與野生型比較微生物中具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明內(nèi)源性核酸的特異啟動(dòng)子活性，其中所述內(nèi)源性核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄，或br)將根據(jù)實(shí)施方案a)的具有降低的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組，以至內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在所導(dǎo)入的具有降低的啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行。
本發(fā)明還涉及通過如下方式用于改變或引發(fā)與野生型比較微生物中基因的表達(dá)率的方法
c)改變與野生型比較微生物中本發(fā)明內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，其中所述內(nèi)源性表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的表達(dá)，或d)通過本發(fā)明的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案c)的具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
根據(jù)實(shí)施方案c)，改變或引發(fā)與野生型比較微生物中基因的表達(dá)率可通過改變，即提高或降低微生物中的特異表達(dá)活性進(jìn)行。這可以通過將具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸序列定向突變，即通過定向替換、缺失或插入核苷酸進(jìn)行。例如擴(kuò)大SD序列和翻譯起始密碼子間的距離通常導(dǎo)致特異表達(dá)活性的改變、減弱或增強(qiáng)。特異表達(dá)活性的改變還可以通過缺失或插入核苷酸縮短或擴(kuò)展SD區(qū)(核糖體結(jié)合位點(diǎn))序列離翻譯起始密碼子的距離實(shí)現(xiàn)。此外還通過如此方式改變SD區(qū)的序列以至對(duì)互補(bǔ)性3’側(cè)16SrRNA的同源性增強(qiáng)或減弱。
對(duì)“特異表達(dá)活性”而言，與野生型比較提高或降低意指與野生型的本發(fā)明表達(dá)單元比較即例如與SEQ.ID.NO.2比較特異活性的提高或降低。
根據(jù)實(shí)施方案d)，改變或引發(fā)與野生型比較微生物中基因的表達(dá)率可通過本發(fā)明的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案c)的具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)而進(jìn)行，其中所述基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
這優(yōu)選地由如下方式實(shí)現(xiàn)d1)將一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)在導(dǎo)入的表達(dá)單元控制下進(jìn)行，或d2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的表達(dá)在本發(fā)明的內(nèi)源性表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述內(nèi)源性表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，或d3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的表達(dá)單元，其根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待表達(dá)的核酸。
因此有可能通過如下方式改變即提高或降低野生型內(nèi)源性基因的表達(dá)率根據(jù)實(shí)施方案d1)，將一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)在導(dǎo)入的表達(dá)單元控制下進(jìn)行，或根據(jù)實(shí)施方案d2)，將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的表達(dá)在本發(fā)明的內(nèi)源性表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述內(nèi)源性表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，或根據(jù)實(shí)施方案d3)，將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的表達(dá)單元，其根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待表達(dá)的核酸。
還有可能通過如下方式引發(fā)與野生型比較外源性基因的表達(dá)率根據(jù)實(shí)施方案d2)，將一個(gè)或多個(gè)外源性基因?qū)胛⑸锘蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的表達(dá)在本發(fā)明的內(nèi)源性表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述內(nèi)源性表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，或根據(jù)實(shí)施方案d3)，將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的表達(dá)單元，其根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待表達(dá)的外源性核酸。
根據(jù)實(shí)施方案d2)的基因插入還可以通過將基因整合至編碼區(qū)或非編碼區(qū)進(jìn)行。插入優(yōu)選地在非編碼區(qū)內(nèi)進(jìn)行。
根據(jù)實(shí)施方案d3)的核酸插入還可以以染色體或染色體外方式進(jìn)行。核酸構(gòu)建體優(yōu)選地進(jìn)行染色體性插入。
核酸構(gòu)建體此后也稱作表達(dá)盒。
在實(shí)施方案d)中，還優(yōu)選使用根據(jù)實(shí)施方案c)的具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明表達(dá)單元。在實(shí)施方案d)中，如實(shí)施方案d)中所述，這些表達(dá)單元可以在微生物中存在或產(chǎn)生，或以分離的形式導(dǎo)入微生物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及用于通過如下方式提高或引發(fā)與野生型比較微生物中基因的表達(dá)率的方法ch)提高與野生型比較微生物中本發(fā)明內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，其中所述內(nèi)源性表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的表達(dá)，或dh)通過本發(fā)明的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案c)的具有提高的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
通過本發(fā)明的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案c)的具有提高的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)優(yōu)選地由如下方式實(shí)現(xiàn)dh1)將一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)在所導(dǎo)入的表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，或dh2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的表達(dá)在本發(fā)明的內(nèi)源性表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述內(nèi)源性表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，或dh3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的表達(dá)單元，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待表達(dá)的核酸。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及用于通過如下方式降低與野生型比較微生物中基因的表達(dá)率的方法cr)降低與野生型比較微生物中本發(fā)明內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，其中所述內(nèi)源性表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的表達(dá)，或dr)將根據(jù)實(shí)施方案cr)的具有降低的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組，以至內(nèi)源性基因的表達(dá)在所導(dǎo)入的具有降低的表達(dá)活性的表達(dá)單元控制下進(jìn)行。
在如上所述用于改變或引發(fā)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄率和/或表達(dá)率的本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，基因選自編碼來源于精細(xì)化學(xué)品生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸，其中基因根據(jù)需要可以含有進(jìn)一步的調(diào)節(jié)元件。
在如上所述用于改變或引發(fā)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄率和/或表達(dá)率的本發(fā)明方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因選自編碼來自蛋白原性和非蛋白原性氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自核苷酸和核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自有機(jī)酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自脂類和脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自二醇生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自糖類生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自芳香化合物生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自維生素生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自輔因子生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸和編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸，其中基因根據(jù)需要可以含有其它調(diào)節(jié)元件。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，來自氨基酸生物合成途徑中的蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LuxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR1、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚γ-合成酶、胱硫醚β-裂合酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、蘇氨酸輸出蛋白載體蛋白、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出蛋白、生物素連接酶、半胱氨酸合成酶I、半胱氨酸合成酶II、依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶、不依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和亞基2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調(diào)節(jié)蛋白、RXN2910調(diào)節(jié)蛋白、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸外排蛋白(effluxprotein)、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA248、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA247、蛋白質(zhì)OpcA、1-磷酸果糖激酶和6-磷酸果糖激酶。
如上所述來自氨基酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)中優(yōu)選的蛋白質(zhì)和編碼這些蛋白質(zhì)的核酸分別是微生物來源的蛋白質(zhì)序列和核酸序列，優(yōu)選來自棒桿菌屬或短桿菌屬(Brevibacterium)細(xì)菌，優(yōu)選地來自棒狀細(xì)菌，特別優(yōu)選地來自谷氨酸棒桿菌。
來自氨基酸生物合成途徑的特別優(yōu)選的蛋白質(zhì)序列和編碼這些蛋白質(zhì)的相應(yīng)核酸序列的實(shí)例、涉及其的參考文獻(xiàn)及其在參考文獻(xiàn)中的編號(hào)在表1列出
來自氨基酸生物合成途徑中特別優(yōu)選的蛋白質(zhì)序列和編碼該蛋白質(zhì)的相應(yīng)核酸序列的又一實(shí)例是又稱作fbr2的果糖-1，6-二磷酸酶2的序列(SEQ.ID.NO.15)以及編碼果糖-1，6-二磷酸酶2的相應(yīng)核酸序列(SEQ.ID.NO.14)。
來自氨基酸生物合成途徑中特別優(yōu)選的蛋白質(zhì)序列和編碼該蛋白質(zhì)的相應(yīng)核酸序列的又一實(shí)例是在硫酸鹽還原作用中也稱作RXA077的蛋白質(zhì)(SEQ.ID.NO.17)以及編碼硫酸鹽還原作用中該蛋白質(zhì)的相應(yīng)核酸序列(SEQ.ID.NO.16)。
來自氨基酸生物合成途徑中其它特別優(yōu)選的蛋白質(zhì)序列任何情況下中具有表1中對(duì)該蛋白質(zhì)所示的氨基酸序列，其中相應(yīng)蛋白質(zhì)在表2/列2對(duì)該氨基酸序列所指示氨基酸位置中的至少一個(gè)氨基酸位置中具有與表2/列3相同行中所示相應(yīng)氨基酸不同的一個(gè)蛋白原性氨基酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)在表2/列2對(duì)該氨基酸序列所指示氨基酸位置中的至少一個(gè)氨基酸位置中具有如表2/列4相同行中所示的氨基酸。表2中所示的蛋白質(zhì)是氨基酸生物合成途徑中突變的蛋白質(zhì)，具有有利的特性并且因此特別適用于通過本發(fā)明的啟動(dòng)子表達(dá)相應(yīng)核酸并適用于產(chǎn)生氨基酸。例如突變T311I導(dǎo)致對(duì)ask的反饋抑制的關(guān)閉。
可通過常規(guī)方法制備編碼如上所述來自表2的突變蛋白質(zhì)的相應(yīng)核酸。
制備編碼突變蛋白質(zhì)的核酸序列的合適起點(diǎn)是例如可自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心在編號(hào)ATCC13032下得到的谷氨酸棒桿菌菌株的基因組，或表1中所引用的核酸序列。為使突變蛋白質(zhì)的氨基酸序列逆向翻譯為編碼這些蛋白質(zhì)的核酸序列，有利地使用欲向其中導(dǎo)入核酸序列或其中存在該核酸序列的生物的密碼子使用。例如，對(duì)于谷氨酸棒桿菌，使用谷氨酸棒桿菌密碼子使用是有利的。特定生物的密碼子使用可以自描述源于目的生物的至少一個(gè)蛋白質(zhì)和一個(gè)編碼該蛋白質(zhì)的基因的數(shù)據(jù)庫(kù)或?qū)＠暾?qǐng)以本身已知的方式確定。
表2中的信息應(yīng)當(dāng)以如下方式理解在1列“身份”中，顯示相對(duì)于表1中每種序列的清晰命名。
在列2“氨基酸位置”中，相應(yīng)的編號(hào)指來自表1的對(duì)應(yīng)多肽序列的氨基酸位置。因此“氨基酸位置”列中“26”意指相應(yīng)所示多肽序列的氨基酸位置26。位置的編號(hào)自氨基末端+1開始。
在列3 “氨基酸野生型”中，相應(yīng)字母指來自表1序列的對(duì)應(yīng)野生型株中列2所示位置處的氨基酸-由單字母編碼代表。
在列4“氨基酸突變”中，相應(yīng)字母指對(duì)應(yīng)突變株中列2所示的位置處的氨基酸-由單字母編碼代表。
在列5 “功能”中，顯示相應(yīng)多肽序列的生理功能。
對(duì)于具有特定功能(列5)和特定初始氨基酸序列(表1)的突變蛋白質(zhì)，列2、3和4描述至少一個(gè)突變，并且對(duì)于某些序列描述多種突變。這類多種突變總是指以上每一情況下(表1)最接近的初始氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)特定氨基酸序列“氨基酸位置中的至少一個(gè)氨基酸位置”優(yōu)選地意指對(duì)列2、3和4中該氨基酸序列所描述突變的至少一個(gè)突變。
蛋白原性氨基酸的單字母編碼A丙氨酸C半胱氨酸D天冬氨酸E谷氨酸F苯丙氨酸G甘氨酸H組氨酸I異亮氨酸
K賴氨酸L亮氨酸M甲硫氨酸N天冬酰胺P脯氨酸Q谷氨酰胺R精氨酸S絲氨酸T蘇氨酸V纈氨酸W色氨酸Y酪氨酸表2
在以上所述用于改變或引發(fā)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄率和/或表達(dá)率的本發(fā)明方法，和此后描述用于產(chǎn)生基因修飾微生物、此后所述的基因修飾微生物，以及此后所述用于產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物的方法中，將具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸、本發(fā)明的表達(dá)單元、以上所述的基因和以上所述的核酸構(gòu)建體或表達(dá)盒導(dǎo)入微生物，尤其棒狀細(xì)菌優(yōu)選地通過SacB方法進(jìn)行。
SacB方法對(duì)技術(shù)人員為已知并且例如在S ch_fer A，Tauch A，J_gerW，Kalinowski J，Thierbach G，Pühler A.；Small mobilizablemulti-purpose cloning Vectors derived from the Escherichia coli PlasmidspK18 and pK19selection of defined deletions in the chromosome ofCorynebacterium glutamicum，Gene.1994 Jul 22；145(1)69-73和BlomfieldIC，Vaughn V，Rest RF，Eisenstein BI.；Allelic exchange in Escherichia coliusing the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSC101replicon；Mol Microbiol.1991 Jun；5(6)1447-57中描述。
在以上所述本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，改變或引發(fā)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄率和/或表達(dá)率通過將具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸或本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物進(jìn)行。
在以上所述本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，改變或引發(fā)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄率和/或表達(dá)率通過將將以上所述的核酸構(gòu)建體或表達(dá)盒導(dǎo)入微生物進(jìn)行。
本發(fā)明因此也涉及表達(dá)盒，其包含至少一個(gè)本發(fā)明的表達(dá)單元至少一個(gè)其它待表達(dá)的核酸序列，即待表達(dá)的基因和根據(jù)需要其它遺傳控制元件，例如終止子，其中至少一個(gè)表達(dá)單元和待表達(dá)的其它核酸序列功能性地連接在一起，并且待表達(dá)的其它核酸序列相對(duì)于所述表達(dá)單元為異源。
待表達(dá)的核酸序列優(yōu)選地是編碼來自精細(xì)化學(xué)品生物合成途徑的蛋白質(zhì)的至少一個(gè)核酸。
待表達(dá)的核酸序列特別優(yōu)選地選自編碼來自蛋白原性和非蛋白原性氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自核苷酸和核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自有機(jī)酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自脂類和脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自二醇生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自糖類生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自芳香化合物生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自維生素生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自輔因子生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸和編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸。
來自氨基酸生物合成途徑的優(yōu)選蛋白質(zhì)如上所述并且它們的實(shí)例在表1和表2中描述。
如此選擇本發(fā)明表達(dá)盒中表達(dá)單元與待表達(dá)基因的相對(duì)物理位置以便所述表達(dá)單元調(diào)節(jié)待表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄并優(yōu)選地調(diào)節(jié)其翻譯，因此能夠產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。在本上下文中，“能夠產(chǎn)生”包含產(chǎn)生的組成性增加、在特異性條件下產(chǎn)生的減弱或阻抑和/或在特異性條件下提高產(chǎn)生。在本上下文中，“條件”包含(1)將成分添加至培養(yǎng)基、(2)自培養(yǎng)基中移出成分、(3)將培養(yǎng)基中的一種成分替換為第二種成分、(4)提高培養(yǎng)基溫度、(5)降低培養(yǎng)基溫度和(6)調(diào)節(jié)空氣條件，例如在保持培養(yǎng)基的氧濃度或氮濃度。
本發(fā)明還涉及包含以上所述的本發(fā)明表達(dá)盒的表達(dá)載體。
載體對(duì)于技術(shù)人員為眾所周知并且例如可以在“Cloning Vectors”(編者Pouwels P.H.等，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)找到。此外，載體意指技術(shù)人員所知的全部其它載體，如噬菌體、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬菌粒、粘粒、以及線形DNA或環(huán)形DNA。這些載體可以在宿主生物中進(jìn)行自主性復(fù)制或染色體性復(fù)制。
合適的和特別優(yōu)選的質(zhì)粒是在棒狀細(xì)菌中復(fù)制的那些質(zhì)粒。眾多已知的質(zhì)粒載體如pZ1(Menkel等，Applied and Environmental Microbiology(1989)64549-554)、pEKEx1(Eikmanns等，Gene 10293-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，Gene 10769-74(1991))是以隱蔽性質(zhì)粒(crypticplasmid)pHM1519、pBL1或pGA1為基礎(chǔ)。其它質(zhì)粒載體例如pCLiK5MCS或者基于pCG4(US-A4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 66，119-124(1990))或pAG1(US-A 5,158,891)的那些載體質(zhì)?？梢砸酝瑯臃绞绞褂?。
同樣適合的是這樣的質(zhì)粒載體，借助這些質(zhì)粒載體，通過整合至染色體擴(kuò)增基因的方法可例如Remscheid等(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60，126-132(1994))所述用于復(fù)制和擴(kuò)增hom-thrB操縱子。在此方法中，將完整基因克隆至能夠在宿主(通常是大腸桿菌)中復(fù)制而不能在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制的載體。合適載體的實(shí)例是pSUP301(Sirnon等，Bio/Technology 1，784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(Sch_fer等，Gene 145，69-73(1994))，Bernard等，Journal of Molecular Biology，234534-541(1993))、pEM1(Schrumpf等1991，Journal of Bacteriology 1734510-4516)或pBGS8(Spratt等，1986，Gene 41337-342)。隨后通過轉(zhuǎn)化將包含待擴(kuò)增基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移至目的谷氨酸棒桿菌菌株。用于轉(zhuǎn)化的方法在例如Thierbach等(Applied Microbiology and Biotechnology 29，356-362(1988))、Dunican和Shivnan(Biotechnology 7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))中描述。
本發(fā)明還涉及基因修飾微生物，在其中遺傳修飾導(dǎo)致與野生型比較改變或引發(fā)至少一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄率的并且取決于a)改變微生物中至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸的特異啟動(dòng)子活性，其中所述內(nèi)源性核酸調(diào)節(jié)至少一個(gè)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄，或b)通過根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有改變的特異啟動(dòng)子活性的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中基因相對(duì)于具有啟動(dòng)子活性的核酸為異源。
如以上對(duì)方法所述，通過根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有改變的特異啟動(dòng)子活性的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄由如下方式實(shí)現(xiàn)b1)將根據(jù)權(quán)利要求1的一個(gè)或多個(gè)具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在所導(dǎo)入的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行，或b2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄在根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸控制下進(jìn)行，或b3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待轉(zhuǎn)錄核酸。
本發(fā)明還涉及具有至少一個(gè)基因與野生型比較升高或引發(fā)的轉(zhuǎn)錄率的基因修飾微生物，其中ah)提高與野生型比較微生物中根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸的特異啟動(dòng)子活性，其中所述核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的表達(dá)，或bh)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄通過根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案ah)的具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)，其中基因相對(duì)于具有啟動(dòng)子活性的核酸為異源。
如以上對(duì)方法所述，通過根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有提高的特異啟動(dòng)子活性的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄由如下方式實(shí)現(xiàn)bh1)將根據(jù)權(quán)利要求1的一個(gè)或多個(gè)具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在所導(dǎo)入的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行，或bh2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄在根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸控制下進(jìn)行，或bh3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待轉(zhuǎn)錄核酸。
本發(fā)明還涉及具有至少一個(gè)基因與野生型比較降低的轉(zhuǎn)錄率的基因修飾微生物，其中ar)降低與野生型比較微生物中至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸的特異啟動(dòng)子活性，其中所述內(nèi)源性核酸調(diào)節(jié)至少一個(gè)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄，或br)將一個(gè)或多個(gè)根據(jù)實(shí)施方案a)的具有降低的啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組，以至至少一個(gè)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在所導(dǎo)入的具有降低的啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行。
本發(fā)明還涉及基因修飾微生物，在其中遺傳修飾導(dǎo)致與野生型比較改變或引發(fā)至少一個(gè)基因的表達(dá)率，并且取決于c)改變與野生型比較微生物中至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2或3的內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，其中內(nèi)源性表達(dá)單元調(diào)節(jié)至少一個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)，或d)通過根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
如以上對(duì)方法所述，通過根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)由如下方式實(shí)現(xiàn)d1)將一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)在導(dǎo)入的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，或d2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的表達(dá)在根據(jù)權(quán)利要求2或3的內(nèi)源性表達(dá)單元下進(jìn)行，所述內(nèi)源性表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，或d3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待表達(dá)的核酸。
本發(fā)明還涉及具有至少一個(gè)基因與野生型比較提高或引發(fā)的表達(dá)率的基因修飾微生物，其中
ch)提高與野生型比較微生物中至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，其中所述內(nèi)源性表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的表達(dá)，或dh)微生物中基因的表達(dá)通過根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有提高的特異表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元調(diào)節(jié)，其中基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
如以上對(duì)方法所述，通過根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有提高的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)由如下方式實(shí)現(xiàn)dh1)將一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)在所導(dǎo)入的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，或dh2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的表達(dá)在根據(jù)權(quán)利要求2或3的內(nèi)源性表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述內(nèi)源性表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，或dh3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待表達(dá)的核酸。
本發(fā)明還涉及具有至少一個(gè)基因與野生型比較降低的表達(dá)率的基因修飾微生物，其中cr)降低與野生型比較微生物中至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2或3的內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，其中所述內(nèi)源性表達(dá)單元調(diào)節(jié)至少一個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)，或dr)將一個(gè)或多個(gè)具有降低的表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物以至至少一個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)在所導(dǎo)入具有降低的表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元控制下進(jìn)行。
本發(fā)明還涉及其中包含根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元和功能性連接的待表達(dá)基因的基因修飾微生物，其中所述基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
基因修飾微生物特別優(yōu)選地包含本發(fā)明的表達(dá)盒。
本發(fā)明特別優(yōu)選地涉及包含載體，特別包含穿梭載體或質(zhì)粒載體的基因修飾微生物，特別是棒狀細(xì)菌，其中所述載體攜帶至少一個(gè)根據(jù)本發(fā)明所定義的重組核酸構(gòu)建體。
在基因修飾微生物的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以上所述的基因是至少一個(gè)編碼來自化學(xué)品生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸。
在基因修飾微生物的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，以上所述的基因是選自編碼來自蛋白原性和非蛋白原性氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自核苷酸和核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自有機(jī)酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自脂類和脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自二醇生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自糖類生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自芳香化合物生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自維生素生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自輔因子生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸和編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸，其中基因可以根據(jù)需要含有其它調(diào)節(jié)元件。
來自氨基酸生物合成途徑的優(yōu)選蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LuxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR1、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚γ-合成酶、胱硫醚β-裂合酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、蘇氨酸輸出蛋白載體蛋白質(zhì)、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出蛋白、生物素連接酶、半胱氨酸合成酶I、半胱氨酸合成酶II、依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶、不依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調(diào)節(jié)蛋白、RXN2910調(diào)節(jié)蛋白、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸外排蛋白、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA248、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA247、蛋白質(zhì)OpcA、1-磷酸果糖激酶和6-磷酸果糖激酶.
來自氨基酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)和基因的特別優(yōu)選的實(shí)例在表1和表2描述。
優(yōu)選的微生物或基因修飾微生物是細(xì)菌、藻類、真菌或酵母。
特別優(yōu)選的微生物尤其是棒狀細(xì)菌。
優(yōu)選的棒狀細(xì)菌是棒桿菌屬的細(xì)菌，特別是以下種谷氨酸棒桿菌、乙酰谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、棲糖蜜棒桿菌(Corynebaterium melassecola)和Corynebacterium efficiens的細(xì)菌，或是短桿菌屬的細(xì)菌，特別黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)和叉開短桿菌(Brevibacterium divaricatum)。
棒桿菌屬和短桿菌屬的特別優(yōu)選的細(xì)菌選自谷氨酸棒桿菌ATCC13032、乙酰谷氨酸棒桿菌ATCC15806、嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870、熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539、棲糖蜜棒桿菌ATCC17965、Corynebacterium efficiensDSM 44547、Corynebacterium efficiensDSM44548、Corynebacterium efficiensDSM 44549、黃色短桿菌ATCC14067、乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869、叉開短桿菌ATCC14020、谷氨酸棒桿菌KFCC10065和谷氨酸棒桿菌ATCC21608。
縮寫KFCC指韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，縮寫ATCC指美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，縮寫DSM指德意志微生物保藏中心。
棒桿菌屬和短桿菌屬中的其它特別優(yōu)選細(xì)菌列于表3
縮寫含義如下ATCC美國(guó)馬里蘭州洛克維爾美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心FERM日本千葉發(fā)酵研究所
NRRL美國(guó)伊利諾伊州皮若亞美國(guó)北方農(nóng)業(yè)研究所培養(yǎng)物保藏中心CECT西班牙瓦倫西亞普通微生物保藏中心NCIMB英國(guó)阿伯丁國(guó)家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏中心CBS荷蘭巴恩真菌保藏所NCTC英國(guó)倫敦國(guó)家典型培養(yǎng)物保藏中心DSMZ德國(guó)不倫瑞克德意志微生物保藏中心通過具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸和本發(fā)明的表達(dá)單元，借助以上所述本發(fā)明的方法有可能將本發(fā)明基因修飾微生物的以上所述代謝途徑調(diào)節(jié)為朝向特定的生物合成產(chǎn)物。
為此目的，例如導(dǎo)致特定生物合成產(chǎn)物的代謝途徑通過引發(fā)或提高此生物合成途徑的基因轉(zhuǎn)錄率或表達(dá)率而增強(qiáng)，所述生物合成途徑中蛋白質(zhì)提高的量導(dǎo)致所需的生物合成途徑的這些蛋白質(zhì)提高的總活性，因此導(dǎo)致朝向所需生物合成產(chǎn)物的增強(qiáng)的代謝流量。
此外，自特定生物合成產(chǎn)物分流的代謝途徑可通過降低這種分流性生物合成途徑的基因轉(zhuǎn)錄率減弱，該分流性生物合成途徑中蛋白質(zhì)降低的量導(dǎo)致不想要的生物合成途徑中這些蛋白質(zhì)降低的總活性，因此額外導(dǎo)致朝向所需生物合成產(chǎn)物的增強(qiáng)的代謝流量。
本發(fā)明的基因修飾微生物能夠產(chǎn)生例如來自葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素或來自甘油和乙醇的生物合成產(chǎn)物。
本發(fā)明因此涉及用于通過培養(yǎng)本發(fā)明的基因修飾微生物產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物的方法。
取決于所需的生物合成產(chǎn)物，必須提高或降低多種基因的轉(zhuǎn)錄率或表達(dá)率。通常，改變多種基因的轉(zhuǎn)錄率或表達(dá)率是有利的，即提高基因組合的轉(zhuǎn)錄率或表達(dá)率和/或降低基因組合的轉(zhuǎn)錄率或表達(dá)率是有利的。
在本發(fā)明的基因修飾微生物中，基因的至少一個(gè)改變即提高或降低的轉(zhuǎn)錄率或表達(dá)率可歸因于具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸或本發(fā)明的表達(dá)單元。
此外，基因修飾微生物中其它基因額外改變的即額外提高或額外降低的轉(zhuǎn)錄率或表達(dá)率可以但不是必需來自具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸或本發(fā)明的表達(dá)單元。
本發(fā)明因此還涉及用于通過培養(yǎng)本發(fā)明的基因修飾微生物產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物的方法。
優(yōu)選的生物合成產(chǎn)物是精細(xì)化學(xué)品。
術(shù)語(yǔ)“精細(xì)化學(xué)品”為本領(lǐng)域所認(rèn)知，其包括已用于多種工業(yè)的由生物體產(chǎn)生的分子，其中所述工業(yè)例如但不限于藥學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)工業(yè)和化妝品工業(yè)。此類化合物包括有機(jī)酸如酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸、蛋白原的和非蛋白原的氨基酸、嘌呤和嘧啶堿基、核苷和核苷酸(如在Rehm等人編輯的生物技術(shù)(Biotechnology)第6卷中Kuninaka，A.(1996)核苷酸和相關(guān)化合物(Nucleotides and related compounds)，561-612頁(yè)，VCHWeinheim及其中所含參考文獻(xiàn)中所述)、脂類、飽和和不飽和脂肪酸(如花生四烯酸)、二醇(如丙二醇和丁二醇)、碳水化合物(如透明質(zhì)酸和海藻糖)、芳香化合物(如芳香胺、香草醛和靛藍(lán))、維生素和輔因子(如在Ullmann工業(yè)化學(xué)百科全書(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)，A27卷，“維生素”(“Vitamins”)，443-613頁(yè)(1996)VCHWeinheim及其中的參考文獻(xiàn)；以及Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)UNESCO/馬來西亞科學(xué)和技術(shù)協(xié)會(huì)和亞州自由基研究協(xié)會(huì)聯(lián)盟舉辦的“營(yíng)養(yǎng)、脂類、健康和疾病”論文集(“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings ofthe UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associationsin Malaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia)，1994年9月1-3日在馬來西亞檳榔嶼舉行，AOCS Press，(1995))、酶以及在Gutcho(1983)通過發(fā)酵的化學(xué)品(Chemicals by Fermentation)，Noyes DataCorporation，ISBN0818805086和其中的參考文獻(xiàn)中所述的所有其它化學(xué)品。這些精細(xì)化學(xué)品中的某些化學(xué)品的代謝和用途進(jìn)一步闡述如下。
I.氨基酸代謝及用途氨基酸包含所有蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元，并且為所有生物體的正常細(xì)胞功能所必需。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”為本領(lǐng)域所認(rèn)知。蛋白原的氨基酸有20種，為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，在蛋白質(zhì)中它們通過肽鍵連接，非蛋白原的氨基酸(已知成百種非蛋白原的氨基酸)在蛋白質(zhì)中通常不存在(參見Ulmann工業(yè)化學(xué)百科全書(Ulmann工業(yè)化學(xué)百科全書(Ulmann’s Encyclopediaof Industrial Chemistry))，A2卷，57-97頁(yè)，VCHWeinheim(1985))。氨基酸可為D-或L-構(gòu)型，盡管在天然存在的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的唯一類型通常為L(zhǎng)-氨基酸。已充分說明了20種蛋白原氨基酸中每一種在原核和真核細(xì)胞中的生物合成和降解途徑(參見例如，Stryer，L.生物化學(xué)(Biochemistry)，第三版，578-590頁(yè)(1988))。“必需”氨基酸(組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸)，這樣稱呼是因?yàn)橛捎谒鼈兩锖铣傻膹?fù)雜性，必須從食物中攝取它們，它們被簡(jiǎn)單的生物合成途徑轉(zhuǎn)化為其余11種“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸)。高等動(dòng)物能夠合成這些氨基酸中的一部分氨基酸，但必需氨基酸必須從食物中攝取，以進(jìn)行正常的蛋白質(zhì)合成。
除了它們?cè)诘鞍踪|(zhì)生物合成中的功能外，這些氨基酸本身還是令人感興趣的化學(xué)品，并且許多已發(fā)現(xiàn)在食品、動(dòng)物飼料、化學(xué)品、化妝品、農(nóng)業(yè)和藥學(xué)工業(yè)中具有多種應(yīng)用。賴氨酸不僅對(duì)人的營(yíng)養(yǎng)而且對(duì)單胃動(dòng)物如禽和豬都是一種重要的氨基酸。谷氨酸鹽是最常用的調(diào)味添加劑(谷氨酸單鈉鹽，MSG)，并且廣泛用于食品工業(yè)，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸也是如此。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸均用于藥學(xué)工業(yè)。谷氨酰胺、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、絲氨酸和丙氨酸用于藥學(xué)工業(yè)和化妝品工業(yè)。蘇氨酸、色氨酸和D/L-甲硫氨酸是廣泛使用的動(dòng)物飼料添加劑。(Rehm等人(編輯)，生物技術(shù)(Biotechnology)，第6卷，第14a章中的Leuchtenberger，W.(1996)Amino aids-technicalproduction and use，466-502頁(yè)，VCHWeinheim)。還發(fā)現(xiàn)這些氨基酸可用作前體，用于合成合成的氨基酸和蛋白質(zhì)，如N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羥色氨以及在其他Ulmann工業(yè)化學(xué)百科全書(Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)，A2卷，57-97頁(yè)，VCHWeinheim，1985中所述的物質(zhì)。
在可產(chǎn)生它們的生物體如細(xì)菌中已充分描述了這些天然氨基酸的生物合成(細(xì)菌氨基酸生物合成及其調(diào)節(jié)的綜述，見Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47533-606)。谷氨酸通過還原胺化α-酮戊二酸(檸檬酸循環(huán)中的中間體)而合成。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸接下來由谷氨酸產(chǎn)生。絲氨酸的生物合成為三步，由3-磷酸甘油(糖酵解中間體)開始，在氧化、氨基轉(zhuǎn)移和水解步驟后產(chǎn)生該氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸兩者均產(chǎn)生自絲氨酸；在絲氨酸轉(zhuǎn)羥甲基酶催化的反應(yīng)中前者通過高半胱氨酸與絲氨酸縮合，后者通過側(cè)鏈β-碳原子轉(zhuǎn)移至四氫葉酸。苯丙氨酸和酪氨酸在9步的生物合成途徑中合成自糖分解和磷酸戊糖途徑的前體赤蘚糖4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸，它們的不同僅在預(yù)苯酸合成后的最后兩步。色氨酸也從這兩種起始分子產(chǎn)生，但其合成為11步的途徑。酪氨酸也可在苯丙氨酸羥化酶催化的反應(yīng)中由苯丙氨酸合成。丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸均為丙酮酸鹽(糖酵解的終產(chǎn)物)的生物合成產(chǎn)物。天冬氨酸形成自草酰乙酸(檸檬酸循環(huán)的中間體)。天冬酰胺、甲硫氨酸、蘇氨酸和賴氨酸均通過轉(zhuǎn)化天冬氨酸而形成。異亮氨酸從蘇氨酸形成。組氨酸在一個(gè)復(fù)雜的9步途徑中從一種活化糖--5-磷酸核糖-1-焦磷酸形成。
為細(xì)胞蛋白質(zhì)合成所需的過量氨基酸不能被貯藏，并被降解以提供用于細(xì)胞主要代謝途徑的中間體(綜述參見Stryer，L.生物化學(xué)(Biochemistry)第三版，21章，“氨基酸降解和尿素循環(huán)”495-516頁(yè)(1988))。雖然細(xì)胞可將不想要的氨基酸轉(zhuǎn)化為有用的代謝中間體，從所需用于合成氨基酸的能量、前體分子和酶來說，氫基酸的產(chǎn)生是昂貴的。因此對(duì)于氨基酸的生物合成受到反饋抑制調(diào)節(jié)并不讓人吃驚，其中特定氨基酸的存在起到減緩或完全終止其自身產(chǎn)生的作用(關(guān)于氨基酸生物合成途徑中的反饋機(jī)制的綜述參見Stryer，L.生物化學(xué)(Biochemistry)第三版，24章”氨基酸和血紅素的生物合成”575-600頁(yè)(1988))。因此，任一特定氨基酸的輸出受到細(xì)胞中存在的該氨基酸量的限制。
II.維生素、輔因子和營(yíng)養(yǎng)成分的代謝和用途維生素、輔因子和營(yíng)養(yǎng)成分包含高等動(dòng)物不能合成且必須攝取的另一類分子，雖然它們易于被其它生物體如細(xì)菌合成。這些分子自身為生物活性物質(zhì)或?yàn)樵诙喾N代謝途徑中作為電子載體或中間體的生物活性物質(zhì)的前體。除了它們的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，這些化合物作為著色劑、抗氧化劑和催化劑或其它操作輔助劑也具有重要的工業(yè)價(jià)值(這些化合物的結(jié)構(gòu)、活性和工業(yè)應(yīng)用的概述參見例如，Ullman工業(yè)化學(xué)百科全書(Ullman’s Encyclopediaof Industrial Chemistry)，“維生素”A27卷，443-613頁(yè)，VCHWeinheim，1996)。術(shù)語(yǔ)”維生素”為本領(lǐng)域認(rèn)知，包括生物體行使正常功能所需的營(yíng)養(yǎng)素，且該生物體自身不能合成它們。維生素組和包含輔因子和營(yíng)養(yǎng)性化合物。術(shù)語(yǔ)“輔因子”包括進(jìn)行正常酶促活性所需的非蛋白原化合物。此類化合物可為有機(jī)的或無(wú)機(jī)的，本發(fā)明的輔因子優(yōu)選有機(jī)的。術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)成分”包括促進(jìn)植物和動(dòng)物尤其是人的健康食物添加劑。此類分子的實(shí)例為維生素、抗氧化劑和某些脂類(如多不飽和脂肪酸)。
已大量描述了這些分子在可產(chǎn)生它們的生物體如細(xì)菌中的生物合成(Ullman工業(yè)化學(xué)百科全書(Ullman’s Encyclopedia of IndustrialChemistry)，“維生素”A27卷，443-613頁(yè)，VCHWeinheim，1996；Michal，G.(1999)生物化學(xué)途徑生物化學(xué)和分子生物學(xué)圖集(BiochemicalPathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology)，John Wiley&Sons；Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)UNESCO/馬來西亞科學(xué)和技術(shù)協(xié)會(huì)和亞州自由基研究協(xié)會(huì)聯(lián)盟舉辦的“營(yíng)養(yǎng)、脂類、健康和疾病”論文集(“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings of theUNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations inMalaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia)，1994年9月1-3日在馬來西亞檳榔嶼舉行，AOCS PressChampaign，IL X，374 S)。
硫胺素(維生素B1)由嘧啶和噻唑部分通過化學(xué)偶聯(lián)產(chǎn)生。核黃素(維生素B2)由鳥苷-5’-三磷酸(GTP)和核糖-5’-磷酸合成。核黃素接下來用于合成黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。合起來稱為‘維生素B6’的化合物類(例如，吡哆素、吡哆胺、5’-磷酸吡哆醛和商業(yè)上使用的維生素B6鹽酸鹽)均為共同結(jié)構(gòu)單元5-羥基-6-甲基吡啶的衍生物。泛酸鹽(泛酸(R)-(+)-N-(2，4-二羥基-3，3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)可通過化學(xué)合成或發(fā)酵產(chǎn)生。泛酸生物合成的最后步驟由ATP-驅(qū)動(dòng)的β-丙氨酸和泛解酸的縮合組成。負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化為泛解酸、β-丙氨酸和泛酸縮合生物合成步驟的酶是已知的。泛酸鹽的代謝活性形式為輔酶A，其生物合成由5步酶促步驟進(jìn)行。泛酸鹽、5’-磷酸吡哆醛、半胱氨酸和ATP為輔酶A的前體。這些酶不僅催化泛酸鹽的形成，而且催化(R)-泛解酸、(R)-pantolacton、(R)-泛醇(維生素B5原)、泛酰巰基乙胺(及其衍生物)和輔酶A的產(chǎn)生。
已詳細(xì)研究了微生物中生物素從前體分子庚二酰輔酶A的生物合成，并鑒定了幾種所涉及的基因。發(fā)現(xiàn)許多相應(yīng)的蛋白質(zhì)也參與Fe-簇合成，屬于nifS蛋白質(zhì)類。硫辛酸衍生自辛酸，并在能量代謝中作為輔酶，此時(shí)其成為丙酮酸脫氫酶復(fù)合體和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的一部分。葉酸鹽為一組這樣的物質(zhì)，其均為葉酸衍生物，來自于L-谷氨酸、對(duì)氨基苯甲酸和6-甲基蝶呤。已詳細(xì)研究了某些微生物中始于生物轉(zhuǎn)化代謝中間體鳥苷-5’-三磷酸(GTP)、L-谷氨酸和對(duì)氨基苯甲酸的葉酸及其衍生物的生物合成。
類可啉(如鈷胺素且尤其是維生素B12)和卟啉屬于一組四吡咯環(huán)體系的化學(xué)品。維生素B12的生物合成太復(fù)雜，目前尚未徹底解釋清楚，但許多涉及的酶和物質(zhì)已知。煙酸(煙酸鹽)和煙酰胺為吡啶衍生物，也稱為‘煙酸’。煙酸為重要的輔酶NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和它們的還原形式的前體。
這些化合物的大規(guī)模產(chǎn)生很大程度上依賴于無(wú)細(xì)胞的化學(xué)合成，雖然這些化學(xué)品中的一些如核黃素、維生素B6、泛酸鹽和生物素也已通過微生物的大規(guī)模培養(yǎng)物產(chǎn)生。只有維生素B12是僅通過發(fā)酵產(chǎn)生的，因?yàn)槠浜铣傻膹?fù)雜性。體外方法需要耗費(fèi)材料和時(shí)間，通常以高的代價(jià)耗費(fèi)。
III.嘌呤、嘧啶、核苷和核苷酸的代謝和用途嘌呤和嘧啶代謝基因及它們相應(yīng)的蛋白質(zhì)為治療腫瘤和病毒感染的重要靶標(biāo)。術(shù)語(yǔ)“嘌呤”或“嘧啶”包括構(gòu)成核酸、輔酶和核苷酸的含氮堿基。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”包括核酸分子的基本結(jié)構(gòu)單元，其由含氮堿基、戊糖(對(duì)RNA而言，該糖為核糖，對(duì)DNA而言，該糖為D-脫氧核糖)和磷酸組成。術(shù)語(yǔ)“核苷”包括作為核苷酸前體的分子，但其不含核苷酸所具有的磷酸單元。通過抑制這些分子的生物合成，或抑制它們形成核酸分子的代謝，可抑制RNA和DNA合成；通過以靶向癌細(xì)胞的方式抑制這種活性，可抑制腫瘤細(xì)胞分裂和復(fù)制的能力。
此外，有不形成核酸分子但作為能量貯存體(即AMP)或作為輔酶(即FAD和NAD)的核苷酸。
一些出版物已描述了這些化學(xué)品通過影響嘌呤和/或嘧啶代謝對(duì)這些醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥的用途(例如Christopherson，R.I.和Lyons，S.D.(1990)“作為化學(xué)治療劑的嘧啶和嘌呤從頭生物合成的強(qiáng)力抑制劑”醫(yī)學(xué)研究述評(píng)(Med.Res.Reviews)10505-548)。對(duì)參與嘌呤和嘧啶代謝的酶的研究集中在研發(fā)可用作如免疫抑制劑或抗增生劑的新藥上(Smith，J.L，(1995)“核苷酸合成中的酶”結(jié)構(gòu)生物學(xué)最新觀點(diǎn)(Curr.Opin.Struct.Biol.)5752-757；(1995)Biochem Soc.Transact.23877-902)。但是，嘌呤和嘧啶堿基、核苷和核苷酸具有其它應(yīng)用用作一些精細(xì)化學(xué)品(例如，硫胺素、S-腺苷-甲硫氨酸、葉酸鹽或核黃素)生物合成的中間體，作為細(xì)胞的能量載體(例如，ATP或GTP)，和本身作為化學(xué)品，通常作為增味劑(例如，IMP或GMP)或用于一些醫(yī)藥用途(參見例如，Kuninaka，A.(1996)生物技術(shù)中的核苷酸和相關(guān)化合物(Nucleotides and Related Compounds inBiotechnology)第6卷，Rehm等人編輯.VCHWeinheim，561-612頁(yè))。同樣，參與嘌呤、嘧啶、核苷或核苷酸代謝的酶越來越多地用作靶，研發(fā)用于作物保護(hù)的抗這些酶的化學(xué)品包括殺真菌劑、除草劑和殺蟲劑。
已闡釋了這些化合物在細(xì)菌中的代謝(綜述參見例如，核酸研究和分子生物學(xué)進(jìn)展(Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology)，第42卷，Academic Press中的Zalkin，H.和Dixon，J.E.(1992)“嘌呤核苷酸的從頭生物合成”，259-287頁(yè)；和生物化學(xué)途徑生物化學(xué)和分子生物學(xué)圖集(Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and MolecularBiology)，Wiley紐約一書中的Miehal，G.(1999)“核苷酸和核苷”，第8章)。嘌呤代謝已是深入研究的主題，其對(duì)細(xì)胞的正常功能是必需的。高等動(dòng)物中受損的嘌呤代謝可引起嚴(yán)重疾病，如痛風(fēng)。嘌呤核苷酸從核糖-5-磷酸開始，經(jīng)過一系列步驟，通過中間體化合物次黃苷-5’-磷酸(IMP)，產(chǎn)生鳥苷-5’-單磷酸(GMP)或腺苷-5’-單磷酸(AMP)，由此易于形成用作核苷酸的三磷酸形式。這些化合物也用作能量貯存體，這樣它們的降解可提供細(xì)胞內(nèi)用于許多不同生物化學(xué)過程的能量。嘧啶的生物合成由核糖-5-磷酸形成尿苷-5’-單磷酸(UMP)而進(jìn)行。UMP接下來轉(zhuǎn)化為胞苷-5’-三磷酸(CTP)。所有這些核苷酸的脫氧形式通過一步還原步驟從核苷酸的二磷酸核糖形式產(chǎn)生為核苷酸的二磷酸脫氧核糖形式。通過磷酸化后，這些分子可參與DNA合成。
IV.海藻糖的代謝及用途海藻糖由兩個(gè)葡萄糖分子通過α，α-1，1連接組成。它通常作為甜味劑用于食品工業(yè)，為干的或冷凍食品和飲料中的添加劑。但它也用于藥學(xué)、化妝品和生物技術(shù)工業(yè)(參見例如，Nishimoto等人(1998)美國(guó)專利號(hào)5,759,610；Singer，M.A.和Lindquist，S.生物技術(shù)趨勢(shì)(Trends Biotech.)16(1998)460-467；Paiva，C.L.A.和Panek，A.D.Biotech.Ann.Rev.2(1996)293-314；和Shiosaka，M.J.Japan 172(1997)97-102)。海藻糖通過酶從許多微生物產(chǎn)生，并天然釋放入環(huán)境介質(zhì)中，從中可用本領(lǐng)域公知的方法收集海藻糖。
特別優(yōu)選的生物合成產(chǎn)物選自有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、核苷酸和核苷、蛋白原性和非蛋白原性氨基酸、脂類和脂肪酸、二醇、糖類、芳香化合物、維生素和輔因子、酶和蛋白質(zhì)。
優(yōu)選的有機(jī)酸是酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸。
優(yōu)選的核苷和核苷酸例如在Rehm等編輯的Biotechnology，第6卷，VCHWeinheim第561-612頁(yè)Kuninaka，A.(1996)Nucleotides and relatedcompounds及其中出現(xiàn)的參考文獻(xiàn)內(nèi)描述。
此外，優(yōu)選的生物合成產(chǎn)物額外地是脂類、飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸例如花生四烯酸、二醇例如丙二醇和丁二醇、糖類例如透明質(zhì)酸和海藻糖、芳香化合物例如芳香胺、香草醛和靛藍(lán)、維生素和輔因子((如在Ullmann工業(yè)化學(xué)百科全書(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)，A27卷，“維生素”(“Vitamins”)，443-613頁(yè)(1996)VCHWeinheim及其中的參考文獻(xiàn)；以及Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)UNESCO/馬來西亞科學(xué)和技術(shù)協(xié)會(huì)和亞州自由基研究協(xié)會(huì)聯(lián)盟舉辦的“營(yíng)養(yǎng)、脂類、健康和疾病”論文集(“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings ofthe UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associationsin Malaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia)，1994年9月1-3日在馬來西亞檳榔嶼舉行，AOCS Press，(1995))、酶、聚酮化合物(Cane等，(1998)Sicence 28263-68)以及在Gutcho(1983)通過發(fā)酵的化學(xué)品(Chemicals by Fermentation)，Noyes Data Corporation，ISBN0818805086和其中的參考文獻(xiàn)中所述的所有其它化學(xué)品。
特別優(yōu)選的生物合成產(chǎn)物是氨基酸，特別優(yōu)選地是必需氨基酸，特別是L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-組氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸和L-蘇氨酸、L-高絲氨酸、尤其L-賴氨酸、L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸。氨基酸，例如賴氨酸、甲硫氨酸和蘇氨酸，此后在任何情況下意指氨基酸的L形式和D形式，優(yōu)選地是L形式，即例如L-賴氨酸、L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸。
本發(fā)明特別涉及用于通過培養(yǎng)基因修飾微生物產(chǎn)生賴氨酸的方法，其中所述基因修飾微生物具有至少一個(gè)基因的與野生型比較提高或引發(fā)的表達(dá)率，其中ch)提高與野生型比較微生物中本發(fā)明至少一個(gè)內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，其中所述內(nèi)源性表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的表達(dá)，或dh)通過本發(fā)明的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案ch)的具有提高的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
并且基因選自如下核酸編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫羧酶的核酸、編碼二氫吡啶二羧酸合成酶的核酸、編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LuxR的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR1的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR2的核酸、編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)酮酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)醛酶的核酸、編碼賴氨酸輸出蛋白的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼精氨酰-tRNA合成酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、編碼蛋白質(zhì)OpcA的核酸、編碼1-磷酸果糖激酶的核酸和編碼6-磷酸果糖激酶的核酸。
如以上對(duì)方法所述，通過本發(fā)明的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案ch)的具有提高的特異表達(dá)活性的本發(fā)明表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中這些基因的表達(dá)由如下方式實(shí)現(xiàn)dh1)將一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)在導(dǎo)入的本發(fā)明表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，或dh2)將一個(gè)或多個(gè)這些基因?qū)胛⑸锘蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的表達(dá)在本發(fā)明的內(nèi)源性表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述內(nèi)源性表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，或dh3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的表達(dá)單元，其根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待表達(dá)的核酸。
以上所述用于制備賴氨酸的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包含基因修飾微生物，其額外地具有至少一個(gè)選自如下活性的與野生型比較提高的活性天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫羧酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、磷酸丙糖異構(gòu)酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LuxR的活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR1的活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR2的活性、蘋果酸-醌氧化還原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶活性、轉(zhuǎn)酮酶活性、轉(zhuǎn)醛酶活性、賴氨酸輸出蛋白活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、蛋白質(zhì)OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性和生物素連接酶活性。
以上所述用于制備賴氨酸方法的又一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案包含基因修飾微生物，其額外地具有至少一個(gè)選自如下活性的與野生型比較降低的活性蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高絲氨酸激酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、蘇氨酸輸出蛋白活性、蘇氨酸外排蛋白活性、天冬酰胺酶活性，天冬氨酸脫羧酶活性和蘇氨酸合成酶活性。
至少一個(gè)以上所述活性中的那些額外提高或額外降低的活性可以，但不必須由具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸和/或本發(fā)明的表達(dá)單元引發(fā)。
本發(fā)明還涉及用于通過培養(yǎng)基因修飾微生物產(chǎn)生甲硫氨酸的方法，其中所述基因修飾微生物具有至少一個(gè)基因的與野生型比較提高或引發(fā)的表達(dá)率，其中ch)提高與野生型比較微生物中本發(fā)明至少一個(gè)內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，其中所述內(nèi)源性表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的表達(dá)，或dh)通過本發(fā)明的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案ch)的具有提高的特異表達(dá)活性的本發(fā)明表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
并且其中基因選自如下核酸編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼高絲氨酸脫氫酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的核酸、編碼高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼胱硫醚γ-合成酶的核酸、編碼胱硫醚β-裂合酶的核酸、編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶的核酸、編碼亞甲基四氫葉酸還原酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸磷酸酶的核酸、編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼半胱氨酸合成酶I活性的核酸、編碼半胱氨酸合成酶II活性的核酸、編碼依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶活性的核酸、編碼不依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶活性的核酸、編碼硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶活性的核酸、編碼磷酸腺苷磷酰硫酸還原酶活性的核酸、編碼鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶活性的核酸、編碼鐵氧還蛋白NADPH還原酶活性的核酸、編碼鐵氧還蛋白活性的核酸、編碼硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA077的核酸、編碼硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA248的核酸、編碼硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA247的核酸、編碼RXA0655調(diào)節(jié)蛋白的核酸和編碼RXN2910調(diào)節(jié)蛋白的核酸。
如以上對(duì)方法所述，由本發(fā)明的表達(dá)單元或由根據(jù)實(shí)施方案ch)的具有提高的特異表達(dá)活性的本發(fā)明表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中這些基因的表達(dá)由如下方式實(shí)現(xiàn)dh1)將一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，以至一個(gè)或多個(gè)這些內(nèi)源性基因的表達(dá)在導(dǎo)入的本發(fā)明表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，或dh2)將一個(gè)或多個(gè)這些基因?qū)胛⑸锘蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的表達(dá)在本發(fā)明內(nèi)源性表達(dá)單元的控制下進(jìn)行，所述內(nèi)源性表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，或dh3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的表達(dá)單元，其根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待表達(dá)的核酸。
以上所述用于制備甲硫氨酸方法的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包含基因修飾微生物，其額外地具有至少一個(gè)選自如下活性的與野生型比較提高的活性天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、磷酸丙糖異構(gòu)酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、胱硫醚γ-合成酶活性、胱硫醚β-裂合酶活性、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性、亞甲基四氫葉酸還原酶活性、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸絲氨酸磷酸酶活性、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、半胱氨酸合成酶I活性、半胱氨酸合成酶II活性、依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、不依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶活性、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶活性、鐵氧還蛋白NADPH還原酶活性、鐵氧還蛋白活性、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA077的活性、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA248的活性、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA247的活性、RXA655調(diào)節(jié)蛋白的活性和RXN2910調(diào)節(jié)蛋白的活性。
以上所述用于制備甲硫氨酸方法的又一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案包含基因修飾微生物，其額外地具有至少一個(gè)選自如下活性的與野生型比較降低的活性高絲氨酸激酶活性、蘇氨酸脫水酶活性、蘇氨酸合成酶活性、內(nèi)消旋二氨基庚二酸D-脫氫酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性和二氨基吡啶羧酸(diaminopicolinate)脫羧酶活性。
至少一個(gè)以上所述活性中的那些額外提高或額外降低的活性可以，但不必要由具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸和/或本發(fā)明的表達(dá)單元引發(fā)。
本發(fā)明還涉及通過培養(yǎng)基因修飾微生物產(chǎn)生蘇氨酸的方法，其中所述基因修飾微生物具有至少一個(gè)基因的與野生型比較提高或引發(fā)的表達(dá)率，其中ch)提高與野生型比較微生物中本發(fā)明至少一個(gè)內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，其中所述內(nèi)源性表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的表達(dá)，或dh)通過本發(fā)明的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案ch)的具有提高的特異表達(dá)活性的本發(fā)明表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
并且基因選自如下核酸編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼的核酸丙酮酸羧化酶、編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的核酸、編碼高絲氨酸激酶的核酸、編碼蘇氨酸合成酶的核酸、編碼蘇氨酸輸出蛋白載體蛋白的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)醛酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)酮酶的核酸、編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的核酸、編碼賴氨酸輸出蛋白的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼蘇氨酸外排蛋白的核酸、編碼果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、編碼OpcA蛋白的核酸、編碼1-磷酸果糖激酶的核酸、編碼6-磷酸果糖激酶的核酸和編碼高絲氨酸脫氫酶的核酸。
如以上對(duì)方法所述，由本發(fā)明的表達(dá)單元或由根據(jù)實(shí)施方案ch)的具有提高的特異表達(dá)活性的本發(fā)明表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中這些基因的表達(dá)由如下方式實(shí)現(xiàn)dh1)將一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，以至一個(gè)或多個(gè)這些內(nèi)源性基因的表達(dá)在導(dǎo)入的本發(fā)明表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，或dh2)將一個(gè)或多個(gè)這些基因?qū)胛⑸锘蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄在本發(fā)明內(nèi)源性表達(dá)單元的控制下進(jìn)行，所述內(nèi)源性表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，或dh3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的表達(dá)單元，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，和功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待表達(dá)核酸。
以上所述用于制備蘇氨酸方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包含基因修飾微生物，其額外地具有至少一個(gè)選自如下活性的與野生型比較提高的活性天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、磷酸丙糖異構(gòu)酶活性、蘇氨酸合成酶活性、蘇氨酸輸出蛋白載體蛋白的活性、轉(zhuǎn)醛酶活性、轉(zhuǎn)酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、蘋果酸-醌氧化還原酶活性、高絲氨酸激酶活性、生物素連接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、蘇氨酸外排蛋白活性、蛋白質(zhì)OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶活性和高絲氨酸脫氫酶活性.
以上所述用于制備蘇氨酸的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包含基因修飾微生物，其額外地具有至少一個(gè)選自如下活性的與野生型比較降低的活性蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性、內(nèi)消旋二氨基庚二酸D-脫氫酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、天冬酰胺酶活性，天冬氨酸脫羧酶活性、賴氨酸輸出蛋白活性、乙酰乳酸合酶活性、乙醇酮酸還原異構(gòu)酶活性、支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶活性、依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、不依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、二羥酸脫水酶活性和二氨基吡啶羧酸脫羧酶活性。
至少一個(gè)以上所述活性中的那些額外提高或額外降低的活性可以，但不必須由具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明核酸和/或本發(fā)明的表達(dá)單元引發(fā)。
在酶的情形時(shí)，術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)的“活性”意指相應(yīng)蛋白質(zhì)的酶活性，并且對(duì)于其它蛋白質(zhì)的情況例如結(jié)構(gòu)蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白意指該蛋白質(zhì)的生理活性。
酶通常能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)換為產(chǎn)物或催化此轉(zhuǎn)換步驟。
因此，酶“活性”意指特定時(shí)間內(nèi)由酶轉(zhuǎn)所換的底物量或由酶所形成的產(chǎn)物量。
因此，當(dāng)活性與野生型比較提高時(shí)，特定時(shí)間內(nèi)由酶轉(zhuǎn)所換的底物量或由酶所形成的產(chǎn)物量與野生型比較提高。
對(duì)于此前和此后所描述的所有活性，“活性”的這種提高優(yōu)選地升高“野生型活性”的至少5％、還優(yōu)選地至少20％、還優(yōu)選地至少50％、還優(yōu)選地至少100％、更優(yōu)選地至少300％、甚至更優(yōu)選地至少500％、尤其至少600％。
因此，當(dāng)活性與野生型比較降低時(shí)，特定時(shí)間內(nèi)由酶轉(zhuǎn)所換的底物量或由酶所形成的產(chǎn)物量與野生型比較降低。
降低的活性優(yōu)選地意指基于多種細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制的微生物中該酶功能的部分或基本完全抑制或阻斷。
活性的降低包含酶的定量性減少直至基本完全沒有酶(即缺乏可檢測(cè)的相應(yīng)活性或缺乏可免疫學(xué)檢測(cè)的酶)。微生物中的活性與野生型比較優(yōu)選地降低至少5％、還優(yōu)選地至少20％、還優(yōu)選地至少50％、還優(yōu)選地100％?！敖档汀边€特別意指完全沒有相應(yīng)的活性。
基因修飾微生物中和野生型中特定酶的活性，以及因此酶活性的提高或降低可以通過已知方法測(cè)量，如酶測(cè)定法。
例如，丙酮酸羧化酶意指表現(xiàn)轉(zhuǎn)換丙酮酸為草酰乙酸的酶活性的蛋白質(zhì)。
因此，丙酮酸羧化酶活性意指特定時(shí)間內(nèi)由丙酮酸羧化酶蛋白質(zhì)所轉(zhuǎn)換的丙酮酸量或所形成的草酰乙酸量。
因此，當(dāng)丙酮酸羧化酶活性與野生型比較提高時(shí)，特定時(shí)間內(nèi)由丙酮酸羧化酶蛋白質(zhì)所轉(zhuǎn)換的丙酮酸量或所形成的草酰乙酸量與野生型比較提高。
這種“丙酮酸羧化酶活性”提高優(yōu)選地提高了“野生型丙酮酸羧化酶活性”的至少5％、還優(yōu)選地至少20％、還優(yōu)選地至少50％、還優(yōu)選地至少100％、更優(yōu)選地至少300％、甚至更優(yōu)選地至少500％、尤其至少600％。
此外，例如磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性意指磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的酶活性。
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶意指表現(xiàn)轉(zhuǎn)化草酰乙酸為烯醇磷酸丙酮酸的酶活性的蛋白質(zhì)。
因此，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性意指特定時(shí)間內(nèi)由磷酸烯醇丙酮酸羧激酶蛋白質(zhì)所轉(zhuǎn)換的草酰乙酸量或所形成的烯醇磷酸丙酮酸量。
當(dāng)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性與野生型比較降低時(shí)，因此特定時(shí)間內(nèi)由磷酸烯醇丙酮酸羧激酶蛋白質(zhì)所轉(zhuǎn)換的草酰乙酸量或所形成的烯醇磷酸丙酮酸量與野生型比較降低。
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性的降低包含磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的定量性減少直至基本上完全沒有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(即缺乏可檢測(cè)的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性的性或缺乏可免疫學(xué)檢測(cè)的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性與野生型比較優(yōu)選地降低至少5％、還優(yōu)選地至少20％、還優(yōu)選地至少50％、還優(yōu)選地100％。特別地，“降低”還意指完全沒有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
活性的額外提高可以以多種方式進(jìn)行，例如通過在表達(dá)水平和蛋白質(zhì)水平關(guān)閉抑制性調(diào)節(jié)機(jī)制，或通過與野生型比較提高編碼以上所述蛋白質(zhì)的核酸的基因表達(dá)。
與野生型比較提高編碼以上所述蛋白質(zhì)的核酸的基因表達(dá)可以類似地以多種方式進(jìn)行，例如通過激活劑誘導(dǎo)基因，或如上所述通過提高啟動(dòng)子活性或提高表達(dá)活性，或通過將一個(gè)或多個(gè)基因拷貝導(dǎo)入微生物。
提高編碼蛋白質(zhì)的核酸的基因表達(dá)也意指根據(jù)本發(fā)明操縱微生物固有的內(nèi)源性蛋白質(zhì)的表達(dá)。
如上所述，這可以例如通過改變基因的啟動(dòng)子序列和/或表達(dá)單元序列實(shí)現(xiàn)。這種導(dǎo)致基因表達(dá)率提高的改變可以例如通過缺失或插入DNA序列進(jìn)行。
如以上所述，還可能通過施加外源性刺激改變內(nèi)源性蛋白質(zhì)的表達(dá)。這可以通過特定的生理?xiàng)l件即通過施加外來物質(zhì)進(jìn)行。
技術(shù)人員可單獨(dú)或組合地借助其它不同方法以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的提高。因此例如，可以提高適宜基因的拷貝數(shù)，或可以突變?cè)诮Y(jié)構(gòu)基因上游的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)區(qū)域或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)。還有可能通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子提高發(fā)酵期間的表達(dá)。延長(zhǎng)mRNA壽命的方法同樣地改進(jìn)了表達(dá)。類似地還通過阻止酶蛋白質(zhì)的降解增強(qiáng)酶活性?；蚧蚧驑?gòu)建體可以以變動(dòng)的拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中或在染色體中整合并擴(kuò)增。作為備選，還有可能通過改變培養(yǎng)基組成和控制培養(yǎng)而實(shí)現(xiàn)相關(guān)基因的過量表達(dá)。
技術(shù)人員尤其可以在Martin等(Biotechnology 5，137-146(1987))、Guerrero等(Gene 138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1988))、Eikmanns等(Gene 102，93-98(1991))、歐洲專利0472869、美國(guó)專利4,601,893、Schwarzer和Pühler(Biotechnology 9，84-87(1991)、Reinscheid等(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60，126-132(1994)、LaBarre等(Journal of Bacteriology 175，1001-1007(1993))。專利申請(qǐng)WO96/15246、Malumbres等(Gene 134，15-24(1993))、日本公開的說明書JP-A-10-229891、Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58，191-195(1998))、Makrides(Microbiological Reviews 60512-538(1996)和眾所周知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書中找到有關(guān)此方面的參考。
除了表達(dá)或增強(qiáng)基因以外，消除不需要的副反應(yīng)可能額外地有利于生物合成產(chǎn)物的產(chǎn)生，特別是L-賴氨酸、L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸的產(chǎn)生(在Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編者)的Overproduction of MicrobialProducts，Academic Press，London，UK，1982中的Nakayama“Breedingof Amino Acid Producing Microorganisms”)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼如上所述蛋白質(zhì)之一的核酸的基因表達(dá)通過將編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)的至少一個(gè)核酸導(dǎo)入微生物提高。導(dǎo)入核酸可以以染色體方式進(jìn)行或以染色體外方式進(jìn)行，即通過提高染色體上的拷貝數(shù)和/或提高在宿主微生物中復(fù)制的質(zhì)粒上的基因拷貝。
例如導(dǎo)入以包含核酸的表達(dá)盒形式的核酸優(yōu)選地以染色體方式進(jìn)行，尤其通過以上所述SacB方法。
為此目的原則上有可能使用編碼一種如上所述蛋白質(zhì)的任意基因。
當(dāng)包含內(nèi)含子的基因組核酸序列來源于真核時(shí)，如果宿主微生物不能夠或不可能使之能夠表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)時(shí)，優(yōu)選地使用已經(jīng)加工的核酸序列，如相應(yīng)的cDNA。
相應(yīng)基因的實(shí)例列于表1和表2。
微生物中以上所述的活性優(yōu)選地通過至少一個(gè)如下方法降低●導(dǎo)入用于誘導(dǎo)共抑制的至少一個(gè)有義核糖核酸序列或?qū)氪_保其表達(dá)的表達(dá)盒。
●導(dǎo)入抗相應(yīng)基因、RNA或蛋白質(zhì)的至少一個(gè)DNA結(jié)合因子或蛋白質(zhì)結(jié)合因子或?qū)氪_保其表達(dá)的表達(dá)盒。
●導(dǎo)入引起RNA降解的至少一個(gè)病毒核酸序列或?qū)氪_保其表達(dá)的表達(dá)盒。
●導(dǎo)入引起基因功能喪失的至少一個(gè)構(gòu)建體，例如在基因的可讀框中生成終止密碼子或移碼，例如通過在基因中產(chǎn)生插入、缺失、倒位或突變。有可能并且優(yōu)選地經(jīng)同源重組通過定向插入至目的靶基因或?qū)脶槍?duì)靶基因的序列特異性核酸酶生成基因敲除的突變體。
●導(dǎo)入具有降低的啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子或?qū)刖哂薪档偷谋磉_(dá)活性的表達(dá)單元。
技術(shù)人員清楚本發(fā)明范圍內(nèi)還可以使用降低活性或功能的其它方法。例如導(dǎo)入蛋白質(zhì)的顯性失活變體或確保其表達(dá)的表達(dá)盒也可以是有利的。
對(duì)于這些方法中的每一單獨(dú)方法還有可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的量、mRNA的量和/或蛋白質(zhì)的活性降低。組合地使用這些方法也是可以考慮的。其它方法對(duì)技術(shù)人員為已知并且可以包括干預(yù)或抑制蛋白質(zhì)加工、蛋白質(zhì)或其mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制核糖體附著、抑制RNA剪接、誘導(dǎo)降解RNA的酶和/或抑制翻譯延長(zhǎng)或翻譯終止。
在本發(fā)明產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物的方法中，培養(yǎng)基因修飾微生物的步驟后是自微生物和/或自培養(yǎng)肉湯中分離生物合成產(chǎn)物。這些步驟可同時(shí)進(jìn)行和/或優(yōu)選地在培養(yǎng)步驟后進(jìn)行。
可以培養(yǎng)本發(fā)明的基因修飾微生物以便用分批法(分批培養(yǎng))或用補(bǔ)料分批法或重復(fù)的補(bǔ)料分批法連續(xù)或不連續(xù)地產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物，特別是L-賴氨酸、L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸。已知的培養(yǎng)方法簡(jiǎn)述可在Chmiel(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag，Stuttgart，1991))的教科書或在Storhas(Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))的教科書中找到。
待使用的培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式滿足相應(yīng)菌株的需要。在“Manual ofMethods for General Bacteriology”of the American Society forBacteriology(Washington D.C.，USA，1981)”手冊(cè)中存在用于多種微生物的培養(yǎng)基的描述。
根據(jù)本發(fā)明可使用的這些培養(yǎng)基通常包含一個(gè)或多個(gè)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素和/或痕量元素。
優(yōu)選的碳源是糖，如單糖、二糖或多糖。優(yōu)良碳源的實(shí)例是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素。糖還可以通過將復(fù)雜化合物如糖精制中的糖蜜或其它副產(chǎn)物添加至培養(yǎng)基而加入。添加多種碳源的混合物也可以是有利的。其他可能的碳源是油類和脂類例如大豆油、向日葵油、花生油和可可脂、脂肪酸例如棕櫚酸、硬脂酸或亞油酸、醇例如甘油、甲醇或乙醇，以及有機(jī)酸例如乙酸或乳酸。
氮源通常是有機(jī)氮化合物或無(wú)機(jī)氮化合物或包含這些化合物的原料。氮源的實(shí)例包含氨氣或銨鹽如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨或硝酸銨、硝酸鹽、尿素、氨基酸，或者復(fù)雜氮源如玉米漿、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏和其它。氮源可以單獨(dú)地使用或作為混合物使用。
培養(yǎng)基中可存在的無(wú)機(jī)鹽化合物包含鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅和鐵的氯化物、磷酸鹽或硫酸鹽。
為產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，尤其甲硫氨酸，有可能使用無(wú)機(jī)硫化合物例如硫酸鹽、亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、連四硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化物作為硫源，也可以使用有機(jī)硫化物如硫醇和硫醇類作為硫源。
有可能使用磷酸、磷酸二氫鉀或者磷酸氫二鉀或其相應(yīng)含鈉鹽作為磷源。
可將螯合劑添加至培養(yǎng)基以便維持溶液中的金屬離子。特別適合的螯合劑包含二羥苯酚如鄰苯二酚或原兒茶酸鹽或有機(jī)酸如檸檬酸。
根據(jù)本發(fā)明所用的發(fā)酵培養(yǎng)基通常還包含其它生長(zhǎng)因子如維生素或生長(zhǎng)促進(jìn)劑，所述其它生長(zhǎng)因子包含例如生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸和吡哆醇。生長(zhǎng)因子和鹽常常源自培養(yǎng)基的復(fù)雜成分如酵母提取物、糖蜜、玉米漿等。還可以將合適的前體添加至培養(yǎng)基?；衔镌谂囵B(yǎng)基中的確切組成很大程度上取決于特定的實(shí)驗(yàn)并且對(duì)每個(gè)特定的情形將單獨(dú)決定。優(yōu)化培養(yǎng)基的信息可從教材“Applied Microbiol.Physiology，APractical Approach”(編者P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)第53-73頁(yè)，ISBN0 19 9635773)中得到。生長(zhǎng)培養(yǎng)基還可以自供應(yīng)商處購(gòu)買，如標(biāo)準(zhǔn)1(Merck)或BHI(腦心浸液，DIFCO)等。
所有培養(yǎng)基成分通過加熱(20分鐘121℃和1.5 bar)或除菌過濾作用滅菌。各成分可以一起滅菌，或根據(jù)需要分別滅菌。所有培養(yǎng)基成分可以在培養(yǎng)開始時(shí)存在或任選地連續(xù)添加或分批添加。
培養(yǎng)基的溫度通常在15℃至45℃間，優(yōu)選地在25℃至40℃間，并且發(fā)酵期間維持恒定或改變。培養(yǎng)基的pH應(yīng)當(dāng)在5-8.5的范圍，優(yōu)選地在7.0附近，用于培養(yǎng)的pH可以在培養(yǎng)期間通過添加堿性化合物例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水或者酸性化合物例如磷酸或硫酸控制。泡沫的產(chǎn)生可通過施加消泡劑例如脂肪酸聚乙二醇控制。質(zhì)粒的穩(wěn)定性可以通過將具有選擇作用的合適物質(zhì)例如抗生素添加至培養(yǎng)基維持。需氧條件可以通過將氧氣或含氧的氣體混合物例如空氣導(dǎo)入培養(yǎng)基維持。培養(yǎng)基的溫度通常是20℃至45℃。培養(yǎng)持續(xù)進(jìn)行直至目的產(chǎn)物的形成達(dá)到最大。此目標(biāo)通常在10小時(shí)至160小時(shí)內(nèi)達(dá)到。
以此方式所得到發(fā)酵肉湯中干物質(zhì)的含量通常在7.5至25％重量間。
額外有利的是至少在結(jié)束階段，尤其在30％發(fā)酵時(shí)間階段將發(fā)酵在糖限制下運(yùn)行。這意味在此期間將發(fā)酵培養(yǎng)基中可利用糖的濃度維持在0至3g/l，或降低。
生物合成產(chǎn)物自發(fā)酵肉湯和/或自微生物的分離根據(jù)所需的生物合成產(chǎn)物以及生物合成副產(chǎn)物的物理/化學(xué)特性以本身已知的方式分離。
例如隨后可以進(jìn)一步加工發(fā)酵肉湯。根據(jù)要求，生物質(zhì)(biomass)可以自發(fā)酵肉湯通過分離方法完全或部分地分離，如離心法、過濾法、傾析法或這些方法的組合，或者完全留在發(fā)酵肉湯內(nèi)。
隨后發(fā)酵肉湯可以借助旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器、降膜蒸發(fā)器通過已知方法濃縮，如反向滲透法或納米過濾法。隨后，這種濃縮的發(fā)酵肉湯可以通過冷凍干燥法、噴霧干燥法、噴霧造粒法或其它方法制成。
然而，還有可能純化生物合成產(chǎn)物，尤其是L-賴氨酸、L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸等。為此目的，除去生物質(zhì)后，使用合適樹脂層析包含產(chǎn)物的肉湯，雜質(zhì)或者目的產(chǎn)物完全或部分地保留在層析樹脂上。這些層析步驟根據(jù)需要可使用相同或不同層析樹脂重復(fù)。技術(shù)人員可熟練地選擇合適的層析樹脂以及它們最高效的用途。純化的產(chǎn)物可以通過過濾或超濾濃縮并且貯存在該產(chǎn)物最具穩(wěn)定性的溫度。
生物合成產(chǎn)物可以多種形式產(chǎn)生，例如以其鹽形式或酯形式。
所分離化合物的特性和純度可通過現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定。這些技術(shù)包括高效液相層析法(HPLC)、光譜方法、染色方法、薄層層析法、NIRS、酶測(cè)定法和微生物測(cè)定法。這些分析性方法總結(jié)于Patek等(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等(1996)Biotekhnologiya 1127-32；和Schmidt等(1998)Bioprocess Engineer.1967-70.Ullmann’s Encyclopediaof Industrial Chemistry(1996)第A27卷，VCHWeinheim，第89-90頁(yè)，第521-540頁(yè)，第540-547頁(yè)，第559-566頁(yè)，第575-581頁(yè)和第581-587頁(yè)；Michal，G(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry andMolecular Biology，John Wiley and Sons；Fallon，A.等(1987)Applicationsof HPLC in Biochemistry inLaboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，第17卷。
現(xiàn)在通過如下非限制性實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明實(shí)施例1.構(gòu)建載體pSK1Cat將穿梭載體pMT1(Follettie等(1993)J.Bacteriol.1754096-4103)用限制性酶XhoI和BamHI消化，隨后用Klenow片段處理并再次連接。得到的質(zhì)粒名為pMT1-del。將載體pMT1-del用限制性酶BglII和XbaI消化。2.5kb片段包含來自谷氨酸棒桿菌的pSR1 ori并且連接至已經(jīng)同樣地用BglII和XbaI消化的2kb plasposon pTnMod-Okm(Dennis und Zylstra(1998)Appl. Environ.Microbiol.642710-2715)。得到的載體名為pSK1。plasposon pTnMod-Okm的片段攜帶用于大腸桿菌的pMB1復(fù)制起點(diǎn)和卡那霉素抗性標(biāo)志(Tn903)。不帶啟動(dòng)子的Cat基因借助寡核苷酸引物A(SEQ.ID.NO.4)和B(SEQ.ID.NO.5)，使用載體pKK232-8(SEQ.ID.NO.3)作為模板通過如Innis等(1990)PCR Protokols，A Guide to Methods andApplications，Academic Press中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。載體和插入物用限制性酶BglII和KpnI消化后，將PCR產(chǎn)物連接至載體pSK1。質(zhì)粒命名為pSK1Cat(

圖1)。
寡核苷酸引物A SEQ.ID.NO.45’-GGAAGATCTTTCAAGAATTCCCAGGCA-3’寡核苷酸引物B SEQ.ID.NO.55’-GGGGTACCTACCGTATCTGTGGGGGG-3’實(shí)施例2.構(gòu)建質(zhì)粒pSK1Ptac質(zhì)粒pKK223-3 SEQ.ID.NO.6包含tac啟動(dòng)子(Ptac)。該啟動(dòng)子經(jīng)限制性酶BamHI消化后分離，并且將該片段克隆至經(jīng)BamHI線性化的載體pSK1Cat SEQ ID。質(zhì)粒命名為pSK1Ptac(圖2)。
實(shí)施例3.克隆P180(SEQ.ID.NO.1)谷氨酸棒桿菌AS019E12的染色體DNA使用Eikmanns等(1994)Microbiology 1401817-1828的方法自指數(shù)期晚期的細(xì)胞分離，隨后用限制性酶Sau3AI部分消化。將得到的0.4-1.0kb大小的片段連接至經(jīng)限制性酶BamHI線性化的載體pSK1Cat。使用Follettie等(1993)J.Bacteriol.1754096-4103的方法，將連接混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌AS019E12。將細(xì)胞在含有5μg/ml氯霉素的平板涂布。分離并分析在這些平板上生長(zhǎng)的單個(gè)菌落中的質(zhì)粒。一個(gè)如此質(zhì)粒是pSK1CatP180，其包含啟動(dòng)子P180(SEQ.ID.NO.1)。該啟動(dòng)子位于編碼推定性膜蛋白的基因上游區(qū)域。插入物大小為182bp。
實(shí)施例4.谷氨酸棒桿菌AS019E12的氯霉素抗性在30℃僅包含質(zhì)粒pSK1Cat(圖1)的谷氨酸棒桿菌細(xì)胞在具有5μg/ml氯霉素濃度的MB平板(Follettie等(1993)J.Bacteriol.1754096-4103)和MCGC平板(von der Osten等(1989)Biotechnol.Lett.1111-16)上不能生長(zhǎng)。Cat基因未表達(dá)。與此相反，包含質(zhì)粒pSK1CatPtac(圖2)的谷氨酸棒桿菌細(xì)胞在具有40μg/ml氯霉素濃度的MB平板和MCGC平板上生長(zhǎng)。當(dāng)氯霉素濃度大于40μg/ml，生長(zhǎng)十分微弱或者根本不能觀察到。包含質(zhì)粒pSK1CatP180的細(xì)胞能夠在氯霉素濃度大于40μg/ml的MB和MCGC平板上生長(zhǎng)。
實(shí)施例5.大腸桿菌的氯霉素抗性包含質(zhì)粒pSK1CatPtac(圖2)的大腸桿菌細(xì)胞在具有400μg/ml氯霉素濃度的LB平板(Sambrook等(1989)Molecular cloning-A laboratorymanual.Cold Spring Harbor Laboratory，第二版.，Cold Spring Harbor，N.Y.)上生長(zhǎng)。在600μg/ml氯霉素濃度下不能觀察到生長(zhǎng)。包含質(zhì)粒pSK1CatP180的細(xì)胞能夠在600μg氯霉素濃度生長(zhǎng)在LB平板上。
實(shí)施例6.構(gòu)建質(zhì)粒pSK1PtacmetAmetA基因借助寡核苷酸引物C SEQ.ID.NO.7和D SEQ.ID.NO.8，使用質(zhì)粒pSL75(Park等(1998)Mol. Cells 8286-294)作為模板，通過如Innis等(1990)PCR Protokols，A Guide to Methods and Applications，Academic Press中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物用限制性酶EcoRI和PstI消化并連接至事先已經(jīng)用限制性酶EcoRI和PstI消化的載體pKK223-3 SEQ.ID.NO.6。得到的質(zhì)粒名為pSL314。將包含構(gòu)建體PtacmetA的質(zhì)粒pSL314(圖3)的1.4kb BamHI/PstI片段連接至已用限制性酶BamHI和PstI線性化的質(zhì)粒pSK1Cat(圖1)。位于質(zhì)粒中的Cat基因隨后通過PstI/KpnI消化作用缺失。將質(zhì)粒經(jīng)T4DNA聚合酶處理后再連接。得到的質(zhì)粒名為pSK1PtacmetA(圖4)。
寡核苷酸引物C SEQ.ID.NO.75’-TAGA ATTCATGCCCACCTCG-3’
寡核苷酸引物D SEQ.ID.NO.85’-TACTGCAGGAGATCCCTGTCT-3’實(shí)施例7.構(gòu)建質(zhì)粒pSK1P180metAP19 SEQ.ID.NO.9中大約180bp片段借助寡核苷酸引物E(SEQ.ID.NO.10)和F(SEQ.ID.No.11)，使用如Innis等(1990)PCR Protokols，AGuide to Methods and Applications，Academic Press中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，隨后用限制性酶BamHI和PstI消化，然后插入事先已同樣地用BamHI和PstI線性化的質(zhì)粒pSK1Cat(圖1)。得到的質(zhì)粒pSK1CatP180(圖5)用限制性酶PstI和KpnI線性化以便將Cat基因替換為metA基因。metA基因借助寡核苷酸引物G(SEQ.ID.NO.12)和H(SEQ.ID.NO.13)和模版pSL75(Park等(1998)Mol.Cells 8286-294)，按照如Innis等(1990)PCR Protokols，A Guide to Methods andApplications，Academic Press中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，隨后用限制性酶KpnI和PstI切割。將metA基因產(chǎn)物和線性化的質(zhì)粒pSK1CatP180(圖5)連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pSK1P180metA(圖6)。
寡核苷酸引物E SEQ.ID.NO.105’-GCGGATCCTAATAAAGGTGGAGAA-3’寡核苷酸引物F SEQ.ID.NO.115’-GTCGAAGCTCGGCGGATTTG-3’寡核苷酸引物G SEQ.ID.NO.125’-GCCTGCAGAGGATTTCATGCCC-3’寡核苷酸引物H SEQ.ID.NO.135’-GGGGTACCCTGTCTATTTGTCGT-3’實(shí)施例8.測(cè)定高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性為測(cè)定P180的相對(duì)活性，將質(zhì)粒pSK1Cat、pSL75、pSK1PtacmetA和pSK1P180metA通過Eikamnns等(1994)Microbiology 1401817-1828的方法電穿孔入谷氨酸棒桿菌AS019E12。質(zhì)粒pSL75包含具有其天然啟動(dòng)子的metA基因。高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(metA)活性在不同生長(zhǎng)條件下通過Park等(1998)Mol.Cells 8286-294中所述的方法測(cè)定。細(xì)胞在MB培養(yǎng)基(Follettie等(1993)J.Bacteriol.1754096-4103)或MCGC培養(yǎng)基(vonder Osten等(1989)Biotechnol.Lett.1111-16)生長(zhǎng)至達(dá)到靜止期。通過Jetten和Sinsky(1993)FEMS Microbiol.Lett.111183-188的方法制備粗提取物。結(jié)果匯編在下表。
a將10mM甲硫氨酸添加至培養(yǎng)基附圖圖1顯示pSK1Cat的質(zhì)粒圖(A)以及BamHI克隆位點(diǎn)的核苷酸序列(B)。B中劃線的序列代表用于生成測(cè)序寡核苷酸的區(qū)域。指出了起始密碼子和BamHI克隆位點(diǎn)。
圖2顯示pSK1Ptac的部分核苷酸序列。啟動(dòng)子Ptac以斜體顯示。還顯示了Ct基因的-35區(qū)和-10區(qū)、RBS和起始密碼子。
圖3顯示pSL314的部分核苷酸序列。插入物以斜體顯示。還顯示了metA基因的-35區(qū)和-10區(qū)、RBS和起始密碼子。
圖4顯示psK1PtacmetA的部分核苷酸序列。不帶CAT基因的質(zhì)粒pSK1Cat顯示為黑色，而PtacmetA顯示為藍(lán)色。還顯示了metA的-10區(qū)和-35區(qū)、RBS以及起始密碼子和終止密碼子。
圖5顯示pSK1CatP180的部分核苷酸序列。質(zhì)粒pSK1Cat顯示為黑色，而P180顯示為藍(lán)色。還顯示了cat基因的-10區(qū)和-35區(qū)、RBS和起始密碼子。
圖6顯示pSK1P180metA的部分核苷酸序列。不帶cat基因的質(zhì)粒pSK1Cat顯示為黑色，而P180顯示為紅色且metA為藍(lán)色。還顯示了metA的-10區(qū)和-35區(qū)、RBS以及起始密碼子和終止密碼子。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>P180表達(dá)單元<130>AE 20040553<160>17<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>182<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(182)<223>
<400>1agttaactgc gttaataaag gtggagaata agttgtttcc aagatcaatt caaggaaagt 60tgcattttcg caggtcagtg ttacccccta agactacccc tttccattgc atacaaagga120aatacatata gacttttggg cattagatta cctcgataaa agtttaggga atctaaattc180at 182<210>2<211>375<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(375)<223>表達(dá)單元<400>2agttaactgc gttaataaag gtggagaata agttgtttcc aagatcaatt caaggaaagt 60tgcattttcg caggtcagtg ttacccccta agactacccc tttccattgc atacaaagga120aatacatata gacttttggg cattagatta cctcgataaa agtttaggga atctaaattc180
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<221>misc_feature<222>(1)..(5094)<223>質(zhì)粒<400>3ttcccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct 60gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg120ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccagggaat180tcccggggat ccgtcgacct gcagccaagc ttgagtagga caaatccgcc gagcttcgac240gagattttca ggagctaagg aagctaaaat ggagaaaaaa atcactggat ataccaccgt300tgatatatcc caatcgcatc gtaaagaaca ttttgaggca tttcagtcag ttgctcaatg360tacctataac cagaccgttc agctggatat tacggccttt ttaaagaccg taaagaaaaa420taagcacaag ttttatccgg cctttattca cattcttgcc cgcctgatga atgctcatcc480ggaattccgt atggcaatga aagacggtga gctggtgata tgggatagtg ttcacccttg540ttacaccgtt ttccatgagc aaactgaaac gttttcatcg ctctggagtg aataccacga600cgatttccgg cagtttctac acatatattc gcaagatgtg gcgtgttacg gtgaaaacct660ggcctatttc cctaaagggt ttattgagaa tatgtttttc gtctcagcca atccctgggt720gagtttcacc agttttgatt taaacgtggc caatatggac aacttcttcg cccccgtttt780caccatgggc aaatattata cgcaaggcga caaggtgctg atgccgctgg cgattcaggt840tcatcatgcc gtctgtgatg gcttccatgt cggcagaatg cttaatgaat tacaacagta900
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ctgtattaac gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt tctctggtcc cgccgcatcc 2040ataccgccag ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg ggcatgttca tcatcagtaa 2100cccgtatcgt gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat tacccccatg aacagaaatt 2160cccccttaca cggaggcatc aagtgaccaa acaggaaaaa accgccctta acatggcccg 2220ctttatcaga agccagacat taacgcttct ggagaaactc aacgagctgg acgcggatga 2280acaggcagac atctgtgaat cgcttcacga ccacgctgat gagctttacc gcagctgcct 2340cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 2400agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 2460tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg 2520cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 2580ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact 2640gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 2700atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 2760caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 2820cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 2880taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 2940ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 3000tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 3060gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 3120ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 3180aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 3240aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 3300agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 3360cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 3420gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 3480
atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 3540gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 3600tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 3660gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 3720ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 3780actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 3840ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg 3900tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 3960cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 4020ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 4080ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 4140tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat 4200agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 4260atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 4320gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 4380aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 4440tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 4500aaaaataaac aaaagagttt gtagaaacgc aaaaaggcca tccgtcagga tggccttctg 4560cttaatttga tgcctggcag tttatggcgg gcgtcctgcc cgccaccctc cgggccgttg 4620cttcgcaacg ttcaaatccg ctcccggcgg atttgtccta ctcaggagag cgttcaccga 4680caaacaacag ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttgatg 4740cctggcagtt ccctactctc gcatggggag accccacact accatcggcg ctacggcgtt 4800tcacttctga gttcggcatg gggtcaggtg ggaccaccgc gctactgccg ccaggcaaat 4860tctgttttat cagaccgctt ctgcgttctg atttaatctg tatcaggctg aaaatcttct 4920ctcatccgcc aaaacagaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tccccgggta 4980
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tttgggcatt agattacctc gataaaagtt tagggaatct aaattcat 228<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
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ggc acc acc ctg atg gct gag ggt cgc ccc aac gca att tcc att ctc 336Gly Thr Thr Leu Met Ala Glu Gly Arg Pro Asn Ala Ile Ser Ile Leu100 105 110gca gct gca gag cgt ggc acc atg tac gat cca tcc tcc gtc ttc tac 384Ala Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp Pro Ser Ser Val Phe Tyr115 120 125atg aag aag atc gcc gtg gga cct gag gcc gca ggc aag atc gac atc 432Met Lys Lys Ile Ala Val Gly Pro Glu Ala Ala Gly Lys Ile Asp Ile130 135 140gaa gct cca gtt gcc cac aac atc aac gcg gtg gca aag tcc aag gga 480Glu Ala Pro Val Ala His Asn Ile Asn Ala Val Ala Lys Ser Lys Gly145 150 155 160atc aac cct tcc gac gtc acc gtt gtc gtg ctt gac cgt cct cgc cac 528Ile Asn Pro Ser Asp Val Thr Val Val Val Leu Asp Arg Pro Arg His165 170 175atc gaa ctg atc gca gac att cgt cgt gca ggc gca aag gtt cgt ctc 576Ile Glu Leu Ile Ala Asp Ile Arg Arg Ala Gly Ala Lys Val Arg Leu180 185 190atc tcc gac ggc gac gtt gca ggt gca gtt gca gca gct cag gat tcc 624Ile Ser Asp Gly Asp Val Ala Gly Ala Val Ala Ala Ala Gln Asp Ser195 200 205aac tcc gtg gac atc atg atg ggc acc ggc gga acc cca gaa ggc atc 672Asn Ser Val Asp Ile Met Met Gly Thr Gly Gly Thr Pro Glu Gly Ile210 215 220atc act gcg tgc gcc atg aag tgc atg ggt ggc gaa atc cag ggc atc 720Ile Thr Ala Cys Ala Met Lys Cys Met Gly Gly Glu Ile Gln Gly Ile225 230 235 240ctg gcc cca atg aac gat ttc gag cgc cag aag gca cac gac gct ggt 768Leu Ala Pro Met Asn Asp Phe Glu Arg Gln Lys Ala His Asp Ala Gly245 250 255ctg gtt ctt gat cag gtt ctg cac acc aac gat ctg gtg agc tcc gac 816Leu Val Leu Asp Gln Val Leu His Thr Asn Asp Leu Val Ser Ser Asp260 265 270aac tgc tac ttc gtg gca acc ggt gtg acc aac ggt gac atg ctc cgt 864Asn Cys Tyr Phe Val Ala Thr Gly Val Thr Asn Gly Asp Met Leu Arg275 280 285ggc gtt tcc tac cgc gca aac ggc gca acc acc cgt tcc ctg gtt atg 912Gly Val Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Ala Thr Thr Arg Ser Leu Val Met
290 295 300cgc gca aag tca ggc acc atc cgc cac atc gag tct gtc cac cag ctg 960Arg Ala Lys Ser Gly Thr Ile Arg His Ile Glu Ser Val His Gln Leu305 310 315 320tcc aag ctg cag gaa tac tcc gtg gtt gac tac acc acc gcg acc 1005Ser Lys Leu Gln Glu Tyr Ser Val Val Asp Tyr Thr Thr Ala Thr325 330 335<210>15<211>335<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>15Met Asn Leu Lys Asn Pro Glu Thr Pro Asp Arg Asn Leu Ala Met Glu1 5 10 15Leu Val Arg Val Thr Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ser Gly Arg Trp Val20 25 30Gly Arg Gly Met Lys Asn Glu Gly Asp Gly Ala Ala Val Asp Ala Met35 40 45Arg Gln Leu Ile Asn Ser Val Thr Met Lys Gly Val Val Val Ile Gly50 55 60Glu Gly Glu Lys Asp Glu Ala Pro Met Leu Tyr Asn Gly Glu Glu Val65 70 75 80Gly Thr Gly Phe Gly Pro Glu Val Asp Ile Ala Val Asp Pro Val Asp85 90 95Gly Thr Thr Leu Met Ala Glu Gly Arg Pro Asn Ala Ile Ser Ile Leu100 105 110Ala Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp Pro Ser Ser Val Phe Tyr115 120 125
Met Lys Lys Ile Ala Val Gly Pro Glu Ala Ala Gly Lys Ile Asp Ile130 135 140Glu Ala Pro Val Ala His Asn Ile Asn Ala Val Ala Lys Ser Lys Gly145 150 155 160Ile Asn Pro Ser Asp Val Thr Val Val Val Leu Asp Arg Pro Arg His165 170 175Ile Glu Leu Ile Ala Asp Ile Arg Arg Ala Gly Ala Lys Val Arg Leu180 185 190Ile Ser Asp Gly Asp Val Ala Gly Ala Val Ala Ala Ala Gln Asp Ser195 200 205Asn Ser Val Asp Ile Met Met Gly Thr Gly Gly Thr Pro Glu Gly Ile210 215 220Ile Thr Ala Cys Ala Met Lys Cys Met Gly Gly Glu Ile Gln Gly Ile225 230 235 240Leu Ala Pro Met Asn Asp Phe Glu Arg Gln Lys Ala His Asp Ala Gly245 250 255Leu Val Leu Asp Gln Val Leu His Thr Asn Asp Leu Val Ser Ser Asp260 265 270Asn Cys Tyr Phe Val Ala Thr Gly Val Thr Asn Gly Asp Met Leu Arg275 280 285Gly Val Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Ala Thr Thr Arg Ser Leu Val Met290 295 300Arg Ala Lys Ser Gly Thr Ile Arg His Ile Glu Ser Val His Gln Leu305 310 315 320Ser Lys Leu Gln Glu Tyr Ser Val Val Asp Tyr Thr Thr Ala Thr325 330 335
<210>16<211>1365<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1365)<223>
<400>16atg aat gat gag aat att caa agc tcc aac tat cag cca ttc ccg agt 48Met Asn Asp Glu Asn Ile Gln Ser Ser Asn Tyr Gln Pro Phe Pro Ser1 5 10 15ttt gac gat tgg aaa cag atc gag gtg tcg ctc tta gat gtc atc gaa 96Phe Asp Asp Trp Lys Gln Ile Glu Val Ser Leu Leu Asp Val Ile Glu20 25 30tcc tca cgc cat ttt tot gat ttg aaa gat agc act gat cgt tct gcg 144Ser Ser Arg His Phe Ser Asp Leu Lys Asp Ser Thr Asp Arg Ser Ala35 40 45tta gat gct gcg cta gag aga gca aaa aga gct gcc gca gtt gat acc 192Leu Asp Ala Ala Leu Glu Arg Ala Lys Arg Ala Ala Ala Val Asp Thr50 55 60aat gcc ata gaa gga atc ttc caa act gat cgc ggt ttt acc cat aca 240Asn Ala Ile Glu Gly Ile Phe Gln Thr Asp Arg Gly Phe Thr His Thr65 70 75 80gtt gca acg cag gta ggg gct tgg gag caa caa atg gcg atg aaa ggc 288Val Ala Thr Gln Val Gly Ala Trp Glu Gln Gln Met Ala Met Lys Gly85 90 95aaa cat gtt aag cct gcg ttt gac gat act cta gaa ggc ttt gag tat 336Lys His Val Lys Pro Ala Phe Asp Asp Thr Leu Glu Gly Phe Glu Tyr100 105 110gtt ctc gat gca gta act ggt aga act cca atc tct cag caa tgg att 384Val Leu Asp Ala Val Thr Gly Arg Thr Pro Ile Ser Gln Gln Trp Ile115 120 125aga aat ttg cac gcc gtc att ctg cgg agc caa gaa agc cac gag gtt 432Arg Asn Leu His Ala Val Ile Leu Arg Ser Gln Glu Ser His Glu Val130 135 140
ttt aca gcc gtt gga gtc caa aat cag gcg ctt cag aaa ggc gag tat 480Phe Thr Ala Val Gly Val Gln Asn Gln Ala Leu Gln Lys Gly Glu Tyr145 150 155 160aaa act cag cca aat agt cca cag cgc tca gat gga tct gta cat gca 528Lys Thr Gln Pro Asn Ser Pro Gln Arg Ser Asp Gly Ser Val His Ala165 170 175tac gcc cca gtt gaa gat act cct gct gaa atg gct aga ttt att tca 576Tyr Ala Pro Val Glu Asp Thr Pro Ala Glu Met Ala Arg Phe Ile Ser180 185 190gaa ctt gaa tct aag gaa ttc tta gca gcc gag aag gtt att caa gct 624Glu Leu Glu Ser Lys Glu Phe Leu Ala Ala Glu Lys Val Ile Gln Ala195 200 205gcc tat gcc cac tat gct ttc gta tgt att cat cct ttt gca gat ggg 672Ala Tyr Ala His Tyr Ala Phe Val Cys Ile His Pro Phe Ala Asp Gly210 215 220aat gga cga gtt gca cga gcc ttg gct agt gtt ttt cta tac aaa gat 720Asn Gly Arg Val Ala Arg Ala Leu Ala Ser Val Phe Leu Tyr Lys Asp225 230 235 240cct ggt gtc cct ctc gta atc tac caa gat caa cgc aga gat tac atc 768Pro Gly Val Pro Leu Val Ile Tyr Gln Asp Gln Arg Arg Asp Tyr Ile245 250 255cat gct cta gaa gca gcg gac aag aat aac ccg ctc ctg ctg att aga 816His Ala Leu Glu Ala Ala Asp Lys Asn Asn Pro Leu Leu Leu Ile Arg260 265 270ttc ttt gct gaa cga gtg acc gat act att aac tct att atc gtt gat 864Phe Phe Ala Glu Arg Val Thr Asp Thr Ile Asn Ser Ile Ile Val Asp275 280 285ctc act acc ccg atc gcg ggt aaa tct ggt tcg gct aag ctt tcg gat 912Leu Thr Thr Pro Ile Ala Gly Lys Ser Gly Ser Ala Lys Leu Ser Asp290 295 300gcg cta cgc ccc act cgc gta tta cca gaa tta cat gat gct gca cat 960Ala Leu Arg Pro Thr Arg Val Leu Pro Glu Leu His Asp Ala Ala His305 310 315 320agg ctc caa gaa agt tta ttt aca gaa atc cga tct cga ttg gat gaa 1008Arg Leu Gln Glu Ser Leu Phe Thr Glu Ile Arg Ser Arg Leu Asp Glu325 330 335gaa gga aaa agg aat ggg ttg gag ttt cta ctt caa cgg att ttt atc 1056Glu Gly Lys Arg Asn Gly Leu Glu Phe Leu Leu Gln Arg Ile Phe Ile
340 345 350ggt tcc cca ttc aat ctg cca gag ggc tat aac gct ttc cct gat agc 1104Gly Ser Pro Phe Asn Leu Pro Glu Gly Tyr Asn Ala Phe Pro Asp Ser355 360 365tat tgt ctg acc tta gct ttc aat agc aac tct cca aaa caa atc ttc 1152Tyr Cys Leu Thr Leu Ala Phe Asn Ser Asn Ser Pro Lys Gln Ile Phe370 375 380cac ccg cta tcc ata gta ata gca gct cga gat ggg aaa aga gcg agc 1200His Pro Leu Ser Ile Val Ile Ala Ala Arg Asp Gly Lys Arg Ala Ser385 390 395 400agc gac ctc gtg gca gct act tct att gga tac aac ttt cac gct tac 1248Ser Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Ile Gly Tyr Asn Phe His Ala Tyr405 410 415gga cgt gaa gtc gag cct gtt gtt act gaa agc ttt cga gaa cgt gtg 1296Gly Arg Glu Val Glu Pro Val Val Thr Glu Ser Phe Arg Glu Arg Val420 425 430aaa att tac gcc gac ggg att gta gat cac ttc tta acc gaa ctg gct 1344Lys Ile Tyr Ala Asp Gly Ile Val Asp His Phe Leu Thr Glu Leu Ala435 440 445aaa aag ttt caa cag aat taa 1365Lys Lys Phe Gln Gln Asn450<210>17<211>454<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>17Met Asn Asp Glu Asn Ile Gln Ser Ser Asn Tyr Gln Pro Phe Pro Ser1 5 10 15Phe Asp Asp Trp Lys Gln Ile Glu Val Ser Leu Leu Asp Val Ile Glu20 25 30Ser Ser Arg His Phe Ser Asp Leu Lys Asp Ser Thr Asp Arg Ser Ala35 40 45
Leu Asp Ala Ala Leu Glu Arg Ala Lys Arg Ala Ala Ala Val Asp Thr50 55 60Asn Ala Ile Glu Gly Ile Phe Gln Thr Asp Arg Gly Phe Thr His Thr65 70 75 80Val Ala Thr Gln Val Gly Ala Trp Glu Gln Gln Met Ala Met Lys Gly85 90 95Lys His Val Lys Pro Ala Phe Asp Asp Thr Leu Glu Gly Phe Glu Tyr100 105 110Val Leu Asp Ala Val Thr Gly Arg Thr Pro Ile Ser Gln Gln Trp Ile115 120 125Arg Asn Leu His Ala Val Ile Leu Arg Ser Gln Glu Ser His Glu Val130 135 140Phe Thr Ala Val Gly Val Gln Asn Gln Ala Leu Gln Lys Gly Glu Tyr145 150 155 160Lys Thr Gln Pro Asn Ser Pro Gln Arg Ser Asp Gly Ser Val His Ala165 170 175Tyr Ala Pro Val Glu Asp Thr Pro Ala Glu Met Ala Ara Phe Ile Ser180 185 190Glu Leu Glu Ser Lys Glu Phe Leu Ala Ala Glu Lys Val Ile Gln Ala195 200 205Ala Tyr Ala His Tyr Ala Phe Val Cys Ile His Pro Phe Ala Asp Gly210 215 220Asn Gly Arg Val Ala Arg Ala Leu Ala Ser Val Phe Leu Tyr Lys Asp225 230 235 240Pro Gly Val Pro Leu Val Ile Tyr Gln Asp Gln Arg Arg Asp Tyr Ile245 250 255
His Ala Leu Glu Ala Ala Asp Lys Asn Asn Pro Leu Leu Leu Ile Arg260 265 270Phe Phe Ala Glu Arg Val Thr Asp Thr Ile Asn Ser Ile Ile Val Asp275 280 285Leu Thr Thr Pro Ile Ala Gly Lys Ser Gly Ser Ala Lys Leu Ser Asp290 295 300Ala Leu Arg Pro Thr Arg Val Leu Pro Glu Leu His Asp Ala Ala His305 310 315 320Arg Leu Gln Glu Ser Leu Phe Thr Glu Ile Arg Ser Arg Leu Asp Glu325 330 335Glu Gly Lys Arg Asn Gly Leu Glu Phe Leu Leu Gln Arg Ile Phe Ile340 345 350Gly Ser Pro Phe Asn Leu Pro Glu Gly Tyr Asn Ala Phe Pro Asp Ser355 360 365Tyr Cys Leu Thr Leu Ala Phe Asn Ser Asn Ser Pro Lys Gln Ile Phe370 375 380His Pro Leu Ser Ile Val Ile Ala Ala Arg Asp Gly Lys Arg Ala Ser385 390 395 400Ser Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Ile Gly Tyr Asn Phe His Ala Tyr405 410 415Gly Arg Glu Val Glu Pro Val Val Thr Glu Ser Phe Arg Glu Arg Val420 425 430Lys Ile Tyr Ala Asp Gly Ile Val Asp His Phe Leu Thr Glu Leu Ala435 440 445
Lys Lys Phe Gln Gln Asn450
權(quán)利要求
1.具有啟動(dòng)子活性的核酸用于基因轉(zhuǎn)錄的用途，所述核酸包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1或B)通過替換、插入或缺失核苷酸而衍生自該序列并具有與序列SEQ.ID.NO.1在核酸水平至少90％同一性的序列，或C)嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)的序列的功能等同片段。
2.表達(dá)單元用于基因表達(dá)的用途，所述表達(dá)單元包含根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸和額外地包含功能性連接的確保翻譯核糖核酸的核酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中表達(dá)單元包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2或F)通過替換、插入或缺失核苷酸而衍生自該序列并具有與序列SEQ.ID.NO.2在核酸水平至少90％同一性的序列，或G)嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.2雜交的核酸序列，或H)E)、F)或G)的序列的功能等同片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中表達(dá)單元由序列SEQ.ID.NO.2的核酸組成。
5.具有啟動(dòng)子活性的核酸，其包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1或B)通過替換、插入或缺失核苷酸而衍生自該序列并具有與序列SEQ.ID.NO.1在核酸水平至少90％同一性的序列，或C)嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)的序列的功能等同片段，條件是排除具有序列SEQ.ID.NO.1的核酸。
6.表達(dá)單元，其包含根據(jù)權(quán)利要求5的具有啟動(dòng)子活性的核酸和額外地包含功能性連接的確保翻譯核糖核酸的核酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)單元，其包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2或F)通過替換、插入或缺失核苷酸而衍生自該序列并具有與序列SEQ.ID.NO.2在核酸水平至少90％同一性的序列，或G)嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.2雜交的核酸序列，或H)E)、F)或G)的序列的功能等同片段，條件是排除具有序列SEQ.ID.NO.2的核酸。
8.用于通過如下方式改變或引發(fā)與野生型比較微生物中基因的轉(zhuǎn)錄率的方法a)改變與野生型比較微生物中根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸的特異啟動(dòng)子活性，其中所述內(nèi)源性核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄，或b)通過根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有改變的特異啟動(dòng)子活性的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中的基因轉(zhuǎn)錄，其中所述基因相對(duì)于具有啟動(dòng)子活性的核酸為異源。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中通過根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有改變的特異啟動(dòng)子活性的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中的基因轉(zhuǎn)錄由如下方式實(shí)現(xiàn)b1)將根據(jù)權(quán)利要求1的一個(gè)或多個(gè)具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物的基因組，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在所導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行，或b2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄在根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸控制下進(jìn)行，或b3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸，以及功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待轉(zhuǎn)錄的核酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中為提高或引發(fā)與野生型比較微生物中基因的轉(zhuǎn)錄率ah)提高與野生型比較微生物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸的特異啟動(dòng)子活性，或bh)通過根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中所述基因相對(duì)于具有啟動(dòng)子活性的核酸為異源。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中通過根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有提高的特異啟動(dòng)子活性的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄由如下方式實(shí)現(xiàn)bh1)將根據(jù)權(quán)利要求1的一個(gè)或多個(gè)具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物的基因組，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在所導(dǎo)入的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行，或bh2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄在根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸控制下進(jìn)行，或bh3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸，以及功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待轉(zhuǎn)錄的核酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中為降低與野生型比較微生物中基因的轉(zhuǎn)錄率ar)降低與野生型比較微生物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸的特異啟動(dòng)子活性，或br)將根據(jù)實(shí)施方案a)的具有降低的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物的基因組，以至內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在所導(dǎo)入的具有降低的啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行。
13.用于通過如下方式改變或引發(fā)與野生型比較微生物中基因的表達(dá)率的方法c)改變與野生型比較微生物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因表達(dá)的根據(jù)權(quán)利要求2或3的內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，或d)通過根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案c)的具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中通過根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)由以下方式實(shí)現(xiàn)d1)將一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)在導(dǎo)入的表達(dá)單元控制下進(jìn)行，或d2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的表達(dá)在根據(jù)權(quán)利要求2或3的內(nèi)源性表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述內(nèi)源性表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，或d3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元，所述表達(dá)單元具有改變的特異表達(dá)活性，以及功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待表達(dá)核酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中為提高或引發(fā)與野生型比較微生物中基因的表達(dá)率ch)提高與野生型比較微生物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因表達(dá)的根據(jù)權(quán)利要求2或3的內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，或dh)通過根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有提高的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中通過根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有提高的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)由如下方式實(shí)現(xiàn)dh1)將一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)在導(dǎo)入的表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，或dh2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M，以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的表達(dá)在根據(jù)權(quán)利要求2或3的內(nèi)源性表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述內(nèi)源性表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，或dh3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，以及功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待表達(dá)的核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中為降低與野生型比較微生物中基因的表達(dá)率cr)降低與野生型比較微生物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因表達(dá)的根據(jù)權(quán)利要求2或3的內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，或dr)將根據(jù)實(shí)施方案cr)的具有降低的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組，以至內(nèi)源性基因的表達(dá)在所導(dǎo)入具有降低的表達(dá)活性的表達(dá)單元控制下進(jìn)行。
18.根據(jù)權(quán)利要求8至17任一項(xiàng)中所述的方法，其中基因選自編碼來自蛋白原性和非蛋白原性氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自核苷酸和核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自有機(jī)酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自脂類和脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自二醇生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自糖類生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自芳香化合物生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自維生素生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自輔因子生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸和編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸，其中基因可以根據(jù)需要包含其它調(diào)節(jié)元件。
19.根據(jù)權(quán)利要求所述的18方法，其中來自氨基酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LuxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR1、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚γ-合成酶、胱硫醚β-裂合酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、蘇氨酸輸出蛋白載體蛋白、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出蛋白、生物素連接酶、半胱氨酸合成酶I、半胱氨酸合成酶II、依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶、不依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和亞基2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調(diào)節(jié)蛋白、RXN2910調(diào)節(jié)蛋白、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸外排蛋白、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA248、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA247、蛋白質(zhì)OpcA、1-磷酸果糖激酶和6-磷酸果糖激酶。
20.表達(dá)盒，其包含a)至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元和b)至少一個(gè)其它待表達(dá)的核酸序列，和c)根據(jù)需要其它遺傳控制元件，其中至少一個(gè)表達(dá)單元和其它待表達(dá)的核酸序列功能性連接在一起，并且其它待表達(dá)的核酸序列相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的表達(dá)盒，其中其它待表達(dá)的核酸序列選自編碼來自蛋白原性和非蛋白原性氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自核苷酸和核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自有機(jī)酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自脂類和脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自二醇生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自糖類生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自芳香化合物生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自維生素生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自輔因子生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸和編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的表達(dá)盒，其中來自氨基酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LuxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR1、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚γ-合成酶、胱硫醚β-裂合酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、蘇氨酸輸出蛋白載體蛋白、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出蛋白、生物素連接酶、半胱氨酸合成酶I、半胱氨酸合成酶II、依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶、不依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和亞基2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調(diào)節(jié)蛋白、RXN2910調(diào)節(jié)蛋白、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸外排蛋白、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA248、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA247、蛋白質(zhì)OpcA、1-磷酸果糖激酶和6-磷酸果糖激酶。
23.表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求20至22任一項(xiàng)中所述的表達(dá)盒。
24.基因修飾微生物，其中遺傳修飾導(dǎo)致改變或引發(fā)與野生型相比至少一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄率并且取決于a)改變微生物中調(diào)節(jié)至少一個(gè)內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄的至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸的特異啟動(dòng)子活性，或b)通過根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有改變的特異啟動(dòng)子活性的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中基因相對(duì)于具有啟動(dòng)子活性的核酸為異源。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的基因修飾微生物，其中通過根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有改變的特異啟動(dòng)子活性的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄由如下方式實(shí)現(xiàn)b1)將根據(jù)權(quán)利要求1的一個(gè)或多個(gè)具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物的基因組，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在所導(dǎo)入的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行，或b2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄在根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸控制下進(jìn)行，或b3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸，以及功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待轉(zhuǎn)錄的核酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的基因修飾微生物，其具有至少一個(gè)基因與野生型比較提高或引發(fā)的轉(zhuǎn)錄率，其中ah)提高與野生型比較微生物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸的特異啟動(dòng)子活性，或bh)通過根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案ah)的具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中所述基因相對(duì)于具有啟動(dòng)子活性的核酸為異源。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的基因修飾微生物，其中通過根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有改變的特異啟動(dòng)子活性的根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄由如下方式實(shí)現(xiàn)bh1)將根據(jù)權(quán)利要求1的一個(gè)或多個(gè)具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物的基因組，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在所導(dǎo)入的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行，或bh2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄在根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸控制下進(jìn)行，或bh3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性，根據(jù)需要具有提高的特異啟動(dòng)子活性的核酸，以及功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待轉(zhuǎn)錄的核酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的基因修飾微生物，其具有至少一個(gè)基因與野生型比較降低的轉(zhuǎn)錄率，其中ar)降低與野生型比較微生物中調(diào)節(jié)至少一個(gè)內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄的至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源性核酸的特異啟動(dòng)子活性，或br)將根據(jù)實(shí)施方案a)的具有降低的啟動(dòng)子活性的一個(gè)或多個(gè)核酸導(dǎo)入微生物的基因組以至至少一個(gè)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄在所導(dǎo)入的具有降低的啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行。
29.基因修飾微生物，其中遺傳修飾導(dǎo)致與野生型比較改變或引發(fā)至少一個(gè)基因的表達(dá)率，并且取決于c)改變與野生型比較微生物中調(diào)節(jié)至少一個(gè)內(nèi)源性基因表達(dá)的至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2或3的內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，或d)通過根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的基因修飾微生物，其中通過根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)由如下方式實(shí)現(xiàn)d1)將一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)在導(dǎo)入的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，或d2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的表達(dá)在根據(jù)權(quán)利要求2或3的內(nèi)源性表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述內(nèi)源性表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，或d3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有改變的特異表達(dá)活性，以及功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待表達(dá)的核酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的具有至少一個(gè)基因與野生型比較提高或引發(fā)的表達(dá)率的基因修飾微生物，其中ch)提高與野生型比較微生物中調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因表達(dá)的至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2或3的內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，或dh)通過根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有提高的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的基因修飾微生物，其中通過根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元或通過根據(jù)實(shí)施方案a)的具有提高的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)由如下方式實(shí)現(xiàn)dh1)將一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，以至一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)在導(dǎo)入的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，或dh2)將一個(gè)或多個(gè)基因?qū)胛⑸锏幕蚪M以至一個(gè)或多個(gè)所導(dǎo)入基因的表達(dá)在根據(jù)權(quán)利要求2或3的內(nèi)源性表達(dá)單元控制下進(jìn)行，所述內(nèi)源性表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，或dh3)將一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體導(dǎo)入微生物，其中所述核酸構(gòu)建體包含根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元，所述表達(dá)單元根據(jù)需要具有提高的特異表達(dá)活性，以及功能性連接的一個(gè)或多個(gè)待表達(dá)的核酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的具有至少一個(gè)基因與野生型比較降低的表達(dá)率的基因修飾微生物，其中cr)降低與野生型比較微生物中調(diào)節(jié)至少一個(gè)內(nèi)源性基因表達(dá)的至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2或3的內(nèi)源性表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，或dr)將一個(gè)或多個(gè)具有降低的表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組，以至至少一個(gè)基因的表達(dá)在所導(dǎo)入具有降低的表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元控制下進(jìn)行。
34.基因修飾微生物，其包含根據(jù)權(quán)利要求2或3的表達(dá)單元和功能性連接的待表達(dá)基因，其中所述基因相對(duì)于表達(dá)單元為異源。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的基因修飾微生物，其包含權(quán)利要求20至22任一項(xiàng)中所述的表達(dá)盒。
36.根據(jù)權(quán)利要求24至35任一項(xiàng)中所述的基因修飾微生物，其中基因選自編碼來自蛋白原性和非蛋白原性氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自核苷酸和核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自有機(jī)酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自脂類和脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自二醇生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自糖類生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自芳香化合物生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自維生素生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來自輔因子生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸和編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸，其中基因可以根據(jù)需要包含其它調(diào)節(jié)元件。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的基因修飾微生物，其中來自氨基酸生物合成途徑中的蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LuxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR1、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚γ-合成酶、胱硫醚β-裂合酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、蘇氨酸輸出蛋白載體蛋白、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出蛋白、生物素連接酶、半胱氨酸合成酶I、半胱氨酸合成酶II、依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶、不依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和亞基2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調(diào)節(jié)蛋白、RXN2910調(diào)節(jié)蛋白、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸外排蛋白、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA248、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA248、蛋白質(zhì)OpcA、1-磷酸果糖激酶和6-磷酸果糖激酶。
38.用于制備生物合成產(chǎn)物的方法，其通過培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求24至37任一項(xiàng)中所述的基因修飾微生物進(jìn)行。
39.用于通過培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求24、25、31或32任一項(xiàng)中所述的基因修飾微生物制備賴氨酸的方法，其中基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫羧酶的核酸、編碼二氫吡啶二羧酸合成酶的核酸、編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LuxR的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR1的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR2的核酸、編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)酮酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)醛酶的核酸、編碼賴氨酸輸出蛋白的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼精氨酰-tRNA合成酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、編碼蛋白質(zhì)OpcA的核酸、編碼1-磷酸果糖激酶的核酸和編碼6-磷酸果糖激酶的核酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中基因修飾微生物額外地具有至少一個(gè)選自如下活性的與野生型比較提高的活性天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫羧酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、磷酸丙糖異構(gòu)酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LuxR的活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR1的活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白LysR2的活性、蘋果酸-醌氧化還原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶活性、轉(zhuǎn)酮酶活性、轉(zhuǎn)醛酶活性、賴氨酸輸出蛋白活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、蛋白質(zhì)OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性和生物素連接酶活性。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的方法，其中基因修飾微生物額外地具有至少一個(gè)選自如下活性的與野生型比較降低的活性蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高絲氨酸激酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、蘇氨酸輸出蛋白活性、蘇氨酸外排蛋白活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脫羧酶活性和蘇氨酸合成酶活性。
42.用于通過培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求24、25、31或32任一項(xiàng)中所述的基因修飾微生物制備甲硫氨酸的方法，其中基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼高絲氨酸脫氫酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的核酸、編碼高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼胱硫醚γ-合成酶的核酸、編碼胱硫醚β-裂合酶的核酸、編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶的核酸、編碼亞甲基四氫葉酸還原酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸磷酸酶的核酸、編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼半胱氨酸合成酶I的核酸、編碼半胱氨酸合成酶II的核酸、編碼依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶的核酸、編碼不依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶的核酸、編碼硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼磷酸腺苷磷酰硫酸還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白NADPH還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白活性的核酸、編碼硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA077的核酸、編碼硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA248的核酸、編碼硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA247的核酸、編碼RXA0655調(diào)節(jié)蛋白的核酸和編碼RXN2910調(diào)節(jié)蛋白的核酸。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中基因修飾微生物額外地具有至少一個(gè)選自如下活性的與野生型比較提高的活性天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、磷酸丙糖異構(gòu)酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、胱硫醚γ-合成酶活性、胱硫醚β-裂合酶活性、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性、亞甲基四氫葉酸還原酶活性、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸絲氨酸磷酸酶活性、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、半胱氨酸合成酶I活性、半胱氨酸合成酶II活性、依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、不依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶活性、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶活性、鐵氧還蛋白NADPH還原酶活性、鐵氧還蛋白活性、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA077的活性、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA248的活性、硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)RXA247的活性、RXA655調(diào)節(jié)蛋白的活性和RXN2910調(diào)節(jié)蛋白的活性。
44.根據(jù)權(quán)利要求42或43所述的方法，其中基因修飾微生物額外地具有至少一個(gè)選自如下活性的與野生型比較降低的活性高絲氨酸激酶活性、蘇氨酸脫水酶活性、蘇氨酸合成酶活性、內(nèi)消旋二氨基庚二酸D-脫氫酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性和二氨基吡啶羧酸脫羧酶活性。
45.用于通過培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求24、25、31或32任一項(xiàng)中所述的基因修飾微生物制備蘇氨酸的方法，其中基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼磷酸丙糖異構(gòu)酶的核酸、編碼高絲氨酸激酶的核酸、編碼蘇氨酸合成酶的核酸、編碼蘇氨酸輸出蛋白載體蛋白的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)醛酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)酮酶的核酸、編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的核酸、編碼賴氨酸輸出蛋白的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼蘇氨酸外排蛋白的核酸、編碼果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、編碼OpcA蛋白的核酸、編碼1-磷酸果糖激酶的核酸、編碼6-磷酸果糖激酶的核酸和編碼高絲氨酸脫氫酶的核酸。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中基因修飾微生物額外地具有至少一個(gè)選自如下活性的與野生型比較提高的活性天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、磷酸丙糖異構(gòu)酶活性、蘇氨酸合成酶活性、蘇氨酸輸出載體蛋白的活性、轉(zhuǎn)醛酶活性、轉(zhuǎn)酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、蘋果酸-醌氧化還原酶活性、高絲氨酸激酶活性、生物素連接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、蘇氨酸外排蛋白活性、蛋白質(zhì)OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和高絲氨酸脫氫酶活性。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或46所述的方法，其中基因修飾微生物額外地具有至少一個(gè)選自如下活性的與野生型比較降低的活性蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性、內(nèi)消旋二氨基庚二酸D-脫氫酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、天冬酰胺酶活性，天冬氨酸脫羧酶活性、賴氨酸輸出蛋白活性、乙酰乳酸合酶活性、乙醇酮酸還原異構(gòu)酶活性、支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶活性、依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、不依賴輔酶B12的甲硫氨酸合成酶活性、二羥酸脫水酶活性和二氨基吡啶羧酸脫羧酶活性。
48.權(quán)利要求38至47任一項(xiàng)中所述的方法，其中在培養(yǎng)步驟之后和/或期間自培養(yǎng)基分離并且根據(jù)需要純化生物合成產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的核酸序列的用途、新啟動(dòng)子和表達(dá)單元本身、用于基因中改變或引發(fā)轉(zhuǎn)錄率和/或表達(dá)率的方法、包含所述表達(dá)單元的表達(dá)盒、具有改變或引發(fā)的轉(zhuǎn)錄率和/或表達(dá)率的基因修飾微生物和用于通過培養(yǎng)基因修飾微生物制備生物合成產(chǎn)物的方法。
文檔編號(hào)C12N15/74GK1989243SQ200580024778
公開日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2005年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月20日
發(fā)明者J-S·崔, W·K·鄭, I·K·金, S·H·林, H-S·李 申請(qǐng)人:巴斯福股份公司